Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Молекулярная фармакология в простой модельной системе: Implicating MAP киназа и фосфоинозитидная сигнализация при биполярном расстройстве

Molecular pharmacology in a simple model system: Implicating MAP kinase and phosphoinositide signalling in bipolar disorder
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3032892/

Понимание механизмов действия лекарств было основным направлением для фармакологических исследователей, традиционно использующих модели грызунов. Тем не менее, не-разумные модельные системы в настоящее время все чаще используются в качестве альтернативного подхода к лучшему пониманию действия или целей наркотиков. Одна из этих модельных систем, социальная амеба Dictyostelium, обеспечивает быструю абляцию или чрезмерную экспрессию генов и последующее использование изогенной клеточной культуры для анализа клеточных сигнальных путей в фармакологических исследованиях. Модель также поддерживает все более важный этический взгляд на исследования, включая сокращение, замену и уточнение животных в биомедицинских исследованиях. В этом обзоре описывается использование Dictyostelium в понимании фармакологического действия двух широко используемых биполярных расстройств (вальпроевая кислота и литий). Оба этих соединения регулируют передачу сигналов с митогенным активированным белком (MAP) киназой и опосредованным фосфолипидом сигналом неизвестными способами. Анализ молекулярных путей, нацеленных на эти препараты в Dictyostelium, и перенос открытий в системы животных помог в дальнейшем понять молекулярные механизмы этих методов лечения биполярного расстройства.

Биполярное расстройство, неврологическое состояние, вызывающее циклическое изменение настроения, приводит к разрушительному влиянию на качество жизни и значительно увеличивает вероятность самоубийства [1]. Для улучшения диагностики и лечения биполярного расстройства текущие исследования были сфокусированы на определении молекулярной основы состояния. Исследовательские модели, используемые для этой цели, традиционно были грызунами. Тем не менее, все большее использование других простых модельных систем, таких как социальная амеба, Dictyostelium discoideum, дает определенные преимущества. Следующий обзор приведет к биполярному расстройству и Dictyostelium в качестве биомедицинской модели. Затем обзор будет посвящен двум наиболее широко используемым методам лечения биполярного расстройства — вальпроевой кислоте (VPA) и литию — сначала изложив текущие знания о клеточных сигнальных путях, регулируемых каждым лечением, а затем иллюстрирует использование Dictyostelium (и последующий перевод на системы млекопитающих), чтобы улучшить наше понимание предполагаемых биполярных беспорядочно-зависимых изменений сигнализации клеток в обоих путях.

Биполярное расстройство (также известное как маниакальная депрессия) — это неврологическое состояние, вызывающее циклические и экстремальные изменения настроения. Два наиболее распространенных типа биполярного расстройства характеризуются слегка различными повторными состояниями: тип 1 описывает повторяющиеся колебания настроения от депрессии до мании, тогда как тип 2 описывает повторяющиеся колебания настроения от депрессии до эутимического (стабилизированного настроения) поведения или умеренных форм мания [2-4]. Биполярное расстройство является одним из наиболее распространенных серьезных неврологических расстройств с оценками его всемирного появления до 4% [4-6]. Такое заболевание развивается равным числом мужчин и женщин, и его частота наиболее высока у людей из низкой экономической конъюнктуры или у потомков людей с более высокими социально-экономическими показателями [7]. В Великобритании финансовое бремя на систему здравоохранения составляет 4,6 млрд. Фунтов стерлингов в год [8], и хотя оно само по себе не наносит физического телесного повреждения, оно приводит к эмоционально разрушительному поведению и несет 15% -ный риск самоубийства, когда его не лечат [ 9]. Недавнее исследование в США показывает, что возникновение биполярного расстройства удвоилось у взрослых и увеличилось в 40 раз для лиц младше 20 лет с 1994 по 2003 год [10]. Многие исследования предполагают наследуемый риск, поскольку монозиготные близнецы указывают на 60% совместного наследования, которое уменьшается до 7% для родственников первой степени [11].

Современные методы лечения биполярного расстройства включают литий, противосудорожные препараты (карбамазепин, тегретол), вальпроевую кислоту (Depakote), габапентин (нейронтин) и ламотригин (ламикталь), антидепрессанты, такие как бупропион (Wellbutrin) или сертралин (Zoloft), нейролептики (например, галоперидол) и бензодиазепины (например, лоразепам). Эти процедуры требуют непрерывного длительного использования и, следовательно, не являются целебными. Решение о том, какое лечение использовать обычно, основано на индивидуальных симптомах. Плохое количество ответов на лечение наркозависимости (только незначительно лучше, чем плацебо) встречается у примерно 35-50% пациентов со значительными побочными эффектами, которые часто приводят к несоблюдению [12].

Исследование биполярного расстройства остается чрезвычайно сложным делом. Это прежде всего потому, что нет приемлемых моделей для состояния [13], пациенты не могут быть сняты с лечения, так как это может вызвать разрушительные изменения настроения, и поскольку молекулярный механизм биполярного расстройства не обнаружен. По этим причинам текущие обработки были обнаружены как вторичный эффект при лечении других состояний (например, эпилепсии). Однако в исследованиях биполярного расстройства по-прежнему используются три широких подхода: генетика, физиология и фармакология. • Генетика. Идентификация генетической основы биполярного расстройства, вероятно, обеспечит конечное происхождение состояния и, следовательно, является принципиально важным подходом. Имеются четкие доказательства того, что возникновение биполярного расстройства имеет сильный генетический компонент [14], и ряд специфических локусов был связан с расстройством [15,16]. Однако из-за большого числа локусов этот подход очень сложный.

Биохимия: понимание физических изменений у людей с биполярным расстройством может дать возможность идентифицировать молекулярную основу состояния. Например, недавние исследования показали биполярные беспорядочные изменения в объемах мозга [17,18] исследований изображений головного мозга [19], в экспрессии генов [20], ферментативной активности [21] и в регуляции клеточных компонентов, таких как жирные кислоты [22,23].

Фармакология. Идентификация и характеристика изменений в сигнале клеток, вызванных биполярными расстройствами, могут идентифицировать молекулярный механизм, вызывающий биполярное расстройство, и позволяют разрабатывать более эффективные методы лечения или лечения с уменьшенными побочными эффектами. Ожидается, что обширный массив генетических факторов риска, связанных с возникновением биполярного расстройства, приведет к изменениям только в ограниченном числе сигнальных путей, которые затем контролируются небольшим количеством современных методов биполярного расстройства. Таким образом, понимание путей передачи сигналов, связанных с биполярным расстройством, может помочь лечению пациентов с широким спектром причинно-следственных факторов. Однако этот подход также является сложным, поскольку лечение биполярным расстройством имеет множество эффектов и / или мишеней, а первичные сайты действия часто неизвестны. Большинство исследований молекулярной основы лечения биполярного расстройства сосредоточено на вальпроевой кислоте (VPA) и литии.

Использование беспозвоночных, нечувствительных модельных организмов может облегчить наше понимание механизма действия лекарств на клеточном уровне, в то же время уменьшая использование животных в исследованиях. Dictyostelium discoideum является одной из этих моделей, перечисленных как одна из десяти биомедицинских моделей, не относящихся к млекопитающим, признанных Национальными институтами здравоохранения США (NIH). Dictyostelium более сложный, чем другие модели, такие как Sacchromycies cerevisiae (дрожжи пекаря), Schizosaccharomyces pombe (дрожжи деления) или Neurospora crassa (нитчатый гриб), так как клетки Dictyostelium подвергаются хемотаксическому и случайному движению. Он также имеет рудиментарные механизмы развития и связанные сигнальные пути. С другой стороны, Dictyostelium проще, чем другие модели, такие как Caenorhabditis elegans (круглый червь) и Drosophila melanogaster (фруктовая муха), Danio rerio (рыбу данио) и Xenopus tropicalis (лягушка), поскольку в ней отсутствуют более сложные процессы развития в формировании этих животных и испытывают недостаток в их основных неврологических сетях. Dictyostelium развил сильную нишу для изучения движения и развития клеток [24-26], для понимания клеточной роли ряда белков [27], для эволюционной биологии [28] и для растущего диапазона областей биомедицинских исследований, изложенных в это издание.

Dictyostelium может быть культивирован либо ростом в питательных веществах, богатых средой (поглощающая среда через макропиноцитоз), либо в сочетании с бактериями в качестве источника пищи (глотание бактериальных клеток через эндоцитоз), и будет продолжать разделяться путем деления на две части до тех пор, пока продукты питания или питательные вещества не истощаются. Таким образом, при наличии достаточного количества питательных веществ большое количество изогенных клеток можно культивировать и использовать для биохимических или клеточных сигнальных исследований (рис.1). Dictyostelium также имеет необычную часть своего жизненного цикла, в результате чего голодание инициирует цикл развития, и ряд генов транскрибируется, что позволяет химически направленному движению клеток (хемотаксис) и агрегации ~ 100 000 клеток в одну точку, за которыми следует примитивное развитие процесс, приводящий к образованию различных типов клеток (клеток споры и стеблей) в зрелом плодоносящем теле (рис.1). Этот процесс разработки занимает около 24 часов.

Гаплоидный геном этого Dictyostelium был полностью секвенирован [29] и содержит 34 Мб ДНК, которая в 84 раза меньше человеческого генома, но кодирует 12 500 генов. Многие из этих генов теперь содержат значительную аннотацию онлайн-исследовательских ресурсов [Dictybase.org [30]]. Необычные аспекты генома Dictyostelium включают высокое отношение AT / GC (86:14) и среднюю открытую рамку считывания 1756 bp с 1,9 интронами на ген. Таким образом, Dictyostelium представляет собой простую модельную систему, которая хорошо охарактеризована на генетическом уровне.

Использование Dictyostelium в качестве фармакологической и фармакогенетической молекулярной модели для VPA и лития первоначально было основано на наблюдении за тем, что оба препарата блокируют развитие, тем самым позволяя провести ряд исследований, чтобы понять их механизм (действие) (рис.1): • REMI мутагенез (рестрикционный фермент, опосредованный инсерционным мутагенезом [31-33], обеспечивает подход к созданию библиотеки вставленных мутантов, посредством чего селектируемый маркер случайным образом интегрируется по всему геному. Затем полученный пул мутантов может быть экранирован на устойчивость к VPA или литию. Мутанты с сопротивлением блоку в развитии идентифицируют локусы, которые контролируют VPA или действие лития [34].

Специфические гены могут быть удалены в гаплоидном геноме, а клональные клеточные линии могут быть выделены и использованы для исследований биохимических или резистентных сопротивлений. Недавняя адаптация технологии иссечения на основе Cre-Lox в Dictyostelium теперь позволяет последовательно повторять этот процесс и, следовательно, целенаправленную абляцию нескольких генов в одной клеточной линии [35]. Например, Кей и коллеги недавно удалили шесть генов в одной клеточной линии [36].

Слишком экспрессию генов или экспрессию флуоресцентно меченных генов можно легко выполнить [37], а изогенные клеточные линии можно выделить и использовать для исследований, изучающих влияние VPA и лития на клеточную сигнализацию или развитие.

Таким образом, уникальная биология Dictyostelium позволяет ряду фармакологических исследований исследовать роль VPA и лития в регулировании клеточной сигнализации и многоклеточного развития.

Вальпроевая кислота представляет собой простую разветвленную короткоцепочечную жирную кислоту (2-пропилпентановую кислоту), которая была случайно обнаружена для контроля судорог в начале 1960-х годов [38]. С тех пор его роль расширилась, включив его в качестве основного метода лечения биполярного расстройства [39,40] и в качестве широко применяемого профилактического лечения мигрени [41]. Совсем недавно он также был предложен в качестве нового лечения для различных состояний, включая ишемию [42], рак [43], болезнь Альцгеймера [44], скрытый ВИЧ [45], при терминальной кровопотере [46] и травматическом мозге травмы [47]. В дополнение к положительным эффектам VPA, он также имеет ряд значительных побочных эффектов. К ним относятся тератогенность [48], при которой у неродившихся детей значительно увеличивается вероятность врожденных дефектов, если препарат принимается матерью в течение первого триместра беременности [49], гепатотоксичность [50] и ряд распространенных побочных эффектов, включая вес усиление, тремор, алопеция [51].

Неудивительно, что эта гамма терапевтических ролей для VPA была связана с различными клеточными механизмами. Они варьируются от увеличения уровней гамма-аминобутаровых (ГАМК) [41], снижая синтез de novo inositol [52,53] и истощение трисофосфата инозитола (InsP3) [54,59,99] до снижения активности ионного канала [55], в регуляции передачи сигналов и оборотов жирных кислот [56] и активации митоген-активированного белка (MAP) киназного пути [57]. Роль для VPA в передаче сигналов GSK3 также была предложена изначально путем прямого торможения [58], хотя это не могло быть воспроизведено другими группами [59,60]. Последующие эксперименты показали контрастные результаты для косвенного влияния VPA на GSK3, в первую очередь на повышенные уровни растворимого β-катенина после лечения [61]. Было показано также, что ингибирование гистондезацетилазы [60] обеспечивает механизм действия для VPA — эффекта, связанного с тератогенностью [62].

Механизм действия для лития представляет значительный интерес с момента его повторного открытия как обработки биполярного расстройства Кейдом [63]. Литий является наиболее часто используемым методом лечения биполярного расстройства, а также эффективен в снижении патологических процессов во множестве моделей болезни Альцгеймера [64]. Побочные эффекты включают мягкий тремор, тошноту, диарею и ее терапевтическое окно, что требует регулярного мониторинга концентрации лития в крови [65]. Кроме того, предполагается, что литий является тератогеном, поскольку введение во время беременности также увеличивает риск врожденных пороков сердца [66].

Несмотря на простую природу этой молекулы (третий элемент на периодической таблице), все еще остается неясным, как литий действует в своем терапевтическом действии. Однако широко показано, что он регулирует четыре сигнальных пути, потенциально связанных с биполярным расстройством: ингибирование фермента гликогенсинтазы киназы (GSK3) [67,68], активация сигнального пути MAPK [69], затухание инозита сигнализация [54], а в последнее время — сигнализация фосфоинозитола [70].

Фармакологический подход, чтобы понять, как VPA и литий регулируют клеточную сигнализацию, поэтому требуют понимания того, как модулируются эти различные пути, и какие гены и пути отвечают за эти эффекты лекарств. Здесь мы сосредоточимся на регуляции пути MAP Kinase и зависимых от инозита и фосфоинозитола путей.

Биполярное расстройство связано с изменениями в нейротрофических сигнальных каскадах, нейроновой клеточной атрофией и региональными сокращениями объема мозга [71,72]. Исследования структурной визуализации пациентов с биполярным расстройством продемонстрировали снижение объемов серого вещества в областях орбитальной и медиальной префронтальной коры, вентральной полосатой и гиппокампа и увеличении числа третьих желудочков по сравнению с здоровыми пациентами контроля [73,74]. Этот эффект был также продемонстрирован в послеродовых невропатологических исследованиях с уменьшением объема коры [74], количества глиальных клеток [75] и размера нейрона в различных областях префронтальной коры и амигдала пациентов с биполярным расстройством [73]. Снижение глиальных клеток в этих регионах особенно интересно из-за роли этих клеток в регулировании развития и поддержки синаптических сетей. Таким образом, изменения в нейротрофической сигнализации и атрофии могут служить механизмом патологии биполярного расстройства.

Показано, что лечение литием и VPA приводит к изменению или ослаблению структурных изменений головного мозга, обнаруженных при биполярном расстройстве [76,77], что свидетельствует о том, что этот нейропротекторный эффект является ключевым механизмом лечения биполярного расстройства. Считается, что эффект происходит через путь MAPK путем увеличения активации (фосфорилирования) внеклеточной сигнальной киназы 2 (ERK2). Повышенное фосфорилирование ERK2 (pERK2) в ответ на лечение наблюдается в культивируемых клетках нейронов, гиппокампе крысы и лобной коре и культивируемых клетках щитовидной железы [78-80]. Поскольку показано, что путь MAPK модулирует такие процессы, как дифференциация нейронов, выживаемость нейронов и долгосрочная нейропластика, он, вероятно, будет участвовать в защите от биполярной беспорядочной гибели нейронов и, следовательно, все чаще рассматривается как потенциальное происхождение расстройства [81 ]. Таким образом, выяснение того, как VPA и литий вызывают этот эффект, представляет большой терапевтический интерес к пониманию этиологии биполярного расстройства [80,82].

Использование Dictyostelium показало, что как VPA, так и литий также регулируют активацию пути MAPK [82] путем увеличения уровней pERK2 в этой простой системе биомедицинской модели (рис. 2A и B). В случае VPA этот эффект проявлялся быстро (в течение 10 мин) — подача биохимической основы для действия препарата, а не генетической регуляции. Предполагалось, что механизм действия не зависит от регуляции восходящего потока, поскольку он не зависит от рецепторного фосфорилирования (рецептор цАМФ 1, cAR1) и не зависит от диссоциации белка G (с использованием анализа FRET или генетической делеции передачи белка G). Кроме того, повышенные уровни pERK2 не могут быть феноксипиризированы путем снижения продукции PIP3 (с использованием широко применяемого ингибитора для белков семейства PI3K, LY294002). Тем не менее, ряд экспериментов показал, что VPA может функционировать посредством блокирования дефосфорилирования pERK2 (рис.2). Эти эксперименты показали, что повышение уровня pERK2 феноксипирируется восстановленным продуктом цАМФ (путем абляции аденилатциклазы А); фармакологическое ингибирование активности протеинкиназы A (PKA) и фармакологическое ингибирование активности фосфотирозинфосфатазы (ванадатом) — все это подразумевает дефосфорилирование pERK2 как механизма действия для VPA. Взаимодействие MAPK и cAMP / PKA-пути является сложным [83] с несколькими точками взаимодействия и кросс-регулирования. Дальнейший анализ этого кроссовера как в системах Dictyostelium, так и в млекопитающих будет необходим для лучшего определения механизма действия VPA на этом пути. Результаты также сильно влияют на ингибирование GSK3 / A в снижении уровней расширенного pERK2, поскольку как литий, так и специфический ингибитор GSK3 / A вызывают увеличение уровней pERK2 через три-четыре минуты после стимуляции [82], а также генетическая абляция GSKA в изогенных клеточных линиях (Фиг.2С). Эта работа также указывает на то, что повышающая литиевая стимуляция pERK2, индуцированная литием, вероятно, будет вызвана прямым ингибированием активности GSK3 / A, что приведет к снижению активности PKA / MKP. Это рассуждение подтверждается также наблюдением, что абляция GSK3 / A блокирует катализируемую литием активацию расширенного пути через четыре минуты после стимуляции (фиг.2А и С). Эти результаты показывают, что VPA увеличивает активированные уровни MAPK за счет ингибирования зависимого от цАМФ / PKA дефосфорилирования pERK2, в то время как литийзависимый эффект происходит через GSKA / 3-зависимую сигнализацию.

Одним из важных аспектов фармакологии VPA является использование соединений, связанных с VPA, для различения различных целей в клеточной передаче сигналов. Первоначально эти исследования основывались на идентификации реакционноспособных метаболитов VPA. Например, β-окисление VPA приводит к метаболиту E-2-пропилпент-2-еновой кислоты, тогда как действие фермента P450 приводит к образованию 3-пропилпент-4-еновой кислоты. Эти соединения проявляют различную ингибирующую активность в отношении β-окисления [84]. Кроме того, тератогенный эффект VPA также сильно структурно зависим [62], требуя головной группы карбоновой кислоты, точки разветвления на втором углероде, водорода на втором углероде и энантиомерной специфичности (S-энантиомеры проявляют большую тератогенность, чем R -энантиомеры).

В Dictyostelium мы использовали ряд соединений, связанных с VPA, для исследования структурных требований к регуляции pERK2 и использовали его для того, чтобы отличить этот эффект от других чувствительных к VPA путей, механизмов действия и терапевтических эффектов. Например, амидное производное VPA (valpromide) демонстрирует улучшенную эффективность при контроле за захватом [85] и испытывает недостаток в тератогенности, но демонстрирует только промежуточную регуляцию уровня pERK2 в Dictyostelium (рис. 2D). Повышение pERK2 также является специфичным энантиомером, так как S-2-пентил-4-пентиноиновая кислота сильно активируется по сравнению с ее энантиомерной R-2-пентил-4-пентиновой кислотой, которая мало влияет (рис. 2D). Интересно, что эти два энантиомера показали улучшение обучения и памяти с более тератогенным S-энантиомером, проявляющим более сильную активность [86], однако это увеличение было потеряно из-за пагубного воздействия на выживаемость нейронов, вызванное тератогенностью. Эти результаты подтвердили бы роль повышения регуляции pERK2 в увеличенном объеме памяти [86,87], а также возможность усиления защиты от повреждения нейронов при биполярном расстройстве. Исследования на основе диктистолия также выявили другие, нетератогенные аналоги VPA (например, 2-метил-2-пентеновая кислота, рис. 2D), которые демонстрируют равную эффективность VPA, таким образом, представляя потенциально новые методы лечения биполярного расстройства. В поддержку зависимого от цАМФ / PKA механизма биполярного расстройства лекарственное действие литий, карбамазепин [88,89] и VPA [90-92] ингибируют передачу сигналов на основе цАМФ в системах млекопитающих.

Будущая работа, связанная с ингибированием сигнальной передачи цАМФ / PKA / GSK3, катализируемой VPA, может обеспечить механизмы для нейропротекторных эффектов, наблюдаемых при лечении пациентов с биполярным расстройством [57,80].

Сниженная инозитол-зависимая сигнализация была первым предложенным механизмом лечения биполярных расстройств [54,93], в основном на основе литиевого ослабления рецидива инозита путем ингибирования инозиновой монофофатазы (IMPase) и инозитолполифосфата 1-фосфатазы (IPPase) [94 ]. Dictyostelium с тех пор доказал важную модель для понимания роли VPA и лития в регулировании сигналов inositol.

В нашей предыдущей работе было выявлено общее влияние VPA и лития на снижение передачи сигналов InsP3 в Dictyostelium
[95] (фиг.3). Эти исследования идентифицировали пролил-олигопептидазу (ПО) в мутантном экране REMI для устойчивости к эффекту лития в блокировании развития [93,95] (рис.1). Мутант нокаута PO смог преодолеть этот блок и, следовательно, сформировать плодовые тела, подняв уровни InsP3. Эти исследования также показали, что лечение VPA, лития и другого биполярного расстройства (карбамазепин) вызвало общее изменение в нейронах млекопитающих и что это изменение может быть отменено добавлением экзогенного инозита или ингибированием активности PO (фиг.3) [ 59,93]. Эта потеря активности PO привела к увеличению распада InsP4, InsP5 и InsP6 с образованием InsP3. ПО-зависимая регуляция клеточных уровней InsP3 с тех пор была продемонстрирована в линиях клеток астроглиомы и COS-7 [96,97]. Таким образом, аблация ПО отменяет общий эффект препаратов биполярного расстройства. Это было новое открытие, так как роль РО считалась полностью основанной на расщеплении небольших пептидов, содержащих пролиловые остатки [98]. Сообщалось также о связи между активностью фермента PO и биполярным расстройством у пациентов с повышенной ферментативной активностью [21]. Кроме того, как системы Dictyostelium, так и системы млекопитающих были использованы для идентификации ряда соединений, структурно связанных с VPA, которые вызывают истощение изотота, чтобы показать, что этот эффект не коррелирует с тератогенной активностью [59,99].

Механизм литийзависимой регуляции фосфата инозитола в последнее время был дополнительно охарактеризован в Dictyostelium
[100] (фиг.3). King et al. [100] показал, что хемотаксис является подходящей моделью для изучения влияния лития на Dictyostelium, поскольку он вызывает сильное снижение скорости клеток. Абляция активности PO снижала чувствительность к этому литиевому эффекту в соответствии с зависимым от InsP3 механизмом действия лития. Абляция фермента множественной инозитолфосфосфатфосфатазы (MIPP), ответственная за разрушение InsP4-6, приводила к снижению уровней InsP3, тогда как экспрессирующие MIPP экспрессирующие клеточные экстракты имели повышенную активность по сравнению с контролем дикого типа. Активность MIPP была необходима для зависимого от PO ингибирования inositol phosphate как при хемотаксисе, так и при производстве InsP3. Эти данные четко определяют ПО как регулятор активности МИПФ. Однако, неожиданно, чрезмерная экспрессия MIPP давала липидный гиперчувствительный фенотип.

Было обнаружено, что происхождение гиперчувствительности лития в клетках, экспрессирующих MIPP, связано с повышенной экспрессией ряда генов, связанных с сигнализацией инозитола [100]. К ним относятся IMPase и IPPase — ранее были описаны как клеточные мишени лития [94] и inositol-синтаза 1 (INO1), отвечающие за синтез inositol de novo. Увеличение экспрессии генов наблюдалось также после генетического и фармакологического ингибирования активности PO. Однако во всех случаях эта повышенная экспрессия зависела от наличия активности MIPP и также вызывалась чрезмерной экспрессией киназ, ответственных за продуцирование InsP4-6 из InsP3. Таким образом, в этой работе был определен механизм регуляции генов, где активация или избыточная экспрессия MIPP приводит к повышенной экспрессии ряда генов регуляции inositol в Dictyostelium. Затем результаты были успешно переведены в клетки человека (HEK293), чтобы продемонстрировать, что ингибирование PO также регулирует несколько генов IMPase и что это повышение зависит от активности MIPP. Интересно, что полиморфизмы IMPase были связаны с риском биполярного расстройства в семейных исследованиях [101-103].

Недавно был предложен новый механизм действия препаратов биполярного расстройства, основанный на работе в Dictyostelium
[104105]. Первоначально, чтобы охарактеризовать VPA-зависимый блок в движении клеток Dictyostelium, мы исследовали роль сигналов фосфоинозитида в качестве мишени для действия VPA [104]. Обработка VPA вызывала быстрое и сильное сокращение производства фосфоинозитидов. Дальнейшее исследование этого эффекта в используемых Dictyostelium клетках, трансформированных связывающим белком PIP3 (PHcrac-GFP), позволяющим контролировать время и местоположение для производства PIP3. VPA произвело острую (10 мин) снижение производства PIP3, что также было показано снижением уровней PIP2 и PIP с использованием экспериментов по радиомаркировке in vivo (рис. 3A и B, красный). Эти эффекты были фенокопированы фармакологическим ингибированием фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) с использованием ингибитора LY294002. Идентификация механизма, который вызывает ингибирующую активность при передаче фосфоинозитида, является очень сложной, поскольку фосфорилирование группы фосфатидилинозитола может происходить в трех положениях на инозитольном кольце (фиг.3), создавая множество продуктов, включая отдельные фосфорилированные фрагменты (например, PI (3) P), а также двойные и тройные фосфорилированные продукты (например, PI (3,4) P2 и PI (3,4,5) P3). Эти данные впервые выявили передачу фосфоинозитида в качестве потенциальной мишени для лечения биполярных расстройств. Значительные данные свидетельствуют о том, что повышенная сигнализация фосфоинозитолом может быть основной причиной биполярного расстройства, поскольку различные исследования выявили этот эффект у пациентов с бесплодиальным биполярным расстройством [106-108], а также последующую понижающую регуляцию уровней фосфоинозитида после биполярного расстройства лечение наркотиками [108, 109].

Недавняя работа по влиянию лития на Dictyostelium теперь расширила наблюдение, что биполярное расстройство-ослабление ослабляет опосредованную фосфоинозитидом сигнализацию [70]. Анализ механизма, приводящего к снижению скорости клеток после лечения, показал, что этот эффект независимо от синтеза цАМФ и полимеризации F-актина. Однако снижение скорости было фенокопиризировано фармакологической или генетической абляцией активности PI3K с использованием либо LY294002, либо одной линии клеток Dictyostelium, лишенной всех пяти генов PI3K [36], подразумевающих передачу фосфоинозитида в качестве мишени для лечения литием. В соответствии с этим фосфорилирование гомолога протеинкиназы В (PkbA), транслокация мембраны которого зависит от связывания с PH-доменом PIP3, также снижалась после лечения литием по сравнению с необработанными клетками. Кроме того, эти эффекты также наблюдались в связи со снижением скорости синтеза PIP и PIP2, хотя никаких изменений в установившемся уровне концентрации PIP2 не было обнаружено. Это может быть связано с небольшим быстро перевернутым пулом PIP2, который быстро метаболизируется во время хемостаза, обеспечивая литиевую чувствительную мишень. Известно, что механизм затухания сигналов inositol литием функционирует через неконкурентное ингибирование IMPase и IPPase [94], King et al. [70] чрезмерно выраженная IMPase для того, чтобы обратить вспять влияние лития на синтез PIP / PIP2 и фосфорилирование PkbA. Затем результаты были успешно воспроизведены на клеточной линии нейтрофилов человека (HL60), где после операции лития была снижена транслокация конструкции GFP, связывающей PIP3 с клеточными мембранами (как показание для производства PIP3). Основываясь на этих исследованиях в Dictyostelium, исследующих как VPA, так и литиевые механизмы действия, теперь мы можем предложить новое расширение тока гипотезы об истощении inositol, в результате чего лечение биполярным расстройством приводит к ослаблению передачи сигналов с помощью фосфоинозитида.

Чтобы помочь пациентам с диагнозом биполярного расстройства, продолжающиеся исследования направлены на выявление изменений сигнальных клеток, которые нацелены на фармакологические агенты, вальпроевую кислоту и литий. Этот подход преодолевает множество потенциальных локусов, вовлеченных в этиологию расстройства, но вместо этого фокусируется на понимании механизма (механизмов), приводящего к симптоматическому контролю. Это также позволяет идентифицировать новые соединения, которые могут быть более эффективными или иметь уменьшенные побочные эффекты при лечении биполярного расстройства. Исследования в этой области традиционно использовали грызунов в качестве модельных организмов, однако все большее использование других простых модельных систем, таких как Dictyostelium, дает определенные преимущества.

Исследование клеточной сигнализации, регулируемой VPA и литием, демонстрирует, что как Dictyostelium, так и мозг животных реагируют путем повышения уровней pERK2 в пути MAPK. Анализ этого эффекта у Dictyostelium предложил два механизма: VPA регулирует повышенные уровни pERK2 посредством ингибирования передачи сигналов cAMP / PKA, тогда как литий ингибирует GSK3 / A, причем оба эффекта приводят к уменьшенному дефосфорилированию pERK2. Сильная структурная специфичность этого эффекта в отношении VPA предполагает, что могут быть идентифицированы новые соединения, которые показывают улучшенную эффективность регуляции MAPK.

Другим клеточным сигнальным эффектом VPA и лития в Dictyostelium является снижение inositol-зависимой сигнализации. В последнее время исследования показали, что уровни клеточного индозитолфосфата контролируются как рециркуляцией инозитолом, так и катализируемым MIPP расщеплением фосфоровых соединений более высокого порядка inositol (InsP4-6), регулируемых активностью пролил-олигопептидазы. Эта работа также обнаружила эффект, основанный на транскрипции, при котором лечение литием приводит к изменению транскрипционной регуляции генов, связанных с инозитолом. Кроме того, исследования на основе диктистелиума обнаружили потенциальную ключевую фармакологическую цель VPA и лития в ослаблении передачи сигналов фосфоинозитола, причем оба препарата вызывают резкое ослабление оборота фосфоинозитола. В случае лития, вероятно, этот эффект происходит за счет ослабления сигнала inositol, тогда как механизм, контролируемый VPA, еще предстоит определить. Эти открытия открывают захватывающее поле исследований фосфоинозитола, с обещанием новых методов лечения (основанных на структуре VPA), демонстрирующих повышенную эффективность в регуляции фосфоинозитида.

В этом обзоре обобщены текущие исследования, направленные на раскрытие сложных механизмов VPA и лития в регулировании клеточной передачи сигналов, а также важную роль Dictyostelium в качестве простой биомедицинской модели для этого исследования. Более глубокое понимание этих изменений сигнальных ячеек может в конечном счете определить основные причины биполярного расстройства и позволит разработать лучшие терапевтические методы лечения.

Грант гранта проекта Wellcome Trust 082640 и NC3Rs Grant G0900775 на RSBW, исследовательский траст по болезни Альцгеймера в PhD для MHRL.

Dictyostelium как простая модель для исследования молекулярной фармакологии. Под контролем условий роста; (1) Диктистелиевые клетки размножаются бинарным делением либо в жидкой среде, либо в сочетании с бактериями в качестве источника пищи, пока ресурсы не исчерпаны. (2) Индукция голодания заставляет клетки прекратить погружение и войти в стадию развития, при этом экспрессия ряда генов развития позволяет клеткам перемещаться вместе в процессе, называемом хемотаксисом (когда клетки движутся к циклическому АМП). (3) После агрегации клеток Dictyostelium подвергается дифференциации развития, чтобы сформировать многоклеточное плодовое тело размером около 1 мм, состоящее в основном из клеток споры и стеблей. Разработка методов молекулярной клеточной биологии для исследований Dictyostelium позволила использовать эту модель в исследованиях молекулярной фармакологии с использованием: (4a) клеточных линий, содержащих одиночные или множественные абляционные (или более выраженные) гены (зеленый); или (4b) пулы случайных вставочных мутантов (приготовленных с использованием REMI, желтый) для получения библиотек-мутантов для экранов устойчивости к лекарственным средствам. (5) Клеточная роль фармакологических обработок (таких как VPA и литий (Li +)) может быть проанализирована с использованием клеток дикого типа или клеточных линий, содержащих абляционные или сверхэкспрессированные гены. (6) Анализ устойчивости к блоку развития VPA / Li + также может помочь понять и охарактеризовать роль конкретных генов или идентифицировать новые гены, участвующие в лечении биполярных расстройств. (Для интерпретации ссылок на цвет в этой фигуре легенда читатель ссылается на веб-версию статьи.)

MAPK путем лечения биполярным расстройством в простой биомедицинской модели Dictyostelium. Как в системах Dictyostelium, так и в млекопитающих обработка вальпроевой кислотой (VPA) и литием (Li +) приводит к увеличению активированного MAPK, показанного здесь для фосфорилирования ERK2 (внеклеточная регулируемая киназа 2 [ERK2] с образованием pERK2). (A) Регулирование уровней pERK2 является сложным, обеспечиваемым балансом между киназзависимым фосфорилированием (катализируемым MEKK [митоген-активированной киназой киназы киназы] и MEK [киназой киназы MAPK]) и дефосфорилированием (катализируемым MKP [MAP киназная фосфатаза] в сигнальном пути PKA [протеинкиназы A] и GSK3 / A [гликогенсинтаза киназа 3 / A]). (B) Обработка клеток Dictyostelium одним импульсом циклического AMP (cAMP) приводит к временному увеличению pERK2, обнаруженному с использованием специфических для фосфорилирования антител. Предварительная инкубация клеток Dictyostelium с VPA (1 мМ, 60 мин) увеличивает и удлиняет активацию пути неизвестным механизмом. (C) Исследования в Dictyostelium позволяют использовать изогенные клеточные линии, содержащие либо абляционные, либо сверхэкспрессированные гены, предоставляя ценные инструменты для фармакологических исследований. Например, мы можем изучить роль GSKA (гомологичной белкам GSK3 человека) в этом эффекте путем сравнения уровней pERK2 в клетках дикого типа и тех, у кого отсутствует GSKA, в условиях контроля (без добавленного препарата) или после Li + (10 мМ, 60 мин, темно-серый) ИЛИ VPA (1 мМ, 60 мин, светло-серый). Абляция GSKA увеличивает уровни pERK2, указывая на то, что она функционирует как отрицательный регулятор этого пути, равно как и фармакологическое торможение Li +. Литий-зависимое увеличение pERK2 также значительно снижается в нулевом значении GSKA, что согласуется с литий-GSKA-зависимым механизмом действия. Напротив, VPA вызывает гиперчувствительный рост pERK2 у этого мутанта, предполагая функции VPA через механизм, независимый от GSKA. Этот подход показывает однозначную роль GSKA в переходном формировании pERK2. * P <0,05 по сравнению с контролем. (D) Новые соединения, связанные с VPA, также могут быть проанализированы в исследованиях зависимости структуры и активности (SAR), где, например, амидное производное VPA (вальпромид), энантиомерные соединения (R- и S-2-пентил-4-пентиноиды кислота) и модифицированные производные (2-этил-4-метилпентановая кислота) проявляют измененную активацию пути. ** P <0,01, * P <0,05 по сравнению с контролем.

Регулирование сигнальной активности инозитолфосфатом и фосфоинозитидом методами биполярного расстройства в простой биомедицинской модели Dictyostelium. (A) Инизольная сигнальная связь инициируется из фосфолипазы C (PLC) -генерированного расщепления связанного с мембраной фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата (PIP2) с мембраной для получения диацилглицерина (DAG) и цитозольного инозитола 1,4,5-трифосфата (InsP3). Пролил-олигопептидаза (ПО) отрицательно регулирует множественную полифосфат-фосфатазу inositol (MIPP), которая, в свою очередь, катализирует разбивку inositol (InsP4, InsP5, InsP6) более высокого порядка с образованием InsP3. InsP3 гидролизуется до InsP2 и далее разрушается полифосфатфосфатазой Инозитола (IPPase) и инозитолмонофофатазой (IMPase) для получения инозита. Затем он включается в сигнализацию фосфоинозитолом с образованием фосфатидилинозитола (PI), фосфатидилинозитолфосфата (PIP), а затем PIP2. DAG рециркулируют через фосфатидную кислоту (ПА). Литий играет хорошо документированную роль в ингибировании IMPase и IPPase для снижения передачи сигналов на основе инозита, а VPA было предложено сократить биосинтез deosovo inositol за счет непрямого ингибирования инозитолсинтазы 1 (INO1) и оборота фосфоинозитидов (все указанные в зеленый). (B) Головная группа инозитола семейства фосфоинозитидных соединений действует как субстрат для ряда киназ, обеспечивая динамическую и сложную сеть продуктов и субстратов. Добавление радиомеченого фосфата (красного) к этим киназным реакциям приводит к включению радиоактивной метки в определенные места на инозитольном кольце (показано здесь для фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K)). (C) Несколько подложек (показаны здесь для PI3K) производят несколько продуктов. Inositol ring (hexagon), P (черный) сайт фосфорилирования, P (жирный красный), идентифицированный с помощью экспериментов по обмену радиоактивными метками Диктистелия, ферменты в синем (курсив); ↓ уменьшено. (Для интерпретации ссылок на цвет в этой фигуре легенда читатель ссылается на веб-версию статьи.)

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *