Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Нокдаун генов восприимчивости психического расстройства нарушает физиологию нейронной сети in vitro

Knockdown of mental disorder susceptibility genes disrupts neuronal network physiology in vitro
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3105225/

Настоящий адрес: Исследовательский институт больницы Оттавы, Университет Оттавы, 451 Смит-Стрит, Оттава, О.Н., Канада. KIH 8M5.

Шизофрения и биполярное расстройство являются распространенными заболеваниями, вызванными множественными генами, которые нарушают мозговые цепи. Несмотря на большой прогресс в выявлении генов восприимчивости шизофрении, эти исследования оставили два основных неотвеченных механистических вопроса: существует ли основной биохимический механизм, регулирующий эти гены, и каковы электрофизиологические последствия изменения экспрессии генов? Поскольку клинические исследования предполагают аномалии в нейронных сетях, мы разработали систему для изучения нейрофизиологии нейронных сетей in vitro, где можно быстро анализировать роль генов-кандидатов-кандидатов. Используя эту систему, мы сосредоточились на трех постсинаптических белках DISC1, TNIK и PSD-93 / DLG2, каждый из которых кодируется геном восприимчивости шизофрении. Мы также рассмотрели полезность этой системы анализа в биполярном расстройстве (BD), которая имеет сильное генетическое совпадение с шизофренией, путем изучения гена восприимчивости биполярного расстройства Dctn5. Глобальное поведение нейронной сети обжига первичных культур нейронов мышиного гиппокампа было исследовано на многоэлектродных массивах (МЭА), а гены, представляющие интерес, были сбиты с использованием интерференции RNAi. Измерение множественных параметров нейронной сети продемонстрировало фенотипы для этих генов по сравнению с контрольными. Более того, различные гены нарушали свойства сети и проявляли отчетливые и перекрывающиеся эффекты. Эти данные показывают множественные гены восприимчивости для сложных психических расстройств, регулируют физиологию нервной сети и демонстрируют новую систему анализа с широким применением.

Шизофрения — это психическое расстройство с высокой наследуемостью, которое не вызвано общей мутацией одного гена, а скорее десятками или, возможно, сотнями мутаций, включая как одиночные нуклеотидные полиморфизмы (SNP) в кодирующих и регуляторных областях, так и варианты количества копий (CNV) (Craddock et al., 2005, Stone et al., 2008). Хотя этот разрозненный набор мутаций участвует в производстве подобных поведенческих эффектов у пациентов, идентичность генов не выявила ни одного семейства или категории молекул, а скорее имеет широко вовлеченные биологические процессы, такие как нейродеструкция и синаптическая передача. Хотя можно предположить, что эти гены все падают на какой-то общий аспект функции нейронов и головного мозга, все еще существует недостаток нейрофизиологических методов для тестирования и сравнения многих генов во многих различных функциональных классах, которые должны были бы дразнить дифференциальные роли каждый ген восприимчивости играет роль в этиологии шизофрении.

Имеются данные, подтверждающие гипотезу о том, что шизофрения представляет собой расстройство мозговых цепей (Arnold et al., 2005) и записи пациентов с шизофренией, биполярным расстройством (BD) и аутизмом показывают аномалии в моделях нейронной активности (Adler et al., 2006; Ford и др., 2007; Ульхас и Сингер, 2007). Совсем недавно было обнаружено, что синхронность в активности между нейронами гиппокампа и префронтальной коры была нарушена в модели шизофрении, в которой человеческое микроделение в хромосоме 22 (22q11.2) было восстановлено у мыши (Sigurdsson et al., 2010) ). Это исследование продемонстрировало прогностическую корреляцию между степенью нейронной синхронности и способностью животного выполнять учебную задачу. Хотя ни один из генов, изученных в этой работе, не находится в области 22q11.2, это исследование предполагает возможность того, что in vitro клеточный дефицит может быть прокси-индикатором или показателем для поведенческих фенотипов in vivo.

Первичные культуры нейронов гиппокампа от эмбриональных мышей, выращенных на многоэлектродных массивах, демонстрируют поведенческие характеристики, такие как разрыв и синхронный обжиг, и могут служить модельной системой для мониторинга и измерения эффектов генетических манипуляций в развитии нейронных сетей. Более конкретно, эти культуры образуют сети, которые спонтанно генерируют потенциалы действия (шипы), быстрые всплески всплесков и синхронный обжиг, которые становятся все более скоординированными в пространственных и временных измерениях по мере взросления культур (Chiappalone et al., 2006). Эта сетевая активность может быть легко записана с использованием MEA (Valor et al., 2007), которые позволяют наблюдать эффекты на уровне сети любых манипуляций с культурами. Поскольку многие кандидатные мутации для шизофрении и связанных с ними психических расстройств связаны с потерей продукта гена, либо путем делеции некоторых или всех экзонов, либо события транслокации, которое прерывает геномную структуру гена, интерференция РНК (RNAi) предлагает простой , быстрый и гибкий метод моделирования влияния этих мутаций непосредственно в первичных культурах. В предыдущих исследованиях были зафиксированы эффекты фармакологических вмешательств на сетевые свойства культивируемых нейронов (Arnold et al., 2005; Gramowski et al., 2004), однако вклад целенаправленного гена в нокдаун, включая кандидатов на гены генов, к этим фенотипам не но не сообщалось.

Чтобы определить, были ли общие дефициты сети созданы гены, связанные с шизофренией, мы изучили влияние нокдауна генов на нейронные сети, выращенные на MEA, используя siRNAs и нацелили три гена, связанные с шизофренией: TRAF2 и NCK-взаимодействующая киназа (Tnik), диски Large Homolog 2 (Dlg2 / PSD-93) и нарушена при шизофрении 1 (Disc1), а также кандидата-кандидата для биполярного расстройства (BD), Dynactin 5 (Dctn5). Все эти гены были либо локализованы по постсинаптической плотности (PSD) напрямую, либо, как и в случае Dctn5, являются частью многопротеинового комплекса, который был обнаружен в PSD (DeGiorgis et al., 2006; Kirkpatrick et al., 2006; Kwinter et al., 2009). Tnik (TNIK) представляет собой киназу, которая локализуется после постсинаптической плотности и взаимодействует с другими белками, сильно связанными с шизофренией, включая NMDA-рецепторы и DISC1 (Wang et al., 2010). Dlg2 (PSD-93 / Chapsyn-110) представляет собой бетон подмышечной ткани постсинаптической плотности, удаленный при шизофрении в исследовании вариации числа копий генома (Walsh et al., 2008) и показывает снижение экспрессии белка в почтовом ящике — пробные образцы мозга у шизофреников (Kristiansen et al., 2006). Более того, мышиные нокауты Dlg2 показывают гипофункцию передачи сигналов NMDA-рецептора (Carlisle et al., 2008), процесс, связанный с шизофренией (Javitt, 2007; Mohn et al., 1999). Гемизиготная транслокация, которая разрушает ген Disc1, выделяется шизофренией и другими психическими расстройствами в шотландской родословной (Millar et al., 2000). Наконец, шизофрения и BD, вероятно, имеют общие генетические механизмы (Purcell et al., 2009), поэтому мы также тестировали ген восприимчивости BD, Dynactin 5. Dctn5 (p25) кодирует субъединицу моторного комплекса dynactin / dynein, который известен важны для ретроградного дендритного транспорта в нейронах и находятся в пределах геномной области, которая была идентифицирована Общим исследованием ассоциации генома (GWAS) в BD (Burton et al., 2007). Кроме того, компоненты динактинового комплекса ранее были связаны с дегенерацией моторных нейронов и семейной деменцией у животных и людей (Laird et al., 2008; Munch et al., 2005).

Нейроны гиппокампа из E17.5 мышиных эмбрионов культивировали на MEA (фиг.1a) и трансфецировали через 4 дня in vitro (DIV 4). Четыре гена-мишени были протестированы с использованием трех различных условий: трансфекции siRNAs, нацеленных на представляющий интерес ген, и двух отрицательных контролей, нетрансфицированных контролей и трансфекции не нацеливающей siRNA (NTC). Сетевую активность нейронов регистрировали в течение 15 мин ежедневно, начиная с DIV 5, и продолжали до DIV 12 (фиг.1b). Нокдаун для всех генов анализировали при DIV 7 (72 ч после трансфекции) и варьировали от 60 до 84% по сравнению с контрольными культурами (фиг.1d), который находится в диапазоне, соответствующем уровням экспрессии, встречающимся в человеческих гемозиготных мутациях (Kristiansen et al., 2006; Millar et al., 2005). Поскольку мРНК и белок были собраны из всей культуры и получены как из нейронов, трансфицированных siRNAs, так и нетрансфицированных клеток, уровень выпадения экспрессии можно принять за нижний предел эффективности трансфекции. То есть, если пул siRNA, нацеленный на Dctn5, уменьшает экспрессию мРНК на 85% в целом в культуре, 85% клеток в этой культуре были трансфицированы как минимум. Таким образом, siRNAs, используемые для нацеливания генов в этом исследовании, трансфицируются в большинство клеток в культурах.

В течение первых 12 дней в контрольных культурах драматический переход от тихих нейронов к активным синхронизированным культурам наблюдался как увеличение как количества спайков, регистрируемых каждый день, так и увеличение количества регистрирующих импульсов электродов (рис.1c) , Записи MEA позволили количественно определить следующие семь параметров активности нейронной сети, которые использовались для наблюдения фенотипических эффектов нокдаунов гена: i) общие всплески, ii)% всплесков во всплесках, iii) скорость вспышки, iv) длительность импульса, v) пакетный шаблон, vi) размер сети и vii) индекс корреляции (суммированный на рисунке 1a). Эти семь параметров характеризуются высокой степенью информации, описывающей активность развивающихся нейронных сетей, и позволяют определить влияние siRNA в разных измерениях и, следовательно, облегчить прямое сравнение генов с разрозненными клеточными функциями. Сводный «штрих-код» результатов нокдауна представлен на рисунке 3, показывающий параметры, которые значительно увеличиваются или уменьшаются путем нокдауна каждого гена при каждом измеренном DIV. В дополнение к этому сводному штрих-коду подробные измерения для каждого параметра сообщаются для каждой из пяти временных точек в культуре (дополнительные таблицы 2-5).

Чтобы проверить наличие значимой токсичности siRNA в культурах, сначала был рассмотрен общий параметр спайка. Общее количество всплесков, обнаруженных на MEA, зависит, в частности, от количества клеток, находящихся в непосредственной близости от электродов (Wagenaar et al., 2006), а также плотности синапса в культуре (Brewer et al., 2009). Таким образом, общие всплески могут использоваться как косвенная мера токсичности с уменьшением общего числа шипов, что указывает на токсический эффект сиРНК. Не было существенной разницы в общих всплесках, ни увеличение, ни уменьшение, зафиксированное между трансфицированными и не трансфицированными культурами в любом из исследованных состояний (p> 0,05) (дополнительный рисунок 1), а также никакой обнаруживаемой потери нейронов при визуальном осмотре , В отсутствие очевидных цитотоксических эффектов разразившееся поведение в сетях, обработанных siRNA, было дополнительно рассмотрено более подробно.

Сетевые эффекты сбивания Тник в этих культурах были самыми драматичными, как показано на рисунке 2. Эффект был достаточно драматичным, чтобы его можно было наблюдать по растровому графику частоты обжига, регистрируемой электродами МЭА (рис.2а). Значительно измененные параметры включали: увеличение процента всплесков во всплесках, снижение длительности всплесков и усиление координации взрывной активности через нейроны в сети, что отразилось на уменьшенной паттерне и увеличении параметров индекса корреляции. Все количественные данные показаны в дополнительной таблице 2. Соотношение всплесков, в частности, представляет интерес из-за связи между синдромом шизофрении и нейронной сети. Во всех случаях наблюдаемый эффект становится значительным только после 7 DIV, что указывает на то, что сети остаются нормальными в течение по крайней мере трех дней после применения siRNA и остаются значительными на протяжении 12-го дня культуры. Задержка начала действия после применения siRNA может быть обусловлена ​​временем, которое требуется для протекания в оборот в клетке после прекращения нового перевода. Временная точка 11-12 DIV прошла ожидаемую эффективность лечения siRNA, а также может предложить «отставание» от оборота белка между трансляцией и функцией. Однако это может также указывать на необратимые последствия для развития нейронных сетей, которые не могут быть компенсированы в более позднее время.

В параллельных экспериментах уровни мРНК Dlg2 были снижены в культурах нейронов на 69 ± 3% (p <0,01) с помощью siRNA и, что наиболее поразительно, вызвало увеличение наблюдаемой скорости разрыва (фиг.3c и дополнительная таблица 4). Мы также наблюдали увеличение средней продолжительности всплесков, в отличие от результатов Тника. Эти различия в скорости и длительности импульса исчезли на одну неделю после трансфекции (DIV 12), возвращаясь к тем же уровням, что и контрольные (фиг.3c). Это говорит о временном эффекте siRNA, из которого впоследствии восстанавливаются культуры, заметно отличается от результатов Tnik. Таким образом, Dlg2 также требовался для нормальной активности нейронной сети.

Нокдаун RNAi Disc1 привел к минимальным фенотипическим эффектам по сравнению с двумя другими генами, причем только длительность всплеска, достигающая статистической значимости в DIV 12 (рис. 3d и дополнительная таблица 5). Несмотря на то, что уменьшение мРНК на 60 ± 19% (p <0,05) было недостаточным для получения более надежного фенотипа, это снижение аналогично уменьшению мРНК на 40-50%, опубликованному в исследовании человека (Millar et al. , 2005).

Наконец, мы нацелились на Dctn5, ген риска риска, для нокдауна и преуспели в сокращении его экспрессии на 86 ± 2% (p <0,01). Наиболее поразительным было то, что скорость разрыва была увеличена до 5,8 всплесков в минуту при нокдаунах Dctn5 (p <0,01) с таким же количеством разрыхляющих электродов (рис.3). Это увеличение скорости вспышки наблюдалось при нокдауне Dctn5 через три дня после трансфекции (DIV 7) и сохранялось до конца периода записи (DIV 12, рис.3). Кроме того, в отличие от контрольных культур, которые показывают устойчивое увеличение размера сети за период записи, нокдаун Dctn5 предотвратил этот рост с DIV 6 дальше, разница, которая становится значимой по DIV 12.

Гены, оцененные в этом исследовании, связаны с двумя заболеваниями, шизофренией и BD, которые, как известно из исследований GWAS, имеют общие генетические основы (Purcell et al., 2009). Сами гены также тесно связаны с одним и тем же субклеточным отделением в нейроне, а именно постсинаптической плотностью (PSD), и поэтому, как ожидается, они будут влиять на функцию сети посредством множественных частично перекрывающихся эффектов на синапс. Учитывая, что эти заболевания, как полагают, возникают из механизмов нейроразвития с электрофизиологическими последствиями (Blumberg et al., 2004; Lewis and Levitt, 2002), описанная здесь система MEA имеет потенциал для измерения эффектов генов восприимчивости, если косвенно, на биологическом уровень сетевой функции. Более того, поскольку эффекты, наблюдаемые в этом исследовании, связаны с сетями многих нейронов, а не с отдельными клетками, результаты можно считать более показательными для состояния болезни в интактном мозге и, следовательно, более уместны для предложенных гипотез о нервной синхронности, таких как гиперактивности гиппокампа при шизофрении, обсуждаемой ниже.

Эти результаты показывают, что нокдаун трех генов восприимчивости Tnik, Dlg2 и Dctn5 приводит к аномальной гиперактивности и нарушению развития нейронных сетей in vitro. Более того, полезность этого анализа генетических манипуляций нейронов проистекает из того факта, что общая сетевая активность представляет собой более высокую степень нейронной физиологии in vitro, чем более редуктивные анализы. Следует помнить, что в качестве предостережения к этим выводам уровень нокдауна для каждого гена на уровне мРНК был различным: от 85% в целом для Dctn5 до 60% для Disc1. Еще одно предостережение этого метода с использованием переходных трансфекций дуплексов siRNA заключается в том, что полный эффект нокдауна достигается только в течение короткого периода времени, обычно длительностью менее одной недели. Мы здесь сообщили о фенотипических эффектах в случаях нокдауна Tnik, Disc1 и Dctn5 в 12 DIV, через восемь дней после трансфекции siRNAs. Этот результат может указывать на медленный оборот белка в синапсе или, альтернативно, роль этих трех генов в развитии нейронной сети (по крайней мере в культурах). Напротив, Dlg2 обнаружил острые эффекты нокдауна при сетевом обстреле, восстановленном к концу периода записи. Это больше согласуется с ролью в текущей синаптической функции, а не с развитием.

Наиболее последовательным результатом всех экспериментов по нокдауну, проведенных с этими генами восприимчивости, было увеличение либо скорости разрыва, продолжительности и / или картины. Увеличение, наблюдаемое в этих параметрах, хорошо согласуется с гипотезой гиперактивной функции гиппокампа, лежащей в основе шизофренической дисрегуляции, постулируемой Энтони Грейсом и другими (Лодж и Грейс, 2007; Krieckhaus et al., 1992). Очевидно, что гиппокамп не является единственным регионом, разрушенным шизофренией и BD, однако, как экспериментальный пример использования этой экспериментальной парадигмы, тот факт, что мы наблюдаем ту же гиперактивность нейронов гиппокампа, наблюдаемую in vivo, помогает обосновать подход.

Насколько нам известно, нет опубликованных данных, свидетельствующих о том, что гены чувствительности шизофрении и BD мешают нейронной сети. Наши результаты свидетельствуют о том, что это нейрофизиологическое нарушение может указывать на многие гены психической чувствительности. Дальнейший интерес представляет явный, но частично перекрывающий характер изменений сети, вызванных подавлением различных генов. В частности, роль Тника в корреляции сетевого обжига отражается на выводах других групп в синхронной нейронной цепи. Также интригует тот факт, что Dctn5 и Dlg2 создают сходящийся фенотипический эффект на скорость всплеска, несмотря на то, что у нейронов совершенно разные функциональные роли. Эти данные свидетельствуют о том, что он будет представлять значительный интерес для тестирования многих других генов-кандидатов и более детально отображать сходящиеся фенотипы и тем самым сравнивать больше генов психиатрических заболеваний. Таким образом, может быть определено большее «взаимодействие» функций нейронных генов, чтобы помочь понять широкий спектр генов, лежащих в основе нейронной болезни.

Эта работа подтверждает гипотезу о том, что дезорганизация нейронных сетей может быть простым и надежным индикатором для тестирования многих генов, которые, как считается, предрасполагают людей к шизофрении и БД, а также к другим психическим заболеваниям. Система анализа MEA поддается вмешательству с лекарственными средствами, нейронам, происходящим из стволовых клеток, и потенциальному масштабированию с высокой пропускной способностью до уровня анализа генома. Разработка новых нейрофизиологических методов является важным требованием для этой эпохи геномной медицины.

В экспериментах на нокдауне и контроле Dctn5 использовали нейроны, полученные как из штаммов C57BL / 6-Tyrc-Brd, так и 129S5 / SvEvBrd мышей, поскольку культуры, полученные из этих штаммов, не обнаруживают различий в сообщенных параметрах (неопубликованные данные). Нокдаун и контрольные культуры для Tnik, Dlg2 и Disc1 включали нейроны только из штамма C57BL / 6-Tyrc-Brd. Все мыши были обработаны в соответствии с Законом Великобритании о научных исследованиях 1986 года, и все процедуры были одобрены через Инспекцию домашнего офиса Великобритании. Гиппокамп и кору были вырезаны из E17.5 мышиных эмбрионов и перенесены в папаин (10 единиц / мл Worthington, Lakewood, NJ) в течение 22 мин при 37 ° C. Клетки вручную диспергировали в солевом растворе с фосфатом в буфере Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, CA) и центрифугировали дважды при 400 × g в течение 3,5 мин. Конечный осадок ресуспендировали в Neurobasal / B27, дополненном 0,5 мМ Gln (Invitrogen), и диссоциированные клетки высевали на поли-d-лизин и покрытые ламинином субстраты с плотностью 1500 клеток / мм2. Нейроны гиппокампа были покрыты на MEA для электрофизиологии, а кортикальные нейроны были нанесены на пластиковые культуральные чашки для полной экстракции РНК. Одна треть культуральной среды изменялась каждые 3-4 дня на протяжении всего эксперимента.

Как только культуры достигли 4 DIV, они были трансфицированы пулами siRNAs. Используемые siRNAs были либо без ориентации зеленых siRNAs siGLO (cat # D-001630-01-05), либо пулов, состоящих из четырех отдельных дуплексов siRNA, предназначенных для Tnik (cat # L-167234-00), Dlg2 (cat # L-043520- 00), Disc1 (cat # L-054060-01) или Dctn5 (кошка № L-063270-01, Dharmacon, Lafayette, CO) и трансфицированы в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, siRNAs и трансфекционный реагент инкубировали отдельно с неосуществленной NeuroBasal средой при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем разбавленные siRNAs и трансфекционный реагент объединяли и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут, затем разбавляли до концентрации 3 × NeuroBasal, дополненной B-27 и l-глутамином. Смесь добавляли к культуральной среде, чтобы получить конечную концентрацию 100 нМ siRNA с 2,4 мкл трансфекционного реагента DharmaFECT-3 (Dharmacon) с общим объемом культивирования 600 мкл. Непереведенные контрольные культуры имели только одно третье изменение объема среды.

Клетки подвергали лизированию и общую РНК экстрагировали в DIV 7 с использованием мини-наборов RNeasy и колонок и проводили обработку ДНКазы на колонке с целью удаления ДНК без ДНК с РНКазой (Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Общая РНК элюировали в 30 мкл H2O и количество и чистоту проверяли с использованием спектрофотометра ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, DE). Затем для обратной транскрипции с обратной транскриптазой SuperScript III (Invitrogen) использовали протокол 1 мкг общей РНК в соответствии с протоколом производителя.

Реакции ПЦР в реальном времени были созданы с использованием 1 мкл кДНК и праймеров при 300 нМ в 20 мкл 1 × Quantitect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). Последовательности праймеров приведены в дополнительной таблице 1. Реакции циклически повторяли в системе PCR 7500 в реальном времени (Applied Biosystems, Foster City, CA) со следующими условиями: 1 цикл 95 ° C в течение 15 минут, затем 40 циклов 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин с последующим циклом диссоциации. Сгенерированные данные были проанализированы с помощью программного обеспечения 7500 System SDS версии 1.2.2 с использованием стандартного метода кривой. Гапдх использовался в качестве эндогенного контроля. Реакции для каждой пары праймеров выполнялись по крайней мере в трех повторах. ANNAA и Fisher PLSD post-hoc test были использованы для статистического анализа количественных данных.

Уровни белка Tnik определяли вестерн-блоттингом. Стандартные методики использовали для экстракции белка, SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга (Komiyama et al., 2002). Первичное антитело против белка Tnik использовали при концентрации 1 мкг / мл (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Блоты определяли количественно на станции Kodak Image 4000MM и анализировали с помощью программного обеспечения молекулярного изображения Kodak 4.0.

Клетки высевали непосредственно на покрытые MEA, которые состояли из 8,8 сеток нитридных титановых электродов диаметром 30 мкм и межэлектродного интервала 200 мкм (MultiChannel Systems, Reutlingen, Germany). Пары MEA были сопряжены с дуплексными 60-канальными усилителями (MultiChannel Systems), и спонтанная активность регистрировалась в 15-минутные эпохи ежедневно в той же среде NeuroBasal, которая использовалась для поддержания культур. Спонтанные всплески были обнаружены и проанализированы с использованием MC Rack (MultiChannel Systems), а потенциалы действия были оцифрованы с помощью 128-канальной аналого-цифровой преобразовательной карты путем выборки 1 мс пре- и 2 мс после пересечения порога со скоростью 25 кГц , Пороги обнаружения были установлены на фиксированный уровень — 20 мкВ, приблизительно 6-8 стандартных отклонений базового уровня шума. Временные метки были извлечены с использованием пакетных сценариев, написанных для NeuroExplorer (Nex Technologies, Littleton, MA), и проанализированы с использованием специального программного обеспечения, разработанного в среде статистического программирования R (www.r-project.org), для вычисления параметров, которые количественно описывают сетевую активность. Алгоритм обнаружения всплесков, аналогичный методу «максимального интервала», используемому в NeuroExplorer, был реализован для классификации поездов потенциалов действия с такими характеристиками, как всплески. Этот метод анализирует шип-поход во всплески на основе различных пороговых значений для интервала между интервалами (ISI) между шипами, начиная и заканчивая всплеском, плюс пороговые значения для принятия решения о слиянии всплесков. ANNAA и Fisher PLSD post-hoc test были использованы для статистического анализа количественных данных. Вычисление индивидуальных параметров проводилось следующим образом: Общее количество спайков. Сумма всех всплесков, обнаруженных в 15-минутную эпоху записи.

Процент всплесков, вызванных всплесками.

Средние всплески в минуту на всех электродах, обнаруживающих более одного пакета в минуту.

Средняя длительность всплесков, обнаруженных на электродах, обнаруживающих более одного пакета в минуту.

Коэффициент вариации интервала между пакетами. Интервалы между всплесками спайков усредняются по всей записи для каждого электрода, и из этих значений рассчитывается коэффициент вариации. Более высокие значения отражают отсутствие временной структуры для активности, а более низкие значения указывают на большую степень временной организации.

Количество электродов, обнаруживающих по меньшей мере один взрыв в минуту. Это отражает размер сети, поскольку только ячейки, которые являются частью сети, могут генерировать всплески пиков регулярно на протяжении всего сеанса записи.

Степень корреляции обнаружения всплеска между парами электродов с использованием метода Wong et al. (1993) и ширину бункера 0,1 мс.

Ниже приводятся дополнительные материалы, относящиеся к этой статье. Дополнительная таблица 1Сравнения праймеров, используемых в экспериментах RT-PCR в режиме реального времени.

Полный набор данных для культур нокдауна Тник.

Полный набор данных для культур нокдауна Dctn5.

Полный набор данных для культур нокдауна Dlg2.

Полный набор данных для культур нокдауна Disc1.

Вестерн-блот из нокаута Тник в культуре. Блоты сканировали на станции Kodak Image 4000MM и количественно определяли с помощью программного обеспечения молекулярного изображения Kodak 4.0.

На общий спайковый параметр не оказывает существенного влияния, сбивая Tnik (a), Dctn5 (b), Dlg2 (c) или Disc1 (d), что подразумевает отсутствие токсичности из-за трансфекции или эффектов RNAi. ANOVA (p> 0,05).

EJM, ПК, MC и SGNG не сообщили о потенциальных конфликтах интересов.

Мы хотели бы поблагодарить Stephen Eglen (Кембриджский университет) за неоценимую помощь в анализе данных МПС. Мы также благодарим Эндрю Мортона за помощь в клеточной культуре и Kathryn Elsegood за управление колонией для мыши. EJM был поддержан Национальным научным фондом Национального научного фонда (0602050). EJM, PC, MC и SGNG были поддержаны Wellcome Trust.

Экспериментальная стратегия. (a) Фазоконтрастное изображение нейронов WT, выращенных на MEA при 4 DIV. Шкала шкалы составляет 200 мкм. В таблице перечислены семь параметров сети, количественно определяемых с использованием записей MEA. (б) Экспериментальный дизайн исследования. Культуры трансфицировали в 4 DIV и регистрировали в течение 15 мин ежедневно до 12 DIV. (c) В контрольных культурах WT общие выбросы и размер сети увеличиваются с 4 DIV до 12 DIV по мере взросления культур. (d) Уровень нокдауна, достигнутый в соответствии с ПЦР в реальном времени или Вестерн-блот. Во всех случаях уровень экспрессии гена-мишени значительно снижается по сравнению с как нетрансфицированными, так и культурами NTC. Нетрансфицированные и NTC-культуры не демонстрировали никакой дифференциальной экспрессии этих генов по сравнению друг с другом. * Р <0,05. (д) Модель, показывающая синаптическую локализацию всех исследованных генов.

Tnik knockdown влияет на сетевые фенотипы. (a) Растровые графики сетевого обжига, записанные на DIV 7 в нетрансфицированной культуре и нокдауне Tnik, показывающие 2 минуты активности по всем активным электродам. Каждый горизонтальный ряд представляет один электрод на MEA, и каждый знак tic представляет собой всплеск, обнаруженный электродом. Тесно упакованные тики, такие как те, которые помещены в коробку, представляют собой всплески. (б) Процент спайков во всплесках (Всплеск шипов) увеличивается, в то время как скорость вспышки снижается в культурах, трансфицированных siRNAs, нацеленных на Tnik, как показано красными полосками. Кроме того, паттерн паттерна уменьшается, а индекс корреляции увеличивается, что свидетельствует об увеличении синхронности при разрыве сети. Непереведенные и обработанные NTC культуры показаны в синих и зеленых барах соответственно, тогда как нокауты Tnik нанесены красным цветом. Отображаются средние данные (± SEM). Данные были проанализированы последовательными испытаниями ANOVA и Fisher PLSD. * p <0,05 и ** p <0,01.

Резюме результатов для всех тестируемых генов. Красный указывает на значительное увеличение и синее значительное снижение (p <0,05) этого параметра в этот момент времени против нетрансфицированных и обработанных NTC культур и существенной разницы между нетрансфекцией и NTC (p> 0,05). Серый цвет не указывает на существенную разницу. Значимость была определена с помощью тестов ANOVA и Fisher PLSD post-hoc.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *