Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Липид-свободный аполипопротеин A-I снижает прогрессирование атеросклероза за счет мобилизации холестерина микродомена и ослабления количества клеток, выражающих CD131: мониторинг гомеостаза холестерина с использованием сотового эфира и общего соотношения холестерина

Lipid‐Free Apolipoprotein A‐I Reduces Progression of Atherosclerosis by Mobilizing Microdomain Cholesterol and Attenuating the Number of CD131 Expressing Cells: Monitoring Cholesterol Homeostasis Using the Cellular Ester to Total Cholesterol Ratio
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5210328/

Атеросклероз — хроническое воспалительное заболевание, развитие которого обратно коррелирует с концентрацией липопротеинов высокой плотности. Текущая терапия включает фармацевтические препараты, которые значительно повышают концентрацию холестерина в липопротеине высокой плотности плазмы. Наши исследования проводились для исследования влияния низкодозного липидного аполипопротеина A-I (apoA-I) на хроническое воспаление. Цель этих исследований заключалась в том, чтобы определить, как подкожно вводимый липид-свободный apoA-I уменьшает накопление липидных и иммунных клеток в корне аорты гиперхолестеринемических мышей без постоянных возвышений в концентрациях холестерина липопротеинов высокой плотности плазмы.

LDLr
— / — и Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышей кормили западной диетой в общей сложности 12 недель. Через 6 недель подмножество мышей из каждой группы получало подкожные инъекции 200 мкг липидоподобного человека apoA-I 3 раза в неделю, тогда как другое подмножество получало 200 мкг альбумина в качестве контроля. У мышей, получавших липид-свободный apoA-I, наблюдалось снижение отложения холестерина и удержания иммунных клеток в корне аорты по сравнению с мышами, обработанными альбумином, независимо от генотипа. Это снижение атеросклероза, по-видимому, напрямую связано с уменьшением количества клеток, экспрессирующих CD131, и этерифицированного холестерина до общего содержания холестерина в нескольких отделениях иммунных клеток. Кроме того, обработка apoA-I изменяет микродоменную композицию холестерина, которая смещает CD131, общую β-субъединицу рецептора интерлейкина-3, от липидного плота до нетранфальных фракций плазматической мембраны.

Лечение ApoA-I уменьшало накопление липидов и иммунных клеток в корне аорты путем системного снижения содержания холестерина в микродоменах в иммунных клетках. Эти данные свидетельствуют о том, что без апоптоза липидов apoA-I опосредует благоприятные эффекты за счет ослабления содержания холестерина липидного плода иммунной клетки, что влияет на многочисленные типы путей передачи сигналов, которые полагаются на целостность микродоменов для сборки и активации.

Атеросклероз — хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся накоплением холестерина в иммунных клетках, расположенных в стенке артерии. Несколько десятилетий наблюдательных исследований показали, что концентрация холестерина липопротеинов высокой плотности плазмы (HDL) (HDL-C) обратно связана с риском инфаркта миокарда (ИМ) 1, стимулируя убеждение, что фармакотерапия, направленная на повышение концентрации HDL в плазме, может предотвратить или уменьшить частоту ИМ.2 В последнее время исследование с использованием менделевских рандомизационных анализов показало, что генетическая оценка, полученная из 14 вариантов, которые, как известно, изменяют концентрацию ЛПВП, не выявила статистической связи с ИМ.3. Это исследование ставит под сомнение установленный взгляд на плазменный ЛПВП -C в качестве биомаркера, так как было безоговорочно принято, что повышение концентрации в плазме будет напрямую переходить на снижение показателей ИМ. Хотя это исследование подчеркивает потенциальные ограничения использования концентрации HDL-C в плазме в качестве суррогатной меры для риска ИМ, его собственные ограничения включают подходящие генетические варианты, достоверный генотип для оценок заболеваний и возможность плейотропного воздействия интересующих генетических вариантов. Сочетание этого исследования с многочисленными сообщениями, в которых описывается общее отсутствие эффективности препаратов, которые повышают уровень ЛПВП путем ингибирования движения холестерилового эфира (СЕ) из HDL4, способствовало появлению ряда новых идей для объяснения защитных свойств ЛПВП. Эти концепции основаны на гипотезе о том, что не все частицы, содержащие плазменный HDL, создаются равными, а также то, что общая концентрация HDL-C во всех случаях отражает число частиц HDL.5, 6, 7, 8. Для решения этих концепций термин HDL частица заменила концентрацию HDL-C. Со временем эти идеи будут тщательно протестированы и оценены, чтобы определить, обеспечивают ли они более надежный биомаркер для прогнозирования риска MI9, 10, 11, 12, 13, чем концентрации плазменных HDL-C.

Функциональность HDL легко следует из недавних исследований, показывающих, что HDL плазмы может стимулировать удаление холестерина в клетках и называется пропускной способностью холестерина. Эти исследования показывают, что плазменный HDL человека стимулирует удаление холестерина из клеток и что скорость удаления является лучшей прогностической мерой риска ИМ, чем общая концентрация HDL-C.14, 15, 16, 17 Поскольку большинство (≈98%) Частицы HDL в плазме обогащены холестерином, не совсем ясно, какая фракция (и) отвечает за вытеснение холестерина из стенок артерий. Большинство исследований показывают, что ABCA1 наиболее эффективно выводит холестерин в белок или липид-бедный аполипопротеин A-I (apoA-I); однако только ≈2% плазменного HDL можно считать липид-белым, 18, 19, оставляя менее адекватное объяснение того, как apoA-I, липид-бедный, образуется на стенке артерии. Возможно, что, поскольку плазменные частицы HDL очень гетерогенны, они участвуют в динамических процессах и реконструируются на стенке артерии.13, 20, 21, 22, 23 Известно, что различные молекулы, переносимые плазменным HDL, влияют на развитие атеросклероз и холестерин, несомненно, один, если не самый важный. Таким образом, когда частицы ЛПВП являются функциональными, они удаляют избыточный артериальный холестерин, который в конечном итоге переносится в печень для экскреции, завершая обратный путь переноса холестерина. Реверсивный перенос холестерина в значительной степени зависит от уникальных свойств apoA-I, основного белкового компонента плазменного HDL. ApoA-I широко изучен и, как известно, обладает структурными свойствами, которые позволяют ему эффективно упаковывать большие количества холестерина24, 25 через его взаимодействие с ABCA126, 27 на поверхности клетки.

Был предпринят ряд различных подходов на обеих моделях животных, а у людей — применение apoA-I в качестве терапевтического агента. Эти исследования направлены на снижение накопления артериального холестерина путем вливания гомологичного HDL28 или липидного HDL 29, в то время как в большинстве исследований основное внимание уделялось введению рекомбинантного HDL, стабильного комплекса фосфолипидов и apoA-I.30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 В целом, HDL-направленная терапия представляется многообещающей, но она продолжает полагаться на концепцию, согласно которой повышение концентрации HDL в плазме согласуется с эффективностью, несмотря на осложнения, возникающие в результате инфузии больших количеств фосфолипида, восстановленного с apoA-I.40

В предыдущих исследованиях нашей лаборатории основное внимание было уделено применению липидоподобного человеческого apoA-I для отмены аутоиммуноподобного фенотипа, который развивается в рецепторе липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) с диетическим питанием, apoA-I (Ldlr
— / —
апоА-I
— / -) двойные нокаутные мыши.41, 42, 43, 44, 45 В этих условиях концентрации плазменного HDL-C не были заметно увеличены после инъекции, но значительное снижение избыточного клеточного холестерина, а также значительные изменения в регуляторной T- число клеток было зарегистрировано.42, 44 В текущих исследованиях мы попытались изучить механистическую основу, объясняющую кажущиеся защитные эффекты подкожно вводимого лечения с низкой дозой apoA-I без увеличения концентрации HDL-C.

LDLr
— / — и Ldlr
— / —
апоА-I
— / — самцы мышей41 были поставлены на западную диету (42% калорий из жира, 0,2% калорий из холестерина) (Envigo-Teklad, #TD 88137) в возрасте 4 недель. Во время вскрытия мышей голодали в течение 3 часов до анестезии с помощью кетамина / ксилазина. Эвтаназия и сбор крови осуществлялись путем сердечной пункции. Числа определенного генотипа, используемые для каждого исследования / анализа, указаны в каждой из легенд. Все мыши выращивали и размещали в клетках микроизолятора в помещении, свободном от патогенов, в Медицинском колледже штата Висконсин (MCW). Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных MCW, а одобрение использования грызунов было получено из MCW в соответствии с критериями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных из национальных институтов здоровья.

Человеческую плазму apoA-I очищали, как описано ранее.42, 44, 46 Человеческий ЛПНП для использования в экспериментах по культуре ткани, побочный продукт от выделения человеческого apoA-I, диализовали и затем фильтровали через 45 мкм центрифужные фильтры Spin-X (Costar) и хранить при температуре 4 ° C. Группы мышей из каждого генотипа получали либо 200 мкг липид-свободного апоА-I, либо 200 мкг бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma, St. Louis, MO). Оба препарата были приготовлены при той же концентрации, и фильтр стерилизовали. После кормления мышей западной диетой в течение 6 недель они вводились подкожно 3 раза в неделю в течение 6 недель либо с помощью BSA, либо с apoA-I, все еще потребляя западную диету.

Кровь собирали в пробирках, содержащих ЭДТА, затем центрифугировали при 2000 г в течение 10 минут при 4 ° С. Общий плазменный холестерин (TPC) и HDL-C определяли с использованием набора для ферментативного анализа (Wako Diagnostics Holesterol E) после разделения класса липопротеинов на колонке Superose 6 10 / 300GL (GE Healthcare), как описано ранее.47 Человеческий apoA-I в мышь плазмы определяли с использованием набора Abcam человеческого ApoA-I ELISA.

Во время жертвоприношения в левый желудочек вставляли иглу бабочки 21G, атриум был обрезан, сердце и аорту перфузировали солевым раствором в течение 5 минут, а затем сердце удаляли и очищали от жира и адвентиции. Мышиное сердце и аорта были встроены в оптимальную среду для срезания, а затем секцию для окрашивания и иммуногистохимии. Для количественного определения общей и процентной площади поражения оптимальные режущие кромки с аортами разрезали на последовательные 6-мкм секции с использованием криостата Leica при -50 ° C. Тканевые участки окрашивали в 0,5% масла Red O (ORO), растворенного в пропиленгликоле в течение ночи, затем выдерживали гемотоксилином. Массонское трихромное пятно использовалось для оценки содержания соединительной ткани в корне аорты. Количественное определение окрашивания проводили после оцифровки разделов с использованием микроскопа Nikon и программного обеспечения Image-Pro Plus 6.2 и определяли количественно с использованием программного обеспечения NIS Elements (Nikon Instruments Inc). Для морфологических анализов использовалось от восьми до 10 секций с интервалом 30 мкм и усреднялось для получения значения для каждого животного. Результаты выражаются как как процент площади поражения, так и область абсолютного поражения, как описано ранее.47

Для иммунофлуоресцентной микроскопии в качестве первичного антитела использовали очищенный крысиный анти-мышиный CD68 (AbD FA-11-Serotec) при разведении 1: 100. Слайды инкубировали в течение 1 часа в PBS, содержащем 2% фетальной телячьей сыворотки, промывали PBS и затем инкубировали с 1: 300 разведением Cy3-конъюгированного козьего анти-крысиного IgG-антитела (Rockland) в течение 30 минут при комнатной температуре. После кратковременного промывания слайдов с помощью PBS они были окрашены DAPI для визуализации ядер, а затем смонтированы с помощью Fluoro-Gel (Electron Microscopy Sciences). Иммунофлуоресценцию визуализировали с использованием микроскопа Nikon Eclipse TE2000-S, и общее количество процентов CD68-окрашивания определяли количественно с использованием программного обеспечения Nikon Elements, как описано ранее.47

Целую кровь (≈800 мкл) собирали с помощью сердечной пункции с использованием гепаринизированного шприца и помещали в 15-мл пробирку, содержащую 5 мкл 100 ммоль / л ЭДТА, и затем смешивали для предотвращения коагуляции. К этой пробирке добавили 10 мл предварительно обработанного буфера ACK (Lonza), тщательно перемешанного путем инверсии и давшего сидеть на льду в течение 5 минут. Образец центрифугировали в течение 5 минут при 2000 об / мин в роторе вращающегося ведра при 10 ° C. После спина весь супернатант удаляли, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) ресуспендировали в 1 мл PBS с pH 7,4 без Ca2 + и Mg2 +, переносили в 1,5-мл пробирку и затем центрифугировали при 2000 об / мин в течение 5 минут при 4 ° С. Осадок промывали 1 или 2 раза PBS для удаления остаточных тромбоцитов и РВМС ресуспендировали, а затем подсчитывали перед FACS.

Мышечную селезенку и клетки костного мозга пропускали через 40 мкм клеточный фильтр, промывали ледяным PBS и затем лизировали один раз холодным буфером для лизиса ACK, как описано для PBMC. Аорты были эксплантированы после перфузии с помощью ФСБ с ледяной складкой, очищены и переварены ДНКазой I, коллагеназой типа I, коллагеназой типа XI и гиалуронидазой типа I, как описано ранее.48 Все протоколы окрашивания были проведены в течение 30 минут на льду. Антитела были приобретены у eBioscience (CD115), Biolegend (lin [lineage]) и BD Bioscience (TCRb, CD11b, CD131, GR-1, Ly6C, Ly6G, CD45, CD11c, F4 / 80, CD117 [c-kit], Ly-6A / E [sca-1]). Anti-Mouse Ig, k / Отрицательные и положительные контрольные бусины были приобретены у BD Bioscience. Образцы окрашивали красителем LIVE / DEAD (Life Technologies). Образцы были получены на LSRII (BD Bioscience), и данные были проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo X 10.0.7r2 (FlowJo, LLC, Ashland, OR).

Периферические клетки крови и плазму были выделены из крови 56 здоровых доноров, которые были частью программы Take Off Pounds Sensibly (TOPS Club, Inc). Все процедуры были одобрены институциональной комиссией MCW и соответствовали соответствующим этическим принципам исследований человека. Каждый участник получал информированное согласие. Критерии для участников, набранных для членства в TOPS Club, Inc, были описаны ранее.49, 50 Семьи с не менее чем двумя сыновьями, страдающими ожирением (индекс массы тела ≥30 кг / м2) и, по крайней мере, 1 неполный родственник и / или родитель (масса тела индекс ≤27 кг / м2) из ​​Висконсина, Иллинойса, Кентукки и Западной Вирджинии были приглашены для участия в исследовании. Участие было добровольным. Пациенты с историей сахарного диабета 1-го типа, рака, почечной или печеночной болезни, активной болезни коронарных артерий, злоупотребления психоактивными веществами, кортикостероидов, препаратов щитовидной железы выше заместительной дозы (для зоба или рака щитовидной железы) или истории потери веса больше, чем 10% массы тела за предыдущие 12 месяцев были исключены из исследования. Все процедуры были одобрены институциональной комиссией MCW и соответствовали соответствующим этическим принципам исследований человека. Информированное согласие было предоставлено каждым участником (как для вопросников, так и для фактического исследования). Кровь втягивали в трубки Vacutainer EDTA (BD Bioscience), центрифугировали, а верхний слой плазмы собирали и замораживали при -80 ° C до анализа. Образцы талой плазмы анализировали на общий уровень холестерина (ТС). LDL и HDL холестерин определяли после осаждения с помощью MgCl2
51 с использованием наборов холестерина от Roche-Boehringer (Индианаполис, IN). РВМС были выделены из истощенной плазмой крови с помощью Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). РВМС промывали для удаления тромбоцитов, затем хранили в среде FBS, содержащей 10% диметилсульфоксида.

Целую кровь (≈800 мкл) собирали путем сердечной пункции с использованием гепаринизированного шприца и помещали в 15-мл пробирку, содержащую 5 мкл 100 ммоль / л ЭДТА, затем смешивали для предотвращения коагуляции. К этой пробирке добавили 10 мл предварительно обработанного буфера ACK (Lonza), тщательно перемешанного путем инверсии и давшего сидеть на льду в течение 5 минут. Образец центрифугировали в течение 5 минут при 2000 г в роторе вращающегося ведра при 10 ° C. После спина весь супернатант удаляли, РВМС ресуспендировали в 1 мл PBS, рН 7,4, переносили в пробирку объемом 1,5 мл и затем центрифугировали при 2000 г в течение 5 минут при 4 ° С. Осадок клеток промывали 1 или 2 раза с помощью PBS для удаления остаточных тромбоцитов, и РВМС снова ресуспендировали, а затем подсчитывали перед инкубацией 3 × 105 клеток с указанным количеством ЛПНП или ЛПВП при 37 ° С, 5% СО2, в 1 мл конечного объема свободной от сыворотки среды RPMI. После инкубации в течение от 30 минут до 6 часов клетки интенсивно промывали PBS для удаления остаточных липопротеинов центрифугированием при 2000 g в течение 5 минут, затем хранили при -80 ° C.

Колбы T75 клеток J774 культивировали в RPMI с 10% FBS до конфлюэнта. Клетки поднимали с использованием Versene (Lonza), затем высевали в 12-луночные планшеты с плотностью 7 × 105 клеток на лунку. На следующий день сливные лунки промывали 2 или 3 раза PBS, а затем человеческий LDL-белок в RPMI добавляли в концентрации от 20 до 150 мкг / мл на лунку. Клетки инкубировали в течение 2-3 дней с человеческим ЛПНП при 37 ° С, 5% СО2, промывали 3 раза без сыворотки RPMI и затем инкубировали с конечной концентрацией белка с 40 мкг / мл липидного свободного апоа- I или BSA в одночасье. На следующий день среду удаляли и клетки промывали PBS, затем поднимали с помощью Versene. Клеточные гранулы центрифугировали, промывали, а затем ресуспендировали и подсчитывали. Лоури-анализ 52 проводили на аликвотах экстракта для концентрации белка, а оставшиеся клетки использовали непосредственно для выделения липидных плотов или использовали для приготовления белковых экстрактов, используемых в западных анализах.

Субклеточные фракции готовили из свежесобранных гранул клеток J774, объединенных из 15 — 100 мм посуды для каждой обработки. Клетки промывали до сбора 10 ммоль / л Tris pH 8, затем высвобождали из пластины с использованием Versene (Lonza). Объединенные клеточные гранулы для каждой группы обработки были взяты в 900 мкл неочищенного лизис-буфера, содержащего ингибиторы протеазы (10 ммоль / л Tris, pH 8, 1 ммоль / л MgCl2, 1 ммоль / л PMSF, 1 ммоль / л Na3VO4 , 5 ммоль / л NaF) и пропускали через иглу шприца 23G, по меньшей мере, в 20-40 раз. Клеточный лизат центрифугировали в течение 5 минут при 1000 г при 4 ° С для получения постнуклеарного супернатанта (ПНС). Послеядерный супернатант доводили до 1,6 мл буфером для лизиса, из которого 0,1 мл сохраняли, а оставшиеся 1,5 мл смешивали с 3,3 мл 65% сахарозы, растворенной в 10 ммоль / л Трис, pH 8, с получением 45% раствора сахарозы (плотность = 1202,5 ​​кг / м3), а затем переносили в центрифужную пробирку. Наверху 45% раствора сахарозы тщательно накладывали 4,8 мл 35% -ного раствора сахарозы (d = 1390,2 кг / м3), затем 2,4 мл 5% -ного раствора сахарозы (d = 1340,3 кг / м3). Образцы вращали в течение ночи при 40 000 об / мин в роторе Beckman SW40, поддерживаемом при 15 ° C. На следующий день каждую пробирку фракционировали в 8 или 9 последовательных фракций с использованием автоматической пробоотборной системы FluorInert (Sigma) с постоянной скоростью. Фракции немедленно замораживали и хранили при -80 ° С до анализа.

Вестерн-блот проводили после полной изоляции белка после экстракции с использованием RIPA-буфера (Cell Signaling Technologies), как описано47, или с использованием фракций липидного плота, не содержащих моющих средств. Все блоты запускали после разделения на 12% SDS-PAGE. Аликвоты белка разбавляли 4X LDS-буфером (Novex), к которому добавляли DTT для достижения конечной концентрации 100 ммоль / л. Образцы нагревали до 70 ° С в течение 20 минут. Перенос на PVDF-мембрану (Perkin-Elmer) осуществляли после обработки буфером Tris-glycine pH 8,3, используя аппарат полусухой блот (BioRad), работающий в течение 30 минут при 10 В. Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в 10 ммоль / л Трис-глицина, pH 7,4 буфера и обрабатывали. Мембрану инкубировали с первичными антителами, флотиллином (BD Biosciences), тубулином (Abcam) и интерлейкином (IL) -3Rb (Santa Curz), в течение ночи при 4 ° C. Блоты промывали и затем инкубировали с HRP-конъюгированным антителом против мышиного или кроличьего IgG (GE Healthcare) при разведении 1: 5000 в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки снова промывали и затем инкубировали с субмикронным субмикронным субстратом (Пирс). Блоты подвергались воздействию рентгеновской пленки (MidSci), а интенсивности определяли количественно с использованием программного обеспечения Image J.

Определение TC и свободного холестерина (FC) проводили на клеточных экстрактах или фракциях из изолятов липидного плота, которые были добавлены с помощью внутреннего стандарта, холестерина-3,4-13C2 (Sigma-Aldrich) и подвергали экстракции липидов, как ранее описанной.44 Для измерения FC аликвоту удаляли, выпаривали в атмосфере аргона, растворяли в гексане и затем вводили на тандемный масс-спектрометр Thermo Scientific TSQ 8000, соединенный с газовым хроматографом Trace 1310 (GC / MS / MS), оснащенным Triplus RSH автоинъектор. В режиме положительного иона использовались следующие параметры: время сканирования 0,1 с, энергия столкновения 10 В, эмиссионный ток 25 мкА, энергия электронов 42 эВ, температура источника и линии передачи 280 ° С и скорость потока = 2,5 Э-8 м3 / s. Анализ проводили с использованием колонны TG-SQC (15 м × 0,25 мм ID) с толщиной пленки 0,25 мкм. Для количественного определения ТК оставшийся образец сушили под потоком азота, повторно растворяли в 1 мл этанола, смешивали с 100 мкл 50% (мас. / Мас.) Водного раствора гидроксида калия и затем омывали в течение 1 часа при 65 ° С. После экстракции ТС измеряли, а СЕ рассчитывали как разность между ФК и ТК. Содержание фосфолипидов определяли на фракциях плота, как описано ранее.27, 53

GraphPad Prism версия 5 использовалась для статистического анализа, и данные сообщаются как среднее ± SD. Различия между группами оценивались независимыми t-тестами и ANOVA с пост-hoc-тестом Tukey.

Предыдущие исследования из нашей лаборатории были сосредоточены на выяснении механизма (механизмов), ответственных за атерозащитные свойства ЛПВП apoA-I. В этих исследованиях мы впервые использовали подкожные (SC) инъекции 500 мкг липидного свободного apoA-I для лечения диетического корма Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышей и реверсировали симптомы, связанные с аутоиммунным фенотипом, развивающимся у мышей, которым кормили западную диету.41, 43 В этих исследованиях инъекции BSA, нерелевантного белка, при той же концентрации не уменьшали или не подавляли нагрузку на холестерин и последующие аутоиммунные фенотип.44 Несмотря на отмену отложения холестерина в коже и слизистых лимфатических узлах, диетпитание Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышечная плазма показала лишь небольшое переходное увеличение концентрации ЛПВП или апоА-I в течение 3-4 часов после инъекции.44 Взятые вместе, эти наблюдения показали, что apoA-I, поставленный в небольших последовательных количествах, предотвращает и / или регрессирует липид осаждение в периферических тканях без устойчивого повышения концентрации ЛПВП в плазме или апоА-I. Однако этот вывод, по-видимому, несовместим с современным восприятием плазменного HDL в качестве терапевтического средства, поскольку считается, что эффективность снижения атеросклероза лучше всего достигается при повышении концентрации HDL-C.

Конструкция текущего исследования проиллюстрирована на рисунке 1A. Группы возрастных мужчин Ldlr
— / — и Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышей кормили западной диетой в общей сложности 12 недель. Начиная с 6 недель рациона, группа (n = 10) из каждого генотипа начала получать инъекции 200 мкг липид-свободного человеческого apoA-I (≈4 мг / кг) 3 раза в неделю в течение оставшейся части 12 недель изучение. Другая группа, представляющая контрольную группу, прошла тот же режим лечения, но получила 200 мкг БСА вместо апоА-I. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что ≈10% не содержащего липидов apoA-I, которое было подкожно введено, достигло плазменного отделения, достигнув пика ≈3 — 4 часа после инъекции и проживало на плазменных HDL-частицах.44 Мы снова исследовали время конечно появление человеческого apoA-I в плазме после SC инъекции липидного свободного apoA-I в диетическом корме Ldlr
— / — мышей, как показано на рисунке S1. Эти данные показывают, что появляется ≈6% -8% от введенного человеческого apoA-I и пики в плазме через 3,5 часа после инъекции SC. Затем мы рассмотрели влияние этого небольшого количества липидов, свободных от apoA-I, на концентрации TPC и HDL-C. На фигурах 1В и 1С показаны концентрации TPC и HDL-C для каждого генотипа и группы лечения, соответственно, и предполагает, что ни концентрации TPC, ни HDL-C не были значительно увеличены обработкой apoA-I или BSA в ходе исследования , как сообщалось ранее.44 На рис. 1D также показано, что отношение эстерифицированного холестерина (EC) к TC в плазме было сходным между группами, что указывает на то, что активность LCAT в сыворотке и / или скорость конверсии FC-EC не были затронуты apoA-I или BSA.24 Следует отметить, что концентрации холестерина в плазме в диетическом корме Ldlr
— / —
апоА-I
— / — средняя мышь ≈600 мг / дл, что почти вдвое меньше, чем у Ldlr
— / — мышей (1200 мг / дл). Интересно, что это различие во многом объясняется различиями в очень холестерине ЛПНП и ЛПНП.41 Механизм (ы) за этим генотип-специфическим ответом на потребление западной диеты остается неясным, но, по-видимому, включает аспекты аутоиммунного фенотипа, связанные с глубоким нарушением в гомеостазе холестерина.41, 43

Дизайн исследования и холестерин липопротеинов плазмы. A, Экспериментальная схема, используемая в ходе этих исследований. Во время отлучения мужчины Ldlr
— / — и Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мыши начали западную диету (Envigo-Teklad), содержащую 42% калорий в виде жира и 0,2% холестерина. Через 6 недель мышей разделили на две группы. Одна группа получала подкожные инъекции 200 мкг липидного аполипопротеина A-I (apoA-I) 3 раза в неделю, а другая группа получала 200 мкг альбумина бычьей сыворотки 3 раза в неделю. Обе группы поддерживались на западной диете во время фазы лечения. После всего 12 недель на диете, мышей оценивали. B, общую концентрацию холестерина в плазме и (C) концентрацию холестерина липопротеинов высокой плотности (HDL) в каждой из групп. D, отношение холестерина эфира (EC) к общему холестерину (TC) в липопротеинах плазмы. Показанные данные представляют собой среднее ± SD от 5 до 10 самцов мышей для каждого состояния генотипа. В отличие от букв, статистическая значимость при P <0,02.

Затем мы рассмотрели влияние липид-свободной терапии apoA-I на степень атеросклероза в обоих генотипах мышей. На фигурах 2А и 2С показаны репрезентативные слайды атеросклеротической нагрузки, оцененные после окрашивания участков корня аорты ОРО, показанных на фиг. 2А и иммунофлуоресценции CD68, показанных на фиг. 2С соответственно. На рисунках 2В и 2D результаты количественного определения ОРО и окрашивания CD68 выражены как общая площадь поражения соответственно. На фиг.2А показаны репрезентативные участки корня аорты для обоих генотипов, обработка α apoA-I (начиная сверху слева направо: обработанный BSA Ldlr
— / —
апоА-I
— / — и Ldlr
— / — мышей, затем внизу слева направо: обработанный apoA-I Ldlr
— / —
апоА-I
— / — и Ldlr
— / — мышей). Количественное определение нейтрального окрашивания липидов было выражено как общая площадь ОРО в мкм2, как показано на фиг.2В. Эти данные свидетельствуют о том, что 6 недель лечения липидов без апостипа во время потребления западной диеты уменьшали содержание нейтрального липида на ≈65% в Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышей и ≈50% в Ldlr
— / — мышей.

Атеросклероз уменьшали путем введения подкожного липидного аполипопротеина A-I (apoA-I). A, репрезентативные участки корня аорты, окрашенные Oil Red O (ORO) из Ldlr
— / — и Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышей кормили западной диетой в течение 12 недель с каждой группы лечения, тогда как (B) показывает количественную оценку площади атеросклеротического поражения в процентах от общей площади аорты для ORO-окрашенных корней аорты. Данные показывают среднее ± SD 10 самцов мышей на группу. C, репрезентативные участки корня аорты, окрашенные флуоресцентно мечеными антителами к CD68 из Ldlr
— / —
и Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышей кормили западную диету в течение 12 недель с каждой группы лечения, тогда как (D) показывает количественную оценку окрашивания CD68 + на фоне в процентах от общей площади поражения. В отличие от букв, статистическая значимость при P <0,05. Флуоресцентный фоновый порог устанавливали на интенсивность секций, получавших вторичное антитело с флуоресцентными метками минус первичное антитело CD68.

Окрашивание корня аорты для CD68 обычно используется в качестве маркера для инфильтрации макрофагов. На фигуре 2С показаны типичные участки, обработанные CD68 +, для обоих генотипов, обработка α apoA-I (начиная сверху слева направо: обработанный BSA Ldlr
— / —
апоА-I
— / — и Ldlr
— / — мышей, затем снизу слева направо apoA-I-лечение, Ldlr
— / —
апоА-I
— / — и Ldlr
— / — мышей). Количественное определение окрашивания CD68 + иммунофлюоресценцией было выражено как общая площадь CD68 + в мкм2, как показано на рисунке 2D. Эти данные свидетельствуют о том, что 6 недель липид-бесплатного лечения apoA-I во время потребления западной диеты уменьшали инфильтрацию CD68 + на ≈50% в Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышей и ≈35% в Ldlr
— / — мышей. Таким образом, оказалось, что эффекты лечения apoA-I на нейтральное липидное окрашивание участков корней аорты оказались параллельными эффектам лечения apoA-I на осаждении CD68 + аорты.

Данные по атеросклерозу предполагают, что лечение безлипидным апоА-I уменьшает как липидные, так и иммунные клетки инфильтраты в аорту мышей, поэтому мы затем исследовали, могут ли эти методы также уменьшать количество или типы циркулирующих иммунных клеток в крови. Для этого мы выделили РВМС из Ldlr
— / — мышей, которые были частью одного и того же исследования, как показано на рисунке 1А. В этих исследованиях РВМС очищали, затем окрашивали с использованием флуоресцентных антител к маркерам поверхностных рецепторов, а затем анализировали с помощью FACS. На фиг.3А показаны репрезентативные участки проточной цитометрии прямого и бокового рассеяния для живых PBMC, выделенных из Ldlr
— / — мышей кормили чау, западной диетой или западной диетой ± apoA-I, соответственно. Из каждого из этих участков прямого и бокового рассеяния клетки CD45 + были закрыты, как показано на фиг.3C. Затем клетки, положительные для CD45 +, были количественно определены, как показано на рисунке 3D, как для их процента, так и для их общего количества CD45 + PBMC в каждой группе лечения. Как отмечалось в предыдущих докладах, диеты, содержащие холестерин, имеют тенденцию к увеличению числа иммунных клеток в периферической крови гиперхолестерических мышей54, 55, 56, 57, 58, в то время как повышенная экспрессия apoA-I уменьшает их расширение.31, 59 В настоящем исследовании , CD45 + РВМС показали только тенденцию к изменению их общего числа в ответ на лечение apoA-I, в то время как различия в процентах между группами не наблюдались. С другой стороны, было обнаружено, что эффект лечения apoA-I очень значим в отношении экспрессии поверхностного рецептора CD131. На фигурах 3Е и 3F показаны репрезентативные гистограммы CD45 + PBMC, экспрессирующие CD131 + в каждой из трех групп лечения вместе с их количественным определением, соответственно. CD131 известен как общая β-субъединица рецептора IL-3, которая связывает и связывает лиганды, IL-3, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и IL-5 и, как было показано, с стимуляцией расширения стволовых клеток в apoE
— / — мышей. 60 Здесь мы видим значительное увеличение как процента, так и количества РВМС, выражающих CD45 + CD131 +, в ответ на западную диету и уменьшение ответа на лечение апоа-I в Ldlr
— / — мышей. Снижение количества CD131, экспрессирующих клетки в обработанном apoA-I Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мыши были похожи на мышей, замеченных в Ldlr
— / — мыши (данные не показаны). Интересно отметить, что это снижение CD131, экспрессирующего РВМС, было зеркально отражено изменениями отношения ЕС к ТК, измеренным в РВМС от тех же мышей, которые использовались для анализа FACS, как показано на рисунке 3В. Эти данные свидетельствуют о том, что потребление диеты в Западной Европе повышает содержание ПБМК EC / TC, что, вероятно, является сигналом избыточного клеточного холестерина и, таким образом, образованием пенных клеток, в то время как добавленный apoA-I стимулирует удаление холестерина через отток и образование зарождающихся частиц HDL. 27, 44

CD131, экспрессирующие клетки в периферической крови, уменьшаются в ответ на лечение аполипопротеином A-I (apoA-I). Схематические диаграммы, показывающие репрезентативные участки проточной цитометрии мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), выделенные из 3 различных групп лечения Ldlr
— / — мышей кормили либо чау, западную диету, либо западную диету + подкожно вводили apoA-I. A, прямой и боковой разброс всех живых PBMC из Ldlr
— / — мышей. B, холестерина эфира PBMC и общего холестерина (EC / TC) для отдельных мышей каждого из указанных генотипов для каждой из трех групп лечения. C, стробирование бокового рассеяния по сравнению с клетками CD45 + из соответствующего затвора выше для Ldlr
— / — мышей кормили либо чау, западную диету, либо западную диету — подкожно вводили apoA-I. D, процент CD45 + клеток от всех клеток (слева) и общее количество клеток CD45 + (справа) для Ldlr
— / — мышей кормили либо чау, западную диету, либо западную диету — подкожно вводили apoA-I. E, гистограммы для клеток, двойные положительные для CD45 + и CD131 +. F, процент клеток, экспрессирующих как CD45 +, так и CD131 +, и общее количество CD45 +, CD131 + экспрессирующих клеток из Ldlr
— / — мышей кормили либо чау, западную диету, либо западную диету — подкожно вводили apoA-I. Результаты, показанные в (B), представляют собой в среднем от 5 до 8 отдельных образцов PBMC для каждого генотипа и группы лечения. Результаты, отображаемые в (D и F), представляют собой среднее ± SD для 10-15 мышей на группу. В отличие от букв, статистическая значимость при P <0,05.

Чтобы определить, были ли изменения, наблюдаемые в отношении EC / TC в мышиных РВМС, переведенными в клетки крови человека, мы получили 56 образцов PBMC от участников из группы TOPS Club, Inc. Клетки подвергали масс-спектрометрии, и отношение каждого человека к РВМС / ЕС / ТП было построено по сравнению с их концентрацией ЛПВП-Л, как показано на фиг. Интересно отметить, что наблюдалась значительная обратная корреляция (P <0,009) между отношением PBMC EC / TC и концентрацией HDL-C в плазме, что указывает на то, что отношение PBMC EC / TC существенно зависит от концентрации HDL в плазме и может быть связано с определением функциональности частиц HDL в продвижении оттока из циркулирующих иммунных клеток.

Для идентификации подмножеств PBMC, экспрессирующих CD131, которые были затронуты обработкой apoA-I, РВМС из диетического корма Ldlr
— / — мышей-apoA-I окрашивали для маркеров поверхности моноцитов и нейтрофилов и анализировали FACS. На фиг.4А показаны репрезентативные участки для CD115 + Ly6C + экспрессирующих клеток, которые, как полагают, представляют собой маркеры воспалительных моноцитов в обращении. На фиг.4С показаны репрезентативные участки для CD11b + Ly6G +, выражающих нейтрофилы. Все показанные графики были сначала закрыты для живых CD45 + клеток для каждого из соответствующих обработок. Чтобы определить уровень экспрессии CD131, гистограммы были созданы из популяции CD115 + Ly6C + monocytes для мышей, получавших диету-apoA-I, а также для популяции нейтрофилов CD11b + Ly6G +. Представительные гистограммы показывают, что после того, как мышей лечили apoA-I, наблюдалось снижение количества CD131-клеток. Количественная оценка данных показана на рис. 4B и 4D для моноцитов и нейтрофилов соответственно. Снижение количества CD131, экспрессирующих клетки в обработанном apoA-I Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мыши были похожи на мышей, замеченных в Ldlr
— / — мыши (данные не показаны). В целом, эти данные показывают, что подмножества PBMC показывают значительное снижение количества CD131 + экспрессирующих клеток после лечения apoA-I Ldlr
— / — мышей кормили западной диетой.

Числа CD131, выражающие моноциты и нейтрофилы, снижаются в ответ на лечение аполипопротеином A-I (apoA-I). Схематические диаграммы, показывающие типичные графики проточной цитометрии и гистограммы мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), выделенные из Ldlr
— / — мышей, получавших либо западную диету, либо западную диету + подкожно вводили apoA-I. A, Gating для CD45 + клеток, которые экспрессируют CD115 и Ly6C и гистограмму CD131, экспрессирующих клетки. B, общее количество воспалительных моноцитов, например, клеток, положительных для CD45 CD131 Ly6C и CD115. C, Gating для CD45 + клеток, экспрессирующих Ly6G и CD11b, и гистограмму CD131-экспрессирующих клеток. D, общее количество нейтрофилов, например, клеток, положительных для CD45 CD131 Ly6G и CD11b +. A и C, представительские графики из Ldlr
— / — мышей, получавших либо западную диету, либо западную диету + подкожно вводили apoA-I. Результаты, показанные в (B и D), выражают как среднее ± SD для 10-15 мышей на группу. В отличие от букв, статистическая значимость при P <0,05.

Затем мы рассмотрели соотношение EC / TC из одноцепочечных суспензий, выделенных из селезенки мыши, костного мозга и артерии, а затем сравнили их с количеством CD131-экспрессирующих клеток в этих отсеках. На рис. 5А и 5D показано соотношение EC / TC для клеток, выделенных из клеток селезенки и костного мозга, соответственно, из Ldlr
— / — и Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышей кормили либо чау, западную диету, либо западную диету — apoA-I. В дополнение к этим отсекам иммунных клеток, клетки, выделенные из артериальных эксплантатов, показанные на рисунке S3, также показали снижение их отношения EC / TC. Как видно из ПМСВ мышей, обработка apoA-I значительно уменьшала соотношение EC / TC в этих отсеках иммунных клеток, и это изменение коррелирует с уменьшением количества клеток, экспрессирующих CD131 +, как показано гистограммой и ее количественной оценкой на фиг.5B и 5C для Ldlr
— / — мышей, обработанных apoA-I, соответственно. Эти же анализы проводили на одноклеточных суспензиях из костного мозга (показанных на фиг. 5Е и 5F), в которых наблюдалось сходное снижение количества клеток у мышей, обработанных апоа-I. Результаты, полученные из Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мыши были подобны тем, которые показаны для Ldlr
— / — (данные не показаны). В целом, эти данные свидетельствуют о том, что небольшие непрерывные дозы липидного апоА-I оказывают существенное влияние на все клетки иммунных клеток, стимулирующие снижение содержания в клетках ЕС, увеличивающихся при гиперхолестеринемии, но практически не влияют на концентрацию холестерина в плазме.

Аполпипротеин A-I (apoA-I) снижает CD131-экспрессирующие клетки в селезенке мыши и костном мозге Ldlr
— / — мышей. A и D, уровень холестерина в отношении общего холестерина (EC / TC) для одноклеточных суспензий, полученных из Ldlr
— / — и Ldlr
— / —
апоА-I
— / — селезенка мыши и костный мозг соответственно, которые анализировали на свободный и полный холестерин с помощью масс-спектрометрии. Как в генотипах, так и в отделениях иммунных клеток лечение apoA-I уменьшало соотношение EC / TC. Аликвоты клеток от тех же мышей анализировали на поверхностные маркеры с использованием FACS. B, Репрезентативная гистограмма для клеток селезенки, экспрессирующих CD131 из Ldlr
— / — мышей кормили чау, западную диету или западную диету ± apoA-I, тогда как (C) показывает количественную оценку общего количества клеток CD131 + селезенки из каждой из трех групп лечения. E, представительная гистограмма клеток костного мозга, экспрессирующих CD131 + из Ldlr
— / — мышей кормили чау, западную диету или западную диету — apoA-I, тогда как (F) показывает количественное определение общего количества клеток костного мозга CD131 + из каждой из трех групп лечения. Результаты выражают как среднее ± SD для 4-15 мышей на группу. В отличие от букв, статистические данные при P <0,05.

Основываясь на влиянии apoA-I на число CD131-экспрессирующих клеток в костном мозге мыши, мы затем определили, влияет ли лечение apoA-I на гемопоэтические стволовые клетки и многопотенциальные клетки-предшественники (HSPC), выражающие CD131. На рисунке 6 показан анализ костного мозга, проведенный FACS, предназначенным для живых отрицательных клеток линии, которые были sca-1 + c-kit + из диеты и диеты + apoA-I-обработанный Ldlr
— / — мышей, соответственно. Значительное снижение процента клеток LSK наблюдается в костном мозге мыши, обработанного apoA-I, в то время как гистограмма дополнительно показывает, что количество экспрессирующих CD131 клеток также уменьшалось после лечения апоа-I. Эти данные согласуются с предыдущей публикацией, в которой показано, что apoA-I уменьшает количество LSK-клеток, уменьшая их пролиферацию в диете с питанием Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышей, обработанных apoA-I.46

Аполпипротеин A-I (apoA-I) уменьшает LSK-клетки, экспрессирующие CD131 в костном мозге Ldlr
— / — мышей. Одноцепочечные суспензии готовили из Ldlr
— / — костный мозг и анализировали на поверхностные маркеры с использованием FACS. На левой панели показаны репрезентативные участки, обозначающие стробирование живых клеток костного мозга из диетического корма Ldlr
— / — мышей, которые были отрицательными линиями (Lin-) и экспрессировали c-Kit и Sca-1 (клетки LSK). Средняя панель показывает репрезентативные участки, обозначающие стробирование живых клеток костного мозга из диеты + apoA-I-обработанный Ldlr
— / — мышей, которые были отрицательными линиями (Lin-) и экспрессировали c-Kit и Sca-1 (клетки LSK). На правой панели показаны репрезентативные гистограммы клеток LSK, экспрессирующие CD131 для Ldlr
— / — мышей кормили диету (сплошная линия) и диета + лечение apoA-I (пунктирная линия). Данные выражаются как процент от общего количества клеток костного мозга и отражают среднее ± SD для 6-8 мышей на группу.

Результаты показывают, что apoA-I вводили диетическое питание Ldlr
— / — мыши уменьшают количество CD131 + экспрессирующих клеток независимо от отделения иммунной ячейки. Эти данные также указывают на причинно-следственную связь между администрацией apoA-I и сокращением отношения EC / TC. Затем мы исследовали вопрос о том, можем ли мы разрушить клеточный холестерин в РВМС ex vivo после инкубации без липидного апоА-I. На фиг.7А показано содержание EC / TC, FC, EC и TC в свежевыделенных PBMC ex vivo, выделенных из диетического корма Ldlr
— / — мышей, инкубированных с 40 мкг / мл липид-свободного человеческого apoA-I в течение 4 часов при 37 ° C, 5% CO2. После инкубации клетки осторожно вращали и промывали PBS, затем хранили при -80 ° С до тех пор, пока не была выполнена масс-спектрометрия. Эти данные показывают, что липид-свободный apoA-I способствует значительному удалению EC, хранящегося в РВМС от гиперхолестеринемических мышей. Альтернативно, РВМС ex vivo из кормовой Ldlr
— / — мышей инкубировали с человеческим ЛПНП и обнаружили, что они обогащены холестерином, как показано на фиг.7В. Значительное увеличение отношения EC / TC наблюдалось только тогда, когда PBMC были инкубированы с 150 мкг / мл человеческого LDL-белка. Эти данные свидетельствуют о том, что загрузка и выгрузка холестерина РВМС может происходить в обращении, поскольку эти клетки находятся в контакте с липопротеинами плазмы, что, в свою очередь, может изменить их статус активации. Аналогичные эксперименты по загрузке / разгрузке были проведены на клетках селезенки и клетках костного мозга (данные не показаны), показывающие аналогичные изменения в содержании холестерина в ответ на инкубацию с LDL или apoA-I.

Аполипопротеин A-I (apoA-I) снижает содержание холестерина в мононуклеарных клетках периферической крови ex vivo (РВМС), в то время как инкубация с липопротеином низкой плотности (LDL) увеличивает отношение EC / TC. A, холестерин сложного эфира (EC) до общего соотношения холестерина (TC), свободного холестерина (FC), EC и содержания TC в свежевыделенных PBMC ex vivo из диетического корма Ldlr
— / — мышей, выраженных как нг / миллион клеток. Приблизительно 3 × 105 клеток инкубировали с 40 мкг / мл липид-свободного человеческого apoA-I в бессывороточной среде в течение 4 часов при 37 ° C. После инкубации клетки промывали PBS, затем хранили при -80 ° C до тех пор, пока не проводилась масс-спектрометрия, как описано в разделе «Методы». B, отношение EC / TC после инкубации ≈3 × 105
РВМС из кормовой Ldlr
— / — мышей, инкубированных с 150 мкг / мл человеческого LDL-белка в течение 30 минут, 1 часа или 6 часов в конечном объеме 1 мл бессывороточной среды. После инкубации клетки интенсивно промывали PBS, затем хранили при -80 ° С до тех пор, пока не проводилась масс-спектрометрия, как описано в разделе «Методы». Результаты выражают как среднее ± SD для 4-6 мышей на группу. В отличие от букв, статистическая значимость при P <0,05.

Учитывая ограниченное число РВМС для изоляции липидного плота / западных анализов, мы обратились к модели культивирования ткани макрофагов мыши, чтобы исследовать влияние загрузки и разгрузки холестерина на состав липидных плотов или микродоменов. Поскольку показано, что CD131 или общая β-субъединица для рецепторов IL-3, GM-CSF и IL-5 активируются при локализации к липидным плотам56, 61, мы стремились определить, изменил ли apoA-I его распределение в микродоменах , Чтобы проверить эту гипотезу, использовали in vitro модель моноцитов мыши, клетки J774. Во-первых, клетки инкубировали с или без 100 мкг / мл ЛПНП, чтобы вызвать загрузку холестерина, после чего среду удаляли и клетки промывали и инкубировали с бессывороточной средой, содержащей либо 40 мкг / мл apoA-I, либо BSA. На рисунке 8А показаны изменения отношения EC / TC ± преинкубация с ЛПНП, после чего среда была заменена либо без липидов apoA-I или BSA. Эти данные показывают, что инкубация с отсутствием липидов apoA-I приводила к уменьшению отношения клеточного EC / TC, в то время как BSA не делала, независимо от того, были ли предварительно загружены клетки. Затем мы рассмотрели состав микродоменов J774 после каждого из различных обработок. Для этого мы провели экстрагирующее экстрагирование на клетках J774 с последующим центрифугированием и фракционированием градиента плотности сахарозы. На фиг.8В показаны результаты вестерн-блоттинга фракций индивидуальной плотности, которые протекают на 12% SDS PAGE для каждой из указанных обработок клеток J774. Для каждой обработки блоты были исследованы для флотиллина для определения фракций, связанных с плодами липидов, и тубулина для идентификации фракции, связанной с нерастворимыми фракциями. Кроме того, блоты также зондировали антителами к рецептору IL-3β для определения его локализации в градиенте сахарозы. Липидные плоты обычно мигрируют в диапазоне плотности от ≈15 до 25% сахарозы, что соответствует фракциям от 2 до 4, в то время как нетранфенные фракции мигрируют в фракции с плотностью сахарозы ≈35% и выше, обычно находящимися в долях 6-8. Здесь мы видим, что в клетках J774, которые не были предварительно загружены ЛПНП, маркер липидного плота, флотиллин находится главным образом во фракциях 2 и 3 с небольшим количеством в нетранной фракции 6, тогда как тубулин в основном расположен во фракциях 7 и 8. Также в этих базальные состояния, рецептор L3b показывает сигнал во фракции 3, при этом большинство рецепторов мигрирует к нерастворимым фракциям. Однако, когда клетки J774 были предварительно загружены с помощью ЛПНП, мы видели более интенсивный сигнал флотиллина во фракции 3 и больший сигнал рецептора IL-3β во фракциях 2, 3 и 4, что соответствовало меньшему количеству нерастворенных фракций. Наконец, когда предварительно загруженные клетки J774 обрабатывали apoA-I, наблюдалось снижение сигнала флотиллина во фракции 3 с большим сигналом во фракции 7 и аналогичным сдвигом сигнала от плота до нераспространения для рецептора IL-3β.

Аполипопротеин A-I (apoA-I) изменил распределение холестерина в клетках J774 и модулированный липидный плот. Конфлюентные клетки J774 инкубировали в присутствии или в отсутствие 100 мкг / мл белка липопротеинов низкой плотности человека (ЛПНП) в течение 72 часов. После предварительной обработки клеток монослои промывали бессывороточной средой и затем инкубировали в течение ночи либо с 40 мкг / мл липидного свободного апоа-I, либо с 40 мкг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA). На следующий день клетки удаляли из лунок с помощью Versene и промывали, а аликвоты использовали как для экстракции липидов, так и для выделения безлимитного липидного плота. A, отношение эстерифицированного холестерина / общего холестерина (EC / TC) в клетках J774, обработанных указанными условиями, показало, что инкубация с липидным свободным apoA-I уменьшает клеточный EC даже тогда, когда клетки не были предварительно загружены холестерином LDL. B, Вестерн-блоттинг-анализ фракций липидных плотов от каждой из указанных обработок клеток J774 после центрифугирования градиента плотности сахарозы из недетергентных экстрагированных клеток. На верхней панели показаны фракции липидного плота из необработанных клеток J774 (-LDL, -apoA-I); на средней панели показаны фракции липидного плота из клеток J774, обработанных 100 мкг / мл ЛПНП в течение 72 часов, промывали и затем инкубировали в течение ночи с 40 мкг / мл BSA (+ LDL, -apoA-I); (B) на нижней панели показаны фракции липидного плота из клеток J774, обработанных 100 мл / мл ЛПНП, промывают и затем инкубируют в течение ночи с 40 мкг / мл apoA-I (+ LDL, + apoA-I). C, отношение холестерина к фосфолипиду для каждой фракции от каждого из указанных обработок, как определено с помощью масс-спектрометрических анализов. D, отношение интенсивности флотиллина, нормированное на интенсивность фракции № 7 непустого тубулина, определяемое по результатам сканирования соответствующего Вестерн-блоттинга. E, отношение интенсивностей рецептора IL-3β, нормированное на интенсивность незараженной частички тубулина № 7 от сканирования соответствующего Вестерн-блоттинга. Эти отношения представляют собой среднее ± SD из 3 различных препаратов плота из пластин из клеток J774 при каждом из указанных условий.

Подтверждая разделение липидного плота от нетранспорта, на рис. 8C показан композиционный анализ масс-спектрометрией отношения холестерина к фосфолипиду для отдельных фракций после центрифугирования градиента плотности сахарозы. В клетках J774 лечение ЛПНП приводит к значительному увеличению отношения доли холестерина к фосфолипиду фракции 3, что значительно снижается, когда предварительно загруженные клетки J774 инкубируются с apoA-I, но не BSA. В клетках J774, которые не были предварительно загружены с помощью ЛПНП, в фракции 3 наблюдалось более низкое отношение холестерина к фосфолипиду, что указывает на то, что содержание липидного плота очень чувствительно к нагрузке на ЛПНП-холестерина в культуральной среде. Наконец, чтобы подтвердить и количественно оценить распределение интенсивности сигнала для различных зондов Вестерн-блоттинга, была просмотрена открытая пленка, и интенсивности сигналов для каждой полосы сравнивались для каждого из трех условий, как показано на рис. 8D и 8E. Якорные клетки J774, инкубированные с ЛПНП, продемонстрировали заметное увеличение отношения интенсивности сигнала флотиллина (липидного плота) к тубулину (нетрансплантат) по сравнению с ненагруженными клетками. Эта интенсивность была снижена, когда клетки, обработанные ЛПНП, инкубировали с apoA-I, как показано на фиг.8D. Интенсивность сигнала рецептора IL-3β в фракциях от 2 до 4 плотов значительно увеличивалась в клетках, предварительно нагруженных ЛНП, над ненагруженными клетками. Интересно отметить, что когда предварительно загруженные клетки обрабатывались апоа-I, снижение сигнала IL-3β наблюдалось во фракциях 2 и 4 с большим соответствующим сдвигом по интенсивности к несвязанным фракциям 7 и 8. В целом эти данные сильно поддерживают концепцию что apoA-I модулирует уровни липидного плода или микродомена холестерина путем удаления холестерина из клеток в виде зарождающихся частиц HDL27.

Текущие исследования показывают, что низкодозовая, но непрерывная, лечение диетического питания Ldlr
— / — и Ldlr
— / —
апоА-I
— / — мышей с липид-свободным apoA-I меняет разложение иммунных клеток и развитие атеросклероза, вызванного гиперхолестеринемией. Интересно, что лечение с помощью apoA-I не приводило к существенному изменению концентраций холестерина в плазме, например, концентрации ЛПНП или ЛПВП-лимфоцитов, что, скорее всего, не влияло на баланс холестерина всего тела, основной эффект заключается в балансе холестерина в иммунных клетках, что показано изменениями в клеточном EC / TC. Эта уникальная способность липидоподобного апоА-I сначала стимулировать удаление клеточного холестерина и, во-вторых, структурно поддерживать образование растворимых холестеролсодержащих частиц, называемый зарождающимся ЛПВП, предназначенный для катаболизма, лежит в основе его защитной функции при ишемической болезни сердца. Поскольку атеросклероз считается хроническим воспалительным заболеванием, избыточный внутриклеточный холестерин в иммунных клетках стимулирует клеточную пролиферацию, вызывающую увеличение их продуцирования и присутствия в циркулирующей крови. Наши исследования представляют собой продолжение работы, впервые представленной Yvan-Charvet et al59, которая показала, что мыши, дефицитные как в ABCA1, так и ABCG1, развивают моноцитоз миелоидных клеток (Gr-1 + CD11b +) и нейтрофилию в крови и костном мозге. Эти исследователи трансплантировали двойной нокаут костного мозга мыши у трансгенных мышей, экспрессирующих apoA-I, и показали, что нарушение миелопролиферата было отменено. Эти исследования далее показали, что усиленный миелопоэз в костном мозге зависел от гемопоэтического фактора роста IL-362 и предположил, что HDL подавляет пролиферацию миелоидных клеток-предшественников путем стимулирования оттока холестерина в клетках-предшественниках в костном мозге. Дальнейшая работа в этой области еще больше показала, что apoE
— / — мыши развивают моноцитоз, внося свой вклад в их аортальные поражения56, 63 и что рецептор IL-3 и GM-CSF способствует расширению стволовых клеток.

Наши данные также показывают, что гиперхолестеринемия в Ldlr
— / — мышей, изобилующих HDL apoA-I, притока клеточного холестерина превышает способность эндогенного HDL apoA-I удалять его. Следствием этого избыточного клеточного холестерина является накопление в мембранных липидных плотах. Учитывая важность липидных плотов или микродоменов в качестве платформы для организации сигнализации рецепторов и белков, включая рецептор В-клеток, рецепторы Т-клеток, 64, 65, 66 и основные рецепторы класса гистосовместимости, 67, 68, следует, что их состав холестерина должен быть тщательно отрегулирован. Холестерин, необходимый для формирования и поддержания липидного плота, может быть получен из экзогенных источников, таких как липопротеины, особенно ЛПНП, или из клеточного синтеза через мевалонатный путь в эндоплазматическом ретикулуме с последующим переносом в плазматическую мембрану 69, 70 или из внутриклеточных капель CE , Движение холестерина из липидной капли опирается на внешние сигналы, способствующие гидролизу СЕ гидролазами сложного эфира холестерина.71, 72 FC можно либо использовать для обслуживания клеточной мембраны, либо перемещать в пул субстратов для экспорта через ABCA1.73, 74 ABCA1 под контроль рецептора X печени является уникальным чувствительным главным регулятором мембранного холестерина, который регулирует состав липидного плота.75 ABCA1 был первоначально обнаружен при исследовании молекулярного дефекта у индивидуумов с болезнью Танжера, у которых отсутствовали нормальные уровни плазменной ЛПВ.76 Было быстро понято, что функция переноса холестерина ABCA1 была необходима для поддержания состава и функции липидного плота.77, ​​78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 Для эффективного удаления холестерина из клетки, ABCA1 требует помощи белков, которые солюбилизируют и организуют молекулы гидрофобного холестерина в липопротеидные частицы и направляют их в печень для устранения.25 Один такой белок, apoA-I, th e основной белковый компонент HDL, 24 однозначно способен к этим функциям и также является одним из самых распространенных белков, присутствующих в плазме17 и лимфе.86. Еще большее признание того факта, что холестерин холестерина и поддержание уровня холестерина липидов являются одним и тем же процессом после обнаружения того, что липидный состав зарождающегося ЛВП был подобен таковому, который обычно обнаруживается в микродоменах из клеточных мембран.27, 87 SC-инъекция микрограмм количества липидоподобного апоа-I на мышей привела к улучшению функции иммунных клеток и уменьшению атеросклероза, хотя и не плазменная концентрация HDL-C.42, 44 Эти результаты показывают, что критические изменения концентраций холестерина, связанных с артерией, могут быть достигнуты при умеренном или полном изменении общей концентрации HDL-C в плазме.

Чистое накопление иммунных клеток в аортальных бляшках пропорционально рекрутированию моноцитов из костного мозга наряду с периферической пролиферацией, в том числе внутри бляшки 73, 88, что уравновешивается эмиграцией и гибелью макрофагов. Новый акцент на этом процессе57, 89 показал, как загрузка холестерина макрофагов увеличивала экспрессию нетрина 1 и семафорина 3Е, которые ингибируют миграцию, вызывая задержку макрофагов при атеросклеротических поражениях 90, 91, 92, процесс, который включает микродомены липидного плота, где оба рецепторы расположены.92, 93, 94, 95 Активация и пролиферация иммунных клеток приводит к атеросклерозу и характеризуется гиперхолестеринемическими моделями животных путем резкого увеличения количества моноцитов Ly-6Chi в обращении, которые завербовываются в бляшки.54, 55, 96 Скопление холестерина моноцитами существенно влияет на рекрутирование и пролиферацию этих воспалительных моноцитов.57, 97 Интересно, что родной, но не ацетилированный ЛПНП, как было установлено, поддерживает пролиферацию лимфоцитов человека при ингибировании синтеза эндогенного холестерина 98, предполагая, что поглощение модифицированного ЛПНП заметно нарушает внутриклеточную регуляцию холестерина лимфоцитов. Процесс, посредством которого иммунные клетки реагируют на изменения гомеостаза холестерина, широко изучается в HSPC в костном мозге, что приводит к возникновению моноцитов и нейтрофилов.56, 59 HSPC из обоих апоэфиров
— / — мышей и Abca1
— / -, Abcg1
— / — мыши увеличивают уровни клеточной поверхности общей β-субъединицы рецепторов GM-CSF и IL-360 из-за увеличения концентрации холестерина в клетках. Расширение HSPC костного мозга в ответ на гиперхолестеринемию приводит к нейтрофилии и моноцитозу, последние приводят к появлению более воспалительных моноцитов, которые могут проникать и оставаться в стенке артерии.73 IL-3 и GM-CSF способствуют пролиферации, дифференцировке и выживанию лейкоцитов и совместно используют общую субъединицу CD131 рецептора β-цепи. IL-3 связывается с α-цепью рецептора гетеродимера IL-3, CD123 и CD131, что приводит к чрезмерной пролиферации лейкоцитов и заправлению цитокиновой бури, которая недавно была связана с атеросклерозом, обострением ИМ, сердечной недостаточностью и сепсисом .99, 100 Исследования показали, что CD131 локализуется в липидных плотах при стимуляции GM-CSF, что приводит к активации митоген-активированных протеинкиназ p38, которые активируют экспрессию гена цитокинов.101 Повышенное содержание холестерина во внешнем листочке макрофагальной плазматической мембраны связано с повышенная сигнализация и активация Rac1 и снижение хемотаксиса 102, предполагая, что ABCA1 и ABCG1 участвуют в регуляции микродоменов в этих клетках. Центральная роль липидных микродоменов в клеточной передаче сигналов и постоянная необходимость регулирования расширения и сокращения этих микродоменов свидетельствует о важности методов лечения, которые направлены на регулирование гомеостаза холестерина. Хотя использование статинов может снизить уровень холестерина в плазме, регуляция клеточных липидных микродоменов требует оттока холестерина через апоа-I- или апоэпоксидные пути.

Мы заключаем, что лечение apoA-I у мышей с гиперхолестеринемией снижает накопление липидов и иммунных клеток в корне аорты путем системного снижения содержания холестерина в микродоменах в иммунных клетках. Эти данные свидетельствуют о том, что липид-свободный apoA-I опосредует полезные эффекты за счет ослабления содержания холестерина липидного плода иммунной клетки, который способен влиять на многочисленные типы путей передачи сигналов, которые полагаются на целостность микродоменов для сборки и активации без изменения уровней плазменный HDL-C. Эти исследования имеют важные последствия, поскольку терапевтические средства ищут для защиты от развития накопления холестерина в стенке артерии.

Это исследование было поддержано грантами Национального института здоровья R01HL112270 и R01HL127649 (Sorci-Thomas). Аналитическая проточная цитометрия поддерживается Ресурсом детской исследовательской организации по проточной цитометрии, расположенным в Медицинском колледже Висконсина. Исследование TOPS было поддержано грантами Национального института здоровья DK 071895 и DK65598 и TOPS Club, Inc.

Никто.

Рисунок S1. Подкожные инъекции липид-свободных аполипопротеинов A-I (apoA-I) и концентрации липопротеинов в плазме. Западный диетический корм Ldlr
— / — мышей подкожно вводили либо 200 мкг липид-свободного человеческого apoA-I, либо бычий сывороточный альбумин через день. Данные показывают концентрацию apoA-I человека в мышиной плазме в каждый из указанных периодов в течение 48-часового периода после инъекции липидоподобного человеческого apoA-I. Звездочки показывают значительные различия при Р <0,05 от момента времени = 0 после введения апоА-I. Приведенные данные представляют собой среднее ± SD из 5 мышей.

Рисунок S2. Соотношение Esterified холестерина / общего холестерина (EC / TC) в мононуклеарных клетках периферической крови человека (PBMCs) показывает обратную корреляцию с концентрацией холестерина липопротеинов высокой плотности (HDL). PBMC из 56 участников в рамках Take Off Pounds Sensibly (TOPS Club, Inc) были проанализированы для их EC / TC и коррелировали с концентрацией холестерина ЛВП каждого человека. Линейный регрессионный анализ соотношения EC / TC по сравнению с концентрацией холестерина ЛПВП дал r = -0,432 с P = 0,0093 для 56 участников.

Рисунок S3. Аполпипротеин A-I (ApoA-I) модулирует соотношение этерифицированного холестерина / общего холестерина (EC / TC) в клетках мышиных артерий. Западный диетический корм Ldlr
— / — мышей подкожно вводили либо 200 мкг липид-свободного человеческого apoA-I, либо бычий сывороточный альбумин через день. Артериальные экспланты очищали и переваривали, как описано в разделе «Методы», а затем соотношение EC / TC определяли с помощью масс-спектрометрии. Данные показывают среднее ± SD от 3 до 5 мышей.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы хотели бы поблагодарить Даниэля Фергюсона за помощь в проведении атеросклеротических оценок и Тамару Нельсон за помощь в анализе FACS. Мы также благодарим Жаклин Маркс (Медицинский колледж штата Висконсин) за ее наблюдение за всеми биохимическими процедурами и, наконец, всех членов Клуба TOPS, Inc и их семей, которые вызвались на это исследование.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *