Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Макрофаги генетически охарактеризованных семейных пациентов с гиперхолестеринемией обнаруживают регуляцию связанных с ЛПНП-рецепторов белков

Macrophages of genetically characterized familial hypercholesterolaemia patients show up‐regulation of LDL‐receptor‐related proteins
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5323824/

Семейная гиперхолестеринемия (FH) является основным риском преждевременной ишемической болезни сердца из-за сильного длительного воздействия высокого уровня ЛПНП. Накопление LDL в сосудистой стенке вызывает атеросклероз с активацией системы врожденного иммунитета. Здесь мы исследовали (i) экспрессию генов LDLR и LRP в клетках периферической крови (PBL) и в дифференцированных макрофагах молодых FH-пациентов; и (ii) имеет ли макрофаг у пациентов с ФГ дифференциальный ответ при воздействии высоких уровней атерогенного ЛПНП. PBL у молодых гетерозиготных генетически охарактеризованных пациентов с FH имеют более высокую экспрессию LRP5 и LRP6, чем сопоставимые с возрастом здоровые органы управления или пациенты со вторичной гиперхолестеринемией. Уровни LRP1 были одинаковыми среди групп. В макрофагах, полученных из моноцитов (MAC), уровни транскрипции LRP5 и LRP1 не различались между FH и контрольными состояниями в условиях покоя, но при воздействии на agLDL FH-MAC демонстрировал значительно значительную регуляцию LRP5, тогда как LRP1 не подвергался воздействию. Клетки PBL и MAC у пациентов с FH имели значительно более низкую экспрессию LDLR, чем контрольные клетки, независимо от терапии, снижающей уровень липидов. Кроме того, воздействие FH-MAC на agLDL приводило к уменьшенной экспрессии CD163, рецептора-поглотителя с противовоспалительными и атерозащитными свойствами. Таким образом, наши результаты впервые показывают, что LRP, активные рецепторы, интерлизирующие липиды, регулируются в врожденных клетках иммунитета молодых пациентов с FH, которые имеют функциональные мутации LDLR. Кроме того, их уменьшенная экспрессия CD163 указывает на меньшую атерозащиту. Оба механизма могут оказывать синергетическое действие на начало преждевременного атеросклероза у пациентов с ФГ.

Семейная гиперхолестеринемия (FH) является наследственным расстройством, характеризующимся высокой концентрацией уровней холестерина липопротеинов низкой плотности плазмы (LDL) в результате мутаций в LDL-рецепторе (LDLR), которые нарушают клиренс LDL 1, 2 и реже генетическими дефекты в аполипопротеине B-100 (Apo B) или протеазе PCSK9 3. Высокие уровни LDL-холестерина (LDL-c) приводят к отложению холестерина в артериальной стенке и способствуют развитию атеросклероза и риска преждевременной ишемической болезни сердца (ИБС) 4. Мутации LDLR включают нулевые или дефектные функции для связывания лигандов, транспорта, интернализации и рециркуляции 5, 6. Таким образом, мутации LDLR являются причинным фактором для атеросклероза и развития сердечно-сосудистых заболеваний 7, 8, 9.

Атеросклеротический процесс, инициированный накоплением липидов, особенно ЛПНП в субэндотелиальном пространстве, протекает с активацией локального воспаления и врожденным ответом иммунитета 10. Удержание ЛПНП протеогликанами внеклеточного матрикса способствует его модификации с образованием агрегатов (agLDL) 11, 12. AgLDL является мощным индуктором накопления внутриклеточного холестеринового сложного эфира (СЕ) в макрофагах (пенные клетки) 13, 14, 15, 16. Действительно, макрофаги являются основным врожденным иммунитетом клеточного компонента атеросклеротических бляшек, что приводит к провоспалительному ответу 17, 18. В атеросклеротических бляшках имеется по меньшей мере два отдельных подтипа макрофагов (M1 и M2) 19; фенотип М2-макрофага характеризуется высокой клеточной экспрессией CD163 20, рецептором мусорщика, связанным с резистентностью к окислительному стрессу 21.

Было показано, что несколько рецепторов участвуют в поглощении модифицированных LDL человеческими макрофагами, включая связанные с ЛПНП-рецепторы белки LRP5 22 и LRP1 16 и рецепторы-поглотители, такие как CD36 23, 24 и MARCO 25.

Накопление внутриклеточного свободного холестерина (FC) вызывает снижение синтеза холестерина с помощью 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермента A редуктазы (HMGCR) и экспрессии HLGR 26, 27 путем ингибирования пути связывания стерол-регуляторного элемента (SREBP) 28. FC претерпевает повторная этерификация в эфиры сложных эфиров холестерина и жирных кислот («пена» из пенных клеток) с помощью ацил-CoA: трансферазы эфиров холестерина (ACAT) 29.

Наша группа показала, что LRP5 участвует в дифференцировке моноцитов в макрофаг 30 и регулируется в макрофагах, подвергшихся воздействию agLDL 22. Анализ in vivo в Lrp5
— / — мышей, получавших диету с гиперхолестеринемией (HC), показало, что дефицит LRP5 увеличивает развитие атеросклеротических поражений аорты, что указывает на атерозащитную роль LRP5 31, 32. LRP5 относится к надсемейству рецепторов LDL и имеет общие мотивы, включая повторы LDLR типа A, EGF-подобные домены и трансмембранные якоря. Интересно, что мы показали, что LRP1, другой член этого семейства, участвует в поглощении клеток гладкой мышцы agLDL, что приводит к увеличению внутриклеточного накопления CE 33, 34 и изменению фенотипа и функциональной емкости 35.

Поскольку LDLR снижается из-за чрезмерного холестерина, липид-нагруженные клетки в бляшке нуждаются в поглощении холестерина через дополнительные рецепторы, чтобы усвоить холестерин и способствовать прогрессированию зубного налета. У пациентов с FH с мутациями в гене LDLR, влияющими на его функцию, и на длительное время жизни на высоких уровнях ЛПНП, наблюдаются высокий сердечно-сосудистый риск (HCVR) и развиваются преждевременные заболевания коронарной артерии 36. Мы ранее сообщали, что у пациентов с FH значительная активация линия лейкоцитарных клеток с повышенными уровнями микрочастиц с циркулирующей клеткой из моноцитарного происхождения, содержащими маркеры активации 37, которые могут непосредственно способствовать усилению провоспалительного состояния как в крови, так и в стенке сосуда, способствуя клеточным перекрестным помехам и доставке паракринных молекулярных эффекторов между клетками ,

Здесь мы исследовали профиль экспрессии связанных с ЛПНП-рецепторов белков (LRP) в лейкоцитах периферической крови и макрофагах, полученных из моноцитов пациентов с FH, и их связь с их фенотипом и функцией (потребление липидов).

В этом исследовании мы исследовали 205 особей семейной гиперхолестеринемии SAFEHEART Cohort 38, распределенных в трех независимых субстанциях, состоящих из 60, 63 и 82 особей, соответственно, как показано на рисунке S1. SAFEHEART — это открытое многоцентровое долгосрочное перспективное когортное исследование, включающее пациентов с клинической и генетической диагностикой гетерозиготных FH 39, 40 и родственников с отрицательным генетическим тестированием для FH без или со вторичной гиперхолестеринемией. Базовые характеристики популяции когорты были описаны ранее 38. Информация о социально-демографических, клинических и липид-снижающих (LLT) данных была получена при включении в реестр когорт. Все пациенты с FH в исследовании имели уровни LDL-c в патологическом диапазоне (> 150 мг / дл). Пациенты, включенные в субстрат 1, были моложе 40 лет и с очень высокой концентрацией плазмы LDL-c натощак в соответствии с международными рекомендациями 41. Уровни LDL-c составляли 227 ± 4,6 мг / дл в субстрате 1; 160 ± 10,7 мг / дл в субстрате 2 и 176 ± 6,8 мг / дл в субстрате 3. Аналогичная картина наблюдалась для общего холестерина (ТС), который был значительно выше у пациентов субстрата 1 по сравнению с таковыми в субстанциях 2 и 3. На напротив, плазменный HDL-холестерин и триглицерид находились в нормальном диапазоне во всех группах, включенных в исследование (таблицы S1-S3), независимо от генетической диагностики для FH и лечения липидоснижающими терапиями. Как показано на рисунке S1, два субстрата были сфокусированы на лейкоцитах периферической крови (PBL) и третьем субституте, направленном на анализ макрофагов, полученных из изолированных моноцитов (ПДК), полученных из крови пациентов с ФГ и контроля не-FH. ПБЛ, используемые в субстанциях 1 и 2, и макрофаги в субстрате 3 всегда получали от отдельных пациентов.

Ни FH, ни контрольные группы не включали пациентов с беременностью, сепсисом или инфекциями, а также с историей рака или подозрением на сердечно-сосудистые события. Результаты исследования представлены в соответствии с руководящими принципами STROBE, и исследование было одобрено Комитетом местной этики «Investigación Clínica Fundación Jimenez Diaz (CEIC-FJD)» (номер протокола: 01/09) и проводилось в соответствии с Хельсинкская декларация и письменное информированное согласие были получены от всех участников до начала исследования.

Субъект 1: исследовалась молодая когорта (средний возраст 35 лет) из 60 особей. Пациенты с FH распределялись в двух группах (N = 20 в каждой группе). Для сравнительных целей была включена здоровая контрольная группа (N = 20). В каждую из этих групп входили 10 мужчин и 10 женщин. Базовые характеристики (таблица S1) показывают, что группы были сопоставлены по возрастным, гендерным и другим демографическим параметрам. Вкратце, группы FH состояли из пациентов с липид-снижающей терапией или без нее (FH-LLT +, N = 20, FH-LLT-группа, N = 20), но с очень высокими уровнями LDL-c в плазме (> 180 мг / дл ). В группу FH-LLT + включены случаи FH, случайным образом выбранные среди пациентов со стабильной липид-снижающей терапией (LLT +), по меньшей мере, 1 год до включения в соответствии с клиническими рекомендациями 40, 42. FH-LLT — для пациентов с FH, которые не получали любое снижение уровня липидов в течение того же периода времени, но соответствует уровням LDL-c, аналогичным уровням группы FH-LLT +. Лица в контрольной группе LLT (N = 20) не имели мутаций LDLR, а уровень LDL-c находился в нормальном диапазоне (ниже 115 мг / дл). За исключением общего холестерина (TC) и LDL-c, FH и контрольные группы не отличались по другим липидным параметрам, таким как холестерин ЛПВП (HDL-c) или триглицериды.

Субъект 2: подгруппа пациентов с FH (FH-AT, N = 37) с субклиническими атеросклеротическими поражениями сонной артерии и аорты, ранее подтвержденными магнитно-резонансной томографией (МРТ) 36, 43 и подгруппой контрольных пациентов (не-FH) со вторичной гиперхолестеринемией (sc-HC; N = 26). Социально-демографические и клинические характеристики групп FH-AT и sc-HC приведены в таблице S2. Все пациенты в группах FH-AT и sc-HC получали липидоснижающее лечение (статины) в соответствии с рекомендациями. Группы не различались по уровням TC, LDL-c и HDL-c, но отношение TC / HDL-c было выше в группе FH-AT, чем у пациентов со вторичной гиперхолестеринемией. Напротив, уровни триглицеридов в плазме и процент лиц с ожирением были значительно ниже в подгруппе FH-AT.

MAC были получены из независимой подгруппы из 62 пациентов с FH (31 мужчина и 31 женщина) и 20 контрольных лиц (11 мужчин и 9 женщин) из когорты SAFEHEART. Средний возраст групп контроля и FH при включении составил 46,5 лет. Пациенты с ФГ характеризовались уровнями LDL-c от 120 до 300 мг / дл, а контрольные люди имели уровни LDL-c в диапазоне от 97 до 145 мг / дл (таблица S3). Недавно выделенные моноциты были дифференцированы в ПДК, как описано ниже.

Образцы крови были выведены из кубической вены без жгута, используя иглу 20-го калибра через 10-14 часов голодания. Для получения мононуклеарных клеток периферической крови образцы крови собирали с помощью системы BD Vacutainer CPT (Becton Dickinson), содержащей гепарин натрия в качестве антикоагулянта и раствора фиколл-гипака для отделения клеток. В течение 2 часов сбора образцы крови центрифугировали при 1500-1800 rcf (относительная центробежная сила) и PBMN получали дифференциальным градиентом плотности, как описано поставщиками. РНК, полученную из PBL, получали непосредственно из образцов крови, собранных в пробирках PAXgene, и обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя. Для биохимического анализа и анализа ДНК образцы крови собирали без антикоагулянтов или в ЭДТА-содержащих пробирках 37. Все образцы сыворотки и плазмы обрабатывали одинаково в течение 60 мин. после экстракции, аликвотируют и замораживают при -80 ° С до тех пор, пока это не потребуется для анализа. ДНК получали из клеток крови в соответствии со стандартными процедурами с использованием коммерческого набора (QiAmp Blood DNA Kit Kit, Qiagen, Germany) 44.

Ферментативные методы использовали для измерения общего холестерина в сыворотке (TC), триглицеридов (TG) и HDL-c. LDL-c рассчитывали по формуле Фридевальда (LDL = TC — HDL — TG / 5); C-реактивный белок (CRP) и глюкозу количественно определяли стандартными лабораторными методами, как описано ранее 45. Молекулярно-генетическую диагностику FH проводили с использованием микрочипа ДНК (LIPOchip, Progenika Biopharma, Derio, Vizcaya, Spain) 46 и капиллярного секвенирования мультиплексным ПЦР-состояния и реакции последовательности 47, 48. Отрицательные образцы для матрицы ДНК или секвенирования также анализировали на большие делеции или вставки с использованием адаптированной количественной флуоресцентной мультиплексной ПЦР-методологии.

PBMN, полученный системой Vacutainer CPT, суспендировали в культуральной среде RPMI-1640-глутамакс, дополненной 10% (объемной) человеческой сывороткой (кровь группы AB, Lonza, Basel, Switzerland), 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, 2 мМ L -глутамина, 10 мМ буфера Hepes (Gibco, Thermo Fisher Scientific corporation: Waltham, MA, USA) (HS-media) и платировали на 6-луночных пластинах из полистирола (Becton Dickenson: Franklin Lakes, NJ, USA) для получения клеточного плотность 2 × 106 моноцитов / мл, как описано ранее 49. После инкубации в течение 24 часов неадгезивные клетки удаляли осторожно промыванием, а адгезивные моноциты пропускали в макрофаги (MAC) в течение 7 дней 50, изменяя среду каждые 48 ч. После этого клетки инкубировали в течение 24 часов в среде RPMI с 0,5% HS (минимальная среда HS). MAC были инкубированы в среде с минимальным уровнем HS с / без 100 мкг / мл agLDL в течение 24 часов в соответствии с предыдущими исследованиями нашей группы 16, 22. Затем клетки промывали фосфатным буфером (PBS) и собирали для экстракции РНК. В конкретных подмножествах экспериментов экспрессия LRP5 в человеческом MAC была заглушена коммерческой siRNA (Siliker® siRNA ID No: s8293, Ambion, Invitrogen, корпорация Thermo Fisher Scientific: Waltham, MA, USA). Вкратце, человеческие макрофаги, полученные из охристых покрытий, трансфицировали реагентом трансфекции HiPerfect (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Через 24 ч клетки подвергали указанным процедурам и собирали. Silencer Селективный отрицательный контроль siRNA (Ambion) использовался в качестве контроля и не оказывал никакого влияния на экспрессию мРНК LRP5.

LDL (плотность 1,019-1,063 г / мл) получали путем ультрацентрифугирования из объединенной плазмы EDTA нормохолестеринемических добровольцев 51. Концентрацию LDL-белка определяли с использованием метода бисинхониновой кислоты (BCA) (Pierce Chemical Company, Thermo Fisher Scientific corporation: Waltham, MA, USA) и чистота ЛПНП, определяемая агарозно-гель-электрофорезом (SAS-MX Lipo-kit, Helena Biosciences:, Gateshead, UK). Препараты ЛПНП испытывали, чтобы исключить присутствие эндотоксина (тест лизата лимуаза амебоцита, BioWhittaker: Walkersville, MD, США) и оказался во всех случаях отрицательным. ЛПНП, использованная в экспериментах, была менее 48 часов. AgLDL были получены путем встряхивания ЛПНП (1 мг / мл) в соответствии со способом, ранее описанным Guyton et al. 52 и, как ранее было проведено нашей группой 33. Этот метод показал, что аналогичная ЛПНП-агрегация была получена как инкубация ЛПНП 53. Во всех экспериментах окисление ЛПНП (до и после агрегации) было исключено путем оценки веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (TBARS) образование, согласно Ohkawa et al. 54 с небольшими изменениями 49.

Человеческие макрофаги, обработанные / без 100 мкг / мл agLDL в культуре, промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом. После этого клетки постепенно дегидратировали спиртом и окрашивали раствором Герксхаймера и гематоксилином Майера. Изображения были получены с помощью инвертированной микроскопии ECLIPSE TS100 (Nikon, Tokyo, Japan) с увеличением × 300.

Для количественной оценки интернализации липидов человеческие макрофаги, инкубированные с / без agLDL, фиксировали 4% параформальдегидом, проницаем 0,5% Tween и инкубировали в блокирующем буфере (3% бычий сывороточный альбумин в PBS) перед добавлением 5 мкл / мл среды DiI (30 мг / мл в ДМСО, Sigma-Aldrich) в течение 1 часа, промывают и покрывают антиокислительным реагентом Prolong Gold. Изображения меченых клеток регистрировали на перевернутом конфокальном микроскопе Leica (Leica TCS SP2-AOBS, Leica: Wetzlar, Germany) с использованием объектива HCX PL APO 63x / 1.2W Corr / 0.17 CS. Изображения были получены в формате сканирования 1024 × 1024 пикселя в пространственном наборе данных (xyz) и обработаны стандартным программным обеспечением Leica TCS-AOBS.

Гомозиготные мыши C57BL / 6 дикого типа и Lrp5
— / — В исследовании использовали мышей C57BL / 6. LRP5
— / — мышей, добрый подарок от доктора Барта Уильямса 55, поддерживались на фоне C57BL / 6. Животные размещались в клетках при контролируемой температуре (21 ± 2 ° C) в 12-часовом цикле света / темноты с пищей и водой ad libitum. В возрасте 10 недель животные были разделены на две группы для кормления нормальной диеты для чау-чау (NC) или диеты с высоким содержанием холестерина (HC, TD.88137, Harland Labs, Indianapolis, IN, USA) еще 8 недель (7 мышей / группа). Состав липидного профиля анализировали, как описано ранее 32. В конце периода лечения кровь была получена путем сердечной пункции под концевой анестезией (1 мг / кг медетомидина и 75 мг / кг кетамина, ip) перед хирургическим удалением. Образцы крови (400 мкл) собирали в пробирках PAXgene для извлечения мРНК из крови. После этого аорты были вскрыты и тщательно очищены от адвентициальной ткани под стереоскопической микроскопией. Все процедуры соответствовали критериям, установленным «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных», а протокол исследования был одобрен Комитетом по исследованию животных в Больнице де-ла-Санта-Крю и Сан-Пау (ICCC051 / 5422).

Общая РНК из человеческих макрофагов была экстрагирована с использованием комплекта изоляции miRNA miRNA (Ambion). РНК-экстракцию из PBL образцов человека и мышей проводили с помощью набора РНК PAXgene крови (PreAnalytiX, Qiagen / Becton Dickenson) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, корпорация Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США), а чистота проверялась по соотношению A260 / A280. Обратную транскрипцию генов выполняли с помощью набора обратной транскрипции с кДНК высокой емкости с последующей амплификацией ПЦР в режиме реального времени Taqman в соответствии с инструкцией производителя (Applied Biosystems). Экспрессия генов была проанализирована с помощью конкретных праймеров (Applied Biosystems: Foster City, CA, USA) для LRP5 (Hs00182031_m1; Mm01227476_m1), LRP1 (Hs00233856_m1; Mm00464608_m1), LDLR (Hs01092524_m1; Mm01177349_m1), HMGCR (Hs00168352_m1; Mm01282499_m1), LRP6 (Hs00233945_m1) , Mm00999795_m1), CD163 (Hs00174705_m1; Mm00474091_m1), CD36 (Hs01567185_m1) и MARCO (Hs00198935_m1). Образцы анализировали в дубликатах и ​​принимали только мРНК с уровнями экспрессии ниже 32 циклов. PIK3C2A (Hs00153223_m1) и 18S-РНК (4333760F) использовали в качестве эндогенных внутренних регуляторов для нормализации уровней экспрессии мРНК для образцов человека 49 и мыши соответственно. Данные анализировались с помощью SDS 2.4, RQ Manager 1.2.1 и DataAssits v3.0.1. (Applied Biosystems: Фостер-Сити, Калифорния, США).

Серийные срезы (5 мкм толщины) аортов, вложенных в парафин, были помещены на покрытые поли-L-лизином слайды, депарафинизированы и обработаны H2O2 для подавления эндогенной активности пероксидазы. Иммуногистохимический анализ проводили с использованием методики иммунопероксидазы авидин-биотин, как описано выше 56. Образцы анализировали на Apo B (кролик-поликлональный антиаполипопротеин B, разведение 1: 100, Abcam, ab20737, Abcam: Cambridge, UK), LRP5 ( кролик-поликлональный анти-LRP5, разведение 1:50, Abcam, ab38311) и MAC387, который является маркером для инфильтрирующих ткани моноцитов 57, 58 [антитело против макрофага (MAC387); разведение 1: 100; Abcam, ab22506]. Изображения были захвачены и оцифрованы с помощью микроскопа Nicon Eclipse 80i и камеры Retiga 1330i Fast. Контроль без первичных антител проводился с каждым набором образцов и не показывал фона маркировки.

siRNA-LRP5 и siRNA-случайно обработанные человеческие MAC были инкубированы в течение 8 часов с 100 или 400 мкг / мл agLDL. Клетки последовательно промывали PBS, PBS / 1% BSA и PBS / 1% BSA / гепарин 100 ед / мл и собирали в NaOH 0,1N. Выделение липидов и тонкослойную хроматографию проводили, как описано выше 59, 60. Пятна, соответствующие свободному холестерину (ФК) и холестериновым эфирам (СЕ), определяли путем денситометрии по стандартной кривой холестерина и холестерина пальмитата, соответственно, с использованием вычислительного денситометра (Molecular Dynamics: Саннивейл, Калифорния, США).

Данные выражаются как среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего), за исключением случаев, когда указано. Минимальный размер требуемого образца был рассчитан согласно Noordzij et al. 61. Испытание на нормальность проводили с использованием теста Шапиро-Вилка. Исключительные значения были исключены критерием Чаувенета. Статистические значения между двумя группами определялись с помощью U-теста Манна-Уитни и множественных сравнений по критерию Крускала-Уоллиса, и когда значимый постсоциальный анализ Бонферрони использовался для оценки межгрупповых различий. Категориальные переменные (пол, факторы риска и медикаменты) были сопоставлены с использованием хи-квадратного анализа частот. Сила связи между непрерывными переменными была рассчитана коэффициентами корреляции Спирмена. Статистический анализ выполнялся с помощью Stat View 5.0.1 (Abacus concept, Piscataway, NJ, USA) и SPSS Statistics Version 21.0.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). A P ≤ 0,05 считалось статистически значимым.

Чтобы исследовать, влияют ли уровни транскрипции рецепторов клеточной мембраны на поглощение ЛПНП на долю ПБЛ пациентов с ФГ, мы проанализировали экспрессию мРНК LRP1, LRP5, LDLR и HMGCR в ПЦР в реальном времени в трех группах молодых людей ( контроль не-FH-LLT-, FH-LLT- и FH-LLT +) со средним возрастом 35 лет. Как показано в таблице 1, уровень экспрессии гена LRP5 был выше у пациентов с FH-LLT по сравнению с контрольными (контроль LLT-, P = 0,040). Напротив, контрольные группы и пациенты FH-LLT + показали аналогичные результаты. PBL у пациентов с FH-LLT показала более высокую экспрессию гена LRP5, чем у группы FH-LLT + (P = 0,016), хотя уровни LDL-c не сильно различались между группами FH-LLT + и FH-LLT (группы, соответствующие этому переменная). Аналогично, PBL пациентов с FH-LLT показало увеличенное выражение для LRP1 (P = 0,044) по сравнению с FH-LLT +. Различия в уровнях LRP1 между FH-LLT- и здоровым контролем не достигли статистической значимости. Уровни экспрессии гена LDLR и HMGCR были значительно снижены в PBL у пациентов с FH по отношению к здоровому контролю независимо от липидоснижающей терапии (FH-LLT-: LDLR, P = 0,043 и HMGCR, P = 0,034, FH-LLT +: LDLR, P = 0,020 и HMGCR, P = 0,012).

Уровень экспрессии рецепторов LDL и HMGCR в лейкоцитах периферической крови (PBL) молодых пациентов с FH и здоровых контрольных контролях

Уровни экспрессии генов в PBL. Контроль LLT-
против FH-LLT + и FH-LLT-группы. N = 20 / группа. Анализ ПЦР в режиме реального времени, нормированный на PIK3C2A по калибровочной кривой. Результаты показаны как среднее ± SEM в относительных единицах × 100.

P <0,05 по сравнению с контролем.

P <0,05 по сравнению с FH-LLT +.

Кроме того, уровни LRP5, но не LRP1, были значительно выше у пациентов с FH (группа FH-AT), чем у пациентов без FH (sc-HC) (таблица 2). Кроме того, группа FH-AT имела значительно более высокие уровни LRP6 по сравнению с их гиперхолестеринемическими не-FH-контролем. LRP6 представляет собой белок с высокой гомологией с LRP5, и оба рецептора выполняют избыточные функции. 62. В целом уровни экспрессии LRP5 в PBL были значительно выше у пациентов с FH (N = 77), чем в не-FH (N = 46) (86,8 ± 2,3 против 78,8 ± 2,8, P = 0,019). Таким образом, LRP5-зависимые сигнальные пути увеличиваются в лейкоцитах пациентов с FH.

Уровень экспрессии белка, связанного с рецептором липопротеинов низкой плотности в (PBL) в МРТ, характеризуется пациентами с FH и гиперхолестеринемическим контролем, не связанным с FH

Уровни экспрессии генов в PBL. sc-HC (N = 26) по сравнению с FH-AT (N = 37). Анализ ПЦР в режиме реального времени, нормированный на PIK3C2A по калибровочной кривой. Результаты показаны как среднее ± SEM в относительных единицах × 100.

P <0,05 по сравнению с sc-HC.

Сверхэкспрессия LRP5 встречается в инфильтрированных макрофагах человеческих расширенных коронарных атеросклеротических бляшек 22, а избыточная экспрессия LRP1 сообщается при атеросклеротических поражениях как на животных моделях, так и на поражениях человека 63, 64, 65, 66. Интересно, что у пациентов с ПБЛ пациентов с атеросклерозом (FH-AT), уровень экспрессии транскриптов для LRP1, LRP5 и LRP6 был одинаковым у пациентов с атеросклеротической нагрузкой в ​​одном или нескольких артериальных пластах (рис. S2).

Затем мы исследовали, если рецепторы клеточной мембраны, участвующие в поглощении ЛПНП, по-разному экспрессируются в макрофагах у пациентов с ФГ. С этой целью LRP1, LRP5, LDLR и HMGCR анализировали с помощью ПЦР в реальном времени в загружаемых agLDL макрофагах контроля (здоровые индивидуумы, N = 20) и пациента FH (N = 62). На исходном уровне уровни экспрессии LRP5 существенно не различались между макрофагами, полученными от контролей и пациентов с FH (фиг.1A); однако FH-MAC продемонстрировали значительное увеличение транскрипции гена LRP5 при воздействии на agLDL (увеличение на 1,63 раза, P <0,001), что также было обнаружено, хотя и с более низким уровнем интенсивности, в контрольных ПДК (1,40-кратное увеличение; P = 0,045). Индукция LRP5 с помощью agLDL была значительно выше в FH-MAC, чем в контрольных ПДК (в 1,35 раза, P = 0,049).

Повышенный уровень экспрессии LRP5 у макрофагов у пациентов с контролем и FH. Макрофаги инкубировали со 100 мкг / мл agLDL в течение 24 часов. Экспрессия гена LRP1
(A), LRP5
(B), LDLR
(C), HMGCR
(D), MARCO
(E) и CD36
(F) в безнадзорных (базальных) и загруженных макрофагах (agLDL). Контрольная группа (белые полоски, N = 20) и пациенты с FH (серые полоски, N = 62). Бары представляют собой среднее ± SEM уровня выражения для обеих групп в дублированном порядке. Показаны только значения P <0,05.

Уровни транскрипции LRP1 в макрофагах человека были намного выше, чем уровни LRP5, и они были минимально подвержены воздействию 100 мкг / мл agLDL. В FH-MAC уровни экспрессии LRP1 были незначительно, но значительно уменьшены от базового значения (7%, P = 0,032) в клетках, подвергнутых воздействию LDL (фиг.1B). Уровень экспрессии мРНК LDLR в FH-MAC был на 26% ниже, чем в контрольных ПДК (P = 0,011). Уровень транскрипции LDLR был далее снижен в FH-MAC после воздействия agLDL (1,5 раза, P <0,001) (фиг.1C), эффект, который не наблюдался в макрофагах у здоровых лиц. Аналогично, уровень экспрессии мРНК HMGCR был значительно снижен в FH-MAC (1,56 раза, P <0,001) после воздействия agLDL (фиг.1D). В присутствии agLDL уровни транскрипции как LDLR, так и HMGCR были значительно снижены в FH-MAC по сравнению с не-FH-MAC (45%, P = 0,023 и 40%, P = 0,009 соответственно). Чтобы проверить, повлиял ли фон FH на ответ на agLDL рецепторов-поглотителей, были проанализированы MARCO и CD36 в качестве репрезентативных поглотителей класса А и класса B, связанных с развитием атеросклеротических поражений. Как показано на рисунках 1E и F, ни контрольные MAC, ни FH-MAC не показали статистически значимых изменений уровней экспрессии мРНК MARCO и CD36 после 24-часового воздействия agLDL.

Интернализацию 100 мкг / мл agLDL анализировали в контрольных ПДК и FH-MAC путем окрашивания для общего количества липидов. В условиях контроля, без загрузки agLDL, содержание липидов было незначительным в контрольных ПДК и имело пятно низкой интенсивности в FH-MAC. Напротив, когда к среде добавляли agLDL, наблюдалось сильное окрашивание липидов как в контрольном, так и в FH-MAC (фиг.2А). Эти результаты показывают, что FH-MAC сохраняют способность интернализировать ЛПНП, процесс, который в этих клетках, которые имеют пониженную регуляцию ЛПНП, может быть вызван сверхэкспрессией LRP5.

Интернализация agLDL в макрофагах. (A) Липидное включение показано красным цветом в макрофаги из органов управления и пациентов с FH, по пятнам Герксхаймера. Изображения являются репрезентативными. (B) Конфокальная микроскопия LRP5-заглушенных человеческих макрофагов и обрабатывалась 100 мкг / мл agLDL в течение 8 часов, промывалась, фиксировалась и окрашивалась DiI. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью стандартного программного обеспечения Leica TCS-AOBS (N = 28-32 клеток / состояние). Бар: 10 мкм. N = 3. (C) Человеческие макрофаги, трансфицированные в siRNA-Random (siR) или siRNA-LRP5 (siLRP5), подвергали воздействию agLDL в течение 8 часов. Макрофаги затем тщательно промывали и собирали для измерения внутриклеточных сложных эфиров холестерина (СЕ) и свободного холестерина (FC) с помощью тонкослойной хроматографии. Гистограмма показывает количественные значения CE относительно FC. N = 3.

Для доказательства того, что LRP5 участвует во внутриклеточном накоплении холестерина, siRNA-LRP5 и контрольные контрольные ПНК, обработанные siRNA, инкубируют с agLDL и помечены Dil. Как показано на рисунке 2B, клетки, подвергшиеся воздействию agLDL, показали сильную везикулярную маркировку DII (сигнал флуоресценции> в 2 раза выше, чем без LDL); однако интенсивность маркировки DiI была значительно уменьшена в ПДК с молчаливой экспрессией LRP5, указывающей на снижение поглощения ЛПНП в ПДК с LRP5 (P <0,05 против контролей). Анализ внутриклеточного этерифицированного (СЕ) и свободного (ФК) холестерина тонкослойной хроматографией (фиг.2С) также показал, что глушение LRP5 препятствует поглощению липидов в ПДК. Таким образом, воздействие макрофагов на agLDL индуцировало дозозависимое внутриклеточное накопление CE (100-400 мкг / мл agLDL), тогда как молчание экспрессии LRP5 значительно уменьшало интернализацию СЕ (P <0,05 по сравнению с не-LRP5-сайтированными клетками) в ПДК, подвергнутых воздействию 400 мкг / мл agLDL. Таким образом, LRP5 интернализирует холестерин в человеческих MAC.

Неоднородность мутаций LDLR среди пациентов с FH в когорте SAFEHEART и предсказанные эффекты различных мутаций на функциональность LDLR приведены в таблице S4. Пациенты с мутациями, влекущими за собой рамки считывания сдвига (N = 10) или мутации, влекущие за собой ранний стоп-кодон, приводящий к отсутствию белка (N = 12), были включены в группу FH-LDLR-нуль (FH null, N = 22), тогда как группа FH-LDLR-non-null состояла из пациентов (FH не нуль, N = 40) с мутациями на промоторе (N = 4), мутациями, приводящими к изменению аминокислоты (N = 15), мутациями с изменением сплайсинга (N = 9) и другие мутации, индуцирующие продуцирование мутированного белка (N = 12). На исходном уровне нулевые нуклеотидные группы FH и нуклеотиды FH не отличались по уровням экспрессии LRP (LRP5, LRP1) ни в экспрессии рецепторов поглотителей (MARCO, CD36) (фиг.53). Уровни экспрессии LRP5 были увеличены в 1,78 раза (P <0,001) и 1,63 раза (P = 0,023) в ПДК из непустых и нулевых пациентов соответственно в присутствии agLDL (фиг. S3A). Степень увеличения не связана с серьезностью мутации гена (нулевой и ненулевой, P = 0,466). Интересно, что уровень экспрессии LRP1 был значительно снижен у макрофагов, несущих липид, у пациентов с нулевым уровнем FH (91% от исходного значения: P = 0,012), тогда как этот эффект не был обнаружен в нулевой группе FH (фиг. S3B). Напротив, схема транскрипции MARCO и CD36 в ответ на agLDL существенно не отличалась между FH не нулевыми и нулевыми группами FH (рис. S3C и D).

FH-MAC с экспрессией гена LDLR ниже и выше медианного значения в качестве уровня отсечения (уровень мРНК [2-ΔCt]: 0,121) показал ответную экспрессию LRP5 в ответ на agLDL. Как показано на фиг. 3А, увеличение экспрессии мРНК LRP5 из-за интернализации agLDL было значительно более очевидным в тех клетках, которые были получены у пациентов с более низкими уровнями LDLR. Напротив, изменения в исходном состоянии в экспрессии гена LRP1 после воздействия макрофага на agLDL не связаны с уровнями LDLR (фиг.3B). Кроме того, наблюдалась отрицательная корреляция между уровнями экспрессии гена LRP5 и LDLR у макрофагов, нагруженных липидами у пациентов с FH (рис.3C), тогда как между уровнями экспрессии мРНК LRP1 и LDLR (рис. 3D) не было обнаружено значительной корреляции. Таким образом, LRP5, по-видимому, заменяет LDLR на поглощение липидов в макрофагах пациентов с FH.

Связь между LRP5 и LDLR в макрофаге FH. Уровни экспрессии анализировали с помощью количественной оценки ПЦР в реальном времени для LRP5, LRP1 и LDLR из макрофагов (N = 62), инкубированных с или без 100 мкг / мл agLDL в течение 24 часов. График коробки был разработан с увеличением выражения (Δ, agLDL — Basal) для LRP5
(A) и LRP1
(В). Уровни экспрессии LRP5 и LRP1, связанные с высокими или низкими значениями относительно медианы для LDLR (0.112), как срез. Δ LRP5 по сравнению с низкими значениями LDLR (медиана и IQR: 0,85 и 0,39, среднее ± SEM: 0,83 ± 0,08) и уровень экспрессии LRP5 в сравнении с высокими значениями LDLR (медиана и IQR: 0,18 и 0,24, среднее ± SEM: 0,22 ± 0,08). Δ LRP1 против низких уровней LDLR (медиана и IQR: -5,77 и 28,08, среднее ± SEM: -6,89 ± 3,84) и ΔLRP1 в сравнении с высокими значениями LDLR (медиана и IQR: -13,35 и 33,73, среднее ± SEM: -11,83 ± 3,79 ). IQR: межквартильный диапазон. Корреляция между LRP5 и LDLR
(C) и LRP1 против LDLR
(D). P-значения были получены корреляцией Спирмена (ρ). Выражение гена выполнялось в дублированном виде. Показаны только значения P <0,05.

Недавно мы показали, что экспрессия LRP5 в макрофагах человека ассоциируется с патрулирующим / невоспалительным фенотипом CD16 + (M2-макрофагами) 67. Здесь мы исследовали, влияет ли FH на экспрессию рецептора CD163 с мутантом, также связанного с фенотипом M2-макрофага , Уровень экспрессии CD163 не показал значительных изменений в контрольных ПДК, подверженных воздействию agLDL (P = NS), но был значительно уменьшен в FH-MAC (11,29 ± 0,89 против 14,51 ± 1,16, P = 0,030). Кроме того, CD163 показал значительно более низкую экспрессию в FH-MAC, чем в контрольных ПДК в присутствии agLDL (уменьшение в 1,42 раза, P = 0,034) (фиг.4А). У пациентов с ФГ транскрипция CD163 снижалась в наиболее тяжелых формах мутации LDLR (% уменьшает FH нулевой против FH, не равный нулю: базальный, 38%, P = 0,010 и agLDL, 32%, P = 0,022). У пациентов, несущих нулевой уровень FH, наблюдалось статистически значимое снижение экспрессии CD163 путем воздействия на макрофаги agLDL (уменьшение на 25%, P = 0,045) (фиг.4B). Таким образом, эти результаты показывают, что макрофаги пациентов с ФГ обладают меньшей способностью вызывать опосредованные CD163 противовоспалительные реакции при наличии высоких уровней ЛПНП.

Снижение уровня экспрессии CD163 у макрофагов пациентов с ФГ. Дифференциальный уровень экспрессии в макрофагах, нагруженных липидами, из контролей (N = 20) и пациентов с FH (N = 62) (A) и генотипа FH: FH не нуль (N = 40) и FH null (N = 22) (B) , Бары представляют собой среднее ± SEM уровня выражения в дублированном виде. Показаны только P <0,05.

Мы показали повышенную экспрессию LRP5 в PBLs пациентов с FH, которые подвергались воздействию на протяжении длительного времени высокого уровня LDL из-за мутаций в гене LDLR. Здесь мы индуцировали гиперхолестеринемию у гомозиготных мышей C57BL / 6 дикого типа (Wt) и в Lrp5
— / — C57BL / 6 путем кормления богатой холестерином диеты. Мы проанализировали экспрессию PBL-гена Lrp1, Lrp5, Lrp6, Ldlr, Hmgcr и Cd163. Ут-мышей, получавших диету с высоким содержанием холестерина (ХС) в течение 8 недель, продемонстрировали значительное, но умеренное увеличение уровня ТС плазмы у нормохолестеринемических (NC) животных (ΔTC = 62,5 мг / дл, P <0,005). 32. Уровни экспрессии гена LRP были увеличены у PBL мышей HC (изменение складки Lrp1: 2,0 раза, P = 0,037, Lrp5: 3,30 раза, P = 0,002, Lrp6: 2,0 раза, P = 0,022). Высокие уровни холестерина приводили к снижению регуляции Ldlr (P = 0,028), как и ожидалось, и уровни экспрессии гена Hmgcr существенно не изменялись (рис.5A-E). Кроме того, PBL в группе HC показали двукратное снижение среднего уровня экспрессии Cd163, хотя разница с NC-группой не достигла значимости (фиг.5F).

Гиперхолестеринемический эффект на LRP5 в мышиной модели. Уровни экспрессии гена Lrp1
(A), Lrp5
(B), Lrp6
(С)
, Ldlr
(D)
HMGCR
(E) и Cd163
(F) в PBL от мышей, которым вводили нормохолестеринемию (NC) и диету гиперхолестеринемической (HC), анализировали ПЦР в реальном времени и нормировали на 18S. Бары представляют собой среднее ± SEM уровня выражения в дублированном виде. Показаны только значения P <0,05. (G) Репрезентативные изображения аорты мышей (HC), помеченных для аполипопротеина B (Apo B) и LRP5. N = 7 мышей / группы. Стрелка указывает положительную маркировку. L: просвет.

В отличие от Wt-мышей, Lrp5
— / — животные показали высокий рост ТС плазмы через 8 недель при гиперхолестеринемической диете по сравнению с NC-Lrp5
— / — мышей (ΔTC = 140,0 мг / дл, P <0,005) 32. Кроме того, Cd163 был значительно увеличен в LRP5-дефиците (Lrp5 - / -) мышей по сравнению с Wt как у нормохолестеринемических, так и у гиперхолестеринемических животных (> 2-кратное увеличение, P <0,049, рис. S4).

Чтобы определить, наблюдаются ли повышенные уровни экспрессии гена Lrp5 в культивируемых ПДК, in vivo, мы провели иммуногистохимический анализ аорты мышей на проксимальной стороне аортальной арки, область с самым сильным окрашиванием для липидов с использованием Oil-red-O ( ORO) у гиперхолестеринемических мышей (данные не показаны). Как показано на фиг. 5G, инфильтрация Apo B была очевидна в аорте мышей, которым вводили гиперхолестеринемическую диету (коричневые сигналы на фиг.5G-a). Иммуноокрашивание для LRP5 в соседних участках аорты показало аналогичную положительную картину распределения, особенно на стороне просвета в областях, лежащих в основе эндотелия с присоединенными моноцитами (положительные клетки MAC387), которые были сильно положительными для Apo B и LRP5 (сравните фиг.5G- a и b).

Тяжелая гиперхолестеринемия является известным причинным фактором для атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний 68, вызванных генетическими дефектами в катаболизме ЛПНП, приводит пациентов к долгосрочному воздействию высоких уровней холестерина в плазме и, следовательно, к высокому риску представления ишемической болезни сердца и его клинического проявления инфаркта миокарда в молодом возрасте.

Атеросклероз — это хронический воспалительный процесс, который включает инфильтрацию ЛПНП и активацию врожденного иммунитета. Он характеризуется развитием богатых липидами поражений в артериальной стенке, в которых часто встречаются макрофаги, полученные из моноцитов с липидами. LRP присутствуют в атеросклеротических поражениях человека в сочетании с VSMC и макрофагами 16, 22, 69. Здесь мы приводим доказательства того, что PBL крови у молодых гетерозиготных пациентов с FH с генетически охарактеризованными мутациями LDLR имеют более высокую экспрессию LRP5, чем здоровые контрольные образцы или пациенты, сопоставимые с возрастом со вторичной гиперхолестеринемией. Это увеличение сопровождалось увеличением его высокомологичного рецептора LRP6. Экспериментальные исследования на моделях мышей, выборочно лишенных LRP5 или LRP6, предполагают перекрытие их биологических ролей 62. Различия в чувствительности к уровням ЛПНП в плазме могут объяснять более низкий ответ экспрессии мРНК LRP1 на гиперхолестеринемический фон у наших гетерозиготных пациентов с ФГ. Это может объяснить явное несоответствие между нашими выводами и сообщениями, опубликованными Мосигом и др. 70, 71 об увеличении экспрессии LRP1 в изолированных моноцитах крови пациентов с FH с высокой степенью тяжести заболевания (50% пациентов с гомозиготным рисунком). В этом отношении изменения транскрипции гена в PBL были более очевидными для Lrp5 (в 3 раза), чем для Lrp1 (в 2 раза) в нашей модели, основанной на диете, с гиперхолестеринемическими мышами.

Ключевым патогенным событием в развитии атеросклероза является сохранение липопротеиновых частиц в стенке сосуда, где они агрегируются и закрепляются на протеогликанах субэндотелиальной матрицы 35, 72. Макрофаги пытаются очистить частицы и заполниться этерифицированными каплями холестерина. Мы и другие продемонстрировали, что LRP играют решающую роль в поглощении agLDL либо в сосудистых гладкомышечных клетках, либо в макрофагах 33, 73. Кроме того, наша группа сообщила о более высокой эффективности LRP5, чем LRP1, для содействия накоплению CE в макрофагах человека 22 что было связано с ранним насыщением активности поглощения липидов LRP1. Здесь, расширяя эти предыдущие результаты, мы подтверждаем, что воздействие макрофагов на agLDL в течение длительных периодов времени приводит к расшифровке транскрипции LRP5, но не к LRP1, эффект, который был более очевидным у пациентов с FH, чем у здоровых людей. Интересно отметить, что индуцированная agLDL повышающая регуляция LRP5 была значительно больше у пациентов с ФГ с более низкими уровнями экспрессии LDLR, что не наблюдалось для LRP1.

Актуальность других LDL-связывающих рецепторов для поглощения agLDL в макрофагах еще не определена. В этом исследовании рецепторы мутагенеза макрофагов как MARCO или CD36 не показали каких-либо последовательных изменений на уровне транскрипции в ответ на agLDL и уровень внутриклеточного СЕ, как у FH, так и у здоровых добровольцев. Эти результаты сильно усиливают релевантность LRP5 в поддержании способности моноцитов и макрофагов интернализировать ЛПНП у пациентов с ФГ и, следовательно, способствовать очистке липидов от артериальной интимы и в конечном итоге способствуют образованию бляшек, когда пути становятся насыщенными. В соответствии с этими результатами диетологические гиперхолестеринемические мыши продемонстрировали сильную колокализацию положительных сигналов Apo B и LRP5 в артериальной интиме, а также в моноцитах, прикрепленных к эндотелию сосудов. Важность LRP5 в интернализации agLDL в макрофагах человека подтверждается обнаружением того, что глушение LRP5 приводит к низкому накоплению внутриклеточного липида и снижению содержания СЕ. Тем не менее, вклад LRP5 в атеросклероз все еще недостаточно определен, и его функция может зависеть от клеточной линии. Вклад LRP5 в метаболизм холестерина был ранее предложен путем наблюдения, что ApoE
— / —
LRP5
— / — мыши имеют более крупные атеросклеротические поражения, чем их ApoE
— / — однопометники 74. Помимо своей роли в содействии интернализации липидов, повышенная экспрессия LRP5 также индуцирует активацию канонической передачи сигналов Wnt 22, 31. В макрофагах считается, что каноническая передача сигнала Wnt повышает подвижность клеток через механизм, зависящий от β-catenin 75. Используя подход к системной биологии, Ramsey et al. сообщила о повышении регуляции канонического сигнального сигнала βnt-катенина в потоке Bnt в богатых макрофагами регрессирующих бляшках в двух механически различных липид-опускающих моделях мыши регрессии бляшки 76. Поддерживая эти находки на животных моделях, генетические варианты LRP6 человека, которые ухудшают Wnt / Сигналы β-catenin были связаны с повышенным риском атеросклероза сонной артерии 77 и раннего заболевания коронарной артерии 78 у людей, что указывает на защитные и антиатерогенные эффекты, связанные с канонической сигнализацией Wnt / β-catenin.

Моноциты крови, набранные и инфильтрированные в артериальной интиме, дифференцируются в различные подтипы макрофагов, которые характеризуются их поверхностными эпитопами и рецепторами клеточной мембраны. В недавнем исследовании мы сообщали о значительно более высокой экспрессии LRP5 в макрофагах, полученных из моноцитов, патрулирующих CD14 + CD16 +, чем в случаях, полученных из провоспалительных CD14 + CD16-моноцитов 67. Мы также показали, что большее количество моноцитов дифференцируется в сторону CD16 + фенотип в присутствии нативного ЛПНП 49. Макрофаги CD16 + обычно связаны со зрелым М2-фенотипом, который также характеризуется тем, что он является положительным для CD163 20 рецептора-поглотителя комплекса гемоглобина-гаптоглобина, участвующего в катаболизме гема, посредством процесса, опосредуемого регуляцией экспрессия гем-оксигеназы-1 (HMOX1) 79. Наличие CD163-макрофагов в атеросклеротических поражениях человека также связано с противовоспалительными свойствами, опосредованными через IL10 21, и исследованиями на мышах ApoE
— / — имеют связанную регрессию бляшек с присутствием макрофага M2, экспрессирующее CD163 80, 81, 82. Хотя дифференциация моноцитов в макрофаги, вероятно, будет конечной, макрофаги имеют возможность переключаться с фенотипом и функциональными характеристиками в ответ на внешние сигналы. Интересно отметить, что макрофаги, полученные из моноцитов пациентов с FH, уменьшали экспрессию CD163 при воздействии на agLDL, что не было очевидным в макрофагах здоровых людей, что указывает на более низкий опосредованный HMOX1 атеропротекторный потенциал в FH. Действительно, больные FH, несущие нулевую мутацию и, следовательно, с длительным воздействием высоких уровней ЛПНП и тяжелым атерогенным фоном, были у пациентов с более низким уровнем CD163, как в отсутствие, так и в присутствии agLDL. В соответствии с этим моноциты, подвергнутые воздействию нативного ЛПНП в атерогенной концентрации при дифференцировке на макрофаги, также теряют поверхностную экспрессию CD163 49. Более того, исследования обратного перевода у мышей также показали тенденцию к снижению уровней Cd163-PBL в диете, индуцированной мягко гиперхолестеринемическими животными, и Cd163- экспрессия была значительно повышена у мышей, у которых отсутствует Lrp5, что указывает на прямую связь между высоким уровнем LRP5 и низким уровнем CD163 в макрофагах пациентов с FH.

С учетом вышеуказанных результатов можно предположить, что более высокие уровни LRP5 и более низкие уровни CD163 в артериальных макрофагах могут объяснять более высокую атеросклеротическую нагрузку у пациентов с ФГ по сравнению с индивидуумами в пределах одного и того же возрастного интервала и схожими факторами риска атеросклероза вне генетических диагностика FH 36.

В заключение наши результаты показывают, что другие члены семейства рецепторов LDL, такие как LRP5 и LRP6, являются высокоактивными рецепторами интерстицизации липидов в клетках системы врожденного иммунитета у пациентов с ФГ. Макрофаги, полученные из мононуклеарных клеток, которые были сформированы и распространены в нише с высокими концентрациями ЛПНП, имеют пониженную LDLR, но сохраняют функцию интернализации LDL. LRP5 и LRP6 являются рецепторами, ответственными за интернализацию липидов в макрофагах FH. Макрофаги FH, по-видимому, проявляют низкую противовоспалительную активность и меньшую способность к защите от LDL-опосредованного окислительного стресса из-за их более низкого содержания в рецепторе CD163-поглотителя, что способствует, таким образом, преждевременному развитию атеросклероза у этих пациентов. Дальнейшие исследования необходимы для подтверждения избыточности функции интернализации / рецептора липидов, их соадаптеров и характеристик поляризации моноцитов / макрофагов в клетках пациента FH и их вклада в атеросклеротическое ремоделирование и прогрессирование сосудов.

RE провел исследование и статистический анализ исследования, интерпретировал результаты и написал рукопись. ТП помог в разработке исследования, провел статистический анализ, интерпретировал результаты, написал рукопись и получил финансирование. МБ выполнил эксперименты по молчанию LRP5 и исследования модели мыши и пересмотрел рукопись. РС способствовал отбору пациентов, статистическому анализу и пересмотру рукописи. РА внесла свой вклад в исследование и переработала рукопись. PM получил биологические образцы и клинические данные пациентов с FH и не-FH из когорты SAFEHEART и пересмотрел рукопись. LB разработал исследование, интерпретировал результаты, написал рукопись и получил финансирование.

Авторы подтверждают, что конфликта интересов нет.

Рисунок S1 Схематическая диаграмма, представляющая проект исследования с 205 особями когорты SAFEHEART.

Экспрессия S2 LRP5 в PBL у пациентов с FH-AT.

Уровни экспрессии мРНК S3 LRP и рецепторы поглотителей в макрофагах пациентов с FH по их генетически охарактеризованной мутации LDLR.

Рис. S4
Выражение Cd163 регулируется в PBL Lrp5
— / — мышей.

Таблица S1 Клинические характеристики контроля LLT-, FH-LLT + и FH-LLT-.

Таблица S2 Клинические характеристики доноров sc-HC и FH-AT для исследований лейкоцитов периферической крови (PBL).

Таблица S3 Клинические характеристики контрольных и доноров FH для исследований дифференцировки моноцитов в макрофаг.

Таблица S4 FH генотипы в соответствии с расположением мутации LDLR.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Авторы выражают признательность д-ру Ориолу Хуану и доктору Эстер Пенья за помощь в иммуногистохимии и конфокальной микроскопии и Монце Гомес-Пардо за техническую помощь во время исследования. Эта работа была поддержана Министерством экономики и конкурентоспособности Испании [SAF2013-42962-R до LB], Институтом здравоохранения Карлосом III-ISCIII [FIS PI13 / 02850 до TP / ‘Red de Investigación Cardiovascular’ RIC-RD12 / 0042 / 0027 в LB], Испанское общество кардиологов [SEC2015 до MB] и ФЕДЕРАЛ «Una Manera de Hacer Europa». Мы благодарим Fundación Jesus Serra, Барселона, за их постоянную поддержку. R.E. был получателем досудебного гранта от «Investigacion Cardiovascular Foundation».

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *