Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Эффекты включения диетических дрожжей и острого стресса на профилях пропандиальной цельной крови дорсальной аорта-канюлированной радужной форели

Effects of dietary yeast inclusion and acute stress on post-prandial whole blood profiles of dorsal aorta-cannulated rainbow trout
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5374170/

Дрожжи являются потенциальной альтернативой рыбной муке в диетах для фермерской рыбы, но при замене более 50% рыбной муки приводит к снижению роста рыбы. В 4-недельном эксперименте 15 радужных форели (Oncorhynchus mykiss) были канюлированы и кормили три диеты каждую неделю: 30% рыбной муки в качестве контроля (FM); 60% -ная замена белка рыбной муки на усвояемой основе с Saccharomyces cerevisiae (SC); и 60% замены Wickerhamomyces anomalus и S. cerevisiae mix (WA). Кровь собирали через 0, 3, 6, 12 и 24 ч после кормления. В последнюю неделю рыба подвергалась стрессону на 1 минуту, чтобы оценить возможные взаимодействия диеты и стресса. Значительное увеличение рН, TCO2, HCO3 и избытка основы были обнаружены после того, как рыбы были кормили диету SC и WA по сравнению с FM, которая повышала уровень щелочности крови. Ингредиенты дрожжей имели более низкую буферную способность и зольность, чем рыбная мука, что объясняло увеличение щелочных приливов. Кроме того, рыба, кормившая диету WA, значительно уменьшила площадь эритроцитов, а рыбы, питавшиеся диетами SC и WA, увеличили средний уровень корпускулярного гемоглобина, указывая на гемолитическую анемию. Более высокие уровни нуклеиновой кислоты в диетах на основе дрожжей и потенциально более высокое производство реакционноспособных видов кислорода были заподозрены в повреждении гемоглобина, которые требуют замены меньшими незрелыми эритроцитами. Острый стресс вызвал ожидаемое повышение уровня кортизола и глюкозы, но никакого взаимодействия с рационом не было обнаружено. Эти результаты показывают, что замена 60% белка рыбной муки дрожжами может вызвать гемолитическую анемию в радужной форели, что может ограничить включение дрожжей в рационы для выращиваемой рыбы.

Индустрия аквакультуры опирается на рыбную муку и сою в качестве основных источников белка в рационе для выращиваемой рыбы; однако спрос на продовольствие и экологические издержки увеличили потребность в компонентах нечеловеческого интереса (Tacon and Metian 2008, Naylor et al., 2009, FAO 2014). Дрожжи представляют собой белок с одной клеткой (SCP), полученный при ферментации сельскохозяйственных побочных продуктов и используемых в процессах биотоплива, пивоварения и выпечки, но редко используемых в качестве источника белка в пище человека (Ravindra 2000). В исследованиях рыб только несколько исследований заменили соевую и рыбную муку дрожжами, такими как Saccharomyces cerevisiae, в рационах для радужной форели (Oncorhynchus mykiss) (Mahnken et al., 1980; Rumsey et al., 1992; Martin et al., 1993; Hauptman et al., 2014; Sealey et al., 2015). В лучшем случае Hauptman et al. (2014) успешно заменил 38% рыбной муки (11% диеты) на S. cerevisiae, но более высокое включение привело к отрицательным последствиям для увеличения веса и конверсии корма, даже когда потребление корма и содержание белка были равны между рыбной мукой и дрожжами, основанные диеты. Необходимо провести дополнительные исследования, чтобы объяснить причину снижения производительности, когда рыба питается диетами с высоким содержанием дрожжей.

Дрожжи и другие SCP содержат десятикратные более высокие уровни нуклеиновой кислоты, главным образом из РНК, чем компоненты мяса и растений (Kihlberg 1972, Jonas et al., 2001). Высокие количества нуклеиновой кислоты не могут быть безопасно метаболизированы людьми, так как они приводят к высоким уровням мочевой кислоты (гиперурикемия) и подагре (Waslien et al., 1970, Fox 1981). С другой стороны, рыба производит более высокие уровни уриказы, чем другие животные, и считается, что она способна метаболизировать более высокие уровни нуклеиновой кислоты в рационе без отрицательных последствий для здоровья (Kinsella et al., 1985; Rumsey et al., 1991; Andersen et al. 2006). Напротив, De la Higuera et al. (1981) и Санчес-Муниз и др. (1982) обнаружили, что кормление дрожжей, Wickerhamomyces anomalus, на 81% рациона привело к вредным уровням мочевой кислоты почек и гемолитической анемии в радужной форели. Несмотря на способность рыбы деградировать мочевую кислоту, катаболизм мочевой кислоты и ее предшественников генерирует перекись водорода, реактивный кислород, который может повредить эритроциты и клеточные мембраны, если уровни антиоксидантов недостаточны (Jain 1993, Berg et al., 2015). Перекись водорода образует вредные гидроксильные радикалы в присутствии железа или меди, если пероксид водорода не восстанавливается до воды каталазой или глутатионпероксидазой, используя глутатион в качестве субстрата (Buetler et al., 2004). Следовательно, верхний предел включения диетических дрожжей может существовать на основе содержания нуклеиновой кислоты и способности к окислению рыбы.

Помимо негативных эффектов, стенки клеток дрожжей могут быть разрушены из-за тепла и давления во время экструзии корма (Nasseri et al., 2011) и высвобождающих соединений, таких как β-глюканы и маннано-олигосахариды, которые были показаны в предыдущих исследованиях для стимуляции иммунной функции и уменьшить реакцию стресса у рыб, как описано Ringø et al. (2011) и Meena et al. (2013). В этих обзорах сделан вывод о том, что подача рыбы-глюканов и других иммуностимуляторов обычно приводит к увеличению активности респираторных всплесков и макрофагов, лизоцимов и лейкоцитов, которые повышают устойчивость к инфекциям и стрессу. В обзорах также отмечается отсутствие исследований по краткосрочным и гематологическим эффектам этих соединений, особенно когда они получены из интактных дрожжей.

Контуляция дорсальной аорты (DA) была впервые описана Conte et al. (1963) с целью оценки краткосрочных изменений параметров крови и плазмы у рыб. С тех пор было сделано несколько изменений в процедуре канюлирования и процедур сбора крови для снижения стресса и оценки добровольно кормящей рыбы (Soivio et al., 1975; Zohar 1980; Gamperl et al., 1994; Kiessling et al., 1995; Lo et al. 2003; Djordjevic et al., 2012). Например, комбинации обезболивающих средств, канюли, отменяющие швы, сокращение времени операции, улучшение конструкции резервуара и предотвращение вторичных инфекций, улучшили канюлирование DA (Zahl et al., 2012). На основе этих достижений многие исследования позволили пробовать кровь из добровольного кормления атлантического лосося (Salmo salar) и оценить краткосрочные эффекты кормовых ингредиентов и добавок (Hamre et al., 2001; Kiessling et al., 2003; Sunde et al. 2003; Olsen et al., 2005; Kiessling et al., 2006, 2009; Djordjevic et al., 2012). Напротив, большинство исследований с канюлированной радужной форели DA использовали силовое кормление (Ok et al., 2001; Karlsson et al., 2006; Eliason et al., 2010), которые могут усиливать и подавлять метаболические пути (Vijayan et al., 1991; Cooper and Wilson 2008). Следовательно, достижение добровольного питания в DA-канюлированной радужной форели необходимо для оценки краткосрочных эффектов диеты и стресса на физиологию крови.

Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы определить влияние подавления высоких уровней дрожжей в рационе по цельной крови DA-канюлированной радужной форели. Вторая цель заключалась в том, чтобы различать диету и стресс-эффекты кормления дрожжей и индуцировать острый стресс у DA-канюлированной радужной форели.

Эксперимент проводился в Водном фонде Центра ветеринарной медицины и животных в Шведском университете сельскохозяйственных наук (Уппсала, Швеция). Радужная форель была приобретена у коммерческого производителя Vilstena fiskodling AB (Fjärdhundra, Sweden) и поднята группами в 200-овальных баках. Группы периодически уменьшались до одной рыбы на один танк, который весил 849 ± 199 г (среднее ± SD). Каждый танк был оснащен частичным оттенком (80 × 20 см), светом СИД и потоком воды со скоростью приблизительно 5 л мин-1 (показан на рисунке 1). Сочетание оттенка, света и воды положило рыбу добровольно рядом с портом для сбора (диаметр 5 см), что давало возможность беспрепятственного отбора проб. Система танков была протекающей и снабжалась муниципальной пресной водой, которая анализировалась на растворенный кислород (10,4 ± 0,7 мг L-1), температуру (14,7 ± 0,2 ° C) и рН (8,09 ± 0,05) еженедельно. Рыбы были акклиматизированы до 14:10 световых циклов (загорается в 08:00), чтобы собрать 0- и 12-часовые образцы и кормили коммерческую диету как минимум на 5 дней после операции до начала испытание. Настоящее исследование проводилось в соответствии с законами и положениями об использовании животных в исследовательских целях в Швеции, которое контролируется Шведским советом по сельскому хозяйству (см. Ссылку на разрешение C74-14). 1Иллюстрация конструкции резервуара, в которой положение света, тени и выхода воды направлено дорсальной аортально-канюлированной радужной форели, прилегающей к отверстию для отбора проб для беспрепятственного сбора крови

Канюляцию DA проводили согласно Soivio et al. (1975), с изменениями, разработанными Kiessling et al. (1995), (2003) и Djordjevic et al. (2012). Короче говоря, каждая рыба была седатирована 1 мг L-1 метомидатом (Aquacalm, Western Chemical Inc., Ferndale, США) в соответствии с Kreiberg and Powell (1991), помещалась в газированную ванну и обезболивалась с использованием 80 мг L-1 трикаина сульфонат (MS222, Finquel, Scan Aqua AS, Årnes, Norway), забуференный бикарбонатом натрия для предотвращения изменения рН. Анестезированную рыбу переносили в хирургическую ванну, которая рециркулировала 60 мг L-1 забуференного MS222 над жабрами рыбы для поддержания анестезии. Местные анестетики 0,1 мл лидокаина с адреналином (20 мг мл-1, Xylocaine®, AstraZeneca, Södertälje, Швеция) вводили в проксимальную крышу рта на участке разреза на морду и 0,1 мл лидокаина без адреналина (5 мкг мл- 1, Haukeland Sykehusapotek, Bergen, Norway) вводили в дистальную крышу вблизи участка разреза дорсальной аорты. Отверстие было проколото через рыло стерильной иглой, чтобы вставить 4-сантиметровый кусок из 180 полиэтиленовых (полиэтиленовых) труб, чтобы выступать в качестве пробки. 100-см кусок из 90 труб из полиэтилена был нагрет, чтобы сделать колбу на расстоянии 5 см от конца, чтобы предотвратить смещение канюли. Кончик был сужен и вырезаны две микроскопические отверстия, чтобы предотвратить засорение канюли. Канюлю гепаринизировали с помощью 150 МЕ Na-гепарина (LEO Pharma AS, Ballerup, Дания) в физиологическом растворе (0,9% NaCl), а затем вставляли в DA рыбы через направляющий провод после выполнения разреза между первым и вторым набором жаберные дуги. Канюлю протаскивали через большую трубку, предварительно вставленную в морду, инъецированную гепарин-солевым раствором, и конец был герметичным. 80-сантиметровая трубка из 180 полиэтиленовых труб была добавлена ​​к наружной оболочке канюли, чтобы предотвратить повреждение укусов рыбы. Каждая рыба взвешивалась после хирургической процедуры и возвращалась в резервуар после мягкого распространения слизи из нетронутой кожи в любые пораженные участки рыбы, чтобы снизить риск заражения. Каждая рыба аккуратно направлялась вокруг резервуара, чтобы увеличить расход воды над жабрами и сократить время восстановления. Все рыбы возобновлялись в течение нескольких часов после операции.

В общей сложности 15 DA-канюлированных рыб получали контрольную диету из 30% рыбной муки (FM) и две тестовые диеты дрожжей: S. cerevisiae (SC) или смесь 70:30 W. anomalus и S. cerevisiae (WA) , В диетах SC и WA 60% белка рыбной муки было заменено дрожжевым белком для достижения 380 г кг-1 усваиваемого белка (сухое вещество, DM) на основе 95 и 86% коэффициентов усвояемости для рыбной муки и дрожжей (NRC 2011; Langeland et al., 2016; Vidaković, 2015). Диеты были произведены экструзией в Институте природных ресурсов Финляндии (Лаукаа, Финляндия) с двухшнековым экструдером (3 мм штамп, модель BC-45, Clextral, Creusot Loir, Франция). Экструдированные гранулы сушили на воздухе в течение ночи при 60 ° С, а затем распыляли липидами с использованием вакуумного устройства для нанесения покрытия (Pegasus PG-10VC, Dinnissen, Sevenum, Netherlands). Для диеты и приблизительной композиции см. Таблицу 1. Таблица 1Композиция диеты для контроля за рыбной мукой (FM), диета с 60% рыбной муки, замененная дрожжами Saccharomyces cerevisiae (SC), и диета с 60% рыбной муки, замененная Wickerhamomyces аномалии и S. cerevisiae дрожжи (WA)

Изменено от Видаковича (2015)

aLow-temperature сушеная исландская мойва (Rasioagro Ltd, Расио, Финляндия); 90% сухого вещества; 710 г сырого белка кг-1; 117 г кг-1 сырого липида; 80 г кг-1 золы

сушеная дрожжевая мука (Jästerbolaget AB, Уппсала, Швеция); 94% сухого вещества; 435 г сырого белка кг-1; 9 г кг-1 сырого липида; 58 г кг-1 золы; 78 г нуклеиновых кислот 1 кг-1

сушеная дрожжевая мука с 70:30 W. anomalus S. cerevisiae (Jästerbolaget AB, Уппсала, Швеция); 93% сухого вещества; 391 г сырого белка кг-1; 8 г сырого липида кг-1; 65 г кг-1 золы; 76 г нуклеиновых кислот 1 кг-1

dDiets сбалансированы на содержание перевариваемого белка в 390 г кг-1

Каждая диета анализировалась на сырой протеин (% N × 6,25) с использованием варочного котла Kjeltec 2020 и 2400 анализатора (FOSS Analytical A / S, Hilleröd, Дания) в соответствии с методом Kjeldahl (Nordic Committee on Food Analysis, 1976), сырых липидов с использованием Экстрактор Soxtec HT 1043 (FOSS Analytical A / S, Hilleröd, Дания) без кислотного гидролиза согласно производителю (ANKOM Technology, Македон, Нью-Йорк, США), валовая энергия с использованием изопериболического калориметра Parr 6300 (Parr Instrument Company, Moline, IL, США) и питательного моющего средства в соответствии с методом нейтральной моющей реакции амилазы (Mertens 2002). Диеты и тестовые ингредиенты анализировали на золу с использованием печи для сжигания при 550 ° C в течение 3 часов и буферной способностью путем титрования 1 г 0,1 М молочной кислотой до тех пор, пока рН не стабилизировался при 4,0 в течение 10 мин (McDonald Henderson 1962). Ингредиенты дрожжей анализировали на общую нуклеиновую кислоту (TNA) с использованием ультразвука при 20 Вт-2 в течение 3 мин в 0,5 н. Хлорной кислоте и измеряли поглощение при 260 нм (TNA = OD260 нм × 45,5) (Zachleder, 1984).

Пять рыб на диету получали 1% массы тела (BW) с помощью автоматических ленточных питателей (Hølland teknologi, Sandnes, Norway) один раз в день (т.е. с 10:00 до 11:00) в рандомизированном, перекрестном дизайне 3 × 3 в течение 3 недель. Кормовые отходы из каждого резервуара собирались непрерывно с использованием ленточных коллекторов (Hølland teknologi, Sandnes, Norway), взвешивались ежедневно и собирались еженедельно. Отходы корма и корма анализировали на содержание DM после сушки при температуре 103 ° C в течение 16 часов, а затем использовали для расчета потребления корма: (Feed Feed DM — (Feed Feed Waste DM / Recovery)) / Feed DM, где восстановление представляет собой процент подачи восстановлено после сбора, согласно Helland et al. (1996). Образцы крови из рыбы с потреблением корма менее 0,2% днем ​​1 дня BW считались нерепрезентативными и отклонялись.

Образцы крови брали из канюли каждой рыбы в 0 (30-60 мин до кормления), 3, 6, 12 и 24 ч после кормления на 7-й день каждой недели. Короче говоря, свободно плавающая канюля была осторожно проведена через порт сбора на стороне резервуара с помощью тонкого крючка. Канюлю разрезали, и физиологический раствор и первый 0,1 мл крови отбрасывали. Используя новый гепаринизированный шприц, из канюли отводили 0,35 мл крови, а затем заменяли физиологическим раствором, содержащим 150 МЕ Na-гепарин, перед термоуплотнением и возвращением канюли в резервуар. После анализа цельной крови (ниже) образцы сразу центрифугировали при 500 г в течение 3 мин, а плазму переносили в криотрубки, хранили при -20 ° С и затем переносили в морозильник -80 ° С.

Чтобы протестировать взаимодействие диеты и стресса, образцы крови собирали у рыбы, которую кормили в течение четвертой недели на той же диете, что и на третьей неделе, а затем подвергались воздействию острого стрессора. Рыбу удаляли из воды, держали в сети около бака в течение 1 мин, а затем возвращали. Наблюдалось поведение рыбного плавания и показывалось, что регургитация питательных веществ была незначительной, так как напряжение было вызвано через 30 мин после кормления, чтобы свести к минимуму рвоту (то есть в 11:30). Первый образец, собранный после сетки, происходил через 3 часа после прыжка или 30 минут после стресса (т. Е. 12:00).

Для определения влияния на электролиты и газы крови кровь вводили в кассеты EC8 +, вставленные в портативный анализатор i-STAT (i-STAT Corporation, East Windsor, NJ, USA), в котором измерялись натрий (Na), калий (K), глюкоза, pH, частичный углекислый газ (PCO2), общий углекислый газ (TCO2), бикарбонат (HCO3), избыток основания (BE) и гемоглобин (Hb). Предыдущие исследования подтвердили анализ i-STAT против обычных методологий для разных видов рыб (Harrenstien et al., 2005; Harter et al., 2014).

Для определения эффектов на эритроциты микрокапиллярные трубки крови центрифугировали при 12000 г в течение 5 мин, а уровни гематокрита (Hct) и лейкократа (Lct) измеряли с использованием линейных и микроскопических линей. Красные кровяные клетки (РБК) подсчитывали с увеличением 400 × в пяти квадратах 1 мм2 в гемоцитометре Бюркера (Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG, Сондхайм, Германия) после разбавления 1:20 раствором турка (Stoskopf 1993). Площадь эритроцитов измеряли из мазков крови, которые фиксировали и окрашивали метанолом и Giemsa (Vázquez and Guerrero 2007). Четыре изображения с увеличением 400 × были взяты с периферии мазка, а 10 случайных эритроцитов были автоматически измерены с использованием программного обеспечения NIS Elements Basic Research (Nikon Instruments Europe BV, Amsterdam, Netherlands). Наконец, показатели эритроцитов были рассчитаны на основе среднего объемного объема (MCV = Hct / RBC × 10), среднего корпускулярного гемоглобина (MCH = Hb / RBC × 10) и средней концентрации корпускулярного гемоглобина (MCHC = Hb / Hct × 100) (Stoskopf 1993 ).

В качестве индикатора стресса кортизол анализировали из плазмы с использованием 96-луночных мультивидовых наборов ELISA (DetectX ©, Arbor Assays, Ann Arbor, MI, USA) в 1:25 и разведениях 1: 100 с помощью буфера для анализа для безударного и стрессового рыба. Десять образцов плазмы из безударных и напряженных образцов были перекрестно указаны между методами ELISA и RIA для кортизола и получены ковариации 8,6 ± 2,6% (среднее ± SE).

Данные анализировались с использованием моделей линейных смешанных эффектов (Bates et al., 2015) с программным обеспечением R® версии 3.2.2 (R-Core-Team 2015). Исправленными эффектами, включенными в модели, были диета, время выборки, потребление корма (% BW day-1) и вес рыбы, которые были определены с использованием ANOVA. Кроме того, в модели были включены следующие термины: случайные эффекты рыбы и недели для учета индивидуальных изменений, взаимодействия между рационом питания и часами с учетом ежечасного изменения параметров крови и корреляции между часами и рыбой-неделями для учета повторная выборка. Чтобы определить эффекты диетического стресса, безударную рыбу с 3-й недели сравнивали с напряженной рыбой с 4-й недели, питавшейся той же диетой. Значительные эффекты диеты и стресса были определены с использованием пост-теста Leest Square Means (Lenth 2014) с корректировкой Tukey для парных сравнений. Различия между буферной способностью и зольностью определяли с использованием парного t-теста Стьюдента. Стандартизованные остатки всех моделей были проверены на нормальность по нормальным вероятностным графикам, p <0,05 считалось статистически значимым, а p <0,15 считалось тенденцией.

Через 4 недели рыба достигла среднего прироста массы 161 ± 107 г или 19 ± 12% (среднее ± SD), а рыбы, питаемые диетами FM, SC и WA, достигли аналогичных средних значений приема 0,84 ± 0,22, 0,89 ± 0,23 и 0,81 ± 0,24% BW день-1 (p = 0,589). Для рыб с кормовыми потребностями менее 0,2% BW день-1, 14 из 60 образцов крови были исключены из анализа. Смерти не было; однако пять рыб были заменены из-за нефункционирующих канюлей.

Уровни pH, TCO2, HCO3 и BE значительно увеличились у рыб, которым кормили диеты на основе дрожжей, по сравнению с рыбами, питавшими диету FM (таблица 2, рис.2). Самые высокие измеренные уровни pH, TCO2, HCO3 и BE имели место в первом послепрандиальном образце (3 часа), тогда как уровни Na ​​и PCO2 не изменялись значительно с течением времени. Глюкоза и К показали различные профили после приема пищи между диетами, так как наивысшие значения были в 6 и 0 ч (постоянно уменьшались) для рыб, питавшихся диетой FM, тогда как наивысшие значения были позже (т.е. 12 и 3 ч) для СК и WA диеты. Рыба, питающаяся диетами на основе дрожжей, показала тенденцию к увеличению K по сравнению с рыбой, питавшейся диетой FM. Кислотное титрование и озоление тестируемых ингредиентов показало, что буферная способность и зольность рыбной муки были, по крайней мере, в два раза выше, чем у обеих дрожжей (рис.3). Таблица 2Электролит и значения газа (среднее ± SE) в крови, взятой из радужной форели до и после кормления диет, содержащих рыбную муку (FM; n = 12), дрожжи Saccharomyces cerevisiae (SC; n = 9) или дрожжи Wickerhamomyces anomalus и S. cerevisiae (WA; n = 13)

Na, K калий, pCO
2 частичного двуокиси углерода, ТСО
2 общего диоксида углерода, HCO
3 бикарбонат, избыток БА

Значения в переменных и диете, за которыми следуют различные строчные буквы, значительно различаются (p <0,05)

б
P для каждой средней величины либо диеты SC или WA, по сравнению с диетой FM, основанной на линейных моделях смешанных эффектов, которые включали диету, время, потребление корма и вес как фиксированные эффекты и рыбу и неделю как случайные эффекты

Пост-прандиальные значения цельной крови (среднее ± SE) значения эритроцитов pH и b (RBC) в рационе с питанием радужной форели, содержащей рыбную муку (FM, заполненный алмаз), дрожжи Saccharomyces cerevisiae (SC, заполненный квадрат) и Wickerhamomyces anomalus и дрожжи S. cerevisiae (WA, заполненный треугольник). Значения в рационе, за которыми следуют различные строчные буквы, значительно различаются (p <0,05)

Буферирующая способность (светло-серый) и зольность (темно-серый) на основе кг-1 DM рыбной муки, ингредиенты дрожжей Saccharomyces cerevisiae (SC) и Wickerhamomyces anomalus и S. cerevisiae (WA). Значения для каждого параметра, за которыми следуют разные строчные буквы, значительно различаются (p <0,05)

Уровни Hct, Lct, RBC и Hb не были существенно различны между диетами и достигли наименьших значений через 12 или 24 ч после прандия (таблица 3). Не было обнаружено различий в показателях эритроцитов, за исключением уровней MCH между рыбами, питавшими диету FM и WA, в то время как наблюдалась тенденция к увеличению рыбы, питавшейся диетами SC и FM (таблица 3, рис.2). Размер эритроцитов существенно не различался между всеми диетами, хотя площадь значительно уменьшилась между 0 и 12 ч пробами у рыб, кормивших диету WA (таблица 3). Табличная 3Haematology, показатели эритроцитов и значения гормонов (среднее ± SE) в крови, взятой из радужной форели до и после кормления диет, содержащих рыбную муку (FM; n = 12), дрожжи Saccharomyces cerevisiae (SC; n = 9) или дрожжи Wickerhamomyces anomalus и S. cerevisiae (WA; n = 13)

Hct гематокрит, лейкоцит Lct, гемоглобин Hb, эритроциты эритроцитов RBC, средний объем тела MCV, MCH, средний корпускулярный гемоглобин, MCHC средняя концентрация корпускулярного гемоглобина

Значения в переменных и диете, за которыми следуют различные строчные буквы, значительно различаются (p <0,05)

б
P для каждой средней величины либо диеты SC или WA, по сравнению с диетой FM, основанной на линейных моделях смешанных эффектов, которые включали диету, время, потребление корма и вес как фиксированные эффекты и рыбу и неделю как случайные эффекты

Параметры цельной крови и концентрация кортизола в плазме не показали существенных различий между стрессовой рыбью, питавшейся FM и диетами дрожжей, и поэтому значения от рыбы, питавшейся всеми тремя диетами, были объединены для сравнения стрессовой и неактивной рыбы. В отличие от безударной рыбы уровни рН, ТСО2, НСО3 и БЭ значительно снижались у стрессовых рыб, причем самые низкие уровни наблюдались через 0,5 ч после стресса (табл. 4). Кроме того, Hct и Lct были самыми высокими в течение 3,5 ч после стресса, тогда как последовательное снижение с течением времени наблюдалось у безударных рыб. Наконец, значительное увеличение кортизола и глюкозы произошло через 0,5 и 3,5 часа после стресса, при этом концентрация кортизола увеличивалась более чем в 20 раз (рис.5) .Таблица 4Вольная кровь и значения кортизола плазмы (среднее ± SE) в радужной форели, отобранной до и после воздействия на 1-минутный стягивающий стресс (пустые диеты, n = 12)

Hct гематокрит, лейкоцит Lct, TCO
2 общего диоксида углерода, HCO
3 бикарбонат, избыток БА

Значения внутри переменной, за которой следуют различные строчные буквы, значительно различаются (p <0,05)

б
P для каждой средней величины либо диеты SC или WA, по сравнению с диетой FM, основанной на линейных моделях смешанных эффектов, которые включали диету, время, потребление корма и вес как фиксированные эффекты и рыбу и неделю как случайные эффекты

Значительно повышенные уровни рН крови, ТСО2, HCO3 и BE у рыб, кормящих диеты SC и WA (таблица 2), показали, что диеты дрожжей индуцируют более высокие щелочные приливы, чем диета FM. Алкалиновый прилив вызван оттоком HCO3 в кровь, чтобы предотвратить подщелачивание париетальных клеток после секреции HCl в просвете желудка во время пищеварения (Niv and Fraser 2002). Bucking and Wood (2008) и Cooper and Wilson (2008) обнаружили аналогичное повышение pH, HCO3 и BE в DA-канюлированной диете с питанием радужной форели на основе рыбной муки и предположили, что высокая буферная способность рыбной муки влияет на щелочной поток. Показано, что рыбная мука обладает одной из самых высоких буферных способностей среди кормов, и эта характеристика коррелирует с высоким содержанием катионов и золы (Jasaitis et al., 1987; Lević et al., 2005; Montañez-Valdez et al., 2013). Настоящее исследование подтвердило, что рыбная мука имела более чем двукратный более высокий уровень золы и буферной способности по сравнению с обоими ингредиентами дрожжей (рис.3). Показано, что более низкая буферная способность оказывает благотворное влияние на белковый обмен и кишечную микробиоту из-за повышенного рН желудка (Eckel et al., 1992; Gabert and Sauer, 1994). Исследование, проведенное нашей исследовательской группой по поводу вызванных дрожжами изменений рН кишечника и микробиоты, продолжается.

Рыба, кормившая диету WA, имела значительно меньшие эритроциты между 0 и 12 ч после кормления (таблица 3), что свидетельствует о гемолитической анемии (Jain 1993). У рыб повреждение эритроцитов приводит к увеличению производства и замещению небольшими незрелыми эритроцитами для компенсации потерь в переносе кислорода (Stoskopf 1993; Clauss et al., 2008; Hrubec and Smith 2010). Sanchez-Muniz et al. (1982) обнаружили, что рацион с радужной форелью, содержащий 81% W. anomalus, уменьшал размер эритроцитов и снижал активность пероксидазы по сравнению с рыбой, питавшейся диетой на основе рыбной муки. Показано, что в рыбе и других моногастриках катаболизм высоких уровней пуриновых нуклеотидов, таких как окисление ксантина и мочевой кислоты, приводит к высоким уровням перекиси водорода, которые приводят к повреждению эритроцитов (Clifford and Story 1976, Goldenberg 1977, Bontemps et al. 1986, Rumsey et al., 1992, Berg et al., 2015). Глутатион и глутатионпероксидаза ответственны за уменьшение токсических эффектов перекиси водорода, но если концентрация глутатиона и / или активность пероксидазы недостаточна, что может привести к окислению гемоглобина до метагемоглобина, образованию Хайнца и возможному гемолизу (Mills and Randall 1958; Berg et al., 2015) (см. рисунок 4). В дополнение к недостаткам в глутатионе недостатки NADPH или других компонентов пентозофосфатного пути, необходимые для поддержания уровня глутатиона, могут привести к снижению защиты гемоглобина (Mills and Randall 1958, Berg et al., 2015). Таким образом, гемолиз, наблюдаемый в диетах, питающихся рыбой в настоящем исследовании, показывает, что уровень пуриновых нуклеотидов был слишком высоким, чтобы безопасно метаболизировать радужную форель (рис.4). Рисунок 4 Упрощенная диаграмма катаболизма пуриновых нуклеотидов у рыб, приводящая к получению перекиси водорода (H2O2), которая может быть: (1) восстановлена ​​до H2O глутатионпероксидазой при условии достаточного отношения глутатиона SH: SS, поддерживаемого пентозофосфатным путем, или (2 ), используемые для окисления гемоглобина до молекул метагемоглобина, которые связываются с образованием тел Хайнца, модифицированных из Sanchez-Muniz et al. (1982) и Berg et al. (2015)

Гемолитическая анемия может оказывать долгосрочное воздействие на физиологию, такую ​​как хроническая усталость, из-за недостаточного переноса кислорода и повышенного эритропоэза (Jain 1993). Эффекты анемии могут объяснить снижение роста рыбы, наблюдаемое в предыдущих исследованиях, в результате которых кормление дрожжей радужной форели, в которой было заменено более 40% рыбной муки (30% от рациона) (Rumsey et al., 1991; Hauptman et al., 2014; Vidaković 2015 ). Rumsey et al. (1992) показали, что диеты, содержащие до 4,1% дрожжевой нуклеиновой кислоты (включение 50% дрожжей), не уменьшали рост рыбы, но диеты, содержащие 1,5% аденозина, пуриновый нуклеотид, приводили к уменьшению роста радужной форели. В настоящем исследовании дрожжевые ингредиенты S. cerevisiae и W. anomalus mix вносили 2,5 и 2,3% нуклеиновой кислоты в диеты SC и WA (таблица 1), но уровень аденозина не определялся. Интересно отметить, что повышение уровня щелочности и снижение уровня глюкозы в крови, как было показано, увеличивает катаболизм пуриновых нуклеотидов in vitro (Bontemps et al., 1986; Van den Berghe et al., 1988), в то время как оба условия встречаются в диетах, питающихся рыбой, в настоящем исследовании и свидетельствуют о том, что токсические эффекты пуринового катаболизма, возможно, были увеличены. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования для установления корреляции и ограничения между уровнями диетических производных пуриновых нуклеотидов дрожжей с гемолизом и уменьшением роста радужной форели.

В дополнение к размеру эритроцитов наблюдалось значительное увеличение уровней МЧК, показателя гиперхромной анемии (Stoskopf 1993), у рыб, кормивших диету WA, и тенденция к увеличению рыбы, питавшейся диетой SC (таблица 3). Напротив, Sanchez-Muniz et al. (1979) обнаружили снижение уровня MCH у рыб, которым кормили диету W. anomalus, что указывает на гипохромную анемию. Однако окисление гемоглобина до метагемоглобина и последующее образование тел Хайнца могут приводить к ошибочным возвышениям в значениях MCH и MCHC (Jain 1993). По сравнению с предыдущими исследованиями (Miller et al., 1983; Řehulka et al., 2004) значения MCH и MCHC в настоящем исследовании были равны или выше 99-го процентиля для радужной форели (таблица 3). Тем не менее, метод i-STAT для определения гемоглобина и большая рыба, используемые в настоящем исследовании, могут иметь увеличенные значения MCH и MCHC, несмотря на разницу между диетами. Микроцитарная анемия обычно не связана с гиперхромными состояниями, поскольку более мелкие незрелые эритроциты не должны содержать более высокие уровни гемоглобина (Jain 1993). Более высокое включение дрожжей в диету WA, чем в диете SC (таблица 1), возможно, увеличило эффект гемолиза на рыбе, хотя незначительное уменьшение размера эритроцитов и тенденция к увеличению MCH у рыб, кормивших диету SC ( Таблица 3) предполагают, что диета SC приводила к гемолизу в меньшей степени. Поэтому более высокие уровни МЧК в настоящем исследовании, возможно, были искусственно увеличены за счет образования тел Хайнца из-за гемолиза.

Рыбы показали значительно повышенный уровень кортизола и глюкозы между 0,5 и 9,5 ч после стресса (рис.5), но между рационами не было обнаружено различий. Высоты в кортизоле и глюкозе используются в качестве первичных и вторичных показателей стресса у рыб (Barton and Iwama 1991). У безударных рыб уровень кортизола в плазме значительно повышался в течение 12 часов после приема пищи для всех диет (таблица 3), что можно объяснить суточным циклом на основе суточного ритма, как показано ранее (Holloway et al., 1994; Reddy and Leatherland 2003 ). Увеличение Hct и Lct также использовалось в качестве вторичных показателей стресса в исследованиях рыб (Anderson 1990; Barton and Iwama 1991). В настоящем исследовании уровни Hct значительно повышались через 0,5 часа после стресса, а затем уровни Hct и Lct постоянно снижались, как у безударной рыбы (табл. 3 и 4). Небольшое увеличение Hct может быть отражением стрессора низкой интенсивности, в то время как непрерывные сокращения Hct и Lct для безударной рыбы были обнаружены в предыдущих исследованиях, что объясняет уменьшение гемодилюции как эффекта повторного отбора крови (Soivio et al., 1972) , 1975, Bry and Zohar 1980, Deng et al., 2000). В отличие от Hct уровни рН и HCO3 значительно снижались сразу после стресса (таблица 4). Это согласуется с результатами предыдущих исследований, которые объясняют снижение до повышенной жаберной вентиляции и анаэробных процессов (Jones and Randall 1979, Turner et al., 1983). Наконец, эффекты дрожжевых диет не наблюдались на цельной крови и параметрах кортизола рыб, хотя необходимо провести дополнительные исследования на экстрагированных дрожжевых соединениях, например. бета-глюканы. Поэтому диеты на основе дрожжей не уменьшали острого стрессового ответа рыб, но, с другой стороны, эти новые источники белка не вызывали дополнительного стресса.

Постиндустриальные значения цельной крови (среднее ± SE) глюкозы и b кортизола в безударном (заполненном квадрате) и подчеркнутой (наполненной алмазом) радужной форели. Значения для безударной или напряженной рыбы, за которой следуют различные строчные буквы, значительно различаются (p <0,05)

Насколько нам известно, это исследование было первым, кто изучил влияние диеты на параметры цельной крови и кортизола в DA-канюлированной радужной форели после добровольного питания. В отличие от предыдущих исследований (Ok et al., 2001; Karlsson et al., 2006; Eliason et al., 2010), в настоящем исследовании избегали принудительного кормления, чтобы отрицать эффекты стресса на физиологию рыб и диетический обмен (Vijayan et al. 1991). Например, Cooper and Wilson (2008) обнаружили, что рН крови и HCO3 были в два раза выше у радужной форели после принудительного кормления, чем после добровольного кормления. Успех в достижении добровольного питания в настоящем исследовании может быть связан с несколькими месяцами акклиматизации резервуаров с постепенным уменьшением плотности рыбного запаса, хотя это не было проверено. Устраняя стресс от силового кормления, это исследование может обеспечить более реалистичный сценарий постпрандиальной цельной крови и параметров кортизола в радужной форели.

Замена 60% рыбной муки на перевариваемой белковой основе с помощью S. cerevisiae и W. anomalus mix значительно повлияла на параметры цельной крови у радужной форели, но после контакта с острым стрессором не было никакого взаимодействия между рационом и стрессом. После кормления диеты дрожжей индуцировали более высокие щелочные приливы в рыбе из-за более низкого содержания зольной кислоты и, следовательно, более низкую буферную способность ингредиентов дрожжей по сравнению с рыбной мукой. Кроме того, дрожжевые диеты вызывали гемолитическую анемию, что приводило к меньшим эритроцитам и искусственным возвышениям в MCH, особенно для рыб, кормивших диету WA. Эти результаты подтверждают предыдущие предположения, что катаболизм высоких уровней нуклеиновых кислот вызывает реактивные виды кислорода, которые могут подавлять антиокислительные пути и повреждать эритроциты. В целом, это исследование показало, что замена рыбной муки дрожжами в рационах радужной форели уменьшает буферную способность корма и индуцированную гемолитическую анемию. Уменьшенная буферная способность может быть полезной для метаболизма корма, но содержание нуклеиновой кислоты может ограничивать уровень включения дрожжей в диеты рыб. Редукции нуклеиновых кислот, в частности пуриновых нуклеотидов, могут смягчить эффекты анемии в диетах с питанием радужной форели с 60% заменой рыбной муки дрожжами, хотя для подтверждения этого необходимы дополнительные исследования.

Финансирование этого исследования было предоставлено FORMAS (Шведским исследовательским советом по окружающей среде, сельскохозяйственным наукам и территориальному планированию, № 223-2013-297) и финансированием стипендий из грантов, проведенных профессором Риком Моччией, Университет Гвельфа, Канада. Авторы выражают особую благодарность Рику Моксии, Джуни Вилме, Стефану Эрну, Анне-Грете Хаглунду и Бёрджу Эриксону за их помощь и дискуссии, а также за Jästbolaget® за вклад в тестовые ингредиенты.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *