Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Ингибирование Xanthin оксидазы по Febuxostat Attenuates Экспериментальный атеросклероз у мышей

Xanthine Oxidase Inhibition by Febuxostat Attenuates Experimental Atherosclerosis in Mice
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3971401/

Атеросклероз — хроническое воспалительное заболевание из-за осаждения липидов в артериальной стенке. В воспалительном процессе участвуют множественные механизмы, включая окислительный стресс. Ксантиноксидаза (ХО) является основным источником реакционноспособных видов кислорода (ROS) и связана с патогенезом атеросклероза, но основные механизмы остаются неясными. Здесь мы демонстрируем усиленную экспрессию XO в макрофагах в атеросклеротической бляшке и в эндотелиальных клетках аорты у мышей ApoE — / — и что febuxostat, сильнодействующий ингибитор ХО, подавляет образование бляшек, снижает артериальные уровни ROS и улучшает эндотелиальную дисфункцию в ApoE- / — мышей, не влияющих на уровень холестерина в плазме. В in vitro фебуостат ингибировал образование ROS, индуцированного холестерином, и высвобождение воспалительных цитокинов в мышиных макрофагах. Эти результаты показывают, что в атеросклеротической бляшке XO-опосредованное образование ROS является провоспалительным, а XO-ингибирование фебусостатом является потенциальной терапией для атеросклероза.

Атеросклероз — хроническое воспалительное заболевание артерий, вторичное по отношению к отложению липидов в стенке сосуда, и окислительный стресс участвует в его патогенезе123. На ранней стадии атеросклероза окислительный стресс меняет LDL на окисленный ЛПНП, который поглощается макрофагами в интиме сосудистой стенки, что в конечном итоге приводит к образованию пенных клеток. Позже появляются кристаллы холестерина (СС), которые могут стимулировать воспалительные реакции и апоптоз в макрофагах пены4. Окислительный стресс также вызывает эндотелиальную дисфункцию, одну из ранних особенностей атеросклероза5. Поэтому окислительный стресс и воспаление тесно связаны и играют важную роль в развитии атеросклероза, а выяснение основных механизмов может привести к новым стратегиям профилактики и лечения атеросклероза.

Окислительный стресс возникает в результате образования активных форм кислорода (ROS), которые генерируются различными путями, такими как ксантиноксидоредуктаза (XOR), NADPH-оксидаза и митохондриальные респираторные ферменты6. XOR является ферментом, содержащим молибдоптерин, который окисляет гипоксантин до ксантина и, наконец, к мочевой кислоте. XOR существует в двух взаимообратимых формах: ксантиноксидаза (XO) и ксантиндегидрогеназа (XDH). В то время как XDH использует NAD + в качестве акцептора электронов и производит NADH, XO в основном производит ROS, такой как супероксид и перекись водорода, предпочтительно используя молекулярный кислород в качестве акцептора электронов7. XOR, а также его метаболиты мочевой кислоты увеличиваются в атеросклеротических бляшках по сравнению с неатеросклеротическими сонными артериями, а CCs, XOR и мочевая кислота совместно локализованы в этих бляшках8. Кроме того, ингибиторы XOR, такие как вольфрам и аллопуринол, ингибировали прогрессирование атеросклероза у мышей ApoE — / -. XOR участвует не только в поглощении окисленного LDL в макрофагах, но также в индукции цитокинов растворимыми лигандами, такими как LPS и атеросклеротической сывороткой91011. Кроме того, поглотители ROS, такие как N-ацетил-L-цистеин (NAC) и апоцинин, ингибировали образование бляшек и артериальное воспаление у мышей121314. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что XO играет важную роль в развитии атеросклероза посредством генерации ROS, но окончательное доказательство его роли в атеросклеротическом воспалении и лежащие в основе механизмы остаются в силе.

Внутриклеточные CCs обнаружены в атеросклеротических бляшках, индуцированных диетой, и состоят из окисленного LDL, который подвергся эндоцитозу1516. В макрофагах CCs активируют NLRP3-воспаление, приводящее к секреции IL-1β151617. Было показано, что внутриклеточное продуцирование ROS имеет решающее значение для NLRP3-зависимой секреции IL-1β в ответ на мононатриевый урат (MSU) 1819. Неизвестно, является ли CC-индуцированное провоспалительное выделение цитокинов XO- или ROS-зависимым процессом.

В этом исследовании мы изучили экспрессию XO в экспериментальном атеросклерозе и изучили эффекты febuxostat, сильнодействующего ингибитора XOR, как in vivo в модели атеросклероза, так и in vitro в CC-индуцированном воспалении в макрофагах.

ApoE — / — мыши, содержащиеся на диете с высоким содержанием холестерина в течение 12 недель, показали атеросклеротические свойства, такие как развитие масляного красного О-положительного окрашивания и инфильтрация макрофагов аортального синуса по сравнению с неатеросклеротическими мышами WT (рис. 1а). В аортальном синусе от ApoE — / — мышей XOR-белок был обильно экспрессирован в MOMA-2-положительных макрофагах, проникших в бляшку, тогда как он был очень низким в неатеросклеротическом аортальном синусе от мышей WT. Кроме того, в грудной аорте от ApoE — / — мышей XOR был увеличен в эндотелиальных клетках и гладкомышечных клетках (рис. 1b). В соответствии с этими результатами функциональная активность XOR у аорты у мышей ApoE — / — была увеличена по сравнению с мышами WT. Повышенная активность XOR наблюдалась также в печени и плазме (рис. 1c и таблица 1). Поскольку макрофаги и эндотелиальные клетки участвуют в процессе образования бляшек и эндотелиальной дисфункции, мы предположили, что XOR может играть определенную роль в обоих этих патогенных процессах атеросклероза.

Мы исследовали ли фебусостат, сильнодействующий ингибитор XOR, ингибировали образование бляшек и инфильтрацию макрофагов. Febuxostat (2,5 мг / кг / день) вводили в течение 12 недель в питьевую воду для мышей ApoE — / -, которые получали диету с высоким содержанием холестерина и значительно ингибировали активность XO в плазме в течение 12 недель по сравнению с мышами, обработанными носителем, что показывает, что эффективная доза febuxostat. С другой стороны, febuxostat не изменял массу тела, общий уровень холестерина, триацилглицерина, NEFA и уровень глюкозы, но повышенные уровни HDL были обнаружены у мышей ApoE — / — (таблица 1). Гистологически, как целая аорта, так и поперечный разрез аортального синуса показали нефтеносные О-положительные участки поражения, которые были значительно уменьшены у обработанных febuxostat ApoE — / — мышей по сравнению с обработанной транспортным средством группой (рисунок 2). Febuxostat существенно не уменьшал окрашивание MOMA-2 у мышей ApoE — / -. Эти результаты свидетельствуют о том, что ингибирование XOR с помощью febuxostat ослабляет образование бляшек, но не инфильтрацию макрофагов у мышей.

Мы оценили уровень ROS, выраженный в аортальном синусе окрашиванием DHE, показателем окислительного стресса, и обнаружили, что окрашивание было значительно увеличено в аорте у мышей ApoE — / — по сравнению с мышами WT (рисунок 3). Febuxostat значительно уменьшал окрашивание DHE у мышей ApoE — / -. Эти данные показали, что повышенная активность XO у мышей ApoE — / — связана с увеличением уровней ROS, а также с выраженностью атеросклероза и может быть ослаблена febuxostat.

Затем мы исследовали экспрессию мРНК провоспалительных генов в аорте (рис. 4). Сообщалось, что экспрессии MCP-1, IL-1α и IL-1β связаны с атеросклерозом202122. Кроме того, VCAM-1 опосредует миграцию макрофагов в ткань, а CD68 является маркером линии макрофагов23. Мы обнаружили значительно повышенные уровни мРНК MCP-1, IL-1α, IL-1β, CD68 и VCAM-1 у мышей ApoE — / -. Обработка Febuxostat значительно уменьшала экспрессию MCP-1, и наблюдалась тенденция к снижению уровней экспрессии IL-1α, IL-1β и CD68. Напротив, уровень экспрессии VCAM-1 не был затронут. Кроме того, мы исследовали eNOS, медиатор эндотелиально-зависимой релаксации и сосудистой защиты2425, и обнаружили, что уровни мННК eNOS у мышей ApoE — / — значительно усиливались febuxostat.

Мы предположили, что CCs стимулируют выделение провоспалительных цитокинов макрофагов, индуцируя продукцию XO и ROS. BMDM сначала загружали Pam3CSK4 для активации, а затем стимулировали CCs. Уровни внутриклеточной мочевой кислоты повышались с помощью CCs, предполагая, что CCs увеличивают метаболизм пуринов, что приводит к относительному увеличению эндогенной активности XOR (рис. 5a). Как и ожидалось, febuxostat полностью ингибировал увеличение внутриклеточной продукции мочевой кислоты (рис. 5а). CCs также увеличивали внутриклеточную генерацию ROS заправленными макрофагами (рис. 5b). Эта индукция ROS полностью ингибировалась NAC, поглотителем ROS, а также febuxostat (рис. 5b). Эти результаты показали, что CCs индуцирует активность XO, что приводит к увеличению уровня ROS. Затем мы проверили, индуцирует ли CCs провоспалительное выделение цитокинов. Секреция IL-1β с помощью загрунтованных макрофагов ингибировалась ингибитором каспазы z-VAD-fmk, ингибиторами ROS, а также фебусостатом дозозависимым образом (фиг. 5c). Кроме того, мы обнаружили, что MCP-1, IL-1α и IL-6, которые все играют важную роль в атеросклерозе, также индуцировались CC-стимуляцией в загрунтованных макрофагах (рис. 5d-f). Хотя ингибирование каспазы оказывало частичное действие на секрецию IL-1α и MCP-1, оно не оказывало влияния на секрецию IL-6. Febuxostat доза-зависимо уменьшала высвобождение всех этих цитокинов / хемокинов, указывая на то, что она ингибирует высвобождение как каспазы-1-зависимых, так и независимых молекул (рис. 5c-f). RAC-поглотители NAC и апоцинин рекапилировали ингибирующие эффекты febuxostat на секрецию MCP-1, IL-1β, IL-1 и IL-6 (фиг. 5c-f). Кроме того, сообщалось, что каспаза-1-зависимая гибель клеток, называемая пироптозом, участвует в нестабильности бляшек26. Febuxostat предотвращал высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH), индуцированное CCs, что указывает на то, что febuxostat не имеет цитотоксичности как таковой и может ингибировать пироптоз, индуцированный CCs (фиг. 5g). В совокупности эти результаты показали, что генерация ROS через активность XO является важным механизмом в производстве цитокинов и хемокинов, индуцированных CC.

Роли XO и ROS при атеросклерозе были хорошо описаны в предыдущих исследованиях910121314, но механизмы, которые приводят к генерации ROS, а также последствия его производства, до конца не поняты. В этом исследовании мы приводим данные, показывающие, что развитие атеромы в аорте сопровождается инфильтрацией макрофагов и локализуется с участками повышенной активности XO и ROS. Ингибирование образования XO и ROS мощным ингибитором XOR, febuxostat, ослабляло не только гистологические особенности атеросклероза, но и производство провоспалительных медиаторов в аорте. Кроме того, CCs стимулируют макрофаги для продуцирования медиаторов воспаления, участвующих в атеросклерозе через XO-зависимый путь ROS. Эти данные показывают, что генерация ROS посредством XO связывает накопление CC в атероматозном бляшке с местным воспалением, и его ингибирование может ослаблять прогрессирование атеросклероза.

Атероматозные бляшки образуются путем кристаллизации растворимого окисленного ЛПНП в СС в макрофагах15 и являются воспалительными поражениями14. Мы обнаружили, что CCs являются мощными индукторами секреции медиаторов воспаления, таких как MCP-1, IL-1α и IL-6 из макрофагов, и подтвердили, что CCs индуцирует секрецию макрофагов IL-1β через механизмы, зависящие от каспазы-1. Важность NLRP3 / каспазы-1 при атеросклерозе была поставлена ​​под сомнение. Сообщалось, что NLRP3 — / — ApoE — / — двукратно дефицитные мыши развивают атеросклероз независимо от воспаления 27. Напротив, меньшее количество атеросклеротической бляшки наблюдалось у мышей с НЛПР3 / /, трансдуцированных костным мозгом, лишенных дефицита ЛПНП или у мышей с дефицитом кальция-1 — / — ApoE — / — с двойной недостаточностью1528. Причины этих расхождений неясны, но предполагают, что воспаление при атеросклерозе не всегда требует NLRP3-воспаления.

Частицы DAMP, такие как кристаллы MSU, активируют NLRP3-воспаление через ROS-зависимые механизмы29. Макрофаги, подвергшиеся воздействию CC, показали повышенную активность XO, о чем свидетельствуют увеличение внутриклеточной мочевой кислоты и уровней ROS и поглотителей ROS, а febuxostat ингибировал продукцию IL-1β, индуцированную CCs. Мы обнаружили, что XO является основным источником ROS в макрофагах, и его результаты генерации не только в высвобождении IL-1β, но также в секреции IL-1α, IL-6 и MCP-1. Эти результаты были повторены in vivo, так как атероматозные бляшки показали повышенную активность XO, уровни ROS и экспрессию воспалительных цитокинов. И атеросклероз, и воспаление были ослаблены, когда мышей лечили фебусостатом. Сам февкустостат не влиял на липиды сыворотки в модели животных, что указывает на то, что его эффекты были вызваны ингибированием ХО. Взятые вместе, мы заключаем, что XO играет фундаментальную роль в воспалении, связанном с атеросклерозом, путем внутриклеточного накопления ROS в макрофагах, но не в липидном метаболизме.

Как in vivo, так и in vitro ингибирование XO ингибировало каспазу-1-зависимое и -независимое провоспалительное выделение цитокинов / хемокинов. In vitro, CCs индуцировали MCP-1, IL-1α и IL-6 высвобождение из макрофагов. Секреция IL-6 является каспазой-1-независимой, так как она не изменялась при добавлении z-VAD-fmk; тогда как индукция IL-1α и MCP-1 частично зависела от каспазы-1. In vivo уровень экспрессии MCP-1 снижался, когда животным давали febuxostat. Мы заключаем, что febuxostat, а также акцепторы ROS действуют как на каспаз-1-зависимые, так и на независимые пути выделения цитокинов / хемокинов с помощью CC. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения основополагающих механизмов участия ХО в каспаз-1-зависимых и зависимых путях.

Мы предполагаем, что повышенная активность XO в конечном итоге приводит к избыточному образованию ROS, что приводит к повреждению тканей. В этом контексте фармакологические ингибиторы XO, такие как febuxostat, аллопуринол и оксипуринол, как сообщается, оказывают противовоспалительное действие при различных заболеваниях, скорее всего, посредством ингибирования продукции ROS. Кроме того, недавно мы продемонстрировали ингибирующее действие febuxostat на экспрессию цитокинов / хемокинов in vitro в человеческих и мышиных макрофагах. Этот ингибирующий эффект был связан с внутриклеточными уровнями ROS, а не с уровнями мочевой кислоты11. С другой стороны, мочевая кислота, которая является одним из конечных продуктов XOR, может действовать как поглотитель для пероксинитрита (PN). Таким образом, мочевая кислота в крови, как ожидается, будет способствовать уменьшению окислительного стресса PN. Действительно, ПН участвует в множественном склерозе (МС) и экспериментальном аллергическом энцефаломиелите (ЭАЭ) на животных, а мочевая кислота, как сообщается, снижается в сыворотке пациентов с рассеянным склерозом (РС) и невритом зрительного нерва (ОН). Было высказано предположение, что более низкие уровни мочевой кислоты в сыворотке крови у пациентов с РС могут представлять собой потерю защиты от ПН. В соответствии с этим, применение мочевой кислоты было полезным в EAE. Однако в некоторых недавних исследованиях не удалось сопоставить уровни сыворотки мочевой кислоты и несколько клинических параметров MS и ON3031. Инсульт также является еще одним заболеванием, при котором мочевая кислота может играть защитную роль. Тем не менее, прогностическое значение сыворотки мочевой кислоты при остром ишемическом инсульте является спорным. В одном клиническом исследовании повышенные уровни сыворотки мочевой кислоты связаны с лучшим исходом у пациентов с инсультом 32, тогда как в другом исследовании связь между уровнями мочевой кислоты в сыворотке крови и как краткосрочным, так и долгосрочным результатом при инсульте была обнаружена33. Самое главное, что причинно-следственная связь между увеличением инсульта и снижением уровня мочевой кислоты при лечении фебуксостатом не установлена, и у пациентов с febuxostat3435 не наблюдалось обострений воспалительных заболеваний.

Среди клинически доступных ингибиторов XOR ранее сообщалось, что аллопуринол, а также febuxostat эффективны для мышиной модели атеросклероза9. Наши недавние исследования показали, что febuxostat ослабляет LPS-индуцированную MCP-1 продукцию11 и улучшает эндотелиальную дисфункцию у мышей ApoE — / — (см. Дополнительный рис. S1 oneline). Febuxostat в 1000 раз более эффективен, чем аллопуринол, в ингибировании продукции ROS или мочевой кислоты с помощью XO, и он может полностью ингибировать продукцию ROS посредством связанного с эндотелием XO, тогда как аллопуринол имеет лишь частичный эффект36. У пациентов с высокой риском сердечной хирургии с гиперурикемией, фебусостат, но не аллопуринол понижал уровень окисленного ЛПНП, окислительный стресс и скорость пульсовой волны37. Эти данные показывают, что febuxostat обладает превосходной эффективностью для аллопуринола для ингибирования продукции ROS на основе XO. Кроме того, обнаружение того, что febuxostat может ингибировать образование каспазы-1-зависимого и -зависимого цитокина / хемокина, делает его привлекательным терапевтическим агентом при атеросклерозе.

Самцов apoE — / — (B6.129P2-Apoetm1Unc / J) и мышей дикого типа (WT; C57BL / 6J) приобретали в возрасте 7 недель из лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME). С 8-недельного возраста apoE — / — мышей кормили западной диетой, содержащей 0,15% холестерина и 40% жира (F2WTD, восточные дрожжи, Токио, Япония), и вводили питьевую воду, содержащую 0,027 мг / мл фебусостата (Teijin Pharma Ltd., Токио, Япония) в течение 12 недель. В качестве неатеросклеротического контроля мышей ВТ проводили на нормальной диете за тот же период. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных (Teijin Pharma Ltd.), и каждый экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по экспериментам на животных Института биомедицинских исследований им. Тейджина. Все усилия были направлены на минимизацию страданий и минимизацию количества мышей, необходимых для оценки статистической значимости и экспериментальной воспроизводимости.

Для иммуногистохимии корень аорты замораживали в ОСТ-соединении, разрезали на серийный участок 10 мкм и окрашивали антителом MOMA-2 (AbD serotec, Raleigh, NC) и XOR-антителом (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) для оценки инфильтрации макрофагов, а также для изучения уровня белка XOR, соответственно. Для количественной оценки атеросклеротического поражения были измерены поверхности масла O-положительного поверхностного слоя масла при подготовке всей аорты. Вкратце, аорту от корня до брюшной области расчленяли и фиксировали формалином, а затем тщательно удаляли соединительные ткани. Затем вся аорта была открыта продольно, прикреплена к лицу, окрашена маслом Red O (Вако, Осака, Япония) и сфотографирована с цифровой камерой. Общая площадь поверхности и общая площадь нефтеносного О-положительного поражения определялись с использованием WinROOF ver.6 (Mitani Corporation, Токио, Япония). Степень развития атеросклеротического поражения определялась как процентная доля общей площади опухолей O-положительного масла в массе по всей площади поверхности. Кроме того, замороженные участки корня аорты также окрашивались маслом Red O, и была определена общая площадь O-положительного поражения масла Red Red. Для обнаружения супероксида замороженные срезы окрашивали 10 мкМ дигидроэтидия (DHE, Wako) в течение 30 мин с последующим контрастированием и герметизацией с помощью монтажной среды VECTASHIELD® Hard Set с DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Флуоресцентные изображения были получены с помощью аппарата BIOREVO BZ-9000 (KEYENCE, Япония), а интенсивность флуоресценции анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Два мышиных кольца аорты (длина 2 мм) готовили и помещали в аппарат магнуса (Iwashiya Kishimoto Medical Instruments, Киото, Япония) в растворе Кребса-Хенсейта (119 мМ NaCl, 25 мМ NaHCO3, 10 мМ глюкозы, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO47H2O, 1,2 мМ KH2PO4 и 2,5 мМ CaCl22H2O) с 95% O2 / 5% CO2. После уравновешивания в течение 60 мин кольца дважды сжимали с помощью 60 мМ KCl и один раз с 1 мкМ фенилэфрина (PE, Wako). Затем релаксационную реакцию получали добавлением ацетилхолина (ACh; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) для подтверждения присутствия эндотелиальных клеток. После промывки было проведено кумулятивное добавление ACh (0,001-100 мкМ) к предварительному прекурсовому кольцу с PE, чтобы получить релаксацию, зависящую от эндотелиальных клеток. Кумулятивное добавление нитропруссида натрия (SNP; 0,001-100 мкМ, Sigma-Aldrich) в PE-предварительноконтрастное кольцо выполняли для получения независимой от эндотелиальной клетки релаксации.

Активность XO / XDH в тканях или плазме измеряли с помощью анализа на основе птерина, как описано ранее38. Для образцов in vivo аорту или ткани печени гомогенизировали в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТА и коктейль ингибитора протеазы. Затем гомогенизаторы тканей или плазму подвергали взаимодействию с 50 мкМ птерином (Sigma-Aldrich) для активности XO или 50 мкМ птерин плюс 50 мкМ метиленовой синей (Sigma-Aldrich) для активности XO плюс XDH. Активность была выражена как единицы / мл (плазма) или единицы / мг белка (гомогенат ткани) с использованием пахты XO (Merck Millipore, Billerica, MA) в качестве стандарта.

Образцы крови собирали через 12 недель после введения с febuxostat. Концентрацию плазмы общего холестерина, HDL-холестерина, триацилглицерина, глюкозы и NEFA измеряли ферментативными методами с использованием автоанализатора Hitachi 7180 (Hitachi, Tokyo, Japan).

Общая РНК из аорты была экстрагирована с использованием реагента TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями производителя и преобразована в кДНК с использованием SuperScript VILO MasterMix (Life Technologies). КДНК амплифицировали с использованием SYBR® Green (Life Technologies) с генно-специфическими праймерами в системе ABI PRISM 7500 (Life Technologies). Олигонуклеотидные праймеры, используемые в экспериментах, приведены в таблице 2. Для нормализации данных для контроля входа кДНК был определен эндогенный контроль (36B4), а относительные единицы были рассчитаны с помощью сравнительного метода Ct.

Стерильные, без пирогенные СС были синтезированы, как описано ранее15. Перед экспериментом кристаллы ресуспендировали в среде RPMI1640 (Life Technologies), заземляли и обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин. Как и ожидалось, из кристаллов, не содержащих пирогенов, эти кристаллы не содержат загрязняющих веществ, способных проецировать клетки, и, следовательно, IL-1β не был обнаружен в супернатанты несферированных макрофагов, стимулированных CCs.

Клетки костного мозга были выделены из большеберцовой кости и бедра мышей C57BL / 6 дикого типа. Выделенные клетки инкубировали в течение 7 дней на чашках Петри с 30% кондиционированной средой L929 (источник M-CSF), 10% FBS (PAA labatories GmbH, Австрия), 1% HEPES (Life Technologies) и 1% пенициллин-стрептомицин ( Life Technologies) в модифицированной среде Дульбекко Eagle Medium (DMEM, Life Technologies) для дифференциации в макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM). После дифференцировки полученный BMDM отделяли с использованием холодного PBS и обрабатывали для экспериментов с стимуляцией с полной средой RPMI1640 с 10% FBS, 1% HEPES и 1% пенициллин-стрептомицином (Life Technologies).

BMDM гасят и оставляют несколько часов в 96-луночных планшетах или 48-луночных планшетах в полной среде. Для экспериментов, которые требовали грунтования, клетки стимулировали в течение ночи 100 нг / мл Pam3CSK4 (InvivoGen, San Diego, CA). Затем клетки инкубировали в неполной среде (без FBS) с febuxostat в указанных концентрациях, NAC (50 мМ, Sigma-Aldrich), Apocynin (500 мкМ, Sigma-Aldrich) или z-VAD-fmk (10 мкМ, ENZO Life Sciences , Нью-Йорк, Нью-Йорк) до стимуляции CCs (1 мг / мл) в течение 6 часов. В качестве положительного контроля использовали кристаллы МГУ при 250 мкг / мл. В конце инкубации супернатанты собирали и хранили при -20 ° С для ELISA. Клеточные экстракты готовили для активности XOR и измерения мочевой кислоты.

LDH в супернатанте измеряли с использованием набора для определения целостности гомогенной мембраны CytoTox-ONE ™ (Promega, Madison, WI) в соответствии с инструкциями производителя. Выделение LDH (%) рассчитывали по следующей формуле. Выделение LDH (%) = [(значение в пробе) — (фон)] / [(значение в образце, обработанном Triton X-100) — (фон)].

Набор MCP-1, IL-1β, IL-6 ELISA (eBioscience, Inc., San Diego, CA) и IL-1α ELISA kit (BioLegend, San Diego, CA) использовали для измерения соответствующих уровней хемокина / цитокинов в супернатантах в соответствии с инструкциями производителя.

Уровень внутриклеточного ROS измеряли с помощью набора для измерения активности флуориметрических внутриклеточных комплексов Cell Meter ™ (AAT Bioquest®, Inc., Sunnyvale, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки загружали в течение 60 минут с помощью Amplite ™ ROS green. Затем клетки предварительно обрабатывали в течение 10-15 мин с указанной концентрацией febuxostat или NAC и стимулировали 1 мг / мл CC в забуференном HEPES физиологическом растворе (Life Technologies). Интенсивность флуоресценции при 490 нм (возбуждение) и 525 нм (излучение) измеряли с помощью считывателя флуоресцентных пластин.

Внутриклеточную мочевую кислоту измеряли с помощью набора Amplex® Red Uric Acid / Uricase Assay Kit (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Уровень уксусной кислоты был выражен в виде белка нмоль / мг путем нормализации концентрации белка.

Все данные выражаются как среднее ± SEM. Для двухгрупповых сравнений использовался t-критерий ученика. Для множественных сравнений для сравнения каждой группы с группой, обработанной транспортным средством или средней группой, использовалась однонаправленная ANOVA с последующим тестом Dunnett. Все данные были статистически проанализированы с использованием программного обеспечения GraphPad PRISM версии 6.01 (GraphPad, La Jolla, CA). Различия с вероятностным значением <0,05 считались значимыми.

J.N., N.B., T.S. и M.T. разработанных экспериментов. J.N., C.M., S.T. и T.S. проведенных экспериментов. J.N., N.B., A.I. и в качестве. писал или способствовал написанию рукописи. T.K., A.S. и Y.Y. руководил этим исследованием.

Дополнительная информация

Мы благодарим Наталиан Бануд (CHUV) за отличную техническую поддержку.

Эта работа была поддержана Тейджин Фарма Лимитед и Национальной судебной экспертизой (грант 310030-130085 / 1]. CHUV получил исследовательскую поддержку от Teijin Pharma Limited. J.N., C.M., S.T., T.S., M.T., T.K. и Y.Y. являются сотрудниками Teijin Pharma Limited.

(a), репрезентативные фотографии окрашивания XOR (верхние панели), окрашивание MOMA-2 (средние панели), окрашивание масляным красным O (средние панели) и окрашивание гематоксилин-эозином (нижние панели) аортального синуса. Масштабирование: 200 мкм. (b), Репрезентативные фотографии окрашивания XOR грудной аорты. Шкалы шкалы: 100 мкм (верхние панели) и 25 мкм (нижние панели). (c), XOR-активность в грудной аорте (n = 5) и печени (n = 10) от мышей WT и ApoE — / -. Данные показаны как среднее ± SEM.

(a), Репрезентативные фотографии окраски масла красного цвета O аорты (верхние панели), окрашивание маслом красного цвета O (средние панели), окрашивание MOMA-2 в поперечном сечении (средние панели) и поперечное сечение гематоксилин- окрашивание эозином (нижние панели) аортального синуса. Шкалы шкалы: 2 мм (верхние панели) и 200 мкм (другие панели). (b), Количественный анализ масляной красной О-положительной области аорты из обработанных транспортным средством (n = 10) и обработанных febuxostat (n = 10) ApoE — / -. Данные показаны как среднее ± SEM. * P <0,05 по сравнению с обработанной машиной группой. (c), Количественный анализ красной O-положительной области поперечного сечения аортального синуса из обработанных обработанным транспортным средством (n = 19) и обработанных febuxostat (n = 19) ApoE - / -. Данные объединяются из двух независимых экспериментов, в которых аналогичные результаты были получены и показаны как среднее ± SEM. ** P <0,01 по сравнению с обработанной машиной группой. (d), Количественный анализ поперечной MOMA-2-положительной области аортального синуса у обработанных обработанным транспортным средством (n = 15) и обработанных febuxostat (n = 15) ApoE - / -. Данные объединяются из двух независимых экспериментов, в которых аналогичные результаты были получены и показаны как среднее ± SEM.

(a), репрезентативные фотографии окрашивания DHE в поперечном сечении (верхние панели), окрашивание DAPI (средние панели) и яркое поле (нижние панели) аортального синуса. Пунктирные линии указывают на поражение аортального синуса. Масштабирование: 200 мкм. (b), Количественный анализ интенсивности флуоресценции DHE в аортальном синусе от WT (n = 10), обработанных носителем (n = 8) и обработанных febuxostat (n = 10) ApoE — / -. Данные представляют собой два независимых эксперимента, в которых аналогичные результаты были получены и показаны как среднее ± SEM. #### P <0,0001 по сравнению с обработанным транспортным средством WT, * P <0,05 по сравнению с обработанными транспортным средством ApoE - / - мышами.

Анализ qRT-PCR проводили с использованием общей РНК, экстрагированной из аорты обработанных транспортным средством WT (n = 10), обработанных транспортным средством (n = 10) и обработанных febuxostat (n = 9) ApoE — / -. Данные объединяются из двух независимых экспериментов, в которых аналогичные результаты были получены и показаны как среднее ± SEM. #P <0,05, ## P <0,01, ### P <0,001 по сравнению с обработанными CART мышами WT, * P <0,05 по сравнению с обработанными автомобилем ApoE - / - мышами.

Примарный BMDM стимулировали в течение 30 мин (а) и (б) или 6 ч (с-г) с СС в присутствии или отсутствии фебусостата. (a), Влияние CCs на уровень внутриклеточной мочевой кислоты. Данные представляют собой три независимых эксперимента и показаны как среднее ± SEM. ## P <0,01 по сравнению с обработанным транспортным средством / средой, *** P <0,001 по сравнению с группой, обработанной транспортным средством / СС. (b), Влияние CCs на внутриклеточное накопление ROS. Данные представляют собой три независимых эксперимента и показаны как среднее ± SEM. **** P <0,0001 по сравнению с группой, обработанной транспортным средством / СС. (c-f), Влияние CCs на продукцию воспалительных медиаторов. Fx обозначает febuxostat; NAC, N-ацетил-L-цистеин (50 мМ); Apo, Apocynin (500 мкМ); z-VAD, z-VAD-fmk (10 мкМ), соответственно. Данные представляют собой три независимых эксперимента и показаны как среднее ± SEM. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001 по сравнению с группой, обработанной транспортным средством / СС. (g), Влияние CCs на выброс LDH. Данные представляют собой три независимых эксперимента и показаны как среднее ± SEM. ### P <0,001 по сравнению с группой, обработанной транспортным средством / средой, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с обработанной транспортным средством группой.

Плазму готовили через 12 недель с мышей, обработанных машиной WT, или у мышей ApoE — / -, обработанных транспортным средством или febuxostat. Значения — среднее ± SEM. BW указывает массу тела; T chol, общий холестерин; HDL, липопротеин высокой плотности; ТГ, триацилглицерин; NEFA, неэтерифицированной жирной кислоты. Активность XOR в плазме была получена из XO, но не XDH. Число образцов: n = 20 для активности XO и n = 10 для других параметров.

*П < 0.0001;

†П < 0.001;

‡ P <0,01 против WT;

§П < 0.05;

|| P <0,0001 по сравнению с обработанными АР-ApoE - / - мышами.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *