Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Пассивная иммунизация специфическими антителами к гипохлориту-oxLDL снижает объем бляшек у мышей с дефицитом LDL-рецептора

Passive Immunization with Hypochlorite-oxLDL Specific Antibodies Reduces Plaque Volume in LDL Receptor-Deficient Mice
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3713002/

Конкурирующие интересы: Луи Бун работает в Bioceros B.V. Других заявлений, касающихся занятости, консультирования, патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, нет. Это не изменяет приверженность авторов ко всем политикам PLOS ONE по обмену данными и материалами.

Задуманные и разработанные эксперименты: MvL MdW JWCT. Выполнены эксперименты: MvL MK DH NB LB. Проанализированы данные: MvL MK MdW AD MG JWCT. Написал документ: MvL MK MdW AD MG JWCT.

Необходимы новые стратегии преодоления осложнений сердечно-сосудистых заболеваний. Поскольку было продемонстрировано, что атеросклероз является воспалительным заболеванием, модуляция иммунной системы может быть многообещающим подходом. Ранее было высказано предположение, что антитела могут оказывать защитное действие на развитие атеросклероза. В этом исследовании мы предположили, что пассивная иммунизация антителами против oxLDL IgM, специфичными для гипохлорита (HOCl), может быть атеро-защитной у мышей.

Получают моноклональные мышиные IgM-антитела и выбирают антитело со специфичностью для гипохлорита-oxLDL (HOCl-oxLDL) (Moab A7S8). Определение последовательности VH показало, что Moab A7S8 является естественным IgM-антителом. Атеросклероз у мышей LDLr — / — индуцировался периваскулярным размещением вокруг правой сонной артерии в сочетании с кормлением диеты с высоким содержанием жиров. Затем мышей обрабатывали каждые шесть дней 500 мкг Moab A7S8, нерегулярного IgM или PBS, а сонные артерии и корни аорты изучали для атеросклероза. Пассивная иммунизация этим Moab A7S8 приводила к значительному уменьшению объема образования бляшек у мышей LDLr — / — по сравнению с PBS-обработкой (P = 0,002 и P = 0,035). Уровни холестерина снижались на 20%, когда мышей обрабатывали Moab A7S8 по сравнению с PBS. Кроме того, продуцирование антител против IgLD-специфического IgM и IgG значительно увеличивалось у мышей, обработанных Moab A7S8, по сравнению с мышами, обработанными PBS.

Наши данные показывают, что пассивная иммунизация природным IgM-антителом, направленным в HOCl-oxLDL, может снизить развитие атеросклеротической бляшки. Мы постулируем, что специфическая терапия антител может быть разработана для использования при сердечно-сосудистых заболеваниях человека.

Атеросклероз является наиболее важной причиной сердечно-сосудистых заболеваний и является основным фактором заболеваемости и смертности в западном обществе. В крупных рандомизированных клинических испытаниях осложнения, такие как инфаркт миокарда и инсульт, снижаются менее чем на 50% при текущей терапии. Поэтому разработка новых терапевтических стратегий крайне необходима для дополнения или замены современных методов лечения [1]. Как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы все чаще признаются существенными в атерогенезе [2].

Иммуномодуляция с помощью стратегии пассивной иммунизации направлена ​​на использование атеро-защитных аспектов иммунной системы для модуляции развития атеросклероза [3], [4]. В модели атеросклероза венозного трансплантата было продемонстрировано, что пассивная иммунизация с помощью T15 природных IgM-антител может снизить развитие бляшек на 25% [5]. Это указывает на потенциальную роль антител IgM в стратегиях пассивной иммунизации. T15 IgM-антитела считаются частью врожденного иммунного ответа, которые имеют естественное происхождение. Эти антитела секретируются различными наборами врожденных подобных В-клеток, клеток В-1 и маргинальных В-клеток, которые возникают на ранней стадии развития и становятся источником «естественной иммунной памяти». Из-за их взаимодействия с множеством самоопределяющихся, ранее предполагалось, что естественные антитела имеют важное значение для поддержания гомеостаза хозяина [6], [7]. Окислительные эпитопы на апоптотических клетках и на LDL (oxLDL) распознаются природным антителом T15, кодируемым фосфорилхолином (ПК), специфичным к B-1 [6]. In vitro аутоантитела IgM к oxLDL блокируют связывание и деградацию oxLDL макрофагами [8]. Повышенные уровни естественных IgM T15 антител со специфичностью для фосфорилхолинового эпитопа обеспечивают защитный эффект при атеросклерозе мышей, как показано уменьшением образования атеросклеротической бляшки [9], [10]. Кроме того, было установлено, что высокий уровень аутоантител к иммуноглобулину М против фосфорилхолина является защитным против атеросклероза человека [11] — [13], который также оказался прогностическим фактором при острых коронарных синдромах [14].

OxLDL играет ключевую роль в развитии атеросклероза. Модификация LDL в его окисленную форму вызвана несколькими различными механизмами. Один клинически значимый путь — через миелопероксидазу (МПО) и его гипохлорит окислителя (HOCl) [15], [16]. Активный МПО может быть продемонстрирован в экстрактах атеросклеротических артерий человека [17], циркулирующие уровни MPO независимо предсказывают риск развития событий сердечно-сосудистых заболеваний [18], [19] и -463 полиморфизма MPO предсказывает риск сердечно-сосудистых событий [20]. Сообщалось, что у мышей и людей повышенные титры аутоантител против HOCl-oxLDL наблюдались во время атерогенеза [4], [21] — [23]. Недавно мы продемонстрировали наличие нейтрофилов с ко-локализованным МПО в атеросклеротических бляшках мыши [24]. Кроме того, повышенные уровни циркулирующего МРО наблюдались у мышей, подверженных атеросклерозу, при подаче с высоким содержанием жира [24].

Мы предположили, что развитие атеросклеротической бляшки можно уменьшить с помощью пассивной иммунизации IgM-антител, специфичных к HOCl-oxLDL. Чтобы проверить эту гипотезу, мы выбрали моноклональное антитело, связанное с гипохлоритом-oxLDL, и провели пассивную иммунизацию в нашей модели LDLr — / — мыши для атеросклероза.

Исследование соответствует Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованному в соответствии с директивой Европейского парламента (Директива 2011/63 / ЕС). Утверждение было предоставлено комиссией по обзору этики Маастрихтского университета (номер ссылки: 2008-111) и проведено в соответствии с правительством Нидерландов.

Мышей Balb / C иммунизировали модифицированным гипохлоритом oxLDL [21]. Мышам была получена внутрибрюшинная доза 50 мкг oxLDL в 100 мкл стерильно-фильтрованного PBS и равный объем полного адъюванта Фрейнда в день 0, а затем на 21-й день и 35 с помощью бустерных инъекций 50 мкг oxLDL в неполном адъюванте Фрейнда , За пять дней до пожертвования внутривенно вводили 50 мкг oxLDL. На 48 день мышей умерщвляли и собирали селезенку. Одну клеточную суспензию готовили и сливали с HAT-чувствительной клеточной линией SP2O. Анти-oxLDL IgM-продуцирующие клоны отбирали с помощью иммуноферментного анализа с использованием фермента (ELISA), как описано ранее [22].

Антителосодержащую среду получали путем культивирования линии клеток гидридомы в IMDM, содержащей 1% FCS. К среде, содержащей IgM, добавляли 0,75 М амонийсульфата и среду загружали на тиофильную агарозную смолу. Колонку ускользали, используя 50 мМ Трис-HCl-буфер при рН 8,9. Концентрацию белка определяли как поглощение при А280. Очищенные IgM-антитела диализировали против PBS и затем фильтровали с помощью фильтра 0,2 мкМ и хранили при -80 ° C.

Очищенное моноклональное антитело IgM, распознающее HOCl-модифицированный LDL, получали, как описано выше. Препарат антитела растворяли в необращающемся буфере для образцов и анализировали с помощью SDS-полиакриламид-гель-электрофореза (SDS-PAGE) с использованием модификации метода, описанного Laemmli [25]. Десять мкг белка проводили на 2-10% градиентном геле в течение четырех часов при максимальном 400 вольт и белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher Schuell, Keene, NH) в течение одного часа при 70 В. После блокирования NaCl / Tris-буфера содержащий 1% альбумина бычьей сыворотки (BSA, Merck, Darmstadt, Germany), блоты инкубировали с антителом против IgM, связанным с щелочным фосфатитом; окрашивание визуализировали с использованием набора векторов AP (Vectot Laboratories, Burlingame, CA) в соответствии с инструкциями производителя.

Одностадийное определение моноклональных антител мыши (набор изотипов мышиного mAb, HBT, Uden, The Netherlands) включает в себя захват мышиных иммуноглобулинов с помощью моноклональных антител против мышиных крыс против мыши, которые иммобилизованы на тест-полоске.

LDL выделяли согласно Smook et al. [26] Вскоре нативный LDL и гипохлорит окисленный LDL (HOCl) покрывали в концентрации 100 мкг / мл в PBS, в планшетах для микротитрования (Nunc MaxiSorp ™, Nalgene Nunc, Rochester, NY) в течение ночи при 4 ° C. Затем лунки промывали пять раз буфером, содержащим 0,01 М Трис, 0,15 М NaCl и 0,05% Твин 20 (рН 8,0) с последующей инкубацией с чистым моноклональным IgM-антителом в различных концентрациях (100, 50, 25 и 1 мкг / мл) , 100 мкл / лунку, в буфере, содержащем 0,1 М Трис, 0,3 М NaCl и 0,05% Твин 20 (рН 8,0) и инкубировали в течение ночи при 4 ° С, как описано ранее [22]. На каждой пластине использовался положительный контроль. На следующий день планшеты промывали и инкубировали с конъюгированным с щелочной фосфатазой козлом F (ab ‘) 2 антителом против мышиного IgM (μchain) -специфического конъюгата (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Нидерланды), разбавленным 1 000 000 в инкубационном буфере для 1 час при 37 ° C. После промывки в каждую лунку добавляли 100 мкл свежеприготовленного субстрата, содержащего 1 мг / мл нитрофенилфосфата в диэтаноламинном буфере при рН 9,8. Пластины считывали при 405 нм.

Для определения последовательности VH моноклонального антитела IgM тяжелую цепь клонировали и секвенировали после амплификации с помощью универсального VH-гена специфического 5 ‘AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG 3’ [27] и праймера для константной области IgM 5 ‘[28]. Последовательность была сравнена с генами VH зародышевой линии с использованием международной информационной системы ImMunoGeneTics / -QUEry and Standardization (IMGT / V-Quest) [29]. Следуя сравнению с справочным каталогом IMGT, IMGT / V-QUEST идентифицирует связанные с аллели (D) и связанные с объединением (J) зародышевые аллели, определяет N-функциональное разнообразие и вычисляет процентные несоответствия нуклеотидов, наводящие на размышления о соматических гипермутация.

Двенадцатинедельные мышиные мыши LDLr — / — (n = 18 на группу), полученные из лаборатории Джексона, работали после 2 недель диеты с высоким содержанием жиров (0,25% холестерина, 16% жира), чтобы ввести 2 мм -констриктивная силастическая трубка вокруг обеих сонных артерий, как описано ранее [30]. Мышей анестезировали 3 — 4% изофлурана и поддерживали на 1,5-2,5%. Облегчение боли осуществляли путем подкожной инъекции бупренорфина 0,1 мг / кг, предоперационной и в конце дня. В течение 6 послеоперационных недель диету с высоким содержанием жиров продолжали, и мышей обрабатывали каждые шесть дней путем внутрибрюшинной инъекции с 500 мкг Moab A7S8, начиная со второго дня после размещения воротника. Кроме того, две контрольные группы мышей обрабатывали каждые шесть дней 500 мкг PBS или ненастраиваемое моноклональное антитело IgM, направленное на человеческий анти-EGP2 / анти-epCAM (MOC153, щедрый подарок от профессора LFMH (Lou) де Лейдж, Университетский медицинский центр Гронинген, Гронинген, Нидерланды). Конечная внутрибрюшинная инъекция была назначена за 24 часа до жертвоприношения. Всего было предоставлено 8 инъекций (см. Рисунок 1A, B для экспериментальной разработки). Мышей умерщвляли двуокисью углерода (гранулированное заполнение) и были обескровливаемы. При жертвовании правая сонная артерия была выделена и внедрена в парафин. Разделы 5 мм были сделаны, и каждые 100 мм участки были окрашены гематоксилин / эозин для анализа площади поражения. После жертвоприношения сердце и аорта были вывезены, встроены в OCT (Sakura Finetek, Zoeterwoude, Нидерланды) и заморожены на сухом льду. Сердце вырезали перпендикулярно оси сердца чуть ниже предсердий. Разделы 7 мкм были вырезаны из сердца в области, где были видны атриовентрикулярные клапаны. Для измерений площади поражения четыре участка, окрашенных толуидином, с интервалом 42 мкм, были проанализированы с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop, как описано ранее [31], [32].

A. Атеросклеротические поражения развиваются каудально к ошейнику, поперечные сечения были сделаны из общей правой сонной артерии в хвостовом направлении от воротника и собраны в параллельную серию слайдов B. Временной график эксперимента для изучения эффекта пассивного иммунизации с использованием Moab A7S8 или PBS при развитии атеросклеротической бляшки.

Чтобы определить титры антител против oxLDL, ELISA выполняли, как описано ниже. Образцы крови были взяты: до введения HFD (T = -2) за один день до размещения воротника (T = 0), через неделю после размещения воротника (T = 1, после 1 × вмешательства с PBS или Moab A7S8), через 3 недели после (T = 3, после 5 × вмешательства с PBS или Moab A7S8) и в день жертвоприношения (T = 6, после 8 × вмешательства с PBS или Moab A7S8).

Общий уровень IgM и IgG измеряли в ELISA сэндвича на основе хемилюминесцентной системы с использованием поликлонального козьего антимышиного IgM для захвата и щелочной фосфатазы (AP) -меченого козьего антимышиного IgM (специфическая для μ-цепи) для обнаружения. Сыворотку разбавляли 1:10,000 для общего IgM.

Человеческий LDL был выделен, и MDA-LDL и окисленный LDL LD были приготовлены, как описано [10]. Специфические титры антител определяли с помощью хемилюминесцентных иммуноферментных анализов, как описано [9], [33]. Вкратце, сыворотки разводили 1:100 и связывание антител с указанными антигенами измеряли с использованием следующих вторичных антител: щелочной фосфатазы (AP) -меченого козьего антимышиного IgM (специфическая для μ-цепи) и IgG (специфическая для γ-цепи) ( Сигма).

Частицы ApoB-100 захватывали на микротитровальных лунках с использованием LF3, моноклонального антитела, специфичного для мышиного апо-100, которое покрывали на лунках для микротитрования при 5 мкг / мл в PBS. После промывки и стадии блокирования плазму (1:100 в BSA-PBS) инкубировали в лунках в течение 1 часа при комнатной температуре и после дальнейшей промывки связывали IgM или IgG, детектировали с использованием конъюгированного с конъюгированной с кошкой антимышиного IgM или анти-IgG с помощью хемилюминесцентного ИФА. Для обнаружения антител T15 / EO6, связанных с захваченными частицами, содержащими apoB, использовали биотинилированный AB1-2 с последующей инкубацией с AP-мечеными NeutrAvidin и LumiPhos 530. В параллельных лунках определялось относительное количество apoB, взятое в каждом образце с использованием биотинилированного LF5, другого моноклонального антитела, специфичного для мышиного apoB-100, с последующей инкубацией с AP-меченным NeutrAvidin и LumiPhos 530. Поскольку LF5 связывается только с одним эпитопом apoB-100, количество каждого антитела, используемого в этом анализе, связанное с захваченный ЛПНП затем нормализуется на количество захваченного апо и выражается как отношение количества антител (RLU / 100 мс) к числу апоБ-100 (RLU / 100 мс) [9].

ЛПНП выделяли из плазменного пула здоровых людей. Вскоре модификацию HOCl проводили путем покрытия 100 мкл нативного ЛПНП, разведенного до 100 мкг / мл в PBS, в планшетах для микротитрования (Nunc MaxiSorp ™, Nalgene Nunc, Rochester, NY, США) в течение ночи при 4 ° C. После трехкратного промывания PBS половину каждой пластины инкубировали в течение 2 часов при 4 ° С в 36 мкМ HOCl натрия (Sigma, St Louis, MO, USA) в PBS; другую половину планшета инкубировали в PBS. После инкубации проводили промывку PBS, чтобы остановить реакцию, и планшеты хранили в PBS при 4 ° C в течение максимум 2 ч перед началом иммуноферментного анализа с ферментным связыванием (ELISA). Затем лунки промывали пять раз буфером, содержащим 0,01 М Трис, 0,15 М NaCl и 0,05% Твин 20 (рН 8,0) с последующей инкубацией в двухслойной оболочке с плазмой мыши в разбавлении 1:50, 100 мкл / лунку, в буфер, содержащий 0,1 М Трис, 0,3 М NaCl и 0,05% Твин 20 (рН 8,0) и инкубировали в течение ночи при 4 ° С. На каждой пластинке использовался положительный контроль для проверки вариации внутрипроблемного анализа. На следующий день планшеты промывали и инкубировали с конъюгированным с щелочной фосфатазой козлом F (ab ‘) 2 антителом против мышиного IgM (μchain) -специфического конъюгата (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Нидерланды), разбавленным 1 000 000 в инкубационном буфере для 1 ч при 37 ° С. После промывки в каждую лунку добавляли 100 мкл свежеприготовленного субстрата, содержащего 1 мг / мл нитрофенилфосфата в диэтаноламинном буфере при рН 9,8. Пластины считывали при 405 нм. Результаты выражают в виде средних значений поглощения (405 нм) из двух повторяющихся определений и рассчитывают путем вычитания связывания с нативным ЛПНП от связывания с oxLDL.

Для обнаружения естественных IgG T15-клонотипических антител (например, EO6) в плазме мышей использовали анализ захвата антител на основе хемилюминесцентных оснований [10]. В этом анализе использовали моноклональное анти-Т15-идиотипическое антитело AB1-2, IgG1 мыши, специфичное как для канонического T15 VH, так и для областей T15 VL, в качестве захвата антитела. Для анализа 2 мкг / мл AB1-2 в PBS наносили на микротитровальные планшеты в течение ночи при 4 ° C. После промывки и стадии блокирования 50 мкл мышиной плазмы, разведенной 1:100 в BSA-PBS, инкубировали в течение ночи при 4 ° С. После дальнейшей промывки захватываемые T15-клонотипические антитела были обнаружены с использованием конъюгированного с АПК козьи-антимышиного IgM (Sigma, St Louis, MO, USA), разбавленного в BSA-TBS, и 50% -ного водного раствора LumiPhos 530.

Красное окрашивание Picro-Sirius анализировали для определения содержания коллагена в очагах у мышей с LDLr — / -. Положительную площадь коллагена определяли из самой большой атеросклеротической бляшки каждой мыши и анализировали путем экспрессии окрашенной площади поверхности в процентах от общей площади бляшки.

образцы лазы для определения холестерина были взяты перед началом HFD, перед размещением воротника и при умерщвлении мышей. Все образцы плазмы принимались после голодания в течение ночи. Уровни уровня холестерина в плазме измеряли с помощью имеющегося в продаже набора (Sigma) в соответствии с инструкциями производителя.

Все статистические анализы были выполнены с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Ошибки показаны как SEM, а P <0,05 считается значительным. Измерения объема бляшек на ошейнике выполнялись с помощью двухстороннего ANOVA. Различия между группами анализировались с использованием однонаправленного ANOVA при анализе нескольких групп; при сравнении двух групп с параметрическими или непараметрическими данными использовались двухсторонний t-критерий Стьюдента или U-тест Манна-Уитни, соответственно.

Чтобы создать моноклональное антитело IgM к oxLDL, мы иммунизировали мышей с oxLDL человека. С помощью методов ELISA мы выбрали и увеличили масштабное моноклональное IgM-антитело со специфичностью для HOCl-oxLDL, обозначенного Moab A7S8. Этот Moab A7S8 был обнаружен как пентамерный IgM (κ) без дальнейшей деградации, что было продемонстрировано методами вестерн-блоттинга, с помощью которого был обнаружен белок размером приблизительно 800 кб (данные не показаны). Специфичность Moab A7S8 была показана с использованием ELISA, в которой Moab A7S8 сильно реагировал с HOCl-oxLDL и малональдегидом (MDA) -oxLDL (фиг. 2A). Никакой реактивности в этом анализе не наблюдалось с Cu-oxLDL, фосфорилхолином или нативным LDL, показывающим специфичность Moabs A7S8. Несущественный контрольный IgM не проявлял реактивности с HOCl-oxLD, MDA-oxLDL, Cu-oxLDL или родным LDL (данные не показаны).

A. Реакционная способность к нативным, HOCL-oxLDL и MDA-oxLDL. Измеряется ELISA, OD 405 при различных концентрациях (концентрация 100 мкМ, 50, 25, 10 и 1 мкг / мл IgM). B. Последовательность IgM гибридомы. Последовательность Moab A7S8 сравнивалась с генами VH зародышевой линии с использованием международной информационной системы ImMunoGeneTics / -QUEry and Standardization (IMGT / V-Quest). Moab A7S8 состоит из аллелей IgHV1-78 * 01, IGHJ3 * 01 и IGHD1-1 * 02, с 100% идентичностью и без пробелов. За исключением N-добавления, аллели находятся в последовательностях зародышевой линии кадра.

Moab A7S8 состоит из аллелей IgHV1-78 * 01, IGHJ3 * 01 и IGHD1-1 * 02, с 100% идентичностью и без пробелов. За исключением N-добавления, аллели находятся в последовательностях кадровой зародышевой линии, поэтому клон A7S8 B-клеток продуцирует прототипическое естественное IgM-антитело с аффинностью к oxLDL (фиг. 2B).

Чтобы оценить влияние стратегии пассивной иммунизации с использованием нашего Moab A7S8 со специфичностью HOCl-oxLDL на развитие атеросклероза, мышей LDLr — / — 8 раз вводили внутрибрюшинно с помощью Moab A7S8, контрольного IgM или PBS. При жертвовании бляшки располагались в проксимальной области до воротника и в корне аорты. Атеросклеротическое образование бляшек в правой сонной артерии анализировали с использованием окрашивания гематоксилин-эозин. Обработка природных IgM-антител против oxLDL приводила к значительному уменьшению объема образования бляшек у воротника (p = 0,002, рисунок 3A, B, E) у атеросклеротических мышей. Мыши, которым вводили PBS или контрольный IgM, вырабатывали объем бляшки, который достигает расстояния 1150 мкм от воротника. Напротив, мыши, обработанные антителами против oxLDL IgM, развивают содержание бляшек на расстоянии 750 мкм от воротника (рис. 3B, E). При 750 мкм от воротника только у 14% мышей, обработанных Moab A7S8, обнаружены любые проявления бляшек в сонной артерии, тогда как 40% обработанных PBS мышей продемонстрировали образование бляшек в этом месте (рис. 3D, E). За пределами 750 мкм расстояние от воротника образование бляшек было фактически заблокировано обработкой Moab A7S8, как показано на очень значительных эффектах на этих расстояниях. У корня аорты средний размер бляшек, измеренный у мышей, обработанных PBS, контрольным IgM и Moab A7S8, составлял соответственно 330 мкМ2 (SEM 25), 295 мкМ2 (SEM 28) и 263 мкМ2 (SEM 17) (рисунок 3C, D ). Снижение размера бляшек после обработки Moab A7S8 было значительным по сравнению с PBS-обработкой (p = 0,0352), в то время как незначительное по сравнению с контролем IgM (p = 0,3299).

A. Репрезентативные поражения PBS и моава A7S8 у мышей, вызывающих ошейник, индуцируют атеросклероз у мышей с LDLr — / -. Шкала шкалы, 100 мкм (гематоксилин-эозин). B. Процентные мыши с образованием атеросклеротической бляшки после определенных расстояний от воротника. Закрытые стержни: мыши, обработанные PBS. Серые полоски: контрольные мыши, обработанные IgM. Открытые стержни: мыши, обработанные Moab A7S8. C. Репрезентативные поражения в корне аорты из PBS и Moab A7S8, обработанных LDLr — / — мышами. Шкала шкалы, 100 мкм (толуидин синий). D. Объем атеросклеротического бляшки в корне аорты. Объем бляшки, выраженный в мм2. E. Объемный объем атеросклеротического бляшки, индуцированный воротником, измеренный каждые 50 мкм от воротника, в PBS (▪), контрольных IgM (○) и обработанных Moab A7S8 (□) мышах. Точка представляет среднее значение ± SEM.

Как показано на фиг.4, между мышами, обработанными PBS или обработанными Moab A7S8, не было различий в общем содержании коллагена в их бляшках (PBS: 27% ± 13 и Moab A7S8:29% ± 18; P = 0,588). Уровни общего холестерина и массы тела измерялись в три разных момента времени во время эксперимента. Во время эксперимента мышей, обработанных PBS, C-IgM и Moab A7S8, не отличались по массе тела (вес в граммах при жертве: PBS: 23 ± 0,4, C-IgM: 23 ± 0,2, Moab A7S8:23 ± 0,2). Уровни холестерина были одинаковыми на исходном уровне (T = -2) и до размещения каротидного кольца (T = 0). Однако при жертвоприношении мыши, обработанные Moab A7S8, показали значительный (P = 0,01) 20% нижний уровень холестерина в плазме по сравнению с мышами, которым вводили PBS (PBS: 49 ± 8 мМ / л, Moab A7S8:41 ± 8,5 мМ / л, см. рисунок 5). По сравнению с обработкой C-IgM уровни холестерина в плазме в группе, обработанной Moab A7S8, были также ниже, хотя и не статистически значимыми (C-IgM: 44 ± 10,5 мМ / л).

Процент положительного коллагена общей площади бляшки. В PBS (▪) и Moab A7S8 (□) мышей.

Уровни холестерина в сыворотке выражают в виде мМ (± SEM). Закрытые стержни: мыши, обработанные PBS. Серые полоски: контрольные мыши, обработанные IgM. Открытые стержни: мыши, обработанные Moab A7S8.

При T = -2 и T = 1 (в неделях) различий в общих титрах IgM, HOCl-oxLDL и MDA-oxLDL IgM у мышей, обработанных PBS или Moab A7S8, не наблюдалось. Однако после 5 инъекций (T = 3) антител Moab A7S8 наблюдалось значительное увеличение общего IgM, антитела HOCl-oxLDL и MDA-oxLDL IgM по сравнению с обработанной PBS группой. Общий уровень IgM также увеличивался после этого момента в группе PBS и C-IgM, но в меньшей степени по сравнению с группой, обработанной Moab A7S8. Кроме того, можно было заметить, что разница между A7S8 и контрольными группами была выше для антител HOCl-oxLDL и MDA-oxLDL IgM по сравнению с общим IgM. Сопоставимые, но более выраженные различия наблюдались после еще трех инъекций (T = 6) (рис. 6).

A. Все титры IgM, титры IgM против HOCl oxLDL IgM и B. анти-MDA oxLDL IgM у мышей, обработанных PBS (▪), контрольные мыши, обработанные IgM (o) и мыши, обработанные Moab A7S8 (□).

Кроме того, через 3 недели и 6 недель лечения Moab A7S8, Cu-oxLDL IgM, T15 IgM-антитела и IgM-apoB иммунные комплексы резко увеличились (рис. 7). Эти очень специфические эффекты, которые происходят за 3 недели лечения, ясно показывают активные биологические последствия лечения пассивной иммунизации Moab A7S8.

A. Титан антител против Cu-oxLDL IgM, антитела антител B.T15 / EO6 и иммунные комплексы C. IgM-apoB, выраженные в виде IgM / apoB. Мыши, обработанные PBS (▪), контролировали мышей, обработанных IgM (o), и у мышей, обработанных Moab A7S8 (□).

При T = -2, T = 0 и T = 1 (в неделях) различия в HOCl-oxLDL IgG, MDA-oxLDL IgG и Cu-oxLDL IgG не наблюдались. Однако, как было продемонстрировано также для антител против IgML IgM, кроме того, титры IgG против HOCl-oxLDL и MDA-oxLDL значительно увеличились после 3 и 6 недель лечения Moab A7S8 (рисунок 8).

A. Титры антител против HOCl-oxLDL IgG, титры Ig-анти-MDA-oxLDL IgG и титры антител против C. Cu-oxLDL у мышей, обработанных PBS (▪), контрольных мышей, обработанных IgM (o), и у мышей, Moab A7S8 (□).

Это исследование демонстрирует, что пассивная иммунизация Moab A7S8, направленная против HOCl-oxLDL, приводит к снижению развития атеросклероза. Путем введения Moab A7S8 мы наблюдали в нашей модели воротника значительное снижение развития зубного налета по сравнению с обработкой PBS. При развитии поражения уровень холестерина снижался, а титры IgG и IgG против oxLDL увеличивались.

При развитии атеросклероза могут возникать несколько изменений ЛПНП в окисленных формах ЛПНП (oxLDL). Гипохлорит (HOCl) является продуктом катализируемого H2O2 окисления хлорида ферментом myeloperoxidase (MPO). HOCl обладает высокой реакционной способностью и может привести к окислению частицы ЛПНП [16]. Модификация LDL с помощью HOCl является важным процессом окисления in vivo, поскольку MPO, высвобождаемый из нейтрофилов и моноцитов, проникающих через бляшки, обильно присутствует в атеросклеротических бляшках [17], [24]. Важно отметить, что в нескольких исследованиях также участвовала роль МПО в сердечно-сосудистых заболеваниях человека [18] — [20], [34].

С помощью VH-секвенирования мы могли бы определить, что наш Moab A7S8 является естественным антителом. С их способностью распознавать себя, измененные самости и чужеродные антигены естественные антитела представляют собой важную защиту первой линии от инвазивных патогенов, но также важны для тканевого гомеостаза [6], [7]. Недавно Chou et al. [33] продемонстрировал, что оксидантно-специфические эпитопы составляют доминирующую мишень для естественных антител. Примерно 30% всех клонов, секретирующих IgM, продуцируют естественные антитела, которые могут связываться с окислительно-специфическими эпитопами [33]. Воспалительные явления, как и при атеросклерозе, связаны с повышенным окислительным стрессом, а различные специфические для окисления антитела индуцируются не только во время атерогенеза, но также и во множестве других воспалительных состояний [35], [36]. Поэтому неудивительно, что наш Moab A7S8 IgM оказался частью этих естественных антител, распознающих специфические для окисления эпитопы. Ранее было показано, что другое природное антитело EO6 / T15 является атеро-защитным, частично за счет ингибирования поглощения oxLDL макрофагами [10]. Chou et al. [33] показали, что другое природное антитело, клон NA-17, также обладает способностью ингибировать поглощение MDA-oxLDL макрофагами аналогично антителу T15 / EO6. Этот механизм также продемонстрирован у людей, где антифосфорилхолин IgM может ингибировать поглощение ex vivo модифицированного LDL макрофагами [37]. Поэтому маловероятно, что наш Moab A7S8 также позволяет этим способностям ингибировать поглощение oxLDL макрофагами. Moab A7S8 отличается от антитела EO6 / T15 при использовании VH-гена: Moab A7S8 использует IgHV1-78 * 01 VHgene, который является членом семейства генов VH V5 (V1), тогда как EO6 / T15 использует ген V10 S107.1. Поэтому мы постулируем, что наш Moab A7S8 распознает другие эпитопы, чем антитела EO6 / T15, и, возможно, может иметь другие (более сильные) эффекты на атерогенез. Эпитопное картирование нашего Moab A7S8 против HOCl-oxLDL может быть важным для дальнейшего определения антигенного эпитопа (ов).

Атеро-защитная роль антител против oxLDL была продемонстрирована в исследованиях, в которых лечение с помощью различных специфических для ПК специфических молекул уменьшало развитие атеросклеротической бляшки. Во-первых, пассивная иммунизация с помощью PC-специфических антител к T15 IgM снижает атеросклероз венозного трансплантата у мышей ApoE — / — [5]. Во-вторых, иммунизация вакциной против стрептококковой пневмонии, которая содержит PC-эпитоп, связана с увеличением PC-специфических антител и уменьшением атеросклероза [10]. Кроме того, иммунизация ApoE — / — мышей ПК, связанная с белком-носителем, приводила к ингибированию атеросклероза [38]. Этот последний подход привел к получению как ПК-специфического IgM, так и IgG-антител, и было высказано предположение, что эти антитела облегчают удаление oxLDL из внеклеточной ткани артерий («обратный холестериновый транспорт») [38].

Интересно, что наш контрольный IgM уменьшил объем бляшек у корня аорты, хотя эта разница не достигла значения. Эти результаты соответствуют Cesena et al. [39], который показал, что поликлональный IgM снижает атеросклероз у мышей apoE — / -. Известно, что иммуноглобулиновая терапия оказывает множественное воздействие на иммунную функцию, включая усиление репертуара аутоантител и функцию Т-клеток с понижающей модуляцией. Действительно, мы могли бы подтвердить повышенные аутоантитела в контрольной группе IgM по сравнению с группой PBS. Несмотря на то, что наше контрольное моноклональное антитело не проявляло реакционной способности против oxLDL, как было проверено ELISA, увеличение антител к oxLDL и снижение уровней холестерина в сыворотке после лечения нашим контрольным моноклональным антителом затрудняет интерпретацию результатов, полученных нашим контрольным антителом.

В нашем исследовании мы наблюдали снижение уровня холестерина на 20% у мышей, обработанных Moab A7S8. Снижение уровня холестерина способствовало, вероятно, уменьшению развития атеросклеротической бляшки, вызванного пассивной иммунизацией с помощью Moab A7S8. Мы постулируем, что большое количество IgM-антител образовывало иммунные комплексы с (минимально) oxLDL в плазме и приводило к увеличению зазора oxLDL. Во время лечения Moab A7S8 иммунные комплексы IgM-ApoB были сильно индуцированы у наших мышей. В исследовании пневмококковой вакцинации у вакцинированных мышей были обнаружены более низкие уровни холестерина по сравнению с мышами, обработанными PBS [10]. Однако в исследовании, проведенном Fario-Neto, при использовании моноклональных антител T15 не было обнаружено снижения уровня циркулирующего холестерина [5]. Не только уровни IgM anti-oxLDL повышались во время терапии Moab A7S8 в результате пассивной иммунизации, но также были интересны также специфические уровни IgG против oxLDL, свидетельствующие о феномене иммуномодуляции. Когда IgM вводится, он может связываться с oxLDL в кровообращении, что приводит к образованию иммунного комплекса. Эти иммунные комплексы могут впоследствии поглощаться антигенпредставляющими клетками (БТР). Эти APC представляют антиген oxLDL антигенспецифическим клеткам Thelper, которые впоследствии могут приводить к специфической активации В-клеток, что приводит к увеличению продукции анти-oxLDL IgG. Было показано, что презентация специфических для ПК мотивов APC имеет важное значение для генерации антипротективных эффектов. Вакцинация с ox-LDL снижает развитие бляшек во время атерогенеза [40], и, что важно, вакцинация импульсной дендритной клеткой ox-LDL приводила к 87% -ному уменьшению размера поражения сонной артерии в той же модели атеросклероза, которая использовалась в текущем исследовании. В исследовании Эренштейна и др. [41] было показано, что природные IgM-антитела могут играть роль в ускорении первичного иммунного ответа. Иммунные комплексы, состоящие из природных IgM-антител, могут активировать комплемент и, следовательно, могут приводить к эффективной активации В-клеток. Действительно, было продемонстрировано, что первичный иммунный ответ может быть ускорен при введении специфического IgM-антитела. К сожалению, в исследовании Faria-Neto et al. [5] уровни антитела против oxLDL у мышей, обработанных природными IgG-антителами T15, не измерялись. Независимо от того, выясняется ли необходимость введения (естественных) IgM-антител и последующей индукции специфических титров IgM и IgG oxLDL, вызывает снижение развития каротидной бляшки у людей.

В заключение, это исследование демонстрирует ингибирование образования атеросклеротической бляшки путем вмешательства с Moab A7S8, специфичным для HOCl-oxLDL. Лечение приводило к снижению уровня холестерина и индукции специфических IgM и IgG титров против oxLDL. Это, очевидно, показывает активные биологические последствия стратегии пассивной иммунизации с использованием Moab A7S8 у мышей. Дальнейшие исследования должны быть сфокусированы на идентификации антигенного эпитопа (ов) на HOCl-oxLDL, который может индуцировать эти специфические IgM-антитела и IgG-антитела против oxLDL. Мы постулируем, что терапевтический эффект лечения IgM следует дополнительно изучить как потенциальное вмешательство в сердечно-сосудистые заболевания человека.

Мы хотели бы поблагодарить J. v.d. Gaar, R. Theunissen, M. Vroomen, J. Hikspoors и J. Peters за их техническую помощь, лабораторию C. Binder (Медицинский университет Вены, Австрия) для измерения антител против oxLDL и проф. др. L.F.M.H. de Leij за подарок ненасильственного контроля IgM MOC-153 (Университетский медицинский центр Гронинген).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *