Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Холестерин-индуцированный апоптоз макрофагов требует ER-стрессовых путей и взаимодействия рецептора-поглотителя типа A

Cholesterol-induced macrophage apoptosis requires ER stress pathways and engagement of the type A scavenger receptor
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2171235/

Переписка с Ира Табасом: iat1@columbia.edu

Смертность макрофагов при прогрессирующем атеросклерозе способствует децибализации некроза и бляшек. Вероятной причиной смерти макрофагов является накопление свободного холестерина (ФК) в ER, приводящее к активации разворачиваемого белка (UPR) и апоптоза, индуцированного гомологичным белком C / EBP (CHOP). Здесь мы показываем, что передача сигналов p38 MAPK необходима для индукции CHOP и апоптоза. Кроме того, два других сигнальных пути должны взаимодействовать с p38-CHOP для осуществления апоптоза. Один из них включает рецептор-поглотитель типа A (SRA). В качестве доказательства, загрузка FC с помощью механизмов без SRA активирует p38 и CHOP, но не апоптоз, если SRA не задействован. Другой путь включает c-Jun NH2-терминальную киназу (JNK) 2, которая активируется тралением холестерина в ER, но не зависит от CHOP. Таким образом, индуцированный FC-апоптоз требует передачи холестерина в ER, который запускает p38-CHOP и JNK2, и вовлечение SRA. Эти находки имеют важные последствия для понимания того, как УПО, MAPK и SRA могут сговориться вызвать гибель макрофагов, некроз почек и дестабилизацию бляшек при прогрессирующих атеросклеротических поражениях.

Сокращения, используемые в этой статье: ACAT, ацил-кофермент A-холестерин-ацилтрансфераза; ac-LDL, ацетилированный липопротеин низкой плотности; AGE, продвинутый конечный продукт для гликирования; CD, циклодекстрин; CHOP, гомологичный белок C / EBP; CML-BSA, модифицированный карбоксиметиллизином BSA; DiI, 1,1′-диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат; FC, свободный холестерин; JNK, c-Jun NH2-терминальная киназа; ЛПНП, липопротеин низкой плотности; MK2, активированная митогеном протеинкиназа-активированная протеинкиназа 2; MKK3, MAP киназа киназа 3; PERK, ds-РНК-активированная протеинкиназа-подобная ER-киназа; SRA, рецептор-поглотитель типа A; UPR, развернутый белковый ответ; VLDL, липопротеин очень низкой плотности.

Смертность макрофагов при прогрессирующих атеросклеротических поражениях способствует легочному некрозу, который, в свою очередь, связан с нестабильностью бляшек и окклюзией острой атеротромботической окклюзии сосудов (Ball et al., 1995; Ross, 1995; Libby et al., 1996; Mitchinson et al., 1996; Kolodgie et al., 2000; Feng et al., 2003b). Одной из постулируемых причин смерти макрофагов при прогрессирующих поражениях является внутриклеточное накопление неэтерифицированного или «свободного» холестерина (FC) (Lupu et al., 1987; Tabas, 2002; Feng et al., 2003b). В то время как макрофаги в ранних поражениях хранят большинство холестерина, получаемого из липопротеина, в этерифицированной форме из-за действия ацилкоферментной А-холестерина ацилтрансферазы (ACAT), макрофаги в поздних поражениях накапливают все большее количество FC, вероятно, в результате комбинированных недостатков ACAT активности и оттока холестерина (Tabas, 2002). В различных моделях клеточной культуры, которые используют макрофаги, инкубированные с ацетилированным липопротеином низкой плотности (ac-LDL) в условиях недостаточной активности ACAT, FC накапливает и индуцирует апоптоз (Kellner-Weibel et al., 1998; Yao and Tabas, 2000, 2001) ). Ac-LDL представляет собой модельный липопротеин, который, подобно различным типам атерогенных липопротеинов при атеросклеротических поражениях, проникает в макрофаги с помощью рецептора-поглотителя типа А (Henriksen et al., 1981; Brown and Goldstein, 1985). В этой модели индуцируются митохондриальные и Fas-зависимые пути апоптоза, измеряемые активацией каспазы, потерей потенциала митохондриальной мембраны и увеличением окрашивания TUNEL (Yao and Tabas, 2000, 2001).

Недавно мы показали, что трафик FC в ER запускает развернутый белковый ответ (UPR) (Feng et al., 2003a). ФК-обогащение белков с нормальным холестерином и жидкой ER-мембраной вызывает увеличение параметра порядка или упаковки мембранных фосфолипидов. Закрепление ER-мембраны этим процессом связано с дисфункцией конкретного интегрального мембранного белка, саркоэндоплазматической ретикулумной АТФазы, и, вероятно, неблагоприятное влияние оказывают другие белки мембран ER (Li et al., 2004). Эти события почти наверняка способствуют индукции UPR. Самое главное, что трафик FC в ER и активация ветви UOP гомологичного белка C / EBP (CHOP) UPR необходимы для значительной части апоптоза, вызванного FC (Feng et al., 2003a). Более того, исследования in vivo подтверждают актуальность этой модели для апоптоза макрофагов и некроза почек при прогрессирующих атеросклеротических поражениях (Feng et al., 2003b).

В текущих исследованиях в лаборатории мы обнаружили, что загрузка ФК макрофагов активирует пути p38 MAPK и c-Jun NH2-терминальной киназы (JNK) (Li et al., 2005). Ввиду этого открытия и предыдущей литературы, предполагающих возможные связи между активацией MAPK и UPR и апоптозом (Wang et al., 1996; Maytin et al., 2001; Matsuzawa et al., 2002; Yamamoto et al., 2003; Li и Holbrook, 2004), мы попытались определить, сыграла ли роль инициация p38 и / или JNK в этих процессах в FC-загруженных макрофагах. Мы обнаружили, что для индукции CHOP необходим путь MAP-киназ-киназы 3-p38 (MKK3-p38), но не путь JNK. Однако p38 и JNK необходимы для апоптоза в нашей модели вызванной FC гибели макрофагов. Самое главное, мы обнаружили, что активация MAPK и UPR недостаточна для запуска апоптоза без другого «попадания», а именно с помощью SRA. Мы обнаружили, что SRA-опосредованный запуск апоптоза не является уникальным для загрузки FC и может служить общим триггером для апоптоза в клетках, подверженных ER. Эти данные свидетельствуют о парадигме «множественного попадания», которая связана с тем, как стресс ER может привести к клеточному апоптозу, и предложить новую роль для SRA и MAPK в смерти макрофагов, некроза почек и разрушения бляшек при прогрессирующих атеросклеротических поражениях.

Текущая работа в нашей лаборатории показала, что p38 MAPK фосфорилируется и активируется на ранних, преапоптотических этапах загрузки FC. активация p38 находится ниже по течению от MKK3, что указывает на отсутствие фосфорилирования p38 в FC-загруженных макрофагах из Mkk3
— / — мышей (рис. 1 A и Li et al., 2005). Поскольку широко используемые ингибиторы пути p38 (например, SB203580) являются ингибиторами холестерина (неопубликованные данные), Mkk3-дефицитные макрофаги являются важным инструментом для определения последствий активации p38, вызванной FC.

Активация MKK3 / p38 MAPK необходима для индукции CHOP в FC-загруженных макрофагах. (A) WT и Mkk3

/
— макрофаги (Mφs) были загружены FC в течение 0, 2, 5, 7, 10 и 15 ч, используя 100 мкг / мл ac-LDL плюс ингибитор ACAT 58035. Целые клеточные лизаты получали, как описано в разделе «Материалы и методы», и иммуноблоттинг для CHOP (верхняя панель), активированный фосфо-Thr180 / Tyr182 p38 MAPK (фосфо-p38, средняя панель) и общий p38 (нижняя панель). Линии указывают области того же геля, которые были срастаны вместе. (B) WT и Chop

/
— макрофаги оставались необработанными (-) или загружались FC (+) в течение 5 ч, а лизаты были иммуноблоттированы для фосфо-р38 и общего р38. (C) WT и Mkk3

/
— макрофаги оставались необработанными (-) или загружались FC в течение 7 ч (+). В некоторых экспериментах клетки WT обрабатывали только AC-LDL, который показал только минимальное фосфорилирование MK2 (не изображено). Лизаты целых клеток были иммуноблоттированы для активированного фосфо-Thr334 MK2 (фосфо-MK2, верхняя панель) и общего MK2 (нижняя панель). (D) WT и Mk2

/
— макрофаги оставались необработанными (-) или загружались FC в течение 7 ч (+). Цельные клеточные лизаты были иммуноблоттированы для CHOP (верхняя панель), общая MK2 (вторая панель), общая p38 (третья панель) или тубулин в качестве контроля загрузки (нижняя панель). Линии указывают области того же геля, которые были срастаны вместе.

В этом контексте мы проверили, необходим ли путь MKK3-p38 для индукции эффектора UPR, CHOP, в макрофагах, которые были загружены FC стандартным протоколом (инкубация с AC-LDL плюс ингибитор ACAT [58035]). Как показано на фиг.1А (верхняя панель), CHOP индуцировали заметно через 10 ч загрузки FC в макрофагах у мышей дикого типа (WT), но не в макрофагах из Mkk3
— / — мышей. Рисунок 1 A (средняя панель) показывает, что p38 фосфорилировали в начале загрузки FC в WT, но не в Mkk3

/
—deficient, макрофаги. Как и ожидалось, фосфорилирование р38 коррелирует с активацией р38, как определено фосфорилированием in vitro субстрата р38, АТФ-2 (неопубликованные данные). Обратите внимание, что фосфорилирование p38 показало двухфазную форму: умеренная экспрессия 2-5 ч после нагрузки FC, затем уменьшение в течение 5-10 ч, затем увеличение на 15 ч. Напротив, выражение CHOP впервые стало существенным через 10 часов после загрузки FC и сохранялось до 15-часовой точки. В качестве контроля пятно было перечеркнуто для суммарного p38, которое не изменялось существенно в любом из условий (рис. 1 A, нижняя панель). Эти данные согласуются с тем, что путь MKK3-p38 находится выше по потоку от индукции CHOP. Эта точка дополнительно подтверждается данными на фиг.1B, которые показывают аналогичное фосфорилирование p38 в FC-загруженных WT и Chop
— / — макрофаги.

Было идентифицировано несколько нисходящих мишеней р38, таких как активированная митогеном белковая киназа протеинкиназа (МК) -2 (Engel et al., 1998; Rane et al., 2001), MK3 (McLaughlin et al., 1996) , MK5 (Seternes et al., 2002) и митогенных и стресс-активированных протеинкиназ 1 и 2 (Deak et al., 1998). Показано, что p38 непосредственно отвечает за фосфорилирование и регуляцию активности MK2 и локализацию в условиях клеточного стресса, что приводит к повышению регуляции цитокинов, таких как TNFα и интерлейкин-6 и -1 (Engel et al., 1998; Ueda et al., 2004). Поэтому мы стремились определить, активирована ли MK2 в ответ на загрузку FC. Как показано на рисунке 1 C (верхняя панель), разгруженные макрофаги WT продемонстрировали низкий базальный уровень фосфорилирования MK2, который был увеличен после 5 часов загрузки FC. Напротив, базальный уровень фосфорилирования MK2 в Mkk3
— / — макрофаги не увеличивались при загрузке FC. Обратите внимание на нижнее пятно, что обе изоформы общего MK2 оставались относительно постоянными при любых условиях. Фосфорилирование MK2 было намного меньше в клетках, которые были инкубированы только с AC-LDL (неопубликованные данные). В попытке определить функциональную значимость MK2 в экспрессии CHOP, индуцированной FC, мы провели серию экспериментов с макрофагами из Mk2
— / — мышей. Экспрессия CHOP почти полностью уменьшалась в Mk2
— / — дефицитные макрофаги (рис. 1 D, верхняя панель). Однако дефицит MK2 также приводил к потере белка p38 (фиг.1D, третья панель), что, вероятно, связано с его способностью стабилизировать p38 с положительной обратной связью (Kotlyarov et al., 2002). Поэтому, хотя эти данные не могут быть использованы для демонстрации прямой роли MK2 в индукции CHOP, они дают дополнительные доказательства для роли p38.

Чтобы определить, требуется ли p38 для индукции CHOP, мы повторили эти эксперименты в p38α-дефицитных макрофагах. Макрофаги были получены из мышей p38αflox, которые были пересечены с мышами LysMCre, которые экспрессируют Cre рекомбиназу в макрофагах (Clausen et al., 1999). Как показано на рисунке S1 (средняя панель, доступная по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200502078/DC1), p38 не обнаруживался в этих макрофагах. В соответствии с данными на фиг.1 индукция CHOP заметно снижалась в p38α-дефицитных макрофагах при загрузке FC (рис. S1, верхняя панель). Эти данные дополнительно определяют важность p38 в индукции CHOP для ФК-загруженных макрофагов.

Чтобы определить, активирует ли активатор пути р38, отличную от нагрузки ФК, экспрессию CHOP, мы сравнивали макрофаги, которые инкубировали в условиях FC-загрузки с теми, которые были инкубированы с известным активатором p38, стауроспорином (Yamaki et al., 2002) , Обработка 50 или 100 мкМ стауроспорина в течение 6 ч приводила к сильной активации р38, которая была аналогична той, которая наблюдалась при 6-часовом нагружении ФК (рис.2, первая панель). Кроме того, лечение 100 мкМ стауроспорином приводило к активации MK2, что было сходно с тем, что наблюдалось при загрузке FC (фиг.2, вторая панель). Однако ни концентрация стауроспорина не приводила к индукции CHOP (рис.2, третья панель). Эти данные показывают, что активация пути p38 / MK2 недостаточна для индукции CHOP.

Стауроспорин активирует p38 MAPK и MK2, но не индуцирует CHOP в макрофагах. Макрофаги оставались необработанными (-), FC загружались в течение 6 часов (+) с использованием ac-LDL plus 58035 или обрабатывали в течение 6 часов 50 или 100 мкМ ставроспорина. Иммуноблот-анализ проводили для фосфо-p38 или фосфо-MK2 (первая и вторая панели), CHOP (третья панель) и актин (нижняя панель).

Известно, что другие индукторы UPR, такие как ингибитор гликозилирования белка, туникамицин и ингибитор АТФазы саркоэндоплазматического ретикулума, тапсигаргин, активируют p38 (Hung et al., 2004; Li and Holbrook, 2004). Поэтому мы поставили под сомнение необходимость активации p38 для индукции CHOP этими двумя индукторами UPR. Как показано на фиг.3 (верхняя панель) p38 фосфорилировали через 5 часов обработки в условиях FC-загрузки или с помощью туникамицина или тапсигаргина в макрофагах WT. Фосфорилирование р38 при всех трех условиях полностью блокировалось в Mkk3
— / — макрофаги. Самое главное, что только индукция CHOP при загрузке FC была заблокирована дефицитом МКK3 (рис.3, третья панель). Таким образом, требование активации p38 в экспрессии CHOP, вызванной FC, является уникальной особенностью этого конкретного индуктора UPR.

MKK3-зависимая индукция CHOP в макрофагах уникальна для загрузки FC. WT и Mkk3

/
— макрофаги оставались необработанными, FC загружали с использованием ac-LDL plus 58035 или обрабатывали 2,5 мкг / мл туникамицина или 2 мкМ тапсигаргина в течение 7 часов. Лизаты целых клеток были иммуноблоттированы для фосфо-р38 (верхняя панель), всего р38 (вторая панель), CHOP (третья панель) и актина (нижняя панель).

CHOP необходим для апоптоза в макрофагах, которые загружаются FC с помощью AC-LDL плюс ингибитор ACAT; MKK3 требуется для индукции CHOP в этих условиях. Поэтому мы предположили, что путь MKK3 / p38 необходим для индуцированного FC апоптоза. Как показано на фиг.4А, инкубация макрофагов WT с AC-LDL плюс 58035 вызывала значительное увеличение апоптоза, но апоптоз заметно уменьшался в FC-нагруженном Mkk3
— / — макрофаги. Эти результаты не могут быть объяснены уменьшением поглощения AC-LDL или распространением холестерина, полученного из AC-LDL, в ER в Mkk3
— / — макрофаги, поскольку эстерификация холестерина, индуцированная AC-LDL, была очень схожей между WT и Mkk3
— / — макрофаги (фиг.4В). Аналогичные результаты были показаны с использованием p38α-дефицита (фиг.4С) и Mk2
— / — макрофаги (рис. S2, доступны по адресу: http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200502078/DC1). Таким образом, активация пути MKK3 / p38 путем загрузки FC макрофагов требуется для индукции CHOP и последующего апоптоза.

Путь MKK3 / p38 MAPK необходим для апоптоза макрофагов, вызванного FC. WT, Mkk3

/
— (A) и p38α-дефицитные (C) макрофаги оставались необработанными или загружались в FC (ac-LDL plus 58035) в течение 16-18 часов. Клетки окрашивали Alexa 488 Annexin V (зеленый) и йодидом пропидия (красный). Показаны типичные флуоресцентные изображения и количественные данные апоптоза из четырех полей ячеек для каждого состояния. Данные выражаются в процентах от общего количества клеток, окрашенных окклюдином V и йодидом пропидия. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 4). Бар, 25 мкм. (B) Этерификация [14C] олеата в WT или Mkk3

/
— макрофаги, инкубированные 5 ч со средой, содержащей [14С] олеат с или без 100 мкг / мл AC-LDL. Показано среднее ± SEM (n = 3) холестеринового [14C] олеата cpm на мкг общего белка.

Предыдущие данные из нашей лаборатории показали, что загрузка макрофагов с холестерином нелипопротеиновым холестеролом-насыщенным метил-β-циклодекстрином (CD-холестерином) и ингибитором ACAT привела к аналогичному уровню накопления FC-массы, который наблюдался в макрофагах, которые были нагруженный AC-LDL плюс ингибитор ACAT (Feng et al., 2003a). Загрузка FC по этому методу не вызывала апоптоза, который, как мы полагали ранее, был связан с плохой продажей холестерина, полученного из CD, в ER (Feng et al., 2003a). Однако последующие эксперименты показали, что холестерин, полученный из CD, этерифицируется ACAT в той же степени, что и липопротеин-холестерин, что указывает на то, что отсутствие апоптоза при загрузке CD-холестерина требует другого объяснения. Мы рассуждали, что выяснение этого очевидного парадокса могло бы дать важную информацию о механизме апоптоза, наблюдаемом в макрофагах, загруженных FC-производным AC-LDL.

Для начала мы определили, была ли загрузка CD-холестерина вызвана фосфорилированием p38 и индукцией UPR. Как показано на фиг.5А, p38 и MK2 фосфорилировали в макрофагах, загруженных CD-холестерином. Ранняя активация p38 CD-холестерином (то есть в течение 5-8 часов) наблюдалась независимо от ингибирования ACAT. Это открытие может быть связано с прямым воздействием холестерина на основе CD на плазматическую мембрану; это контрастирует с ситуацией с AC-LDL и ингибитором ACAT, который включает в себя трафик холестерина, полученного из липопротеина, в ER (Li et al., 2005). Однако активация p38 в течение 24 часов зависела от ингибирования ACAT, что предполагало, что эта более поздняя фаза активации может зависеть от внутриклеточного трафика холестерина. Самое главное, что CD-холестерин приводил к индукции CHOP и фосфо-PERK (ds-РНК-активированной протеинкиназы-подобной ER-киназе) на 24 часа, что указывало на активизацию UPR (фиг.5B). Учитывая эти данные, мы рассмотрели возможность того, что неспособность CD-холестерина и ингибитора ACAT индуцировать апоптоз даже через 48 часов (неопубликованные данные) объясняется более поздней активацией UPR. Например, возможно, что постепенная активация UPR CD-холестерином может «предустановить» клетки и, таким образом, сделать их устойчивыми к UPR-индуцированному апоптозу, как это наблюдалось в других системах (Hung et al., 2003) ). В этом отношении мы инкубировали ACAT-ингибированные макрофаги с липопротеином β-очень низкой плотности (VLDL), богатым холестерином липопротеином, который быстро эндоцитируется макрофагами. Как показано на фиг.5C, загрузка FC с использованием β-VLDL вызывала относительно быструю индукцию CHOP и активацию p38, аналогичную кинетике с использованием ac-LDL; однако апоптоз не индуцировался (рис.5D). Индукция CHOP по β-VLDL плюс 58035 уменьшалась в p38α-дефицитных макрофагах (рис. S3, доступный по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200502078/DC1), который продемонстрировал свою зависимость от p38. Таким образом, даже быстрая активация CHOP и p38 неспособна индуцировать апоптоз, когда используется липопротеин, отличный от AC-LDL. Поэтому мы рассмотрели альтернативную гипотезу о том, что активация Ф38-индуцированной p38 / UPR необходима, но недостаточно для апоптоза, и апоптоз активированных UPR макрофагов требует другого «удара», вызванного AC-LDL, но не CD-холестерина или β-VLDL.

Загрузка FC с использованием CD-холестерина или β-VLDL индуцирует фосфорилирование p38 MAPK и индукцию UPR. (А) Макрофаги не обрабатывали в течение 5 ч или инкубировали с CD-холестерином (CD-Chol) ± 58035 в течение указанного количества часов. Цельный клеточный лизат был иммуноблоттен для фосфо-p38, фосфо-MK2 и актина. (B) Макрофаги оставались необработанными или инкубировали с CD-холестерином плюс 58035 в течение 8 и 24 часов. Ядерные экстракты выделяли, как описано в «Материалы и методы», и подвергали иммуноблот-анализу для CHOP и нуклеоплазмина (в качестве контроля загрузки). Цитозольные экстракты иммуноблоттировали для фосфо-Thr980 PERK и актина. (C) Макрофаги инкубировали с CD-холестерином или 50 мкг / мл β-VLDL плюс 58035 в течение указанного количества часов. Целые клеточные лизаты подвергали иммуноблот-анализу для CHOP, фосфо-p38 и актина. (D) Макрофаги инкубировали с 50 мкг / мл β-VLDL или 100 мкг / мл ac-LDL плюс 58035 в течение 24 часов, а затем окрашивали Alexa 488 Annexin V (зеленый) и йодидом пропидия (красный). Бар, 25 мкм.

Одна из отличий между AC-LDL и CD-холестерином или β-VLDL заключается в том, что только AC-LDL является лигандом для SRA (Goldstein et al., 1979). Таким образом, AC-LDL может вызвать апоптоз, поскольку он доставляет холестерин и участвует в SRA, тогда как CD-холестерин и β-VLDL влияют только на стадию загрузки холестерина. Чтобы проверить эту идею, мы определили, можно ли «восстановить» апоптоз путем инкубации макрофагов с CD-холестерином (или β-VLDL) плюс лиганд, не содержащий холестерина, для SRA. Как показано на фиг.6А, ни фукоидан, ни лиганд для SRA, ни CD-холестерин не индуцировали значительную степень апоптоза, когда реагенты добавляли индивидуально. Однако комбинация реагентов вызывала выраженный апоптотический ответ. Данные на фиг.6В показывают сходные результаты с другим SRA-лигандом, карбоксиметиллизином-BSA (CML-BSA), который может иметь отношение к диабетическому макрососудистому заболеванию. CML-BSA является предшественником конечного продукта гликирования (AGE), который может образовываться во время окисления липопротеинов в сосудистой стенке (Fu et al., 1996; Miyazaki et al., 2002). Кроме того, те же результаты были получены, когда источником холестерина, не относящегося к SRA, был β-VLDL вместо CD-холестерина (фиг.6С). Чтобы оценить взаимосвязь индуцированного CD-холестерином / фукоиданом апоптоза с индуцированным AC-LDL апоптозом, мы протестировали зависимость от MKK3 / p38 MAPK-пути. Как показано на фиг.6D, индуцированный CD-холестеролом / фукоиданом апоптоз, такой как апоптоз, индуцированный AC-LDL, заметно уменьшался в Mkk3

/
— макрофаги; аналогичные результаты были найдены в Mk2

/
— макрофаги (не изображены).

SRA-лиганды индуцируют апоптоз в макрофагах, которые являются FC, загруженными не-SRA-источниками холестерина или обработаны тапигаргином низкой дозы. (А) Макрофаги оставались необработанными или инкубированными только с 25 мкг / мл фукоидана (Fuc), CD-холестерина плюс 58035 (CD-Chol) или CD-холестерина / 58035 плюс фукоидан в течение 24 часов. Клетки окрашивали Alexa 488 Annexin V (зеленый) и йодидом пропидия (красный). Показаны характерные флуоресцентные и яркие полевые изображения. Количественные данные апоптоза для каждого состояния показаны, как описано в легенде, приведенной на рисунке 4. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 8). Бар, 25 мкм. (B) Эксперимент проводили, как в (A), за исключением того, что макрофаги инкубировали в течение 24 ч с 100 мкг / мл CML-BSA, CD-холестерина / 58035 или CD-холестерина / 58035 плюс CML-BSA. Бар, 25 мкм. В качестве контроля ФК-загруженные макрофаги также обрабатывали немодифицированным БСА, что не вызывало апоптоза (не изображено). (C) Количественные данные апоптоза для макрофагов, оставшихся необработанными или инкубированными в течение 24 ч с 50 мкг / мл β-VLDL плюс 58035, β-VLDL плюс 58035 плюс фукоидан (25 мкг / мл) или 100 мкг / мл AC-LDL плюс 58035 Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 8). (D) Количественные данные апоптоза для WT или Mkk3

/
— макрофаги оставались необработанными или инкубированными в течение 24 ч с CD-холестерином / 58035 или CD-холестерином / 58035 плюс фукоидан. Клетки окрашивали Alexa 488 Annexin V и йодидом пропидия. Репрезентативные количественные данные апоптоза взяты из четырех полей клеток при каждом условии. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 4). (E) Количественные данные апоптоза для макрофагов, оставшихся необработанными или инкубированными в течение 24 ч с фукоидан (25 мкг / мл), 0,5 мкМ тапсигаргина (Tg) или фукоидана плюс тапсигаргина. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 8). Показаны характерные флуоресцентные и яркие полевые изображения. Бар, 25 мкм.

Затем мы проверили, может ли фукоидан индуцировать апоптоз в макрофагах, в которых активация UPR осуществлялась другими способами, кроме холестерина. Для этой цели макрофаги инкубировали с тапсигаргином в отсутствие или в присутствии фукоидана. Тапсигаргин является ингибитором АТФазы саркоэндоплазматического ретикулума и является индуктором UPR (Wong et al., 1993; Bertolotti et al., 2000). Как показано на фиг.6Е, только 0,5 мкМ тапсигаргина и только фукоидана вызывали очень мало апоптоза, но комбинация этих двух реагентов привела к заметному увеличению апоптоза макрофагов. Таким образом, способность фукоидана инициировать апоптоз в активированных UPR клетках не зависит от загрузки холестерина как таковой. В этом контексте мы также показали, что способность фукоидана инициировать апоптоз в UPR-активированных клетках зависит от CHOP; апоптоз, индуцированный β-VLDL / 58035 плюс фукоидан или тапсигаргин плюс фукоидан, почти полностью блокировался в Chop

/
— макрофаги (рис. S4, доступны по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200502078/DC1).

Ни фукоидан, ни CML-BSA не являются специфичными для SRA (Bucciarelli et al., 2002). Поэтому необходимо было определить, зависит ли эффект активации апоптоза от этих молекул от SRA. Как показано на фиг.7, индуцированный CD-холестерин / фукоидан апоптоз заметно уменьшался в Sra

/
— макрофаги. Апоптоз, индуцированный β-VLDL плюс фукоидан, или тапсигаргин плюс фукоидан, также был заблокирован в Sra

/
— макрофаги (неопубликованные данные). Более того, аналогичные результаты были обнаружены с использованием блокирующего анти-SRA-антитела с макрофагами WT, который также был эффективен при блокировании поглощения 1,1′-диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндокарбоцианина перхлората (DiI) -ac-LDL (Рис. S5, A и B, см. Http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200502078/DC1). Таким образом, фукоидан и CML-BSA индуцируют апоптоз главным образом посредством взаимодействия с SRA. Мы также обнаружили, что загрузка FC с помощью AC-LDL плюс 58035 была полностью заблокирована в Sra

/
— макрофаги, которые подтвердили, что AC-LDL рассматривается прежде всего через SRA (рис. S5 C). Таким образом, способность ac-LDL (плюс 58035) индуцировать апоптоз в макрофагах может быть объяснена способностью этого липопротеина активировать UPR (то есть посредством FC-загрузки клетки) и участвовать в SRA.

Индукция апоптоза фукоиданом плюс CD-холестерин / 58035 в макрофагах требует экспрессии SRA. WT и Sra

/
— макрофаги оставались необработанными или инкубировали с CD-холестерином (CD-Chol) / 58035 плюс фукоидан (Fuc) в течение 18 часов. Клетки окрашивали Alexa 488 Annexin V (зеленый) и йодидом пропидия (красный). Показаны типичные флуоресцентные изображения. Количественные данные апоптоза для каждого состояния показаны, как описано в легенде для фиг.6. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 4). Бар, 25 мкм.

Чтобы определить, предотвратил ли недостаточность SRA активацию p38 или индукцию CHOP CD-холестерином, мы проанализировали эти параметры в WT по сравнению с Sra

/
— макрофаги. Как показано на рис. S5, D-F, фосфорилирование p38, фосфорилирование MK2 и индукция CHOP были сходными в WT и Sra

/
— макрофаги в этих условиях. Таким образом, индуцированная FC-активация p38 и индукция CHOP происходят независимо от SRA.

В экспериментах, описанных до настоящего времени, SRA-лиганд добавляли к макрофагам в то же время, что и источник холестерина. Чтобы определить, может ли добавление лиганда SRA после загрузки холестерина вызвать апоптоз, макрофаги загружали CD-холестерином (плюс 58035) в течение 24 часов, а затем обрабатывали фукоидан в течение дополнительных 8 часов. Как показано на фиг.8А, клетки, которые были обработаны CD-холестерином в течение 24 часов и оставались необработанными в течение дополнительных 8 ч, имели очень мало индукции апоптоза. Однако, когда клетки, загруженные холестерином, впоследствии обрабатывали фукоиданом в течение 8 ч, наблюдался заметный рост апоптоза. Как и ожидалось, клетки, которые получали CD-холестерин плюс фукоидан в течение всего 32-часового периода, имели еще большую индукцию апоптоза. Аналогичные результаты были получены с использованием β-VLDL вместо CD-холестерина (фиг.8В). Апоптоз также наблюдали, когда макрофаги инкубировали с фукоиданом, а затем с β-VLDL плюс 58035 (неопубликованные данные). Таким образом, вовлечение SRA до или после загрузки холестерина способно индуцировать апоптоз в FC-загруженных активированных UPR макрофагах.

Взаимодействие SRA вызывает апоптоз в макрофагах, которые были загружены FC до воздействия SRA-лиганда. (А) Макрофаги инкубировали с CD-холестерином (CD-Chol) / 58035 в течение 32 часов. Некоторые из клеток не получали фукоидана (Fuc), некоторые получали фукоидан (25 мкг / мл) в начале инкубационного периода, а некоторые получали фукоидан после 24 часов инкубации. (B) Макрофаги инкубировали с 10 мкг / мл β-VLDL плюс 58035 в течение 24 часов. Некоторые из клеток не получали фукоидана, а некоторые получали фукоидан после 16 ч инкубации. Для обоих наборов экспериментов клетки окрашивали Alexa 488 Annexin V (зеленый) и йодидом пропидия (красный). Показаны типичные флуоресцентные изображения. Количественные данные апоптоза для каждого состояния показаны, как описано в легенде для фиг.4. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 4). Бар, 25 мкм.

В предыдущих исследованиях были предложены роли JNK в индуцированном SRA продуцировании цитокинов и интернализации SRA (Hsu et al., 2001; Ricci et al., 2004). Поэтому мы рассмотрели возможность того, что передача сигналов JNK сыграла роль в SRA-зависимом апоптозе в активированных UPR макрофагах. В связи с этим мы недавно показали, что JNK активируется, когда макрофаги FC загружаются с помощью AC-LDL плюс 58035 (Li et al., 2005). Чтобы проверить возможную роль JNK в апоптозе, индуцированном UPR-SRA, мы впервые использовали ингибитор JNK SP600125 (Bennett et al., 2001). Как показано на фиг.9, А и В, предварительная обработка макрофагов с помощью SP600125 блокировала апоптоз, который был индуцирован ac-LDL plus 58035 и тапсигаргином плюс фукоидан. Чтобы оценить конкретную роль JNK2, мы использовали Jnk2

/
— макрофаги вместо ингибитора JNK и обнаружили аналогичное ингибирование апоптоза (фиг.9С). Таким образом, активация JNK, в общем, и активация JNK2, в частности, необходимы для UPR-SRA-зависимого апоптоза в макрофагах.

JNK2 необходим для апоптоза, но активация не зависит от взаимодействия SRA. (А) Макрофаги предварительно инкубировали в течение 30 мин с 10 мкМ SP600125 или с носителем, а затем инкубировали в течение 18 часов в среде отдельно или в среде, содержащей AC-LDL плюс 58035 ± SP600125. Клетки окрашивали Alexa 488 Annexin V (зеленый) и йодидом пропидия (красный). Показаны типичные флуоресцентные изображения и количественные данные апоптоза из четырех полей ячеек для каждого состояния. Данные выражаются в процентах от общего количества клеток, окрашенных окклюдином V и йодидом пропидия. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 4). Бар, 25 мкм. (B) Макрофаги предварительно инкубировали в течение 30 мин с 15 мкМ SP600125 (SP) или с носителем, а затем инкубировали в течение 18 часов в среде, содержащей только 1 мкФ фукоидана (Fuc), 0,5 мкМ тапсигаргина (Tg) или обоих соединений. Количественные данные апоптоза для каждого состояния показаны, как описано в (A). Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 4). (C) WT или Jnk2
— / — макрофаги инкубировали в течение 18 ч в среде отдельно или в среде, содержащей AC-LDL плюс 58035, 0,5 мкМ тапсигаргина или 0,5 мкМ тапсигаргина плюс 25 мкг / мл фукоидана. Количественные данные апоптоза для каждого состояния показаны, как описано в (A). Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 4). (D) Макрофаги инкубировали с 0,5 мкМ тапсигаргином или 0,5 мкМ тапсигаргина плюс 25 мкг / мл фукоидана в течение 0, 1, 2 и 3 ч. Цельные клеточные лизаты были получены, как описано в «Материалы и методы», и были иммуноблоттированы для активированных фосфо-Thr 183 / Tyr185 JNK (фосфо-JNK, верхняя панель) и общего JNK (нижняя панель). (E) Макрофаги предварительно инкубировали в течение 30 мин с помощью среды или среды, содержащей антитело против SRA 2f8 или контрольный IgG2b с изотипом (30 мкг / мл). Клетки инкубировали в течение 3 часов в среде отдельно или в среде, содержащей 0,5 мкМ тапсигаргина плюс 25 мкг / мл фукоидана. Цельные клеточные лизаты были получены, как описано в «Материалы и методы», и были иммуноблоттированы для активированного фосфо-Thr 183 / Tyr185 JNK (верхняя панель) и общего JNK (нижняя панель). (F) WT и Jnk2

/
— макрофаги (Mφs) были загружены FC в течение 0 или 12 и 15 ч с использованием AC-LDL 100 мкг / мл плюс ингибитор ACAT 58035. Целые клеточные лизаты получали, как описано в «Материалы и методы», и были иммуноблоттированы для CHOP ( верхняя панель), общий JNK (средняя панель) и актин (нижняя панель).

Первоначальная гипотеза заключалась в том, что участие JNK будет связано с сигнализацией SRA. Однако дополнительные эксперименты показали, что JNK играет роль, независимую от SRA. Во-первых, только тапсигаргин индуцировал фосфорилирование JNK, что согласуется с предыдущими данными в литературе (Li и Holbrook, 2004), и этот эффект не был дополнен фукоиданом (фиг.9D). Во-вторых, предварительная обработка клеток блокирующим SRA-антителом (2f8), который эффективно ингибирует поглощение DiI-ac-LDL в этих клетках (см. Рис. S5B), не блокирует фосфорилирование JNK (рис.9 E). В-третьих, предыдущая работа в нашей лаборатории показала, что трафик холестерина в ER необходим для активации JNK (Li et al., 2005), что также указывает на то, что JNK активируется перегрузкой ER холестерина.

Этот последний вопрос поднял важную проблему: была ли сигнализация JNK задействована в пути UPR-CHOP. Предыдущие работы показали, что активация JNK не была ниже CHOP, поскольку JNK фосфорилировали в той же степени в FC-загруженном Chop
+ / + и Chop
— / — макрофаги (Li et al., 2005). Чтобы определить, был ли JNK выше по потоку от CHOP, экспрессия CHOP на основе FC была проанализирована в Jnk2
— / — макрофаги. Как показано на фиг.9F, индукция CHOP была одинаковой в FC-загруженных WT и Jnk2
— / — макрофаги. Аналогичные результаты наблюдались с использованием ингибитора JNK SB600125 (неопубликованные данные). Таким образом, активация JNK2 необходима для UPR-SRA-зависимого апоптоза, а в случае FC-загруженных макрофагов является частью пути ER-холестерина, который не зависит от ветви CHOP UPR.

Таким образом, результаты этого исследования подтверждают модель, в которой, по меньшей мере, два других «хита» должны сочетаться с путём p38-UPR-CHOP для осуществления апоптоза в макрофагах: вовлечение SRA и активация JNK2 (рис.10). Эти удары могут быть активированы отдельными индукторами, как показано на рисунке, или тем же индуктором, что и в случае с AC-LDL.

Модель того, как стресс ER, пути MAPK и взаимодействие SRA сговариваются, индуцируют апоптоз в FC-загруженных макрофагах. Избыточная загрузка FC ER вызывает реакцию ER-напряжения, которая приводит к активации p38 и JNK. Активация p38, в свою очередь, индуцирует эффектор UPR, CHOP. Три пути — p38-CHOP, JNK и вовлечение SRA-комбата для индукции апоптоза. Ac-LDL способен запускать все три пути, поскольку он доставляет холестерин в клетки и является лигандом для SRA.

Исследования современных атеросклеротических бляшек у экспериментальных животных и людей показали сильную корреляцию между обогащением ФК, смертью макрофагов и патологическим некрозом (Ball et al., 1995; Ross, 1995; Libby et al., 1996; Mitchinson et al., 1996; Kolodgie et al., 2000; Feng et al., 2003b). Лекарственный некроз, вызванный непосредственно смертью макрофагов и вероятными результатами постпоптотического некроза этих клеток при отсутствии фагоцитарного разминирования (Kockx, 1998), считается осаждающим событием при разрыве бляшек (Mitchinson et al., 1996). Разрыв налета, в свою очередь, приводит к острой атеротромботической окклюзии сосудов и инфаркту тканей (Kolodgie et al., 2004). Таким образом, выяснение механизмов смерти макрофагов при передовых атеросклеротических поражениях является важным шагом в понимании самой важной стадии атеросклеротического сосудистого заболевания.

Связь между поздним поражением макрофагов и его обогащением была предложена несколькими исследованиями (Small et al., 1984; Lundberg, 1985). Наша недавняя работа в этой области дала доказательства активации UPR и необходимости эффектора UPR, CHOP, в результате вызванной FC гибели макрофагов (Feng et al., 2003a). Мы предоставили данные in vivo, свидетельствующие о важности этого пути при прогрессирующем некрозе поджелудочной железы, а другие группы также обнаружили доказательства активации UPR при прогрессирующих атеросклеротических поражениях (Feng et al., 2003b, Austin et al., 2004). Тем не менее, по мере дальнейшего изучения этих процессов выяснилось, что активация и апоптоз, индуцированные ФК, были более сложными, чем первоначально оценивалось. В этом контексте работа здесь показала несколько критических шагов в этих процессах, изображенных на рисунке 10. Эта новая модель имеет важные клеточные биологические и патофизиологические последствия.

Несколько новых вопросов подняты результатами этого исследования. Например, будущим исследованиям необходимо будет рассмотреть молекулы вверх по течению в путях MKK3-p38 и JNK, которые стимулируются загрузкой FC, и молекулы, расположенные ниже по течению, которые приводят к активации UPR и апоптозу. Как правило, пути MKK3-p38 и JNK инициируются одной из нескольких восходящих киназ, включая MEKK1-4, MLK2-3, DLK, ASK1, Tpl2 и Tak1, которые активируются различными формами клеточного стресса (Nishitoh et al. , 2002; Roux and Blenis, 2004; Kaneto et al., 2005). Примерами клеточных стрессов, которые, как известно, активируют эти киназы, являются окислительный стресс, воспалительные цитокины, гипоксия / ишемия и УФ-облучение (Roux and Blenis, 2004). Было показано, что p38 фосфорилируется стрессорами ER, такими как туникамицин и тапсигаргин (Hung et al., 2004; Li and Holbrook, 2004); однако молекулы, которые связывают ER-стресс с активаторами-предшественниками р38, не идентифицированы. Было показано, что JNK активируется ER-стрессом — в этом случае с помощью ASK1-зависимого механизма (Nishitoh et al., 2002) — но дальнейшие подробности этого пути еще предстоит выяснить. В макрофагах, нагруженных FC, устойчивое фосфорилирование p38 и фосфорилирование JNK ингибировали 70 нМ U18666A, который избирательно блокирует трафик холестерина в ER (Feng et al., 2003a; Li et al., 2005). Однако фосфорилирование p38 и JNK не блокировалось в Chop

/
— макрофаги. Эти данные повышают интересную возможность того, что не-CHOP-ветвь UPR (например, ветвь Ire1-XBP-1) или путь стресса ER, кроме UPR (например, PKR-путь [Gardner et al., 2005] ), помогает инициировать или поддерживать фосфорилирование p38 или JNK. Молекулярная основа этих выводов, а также нижестоящих путей, связывающих p38 и JNK с индукцией CHOP и апоптозом, будет предметом будущих исследований.

Одним из важных новых вопросов, поднятых в этом исследовании, является механизм, посредством которого взаимодействие SRA вызывает апоптоз в FC-загруженных / UPR-активированных макрофагах. Предыдущие отчеты предполагали возможные сигнальные эффекты SRA. Miki et al. (1996) показали, что инкубация человеческих макрофагов ТНР-1 с индуцированным AC-LDL тирозиновым фосфорилированием нескольких клеточных белков. В частности, тирозинкиназа Lyn была фосфорилирована и активирована в течение 30 с связывания AC-LDL, и было обнаружено, что Lyn ассоциируется с SRA с помощью экспериментов с иммунопреципитацией. Hsu et al. (1998) нашли аналогичные результаты, используя липопротеиновые и нелипопротеиновые лиганды SRA. Кроме того, эти исследователи показали, что PLCγ1 и PI3-киназа были фосфорилированы и что активность клеточного PKC была увеличена за счет взаимодействия SRA. В этом исследовании одним из последующих эффектов активации киназы была индукция активатора плазминогена урокиназного типа (Hsu et al., 1998). Однако исследования Ким и др. (2003) показали, что фосфорилирование тирозина PI3-киназы не зависит от SRA, но требует CD-14. В последующем исследовании участие SRA в мышиных макрофагах J774 было вовлечено в сигнальные каскады с участием тирозинкиназы Src, которая активировала Rac1 и p21-активированную киназу. Эти пути активировали JNK и p38 с последующей индукцией интерлейкина-1 (Hsu et al., 2001). Наконец, недавнее исследование Ricci et al. (2004) представили данные, в которых участвовал JNK в фосфорилировании и эндоцитарной функции SRA. Наши данные показывают, что активация JNK необходима для ER-зависимого апоптоза, связанного с SRA, но роль JNK находится в компоненте ER-стресса, а не в компоненте SRA. Будущая работа будет направлена ​​на определение того, участвуют ли эти ранее сообщенные сигнальные события, не связанные с JNK SRA, или другие, в эффекте активации апоптоза SRA-лигандов в FC-загруженных / UPR-активированных макрофагах.

На более фундаментальном уровне нам нужно будет определить, необходима ли интернализация лиганда SRA для эффекта, и инициирует ли инициирование только SRA или взаимодействие SRA с другим «сигнальным рецептором». Этот последний сценарий может произойти с помощью SRA- опосредованный рекрутинг другого рецептора при взаимодействии или путем многовалентного связывания лигандов с SRA с одним или несколькими другими рецепторами. В связи с этим известно, что фукоидан и CML-BSA взаимодействуют с другими рецепторами.

Модель апоптоза с множественным ударом, описанная здесь, имеет потенциально важные биологические последствия клеток, связанные с стрессом ER. Наше нынешнее мнение состоит в том, что стресс ER поражает тонкий баланс между выживанием и апоптозом, который, в отсутствие других «хитов», способствует выживанию. Выживаемость клеток на начальных этапах стресса ER, вероятно, необходима для того, чтобы восстановить работоспособность процессов восстановления. Например, один или несколько эффекторов после активации PERK участвуют в выживании клеток, потому что генетический дефицит PERK заметно ускоряет гибель клеток, в том числе вызванный загрузкой FC (Feng et al., 2003a). И наоборот, клетки, подвергнутые ER-стрессу, должны быть готовы пройти апоптоз, если процессы восстановления не удастся (Kadowaki et al., 2004). Таким образом, ER-стресс вызывает несколько анти- и проапоптотических процессов, которые удерживают клетки в течение некоторого времени, но позволяют быстро начать апоптоз, когда это необходимо. В этом контексте активированные FC / UPR макрофаги могут быть сбалансированы в пользу выживания клеток; вовлечение SRA может склонить равновесие к апоптозу путем ингибирования одного или нескольких механизмов выживания и / или путем индукции дополнительных проапоптотических механизмов.

Основным липопротеином SRA-лиганда при атеросклеротических поражениях является окисленный липопротеин низкой плотности (LDL), но этот липопротеин оказывает комплексное воздействие на жизнеспособность макрофагов. Например, при низких концентрациях окисленный ЛПНП способствует выживанию макрофагов путем индукции пути Akt (Hundal et al., 2001). Хотя более высокие концентрации окисленного ЛПНП индуцируют апоптоз (Wintergerst et al., 2000), сомнительно, существуют ли эти высокие уровни в поражениях. Более того, антиоксидантные испытания у людей не проявили благотворного влияния на болезнь коронарных артерий (Meagher and Rader, 2001). И наоборот, развитые атеросклеротические поражения имеют огромное количество липопротеинов не-SRA-лигандов, которые очень эффективны при загрузке макрофагов с холестерином, таких как липопротеины остатков (которые моделируются β-VLDL) и агрегированные липопротеины (Hoff and Morton, 1985; Guyton and Клемп, 1996). Кроме того, эти поражения также имеют обильные молекулы, которые могут связываться с SRA, такие как матричные белки. Особый интерес представляет обнаружение того, что повышенные уровни продвинутых конечных продуктов гликозилирования (AGE) и продвинутых конечных продуктов липоксидации (Baynes and Thorpe, 2000) обнаружены у пациентов с диабетом и недиабетикой, у которых заболевание коронарной артерии (Kilhovd et al., 1999) ). Иммуногистохимический анализ атеросклеротических поражений человека продемонстрировал внеклеточное и внутриклеточное осаждение AGE в макрофагах (Nakamura et al., 1993). Функция AGE в качестве триггеров апоптоза может быть особенно актуальной, учитывая высокую распространенность образования бляшек и атеротромботических заболеваний сосудов при диабете.

Таким образом, приведенные здесь данные проливают новый свет на фундаментальный вопрос о том, как стресс ER приводит к апоптозу, а также о том, как сближаются UPR, MAPK и SRA, чтобы вызвать апоптоз макрофагов, некроз почек и нестабильность бляшек при распространенном атеросклерозе. Эти результаты помогут в разработке будущих механистических исследований и исследований in vivo для дальнейшего изучения клеточных биологических и патофизиологических последствий этой работы.

Пластмассовый культуральный материал Falcon и 11-миллиметровые покровные стекла были приобретены у Fisher Scientific. Тканевые культуральные среды, реагенты для культивирования клеток и Инактивированные нагреванием FBS (GIBCO BRL) были приобретены у Invitrogen. Ацил-кофермент А-холестерол-ацилтрансфераза (ACAT) ингибитор 58035 (3- [децилдиметилсилил] -N- [2- (4-метилфенил) -1-фенилэтил] пропанамид (Ross et al., 1984) был от J. Heider, формально из Сандоса (Восточный Ганновер, Нью-Джерси). Аккумулят 10 мг / мл производили в ДМСО и использовали во всех экспериментах при концентрации 10 мкг / мл. Все остальные химические реагенты, включая туникамицин, тапсигаргин, метил-β-циклодекстрин (CD), холестерин-олеат, concanavalin A и фукоидан, были приобретены у Sigma-Aldrich. Метил-β-CD насыщался холестерином, как описано ранее (Christian et al., 1997). Моноклональные антитела мыши против GADD 153 ( CHOP) и тубулина были приобретены у Santa Cruz Biotechnology, Inc. Антитела против p38 MAPK, фосфо- (Thr180 / Tyr182) p38 MAPK, фосфо- (Thr334) MAPKAPK-2, MAPKAPK-2, фосфо- (Thr183 / Tyr185) c- Jun NH2-терминальная киназа (JNK) 1/2 и JNK1 / 2 были приобретены по технологии Cell Signaling. Моноклональное антитело мыши к актину было приобретено у CHEMICON Int ernational. Антитело 2f8, направленное против рецептора-поглотителя типа А (SRA) и антител к контролируемому изотипу, было приобретено у Serotec. Конъюгированные с HRP ослиные антитела против мышиного и ослиного антител к кроличьим IgG были приобретены у Jackson ImmunoResearch Laboratories. Соединение SP600125 было приобретено у Biosource International. Тест № 2 для анализа апоптоза экспигментата Vybrant Annexin V / Propidium Iodide был получен от молекулярных зондов. Карбоксиметиллизин-модифицированный (CML) -BSA (24,5% лизиновых остатков, модифицированных как CML) и контрольный BSA (<0,5% лизина, модифицированный как CML), были предоставлены S. Thorp (Университет Южной Каролины, Колумбия, SC) (Reddy et al. , 1995). DiI-ацетил LDL был приобретен у Molecular Probes.

Mkk3

/
— мышей на фоне C57BL / 6J генерировали, как описано ранее (Wysk et al., 1999). нарубить

/
— мышей на фоне C57BL / 6J предоставили Д. Рон (Нью-Йоркский университет, Нью-Йорк, Нью-Йорк) (Zinszner et al., 1998) и Р. Берк (Колумбийский университет, Нью-Йорк, Нью-Йорк). Самки Balb / c и C57BL6J были приобретены в Лаборатории Джексона. Женский маккапк

/
— (Mk2

/
-) мышей, о которых сообщалось ранее Котляровым и др. (1999), были предоставлены Y. Wang (UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния). Sra

/
— (Msr

/
-) мышей на фоне C57BL / 6J генерировали, как описано ранее (Sakai et al., 1996). Макрофаги у самцов мышей C57BL / 6J 8-10-wk-old использовали в большинстве экспериментов в качестве регуляторов дикого типа (WT). JNK2

/
— мыши на фоне C57BL / 6J были получены, как описано ранее (Yang et al., 1998). Макрофаги с дефицитом р38 были получены у мышей p38flox / flox (Engel et al., 2005), пересекающихся с мышами LysMCre / C57BL6 (Clausen et al., 1999).

Липопротеин низкой плотности (d, 1,020-1,063 г / мл) из свежей плазмы человека выделяли ультрацентрифугированием (Havel et al., 1955). Ацетилированный-LDL (ac-LDL) получали из реакции с уксусным ангидридом, как описано ранее (Basu et al., 1976), и использовали во всех экспериментах при концентрации 100 мкг / мл. β-липопротеин с очень низкой плотностью (VLDL) был выделен из новозеландского белого кролика, который получал 2% -ную диету холестерина в течение 3 недель и голодал в ночь перед флеботомией (Tabas et al., 1990). CD-холестерин получали, как описано (Feng et al., 2003a).

Перитонеальные макрофаги у взрослых самцов C57BL6J мышей и всех мутантных мышей, используемых в этом исследовании, собирали через 3 дня после i.p. инъекции конканавалина A (Feng et al., 2003a) или 4d после i.p. инъекцию метил-BSA (mBSA) у мышей, которые ранее были иммунизированы этим антигеном (Cook et al., 2003). Для последнего метода 2 мг / мл mBSA в 0,9% физиологическом растворе эмульгировали в равном объеме адъюванта полного Фрейнда (CFA, DIFCO). Мышей иммунизировали внутрикожно 100 мкл эмульсии. 14d позже, протокол иммунизации был повторен, за исключением неполного адъюванта Фрейнда вместо CFA. Спустя 7 дней мышей вводили, т.пл. с 0,5 мл PBS, содержащего 100 мкг mBSA. Макрофаги собирали через 4 дня путем перитонеального лаважа. Все макрофаги выращивали в полной среде, содержащей DME, 10% FBS и 20% кондиционированную среду с L-клеткой. Среду заменяли каждые 24 ч, пока клетки не достигли 90% слияния. В день эксперимента клетки трижды промывали в теплом PBS и инкубировали, как описано в каждой фигуре. WT и мутантные макрофаги были загружены FC с помощью инкубации с полной средой, содержащей 10 мкг / мл ингибитора ACAT 58035 плюс 100 мкл / мл AC-LDL, 5 мМ метил-β-CD / холестерина (соотношение масс 5: 1) или 10-50 мкг / мл β-VLDL. Клетки были помечены DiI-ac-LDL при 10 мкг / мл в DME / 0,02% BSA при 37 ° C в течение 60 мин. Клетки промывали PBS и инкубировали с 2% PFA в среде в течение 10 мин, промывали и рассматривали с помощью флуоресцентной микроскопии, как описано ниже.

После загрузки FC макрофаги анализировали на апоптоз ранней и средней стадии путем окрашивания с помощью присоединенного к Alexa 488 Annexin V (зеленого) и для апоптоза поздней стадии путем покрытия йодидом пропидия (красный), как описано ранее (Yao and Tabas , 2000). Клетки просматривали сразу же при комнатной температуре с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus IX-70, оснащенного лампой ртути 100 Вт (CHIU Tech Corp), фильтрующих колес, флуоресцентных фильтров (Chroma Technology Corp.), объектива Olympus LCPlanF1 20 ×, изображений (Roper Scientific) и CCD-камеру Cool Snap (RS Photometrics). Представительные поля (4-6 полей, содержащих ~ 1000 клеток) были сфотографированы для каждого условия. Количество иодид-положительных приекций V / пропидия было подсчитано и выражено в процентах от общего количества клеток по меньшей мере в четырех отдельных полях из дублированных колодцев.

Макрофаги инкубировали в течение 5 ч с AC-LDL или 18 ч с CD-холестерином, все в присутствии 0,1 мМ 14C-меченого олеата; этерификацию анализировали, как описано (Tabas et al., 1987).

Клетки лизировали в буфере, содержащем 2% SDS, 62,5 мМ Трис-HCl (рН 6,8), 10% глицерина, 50 мМ DTT и 0,01% бромфенол синего и кипятили при 100 ° С в течение 5 мин. Цитозольные и ядерные экстракты выделяли с использованием набора ядерной экстракции (PANOMIC) в соответствии с протоколом производителя. Примерно 100 мкг белка лизата отделяли на геле SDS-PAGE с 4-20% (Invitrogen) и электропередавали на 0,45 мкм нитроцеллюлозной мембране с использованием мини-переносного резервуара Bio-Rad Laboratories. Мембраны инкубировали с первичными антителами в течение ночи, а белковые полосы детектировали с помощью HRP-конъюгированных вторичных антител и улучшенного хемилюминесцентного раствора SuperSignal West Pico (Pierce Chemical Co.). Мембраны удаляли с помощью Restore Western Blot Stripping Buffer (Pierce Chemical Co.) в течение 15 мин при комнатной температуре и подвергали анализу антитела к актину для контроля различий в нагрузке.

Значения указаны как средства ± SEM; никакие строки ошибок на гистограммах не означают, что значения SEM были меньше графических символов.

На рисунке S1 показано, что индукция CHOP при загрузке FC блокируется в макрофагах, дефицитных в p38 MAPK. На фиг.22 показано, что апоптоз блокируется в макрофагах, дефицитных в МК2. На рисунке S3 показано, что p38 MAPK необходим для индукции CHOP β-VLDL. На рисунке S4 показано, что CHOP необходим для индукции апоптоза фукоиданом. На фиг.55 показано, что индукция апоптоза с помощью AC-LDL + 58035, фукоидана или CML-BSA в обогащенных холестерином макрофагах опосредуется SRA. Дополнительные материалы в Интернете доступны по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200502078/DC1.

Мы благодарим доктора. П. Гоф и Э. Рейнс за полезные обсуждения, связанные с p38 на ранних этапах проекта; Д-ра. S. Thorpe и J. Baynes за щедрое предоставление CML-BSA; Д-ра. Т. Кодама и Х. Судзуки для создания Сра
— / — мышей; и доктора. К. Мур и М. Фримен за предоставление Sra
— / — мышей на фоне C57BL6 / J.

Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения DK07715 (Т. ДеВриес-Сеймон, награжденным Институтом питания человека), HL75662 и HL57560 (I. Tabas) и HL062311 (Y. Wang). Д-р DeVries-Seimon также поддерживался Американской кардиологической ассоциацией (AHA) последипломного обучения AHA-0425805T, а д-р Ю. Ли поддерживался грантом AHA 0435364T.

Авторы не имеют противоречивые финансовые интересы.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *