Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Липоимиметилендиоксифенол снижает экспериментальный атеросклероз за счет активации сигнализации Nrf2

Lipoicmethylenedioxyphenol Reduces Experimental Atherosclerosis through Activation of Nrf2 Signaling
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4747573/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: ZY MC XX NK PB QS SR. Выполнили эксперименты: ZY MC XX NK GM. Проанализированы данные: ZY MC XX NK GM. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: ZY MC XX XW NK RD GM QS SR. Написал газету: ZY MC XX.

Текущий адрес: кафедра химии и фармацевтической химии, Высшая школа, Университет VIT, Веллор, 632014, Индия

Окислительный стресс участвует в патогенезе атеросклероза, а Nrf2 является транскрипционным фактором, центральным в клеточных антиоксидантных ответах. В настоящем исследовании мы исследуем влияние производного дигидролиповой кислоты липоилметилендиоксифенола (LMDP) на прогрессирование атеросклероза и проверяем, является ли его действие на атеросклероз опосредованным Nrf2.

Как сканирование с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ), так и анализ лица показывают, что 14 недель лечения ЛМДП заметно уменьшали атеросклеротическое бремя в модели повреждения сосудов на основе кроликов. Анализ миографа показывает снижение сократительной реакции аорты на фенилэфрин и повышенную реакцию аорты на ацетилхолин и инсулин у животных, обработанных LMDP, что свидетельствует о том, что LMDP ингибирует атеросклероз посредством улучшения сосудистой функции. Роль Nrf2-сигнализации в опосредовании улучшения сосудистой функции LMDP была подтверждена увеличением Nrf2-транслокации в ядерную и повышенную экспрессию генов-мишеней Nrf2. Кроме того, анализ хемотаксиса с камерой Boydem показывает, что лейкоциты, выделенные из кроликов, обработанных LMDP, уменьшали хемотаксис, а сбивание Nrf2 значительно уменьшало эффект LMDP на хемотаксис макрофагов мыши.

Наши результаты подтверждают, что LMDP обладает антиатеросклеротическим эффектом, вероятно, посредством активации передачи Nrf2 и последующего ингибирования хемотаксиса макрофагов.

Все соответствующие данные приведены в документе.

Атеросклероз является основной причиной заболевания коронарной артерии, цереброваскулярных аварий и гангрены конечностей. Существует консенсус в связи с тем, что атеросклеротические поражения являются результатом чрезмерного, воспалительно-фибропролиферативного ответа на различные формы оскорбления эндотелия и гладких мышц стенки артерии. Как критический компонент воспалительных реакций, окислительный стресс, как было показано, опосредует повреждение сосудов несколькими классическими факторами риска атеросклероза, такими как гипертония [1], дислипидемия [2] и ожирение [2]. Кроме того, имеются свидетельства того, что окислительный стресс играет роль в атеросклерозе человека [3], а введение антиоксидантов снижает экспериментальный атеросклероз [4]. Тем не менее, некоторые недавние клинические испытания демонстрируют разрыв между прогнозируемой выгодой и клиническими результатами антиоксидантной терапии [4], свидетельствующие о том, что все еще имеются пробелы в наших знаниях о роли окислительного стресса во внутрисосудистой патофизиологии и выборе эффективной антиоксидантной терапии.

Механизмы снижения риска окислительного стресса развивались в живых клетках, таких как антиоксидантная ферментная система, состоящая из супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы. Ядерный фактор транскрипционного фактора — (2-й эритроид), такой как 2-фактор (Nrf2), является центральным в экспрессии этих антиоксидантных ферментов. Было показано, что его активация защищает эндотелиальные клетки от повреждения окислителем [5], подавляет пролиферацию гладких мышц [6] и уменьшает артериальное провоспалительное состояние [7], предполагая, что Nrf2 может иметь антиатеросклеротическую функцию. Тем не менее, было показано, что полное удаление Nrf2 всего тела способствует прогрессированию атеросклероза [8], вероятно, после дисфункции липопротеинов плазмы [9] и индуцированной холестерином воспалительной активации [10]. Напротив, миелоидная делеция Nrf2 заметно снижает атеросклероз [11], предполагая, что роль Nrf2 в атеросклерозе зависит от типа клеток, и необходимы дальнейшие исследования. Примечательно, что недавнее исследование показало, что диетические активаторы Nrf2 ингибируют атерогенные процессы [12], подтверждая, что путь Nrf2 является антиатеросклеротической мишенью.

Наряду с другими [13-15] мы ранее продемонстрировали, что липоевая кислота, кофермент с антиоксидантными и противовоспалительными эффектами, обладает сильным антиатеросклеротическим эффектом [16]. Интересно, что в нескольких исследованиях было высказано предположение, что антиоксидантное и противовоспалительное действие липоевой кислоты может быть опосредовано активацией Nrf2 [17-19]. Однако нет исследования, исследующего роль активации Nrf2 в антиатеросклеротическом эффекте липоевой кислоты. Кроме того, недавно мы обнаружили, что модифицированное производное метилендиоксифенола заметно ингибирует прогрессирование атеросклероза путем ингибирования воспалительного ответа [20]. В настоящем исследовании мы синтезировали новое соединение липоиметилендиоксифенола (LMDP), которое содержит фрагменты как липоевой кислоты, так и метилендиоксифенола, проверили ее эффективность на атеросклеротическую прогрессию при атеросклерозе кроликов, вызванном воздушным шаром, и исследовали роль активации Nrf2 в его анти- -атеросклеротический эффект как в системах in vivo, так и in vitro.

12 мужчин Новой Зеландии. Белые кролики были куплены у Чарльз-Ривера и кормились диетой с высоким содержанием жиров (HFD) (диета кролика Харлана Теклада с 0,5% холестерина TD 87251) на протяжении всего исследования. Через 4 недели диеты с высоким содержанием жиров кролики были рандомизированы на контроль (n = 6) или LMDP (100 мг / кг / день, n = 6). LMDP был обеспечен путем смешивания его с HFD. Через 2 недели после введения LMDP кроликам подвергали операции денудации аортального баллона, а затем другие 12 недель лечения LMDP. Для выживаемости кроликов анестезировали изофлураном в кислороде (1,5-2,5%). Животных подвергали эвтаназии пентобарбиталом натрия (100 мг / кг, IP), а затем CO2. Все процедуры исследований на животных были одобрены Институтом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета штата Огайо (Протокол № 2009A0195-R1).

Атерома была индуцирована в брюшной аорте комбинацией HFD и индуцированного воздушным шаром интимального повреждения. Кроликов анестезировали изофлураном в кислороде (1,5-2,5%). Сердечно-сосудистую систему контролировали пульсоксиметром, нанесенным на щеку кролика. Левое и правое медиальное бедро и брюшная область были асептически подготовлены к операции. В области бедренного треугольника был сделан разрез 3-4 см, а бедренная артерия была лигирована дистально с 1,5 метрическим плетеным лактомером («Polysorb» Syneture, США) и 0,2 мл 5% -ного раствора папаверина наносили на сосуд местно для обеспечения расширенной вазодилатации. Небольшое отверстие было сделано в артерии с использованием микро ножниц, через которые продвигался 4-х интродуктор (Avanti® +, Cordis). После помещения интродуктор промывали гепаринизированным солевым раствором. Проводник (диаметр 0,014 дюйма и длина 190 см) продвигался через интродукцию в бедренную артерию и брюшную аорту до уровня диафрагмы с использованием блока флюороскопа. Катетер с расширением баллончика NCM 15 / 3.5 (NC Monorail ™, Boston Scientific, Inc) затем наматывали на верхнюю часть направляющего провода и продвигались в нужное место в брюшной аорте. Баллон надувался с использованием смешанного контрастного солевого раствора (Omnipaque / iohexol 350 мг / мл). Контрастный агент внутри баллона позволяет визуализировать инфляцию. Баллон был завышен до номинального соответствия с использованием давления 8,0 АТМ для обеспечения адекватного сопротивления и двигался назад и вперед до бифуркации аорты, чтобы вызвать денудационное повреждение всей брюшной аорты. После успешной инфляции удалены воздушный шар, направляющий провод и интродуктор. Лихорадочную артерию лигировали (имеется достаточное количество коллатерального кровоснабжения ног, что обычно не вызывает каких-либо побочных эффектов). Мышечный слой закрывали, используя прерывистые швы 3-0 из полипропилена, и кожу повторно вводили с использованием внутрикожных 3-0 полипропиленовых непрерывных швов.

Основной профиль липидов (холестерин, триглицериды, прямой ЛВП и прямой ЛПНП) проводили в Cardiovascular Specialty Laboratories, Inc. Atlanta. Калибр 1 мл крови был взят в пробирки K EDTA в начале диеты с высоким содержанием холестерина и снова во время жертвоприношения.

Эксперименты с МРТ проводились в течение двух временных интервалов, 1 неделя и 12 недель после денудации. При предшествующих приемах МРТ кроликов анестезировали ксилазином (2 мг / кг) и кетамином (40 мг / кг). Полученные до и после гадолиния поглощения темной крови с использованием двойной инверсии T1-взвешенной градиентной эхо-турбо-FLASH-последовательности были получены с использованием 1,5-точечной 32-канальной МР-системы всего тела (MAGNETOM Avanto, Siemens, Germany). Для получения изображений кролики были помещены в положение лежа и были обернуты гибкой 6-элементной фазовой матрицей. Тридцать 4 мм толстых поперечных срезов (зазор 4.6 мм между срезами), перпендикулярных аорте, приблизительно от бифуркации подвздошной кости до верхнего полюса самой верхней почки, были получены с помощью разрешения TR / TE = 260/5 мс, 312 × 312 мкм в плоскости , полоса частот 120 кГц, три средних сигнала и общее время сканирования 12:29 минут. После предварительного контрастного введения через катетер вводили 7-10 мл раствора 0,1 ммоль / кг Magnevist ((Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc. Wayne, NJ) и промывали 2 мл физиологического раствора. Повторение предварительно контрастной темной крови сканирование было начато примерно через 6:30 минут после введения контраста. После того, как послеконтрастного сканирования кроликам было позволено выздоравливать.

Изображения МРТ были проанализированы с использованием рабочей станции Siemens Leonardo (Siemens Healthcare Inc., Германия). Чтобы оценить скорость прогрессирования бляшки атеросклероза, аортальная стенка была идентифицирована в предконтрастных изображениях. Регионы, представляющие интерес (ROI), были свободно обведены вокруг внутренней и внешней границы стены судна с 10-22 изображениями для каждого животного. Площадь стенки сосуда была получена в каждом срезе путем вычитания области просвета из области, инкапсулированной внешней границей стенки сосуда. Общий объем стенки сосуда для каждого животного был получен путем умножения толщины среза (4,6 мм) на общую площадь стенки сосуда (в мм). Для учета переменного количества срезов для каждого кролика рассчитывали нормированный объем стенки аорты.

После эвтаназии аорты осторожно удаляли от арки до подвздошной бифуркации вместе с сердцем и обеими почками и помещали в PBS. Сердце, почки и подвздошная бифуркация служили важными ориентирами для ориентации аорты, включая сегмент брюшной аорты, визуализированный с помощью МРТ. Изображения МРТ и гистологические разделы были сопоставлены с использованием аналогичного метода, который был подтвержден Worthley et al [21]. Область абдоминальной аорты, полученной с помощью МРТ, как описано выше, вырезали, разрезали на сегменты длиной 2 мм и внедряли в состав Optimate Cutting Temperature (OCT) (Tissue-Tek, Sakura Finetek USA Inc, Torrance, Calif.), А затем замораживали в жидкости азот, который затем был готов к гистологии. Отдельные МРТ-фрагменты были сопоставлены с гистологическими блоками аорты, измеряя расстояние от почечных артерий. Гистологические сегменты длиной 2 мм, соответствующие соответствующим изображениям МРТ, были последовательно секционированы, чтобы следить за ориентацией секций. По меньшей мере три секции из каждого сегмента анализировались как описано ниже. Участки OCT (5 мкм) окрашивали красками гематоксилин и эозин и масло Red O, а также использовали для иммуногистохимии. Каждое изображение было оцифровано цифровой камерой и проанализировано в рамках исследовательского микроскопа (Zeiss Axioskop с цифровой камерой Spot I, Йена, Германия) с Национальным институтом здравоохранения (NIH) Image software version 1.61 (Wayne Rasband, NIH, http: // rsb .info.nih.gov / NIH-изображение). Все анализы выполнялись слепо без знания происхождения образцов.

Для измерения спонтанного атеросклероза сегменты нисходящей грудной аорты были встроены в состав Optimal Cutting Temperature (Tissue-Tek, Sakura Finetek USA Inc, Torrance, CA) и заморожены на сухом льду. Затем были подготовлены секции секций. Для анализа атеросклеротической нагрузки 8-12 участков (толщиной 4 мкм) собирали с интервалами 20 мкм. После окрашивания H & E и масляно-красного окрашивания, каждый раздел анализировался слепым способом после оцифровки изображений. Изображения были проанализированы под исследовательским микроскопом (Zeiss Axioskop с цифровой камерой Spot I, Йена, Германия) с Национальным Институтом Здоровья (NIH) Image software version 1.61 (Wayne Rasband, NIH, http://rsb.info.nih.gov / NIH-изображение). Результаты были нормированы стеной аорты.

Торакальные аорты были собраны для изучения миографа. 2 мм грудных аортальных колец суспендировали в отдельных органных камерах, заполненных буфером для физиологических солевых растворов (хлорид натрия, 130 мэкв / л, хлорид калия, 4,7 мЭкв / л, дихлорид кальция, 1,6 мэкв / л, сульфат магния, 1,17 мг-экв / л; калий дифосфат, 1,18 мэкв / л, бикарбонат натрия, 14,9 мэкв / л, ЭДТА, 0,026 мэкв / л и глюкоза, 99,1 мг / дл [5,5 ммоль / л], рН 7,4), непрерывно аэрируют 5% -ным диоксидом углерода в кислорода при 37 ° С. Судам разрешалось уравновешивать в течение по меньшей мере 1 часа при натяжении покоя 30 мН, прежде чем подвергаться градуированным дозам агонистов. Агонисты вазоконстриктора включали фенилэфрин (ПЭ), эндотелин-1 (ET-1) или ангиотензин II. Ответы выражали в процентах от пикового ответа до 120 мЭк / л хлорида калия. Суда, подвергшиеся воздействию ПЭ, тщательно промывали и оставляли для равновесия в течение 1 часа перед началом экспериментов с ацетилхолином или SNP. После достижения устойчивого пластового пласта с помощью ПЭ (0,1 мкМ) кольца подвергались воздействию градуированных доз эндотелиального агониста ацетилхолина или эндотелий-независимого агониста SNP. Результаты выражали в процентах от предварительного сжатия ПЭ (0,1 мкМ). Кольца, подвергшиеся воздействию ацетилхолина, тщательно промывали и оставляли для уравновешивания в течение 1 часа. После достижения устойчивого пластового пласта с помощью PE (0,1 мкМ) инсулин затем добавляли аккумулирующим образом. Результаты выражали в процентах от предварительного сжатия ПЭ (0,1 мкМ).

Сегменты грудной аорты были встроены в состав Optimal Cutting Temperature (Tissue-Tek, Sakura Finetek USA Inc, Torrance, CA), а затем заморожены в жидком азоте. Атеросклеротическое бремя анализировали, как показано ранее [16]. Вкратце, 4 последовательных раздела были собраны на одном слайде, и было исследовано по меньшей мере 10 секций из 3 последовательных слайдов на область для мыши (синуса и грудной аорты). Каждое изображение было оцифровано цифровой камерой и проанализировано в рамках исследовательского микроскопа (Zeiss Axioskop с цифровой камерой Spot I, Йена, Германия) с Национальным институтом здравоохранения (NIH) Image software version 1.61 (Wayne Rasband, NIH, http: // rsb .info.nih.gov / NIH-изображение). Области бляшек были скорректированы для области полости поперечного сечения сосуда и выражены как процентное значение. Все анализы выполнялись слепо без знания происхождения образцов.

Лейкоциты выделяли из крови кролика с использованием буфера для лизиса RBC. 0,6 × 106 / мл лейкоцитов, используемых для изучения хемотаксиса в ответ на различные хемокины, такие как MCP-1 (50 нг / мл) и RANTES (100 нг / мл) с использованием 48-луночной камеры хемотаксиса Boyden (Neuro Probe, Inc. Gaithersburg, MD, USA ). Нижние лунки камеры заполняли 26 мкмоль хемокинов в RPMI 1640 и покрывали мембраной из поликарбоната размером 5 мкм. Верхние лунки заполняли лейкоцитами 0,6 × 106 / мл в RPMI 1640 с 1% FBS. Камера хемотаксиса инкубировали в течение 2 часов при 37 ° С и 5% СО2-состоянии. Через 2 часа инкубации поликарбонатную мембрану окрашивали пятновым набором HEMA-3® (Fisher scientific, Inc. Kalamazoo, MI. USA). Мигрированную ячейку подсчитывали при суммарном увеличении в 200 раз с использованием Microscope Zeiss, Axiovert 200M. Три поля высокой мощности с максимальным количеством клеток подсчитывались от каждой зоны скважины.

Предварительно проверенные Nrf2 и контрольная siRNA были получены из Invitrogen. Трансфекцию проводили с использованием Lipofectamine 2000 от Invitrogen в соответствии с инструкцией производителя. Эффективность анализа нокдауна и миграции проводилась через 72 часа после трансфекции.

Все значения в документе представляют собой среднее ± SEM, если не указано иное. p <0,05 были установлены как статистически значимые различия. Вся статистика была выполнена с использованием GraphPad Prism (версия 4.0, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Для анализа зависимостей дозы применялась сигмоидальная кривая доза-реакция для создания оптимизированных наборов данных и, тем временем, была подвергнута двухстороннему анализу ANNOVA. Для гистограмм данные сравнивались с использованием непарного, двухстороннего t-теста, однонаправленного ANNOVA или двухсторонней ANNOVA, как указано в легендах фигур.

В течение всего периода лечения ЛМДП не наблюдалось существенных различий в потреблении пищи и массе тела. МРТ-анализ толщины стенки брюшной аорты, индикатор индуцированной аэрозолем атеросклеротической нагрузки, показывает, что хотя не наблюдалось существенной разницы в толщине стенки брюшной аорты между контрольными и обработанными LMDP животными через одну неделю после травмы воздушного шара (рис. 1А и 1В) , значительно уменьшилась толщина стенки аорты у животных, обработанных LMDP, наблюдалась через 12 недель после операции (рис. 1A и 1B). Это уменьшение толщины стенки брюшной аорты у животных, обработанных LMDP, было реплицировано с помощью контрастных МРТ-анализов (фиг.1С и 1D). Анализ на лицевой поверхности подтверждает, что 14 недель лечения LMDP значительно ингибировали индуцированные аэростатом атеросклеротические поражения (рис. 2A и 2B). Примечательно, что 14 недель лечения LMDP также значительно снизили спонтанную атеросклеротическую нагрузку в грудной аорте (рис. 2C-2F).

Толщина стенки брюшной аорты кролика была проанализирована с помощью МРТ на первой неделе (базовая линия) или на 12 неделе (12 Wk) после травмы воздушного шара. Представлены репрезентативные изображения (A) и данные квантования (B). * p <0,05 против базовой линии и #p <0,05 против контроля, двухсторонняя ANOVA, n = 6 / группа. C и D, контрастный МРТ-анализ брюшной аорты кролика на 12-й неделе после травмы воздушного шара. * p <0,05 против контроля, t-критерий ученика, n = 6 / группа.

A, после лечения LMDP, брюшную аорту кролика собирали, а атеросклеротические поражения визуализировали окрашиванием маслом. Представлены репрезентативные изображения (A) и данные квантования (B). * p <0,05 против контроля, t-критерий ученика, n = 6 / группа. После лечения LMDP спонтанный атеросклероз в грудной аорте анализировали окрашиванием H & E (C и D) и окрашиванием маслом в красный цвет (E и F). Представлены репрезентативные изображения (C и E) и данные квантования (D и F). * p <0,05 против контроля, t-критерий ученика, n = 6 / группа.

Плазменные липопротеины, в частности ЛПНП и ЛПВП, играют центральную роль в развитии атеросклероза, и мы ранее показали, что другой метилендиоксифенол, полученный INV-403, снижает холестерин ЛПНП путем индукции экспрессии рецептора ЛПНП [22]. Чтобы проверить, ингибирует ли LMDP атеросклеротическую прогрессию посредством изменения уровня липопротеинов, плазму контрольных и LMDP-обработанных животных подвергали профилированию липопротеинов. На рисунке 3 показано, что после 14 недель лечения ЛМД не было обнаружено существенных различий в любой фракции липопротеинов плазмы, что свидетельствует о том, что LMDP ингибирует развитие атеросклероза через механизмы, не зависящие от липопротеинов.

Плазма кроликов была собрана до обработки LMDP (базовая линия) и после 14 недель лечения LMDP (14 Wk) профили липопротеинов плазмы, а уровни общего холестерина (A), триглицеридов (B), HDL (C), LDL ( D) и VLDL (E). Двухсторонняя ANOVA, n = 6 / группа.

Сосудистая дисфункция, характеризующаяся повышенной чувствительностью к вазоконстрикторам и сниженной чувствительностью к вазодилататорам, связана с прогрессированием атеросклероза. На фиг.4А и 4В и в таблице 1 показано, что 14 недель лечения ЛМДП значительно уменьшали реакцию аорты на фенилэфрин (ПЭ, селективный агонист а1-адренергического рецептора, который часто используется в качестве сосудосуживающего средства) и усиливал их реакцию на ацетилхолин (Ach, a вазодилататор, прежде всего, посредством активации eNOS), поддерживая, что LMDP ингибирует атеросклеротическую прогрессию посредством улучшения сосудистой функции. На фиг. 4C показано, что лечение LMDP не влияло на реакцию аорты на SNP, донор NO и, следовательно, независимый от эндотелия вазодилататор, что указывает на то, что LMDP прежде всего нацеливает эндотелий на его сосудистые эффекты. Примечательно, что хотя лечение LMDP не влияло на уровень глюкозы в плазме и уровень инсулина в плазме (данные не показаны), это значительно улучшило реакцию аорты на инсулин (рис. 4D), другой зависящий от eNOS вазодилататор.

После эвтаназии грудную аорту кролика выделяли и устанавливали на миограф. Были проанализированы и представлены аортальные ответы на фенилэфрин (А), ацетилхолин (В), нитропруссид натрия (SNP, С) и инсулин (D). * p <0,05 против контроля, двухсторонняя ANOVA, n = 6 / группа.

* p <0,05 против контроля; Сравнение Fits by Prizm5.

Это перепись, что воспаление играет заметную роль в атеросклерозе и его осложнениях, а хемотаксис лейкоцитов является одной из центральных парадигм воспаления. Чтобы исследовать влияние обработки LMDP на миграцию лейкоцитов, лейкоциты были выделены из контрольных и обработанных LMDP животных, а их хемотаксис в ответ на RANTES и MCP-1 оценивали с помощью Boyden Chambers. На рис. 5 показано, что лейкоциты от LMDP-обработанных кроликов значительно уменьшали хемотаксис в ответ на RANTES и MCP-1.

После 14 недель лечения LMDP были выделены лейкоциты кролика, и их миграционные реакции на RANTES (A) и MCP-1 (B) были оценены камерой Бойдена. * p <0,05 против контроля, t-критерий ученика, n = 6 / группа.

Окислительный стресс является одним из важнейших компонентов многих воспалительных реакций и участвует в патогенезе сосудистой дисфункции и атеросклерозе. Система сигнализации Nrf2 развивается для защиты от окислительного стресса. Примечательно, что липоевая кислота не только обладает антиоксидантной активностью, но также активирует передачу Nrf2 [23,24]. Чтобы оценить влияние обработки LMDP на передачу Nrf2, ядерные и цитозольные белки были получены из грудной аорты и подвергнуты транслокационному анализу Nrf2. На фиг.6А и 6В показано, что обработка LMDP значительно увеличивала транслокацию Nrf2 в ядерную среду, поддерживая, что LMDP активирует Nrf2 in vivo. Чтобы подтвердить активацию передачи Nrf2 LMDP, экспрессию некоторых генов-мишеней Nrf2, включая HO-1, NQO-1 и GSTa1, анализировали RT-PCR в реальном времени. На фиг.6С показано, что LMDP значительно увеличивал экспрессию мРНК HO-1 и NQO-1, усиливая то, что LMDP активирует передачу Nrf2 in vivo. Индукцию белка HO-1 обработкой LMDP рекапилировали вестерн-блот-анализом (фиг. 6D и 6E).

A, Транслокацию Nrf2 в аорте кролика оценивали путем компартментализации, следуя вестерн-блоттингу. * p <0,05 против контроля, t-критерий ученика, n = 5 или 6 / группа. Представлены репрезентативные изображения (A) и данные квантования (B). C, уровни экспрессии мРНК указанных генов в аорте кролика анализировали с помощью RT-PCR в реальном времени. * p <0,05 против контроля, t-критерий ученика, n = 5 или 6 / группа. D и E, экспрессию белка HO-1 в аорте кролика анализировали с помощью вестерн-блоттинга. * p <0,05 против контроля, t-критерий ученика, n = 5 или 6 / группа.

Чтобы проверить активацию передачи Nrf2 с помощью LMDP, ячейки COS-7 использовались для анализа репортера сигналов Nrf2. На фиг.7А и 7В показано, что LMDP увеличивает время активности Nrf2 в клетках COS-7 LMDP и доза, поддерживая, что LMDP может непосредственно регулировать передачу сигналов Nrf2. Учитывая, что недавний отчет показал, что передача сигналов Nrf2 в клетках, полученных из костного мозга, имеет решающее значение для развития атеросклероза, мы затем оценили влияние LMDP на активацию Nrf2 в макрофагах мыши. На рис. 7C и 7D показано, что LMDP дозозависимо увеличивает транслокацию Nrf2. Активация Nrf2 в макрофагах мыши дополнительно подтверждалась повышенной экспрессией мРНК HO-1 (фиг. 7Е) и белка (фиг. 7F).

А и В, клетки COS-7 трансфицировали конструкцией репортера Nrf2, которая экспрессирует люциферазу под контролем Nrf2. После обработки LMDP (10 мкМ) в течение указанной продолжительности (A) или указанной концентрации LMDP в течение 4 часов (B) анализировали активность люциферазы. * p <0,05 против 0 часов (A) или носителя (B), в одном направлении ANOVA, n = 5. C и D, мышиные брюшные макрофаги обрабатывали указанной концентрацией LMDP в течение 1 часа, а затем транслокация Nrf2 анализировали вестерн-блот. * p <0,05 против транспортного средства, в одном направлении ANOVA, n = 3. E, мышиные брюшные макрофаги обрабатывали указанной концентрацией LMDP в течение 1 часа, а затем экспрессию мРНК HO-1 анализировали с помощью RT-PCR в реальном времени. * p <0,05 против транспортного средства, в одном направлении ANOVA, n = 3. F, мышиные брюшные макрофаги обрабатывали указанной концентрацией LMDP в течение 4 часов, а затем экспрессию белка HO-1 анализировали вестерн-блоттингом.

Учитывая заметный эффект лечения LMDP на хемотаксис лейкоцитов и доказательства того, что передача сигналов Nrf2 связана с миграцией клеток, мы оценили, что сигнальный путь Nrf2 опосредует эффект LMDP на хемотаксис лейкоцитов. На фиг.8А показано, что Nrf2 siRNA уменьшает экспрессию белка Nrf2 в макрофагах мыши примерно на 60% и соответственно снижает эффект LMDP на хемотаксис макрофагов, сильно поддерживая, что активация Nrf2 связана с уменьшением хемотаксиса лейкоцитов обработкой LMDP.

Мышечные макрофаги живота обрабатывали Nrf2 или контрольной миРНК. Экспрессию белка Nrf2 анализировали с помощью вестерн-блоттинга (А), и миграцию в ответ на C5a в присутствии носителя или LMDP (В и С) оценивали с помощью камеры Бойдена.

Атеросклероз является одной из наиболее важных и распространенных причин смерти и инвалидности во всем мире. В настоящем исследовании мы демонстрируем, что новый синтезированный химический LMDP заметно ингибирует индуцированную аэростатом и спонтанную атеросклеротическую прогрессию в моделях кроликов, сильно поддерживая ее потенциал в лечении атеросклероза человека. LMDP содержит фрагменты липоевой кислоты и метилендиоксифенола, которые, как было показано, ингибируют атеросклеротическую прогрессию на разных животных моделях [13,16,20]. Примечательно, что в то время как липоевая кислота и метилендиоксифенол ингибировали атеросклеротическую прогрессию, по крайней мере частично, из-за их влияния на метаболизм липопротеинов [13,22], в настоящем исследовании не наблюдалось никакого значительного влияния LMDP на липопротеины плазмы, что свидетельствует о том, что антиатеросклеротический механизм LMDP отличается от уровня липоевой кислоты и метилендиоксифенола. Подкрепляя это понятие, лечение LMDP не оказало значительного влияния на массу тела, тогда как лечение липоевой кислотой, как было показано, уменьшает массу тела [13,25].

Другим важным нахождением настоящего исследования является демонстрация важной роли сигнального пути Nrf2 в опосредовании антиатеросклеротического эффекта LMDP. На сегодняшний день существует консенсус в отношении того, что атеросклероз представляет собой состояние повышенного окислительного стресса в сосудистой стенке [26], а путь Nrf2 имеет решающее значение для определения чувствительности клеток млекопитающих к окислительным оскорблениям посредством базальной и индуцируемой экспрессии изобилия детоксикационные ферменты, антиоксидантные белки, транспортеры ксенобиотиков и другие белки реакции стресса [27]. Наши данные показывают, что снижение атеросклеротической нагрузки на ЛМДП сопровождалось увеличением активации сигнального пути аорты и моноцитов Nrf2 (рис. 6), что указывает на то, что антиатеросклеротический эффект LMDP может быть опосредовано этим сигнальным путем. Примечательно, что по-прежнему существуют некоторые разногласия относительно роли передачи Nrf2 при атеросклеротической прогрессии. Например, хотя делеция Nrf2 всего тела уменьшает атеросклероз у мышей ApoE — / — [9,10], миелоидная делеция Nrf2 увеличивает атеросклероз у мышей с LDLR — / — [11]. Проатеросклеротический эффект Nrf2, показанный у мышей с дефицитом общего объема, был в основном связан с измененной холестерином печени и плазмы и индуцированной холестерином воспалительной активностью [9,10]. Наши данные показывают, что антиатеросклеротический эффект LMDP совпадал с отсутствием каких-либо значительных эффектов на липопротеины плазмы. Это согласуется с вышеизложенным понятием и решительно подтверждает, что можно фармакологически дифференцировать антиатеросклеротическую функцию Nrf2 от его регулирования на липидный обмен.

Nrf2 имеет множество генов-мишеней, которые могут выполнять различные функции Nrf2. Интересно, что наши данные показывают, что не все целевые гены Nrf2 одинаково влияют на лечение LMDP (рис. 6C), обеспечивая потенциальную интерпретацию вышеупомянутого несоответствия между фенотипами нокаутных мышей и результатами фармакологических исследований: полный дефицит Nrf2 у нокаутных мышей делает их фенотипы отражают все функции Nrf2, тогда как дифференциальная регуляция генов-мишеней Nrf2 путем фармакологической активации приводит к тому, что его эффекты отражают только частичные функции Nrf2. Это согласуется с недавним исследованием, демонстрирующим, что CD36, один из генов-мишеней Nrf2, определяет эффекты Nrf2 на атеросклероз через неизвестный механизм [28]. Чтобы решить, активирует ли LMDP антиатеросклеротические гены, но не метаболизм липидов, проходит профилирование экспрессии генов-мишеней Nrf2 в ответ на лечение LMDP.

Сосудистая функция, в частности эндотелиальная дисфункция, характеризующаяся уменьшением вазодилататорного ответа на ацетилхолин, сильно коррелирует с прогрессированием атеросклероза у людей и животных моделей. Интересно, что наши данные показывают, что лечение LMDP заметно улучшает реакцию аорты на ацетилхолин и инсулин, предполагая, что антиатеросклеротические эффекты LMDP могут быть опосредованы мелиорацией эндотелиальной функции. Это согласуется с исследованиями, показывающими, что антиатеросклеротический эффект липоевой кислоты сопровождается улучшением эндотелиальной функции [16]. Однако LMDP также уменьшает сократительную реакцию аорты на фенилэфрин, тогда как липоевая кислота не влияет на сократительную способность аорты [16], предполагая, что эффект LMDP на сосудистую функцию также может быть уникальным. Было показано, что окислительный стресс играет решающую роль в регуляции сосудистой функции, а сигнальный путь Nrf2 является одним из наиболее важных клеточных антиоксидантных компонентов. Более того, было показано, что HO-1, один критический целевой ген Nrf2, замедляет сократимость гладких мышц сосудов за счет механизма, независимого от оксида азота [29]. Наши данные показывают, что лечение LMDP не только активировало Nrf2 (фиг. 6A и 6B), но также заметно увеличивало экспрессию HO-1, что указывает на то, что сосудистые эффекты LMDP также могут быть опосредованными путем Nrf2 / HO-1.

Вербовка моноцитов в сосудистую стенку и их последующее развитие в клетках пены являются центральными в патофизиологии атеросклероза [30]. Считается, что улучшение сосудистой функции препятствует адгезии моноцитов и, таким образом, снижает их вербовку в сосудистую стенку. Примечательно, что наши данные показывают, что обработка LMDP также заметно снижает хемотаксис изолированных лейкоцитов, что указывает на то, что ингибирование рекрутирования моноцитов / макрофагов может быть критической мишенью для его антиатеросклеротического эффекта. Это как-то согласуется с исследованиями, показывающими, что липоевая кислота ингибирует миграцию лейкоцитов в центральную нервную систему в мышиную модель острого экспериментального аллергического энцефаломиелита с помощью неизвестных механизмов [31]. Примечательно, что наши данные показывают, что ингибирование хемотаксиса моноцитов с помощью LMDP также может быть зависимым от Nrf2, поскольку сбивание Nrf2 значительно снижает эффект LMDP на хемотаксис макрофагов. Это согласуется с недавним сообщением о том, что Nrf2 — / — макрофаги увеличили миграцию в ответ на MCP-1 [11].

В заключение наши данные показывают, что LMDP ингибирует атеросклеротическую прогрессию в модели атеросклероза, которая может быть опосредована активацией передачи Nrf2 и последующим ингибированием рекрутирования моноцитов / макрофагов. Эти результаты могут иметь последствия для дальнейшего тестирования этого нового соединения при лечении атеросклероза.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

LMMP был синтезирован доктором Раджагопалом Десиканом, который защищен патентом (Патентный номер: 8198317), который принадлежит Исследовательскому фонду штата Огайо и Invasc Therapeutic. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант № 81270342 от ZY и 81500216 до MC), Американской кардиологической ассоциацией (11POST7640030, 13SDG17070131 до ZY) и Национальными институтами здравоохранения (R01ES024516 — ZY и R01ES013406 и R01ES015146 до SR).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *