Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Совместное иммунопреципитация с Tau Isoform-специфическими антителами выявляет отличительные взаимодействия с белками и указывает на предполагаемую роль для 2N Tau при заболеваниях *

Co-immunoprecipitation with Tau Isoform-specific Antibodies Reveals Distinct Protein Interactions and Highlights a Putative Role for 2N Tau in Disease*
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4825019/

Альтернативное сплайсинг генерирует множественные изоформы связанного с микротрубочками белка Tau, но мало известно об их специфической функции. Во взрослом мозге мыши выражаются три изоформы Тау, которые содержат либо 0, 1, либо 2 N-концевые вставки (0N, 1N и 2N). Мы сгенерировали специфические для Tau антитела и проводили совместные иммунопреципитации с последующей мультиплексированной количественной масс-спектрометрией с тандемами. Мы идентифицировали новые тау-взаимодействующие белки, из которых половина состояла из мембран-связанных белков, локализованных в плазматической мембране, митохондриях и других органеллах. Было также обнаружено, что Tau взаимодействует с белками, участвующими в пресинаптической трансдукции сигнала. Анализ MetaCore показал один крупный кластер взаимодействия Тау, в котором содержалось 33 белка Tau pulldown. Чтобы исследовать пути, в которых участвуют эти белки, мы провели анализ пути изобретательности, который выявил два существенных перекрывающихся пути: «связь и взаимодействие между клетками» и «неврологические заболевания». Инструмент функционального обогащения DAVID показал, что, в частности, 2N Tau-взаимодействующие белки были специфически связаны с неврологическим заболеванием. Наконец, для поднабора Tau-взаимодействий (apolipoprotein A1 (apoA1), apoE, U-типа митохондриальной креатинкиназы, β-синуклеина, синаптогирина-3, синаптофизина, синтаксина 1B, синаптогамина и синапсина 1) мы выполнили обратные совместные иммунопреципитации , подтверждая предпочтительное взаимодействие конкретных изоформ. Например, apoA1 показал 5-кратное предпочтение для взаимодействия с 2N, тогда как β-синуклеин показал предпочтение 0N. Примечательно, что обратная иммунопреципитация с apoA1 обнаруживала только изомер 2N. Это подчеркивает различные белковые взаимодействия различных изоформ Тау, предполагая, что они выполняют разные функции в ткани мозга.

Тау принадлежит к семейству связанных с микротрубочками белков (MAPs) 2, которые действуют совместно с гетеродимерами α- и β-тубулина для сборки микротрубочек (1). Члены семейства MAP были названы в соответствии с тремя основными классами размеров полипептидов: MAP1 (> 250 кДа), MAP2 (~ 200 кДа) и Tau (50-70 кДа) (1, 2). MAP2 и Tau выражены вместе в большинстве нейронов, где они частично разделяются на отдельные субклеточные клетки, когда созревание завершено. MAP2 в основном встречается в дендритах, тогда как Tau сосредоточен в аксонах (3). Тау также обнаружен в астроцитах и ​​олигодендроцитах в физиологических условиях, хотя и на относительно низких уровнях (4).

Тау играет решающую роль в нейрогенерации и как таковая становится целью терапевтических вмешательств (5). При болезни Альцгеймера (AD) и других заболеваниях, которые в совокупности называют tauopathies, Tau становится гиперфосфорилированным и образует нерастворимые агрегаты. В этом процессе Tau проявляет свою токсичность различными интегрированными механизмами, как показано в трансгенных моделях животных, которые моделируют аспекты болезни человека (6, 7). Когда Тау регулярно изучают, его часто обрабатывают так, как если бы он был единственным белком, тогда как на самом деле он существует как множественные изоформы и фосфо-виды (8). Он содержит не только 85 сайтов, которые могут быть потенциально фосфорилированы (пять тирозинов и 80 сериновых / треониновых остатков) (9), но также существуют как несколько изоформ, функции которых не полностью поняты. Центральная нервная система взрослых мышей выражает три низкомолекулярные изоформы Тау, которые генерируются путем альтернативного сплайсинга, и имеют либо 0, 1, либо 2 N-концевые вставки (0N, 1N и 2N), а также четыре (4R) микротрубочки -связывающие домены. Напротив, в развивающемся эмбриональном мозге преобладает изоформа 0N3R (10, 11). Вместе это означает, что различные виды Тау должны взаимодействовать с конкретными подмножествами белков и выполнять определенные клеточные функции.

В дополнение к взаимодействию с цитоскелетными белками, такими как тубулин, который образует микротрубочки (12-16), ранее было показано, что Тау взаимодействует с другими классами белка. Они включают киназы и фосфатазы, такие как белковая фосфатаза 2A (PP2A) (17), внеклеточные белки, такие как аполипопротеин E (apoE) и мембранные белки, такие как Src киназа Fyn (18). Было показано, что последнее отличается своим взаимодействием в зависимости от наличия трех или четырех повторяющихся микротрубочек-повторов (3R или 4R) и независимо от того, содержат ли Tau патогенные мутации, обнаруженные в семейных формах лобно-височной деменции (19). Ранее мы продемонстрировали у мышей дикого типа, что изоформы 0N, 1N и 2N Tau показывают отчетливое субклеточное распределение, предполагающее специфические для субъединицы функции (11). Вывод о том, что 1N Tau обогащен ядром, подсказывает нам, что дерегулирование предположительных ядерных функций Тау может потенциально способствовать патологическим условиям. Тау идеально позиционируется для регулирования клеточных функций, поскольку накапливается доказательство того, что он функционирует как основной белок (20) леса, способный связывать по меньшей мере два сигнальных белка и тем самым локализовать сигнальные молекулы и пути трансдукции в определенные субклеточные местоположения (21) ,

Чтобы получить более глубокое понимание изоформ Тау, отличающихся своим N-терминальным доменом, мы стремились использовать совместную иммунопреципитацию (со-IP), чтобы выявлять различные взаимодействия, используя 0N, 1N и 2N Tau-специфические антитела. Мы определили идентичность взаимодействующих белков, используя мультиплексную масс-спектрометрию с тандемой (TMT), мультиплексную количественную масс-спектрометрию (MS), включая ткань мозга Tau knock-out (KO) и пан-тауспецифические антитела в качестве контролей. Мы идентифицировали новые Tau-взаимодействующие белки, которые были подвергнуты биоинформатическому анализу, чтобы выявить два основных кластера путей, как представлено ниже: кластер, связанный с неврологическим процессом, и кластер, связанный с энергетическим обменом. Определена роль в неврологическом заболевании для 2N-изоформы Тау. Подмножество белков было подтверждено обратными со-IP и ELISA, что подчеркивало достоверность анализа MS.

Эксперименты с животными были одобрены комитетами по этике животных Университета Квинсленда (номер официального утверждения QBI / 027/12 / NHMRC). Для исследований со-IP использовались мыши C57BL / 6J дикого типа и Tau KO (22).

Использовались антитела, специфичные для общего (M), 0N, 1N и 2N мышей Tau (11). Антитело 0N было поднято против соединения экзонов 1 и 4 с использованием пептида DMDHGLKAEEAGIG, 1N антитела против соединения экзонов 2 и 4 с использованием пептида DAKSTPTAEAEEAG, 2N антитела против соединения экзонов 3 и 4 с использованием пептида TEIPEGITAEEAGI, и М против пептида RVASKDRTGNDEKK, кодируемого экзоном 5. Эти антитела ранее были показаны как специфические с использованием как экстрактов Tau KO, так и предварительного поглощения с вышеуказанными пептидами в качестве контроля (11).

плазмиды pRc / CMV, содержащие кДНК, кодирующие три мышиные изоформы Тау, были любезно предоставлены доктором Глорией Ли. Они называются Mtau10 (0N4R), Mtau210 (1N4R) и Mtau2310 (2N4R) соответственно. Прямой праймер 5′-ATGGCTGACCCTCGCCAG-3 ‘и обратный праймер 5′-TCACAAACCCTGCTTGGCCAA-3′ использовали для клонирования мышиных тау-кДНК в плазмиду pGEX4t1 (GE Healthcare) в кадре с N-концевым тегом GST. КДНК мышиного β-синуклеина и синаптофизина в pCMV6-Kan / Neo (OriGene) амплифицировали методом ПЦР с использованием следующих форвардных и обратных праймеров 5’-CACCATGGACGTGTTCATGAAGG-3 ‘и 5′-TTACGCCTCTGGCTCGTATTC-3’ для β-синуклеина и 5 ‘ -CACCATGGACGTGGTGAATCAGC-3 ‘и 5′-TTACATCTGATTGGAGAAGGAGG-3’ для синаптофизина. Гены затем клонировали в вектор pET-DEST42 (Life Technologies, Inc.) в кадре с C-терминальным His6 и V5 тегом. Плазмиды трансформировали в бактериальные клетки One Shot® BL21TM (Life Technologies, Inc.) и экспрессию рекомбинантного белка индуцировали 1 мм изопропил-1-тио-β-d-галактопиранозидом в течение 2 ч при 37 ° С. Бактериальную суспензию гранулировали при 4000 × g в течение 15 мин при 4 ° С и затем ресуспендировали в буфере GST (150 мм NaCl, 10 мм Na2HPO4, 5 мм ЭДТА, рН 7,4) для белков Тау или буфера IMAC (300 мм KCl, 50 мм KH2PO4, 5 мм имидазола, pH 8,0) для β-синуклеина и синаптофизина, содержащего 0,1%. Полный ингибитор протеазы и лизоцим 0,1 мг / мл (Sigma) с последующей инкубацией на льду в течение 20 мин. Затем клетки подвергали повторному замораживанию / оттаиванию, после чего их обрабатывали ультразвуком при 60% -ной амплитуде в течение 1 мин (Qsonica Sonicator, Newtown, CT). Лизат центрифугировали при 16000 × g в течение 20 мин при 4 ° С и фильтровали через 0,22 мкм шприцевой фильтр (Millipore, Billerica, MA). Для очистки рекомбинантного тау супернатант пропускали через 1 мл биомасштабированного картриджа Mini Profinity GST (Bio-Rad), уравновешенного в буфере GST, с использованием системы очистки протинов Profinia (Bio-Rad), а затем элюировали в глутатионе 20 мм , 100 мм Трис, 10 мм ЭДТА, pH 8,0. Для очистки рекомбинантного β-синуклеина и синаптофизина отфильтрованные лизаты пропускали через 1-миллилитровый картридж Bio-Scale Mini IMAC (Bio-Rad), уравновешенный в буфере IMAC, и элюировали в 300 мм KCl, 50 мм KH2PO4, 250 мм имидазола, pH 8,0. Элюированные белки подвергали буферному обмену в 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 4,3 мм Na2HPO4, 88 мм KH2PO4, pH 7,4, с использованием Bio-Scale Mini Bio-Gel P-6 Desalting Cartridge (Bio-Rad) и затем подвергали размеру эксклюзионную хроматографию с использованием колонки S200 10/30 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 1 × PBS. Фракции, соответствующие интересующему белку, объединяли и концентрировали, используя фильтр Amicon Ultra с отсечением молекулярной массы 3000 кДа (Merck Millipore).

Весь мозг рассекали от мышей и хранили при -80 ° C. Замороженные мозги промывали 5 мл ледяного IP-промывочного буфера (модифицированный фосфатно-буферный солевой раствор Дульбекко (MDPBS): 8,1 мм Na2HPO4, 1,47 мм KH2PO4, 2,7 мм KCl и 140 мм NaCl) (23), после чего они гомогенизировали в 10 мкл / мкг ледяного IP-буфера, содержащего 25 мм Трис-HCl, pH 7,4, 150 мм NaCl, 1 мм EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% глицерина, ингибиторы протеазы (Complete Mini, Roche Applied Наука, Базель, Швейцария) и ингибиторы фосфатазы (PhoSTOP, Roche Applied Science) с микропестиком в 20 раз и через шприц для инсулина 10 раз. Затем лизат инкубировали на льду в течение 10 мин со встряхиванием для солюбилизации белков. Гомогенат центрифугировали в течение 40 мин при 20000 × g при 4 ° С. Супернатант переносили в новую пробирку, и осадок, содержащий клеточный мусор, отбрасывали. Перемешиваемый супернатант снова центрифугировали в течение 10 мин при 20000 × g при 4 ° С, после чего надосадочную жидкость переносили в новую пробирку.

Для предварительной очистки лизата белки G-Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) сначала трижды промывали в ледяном MDPBS, pH 7,4. Супернатанты головного мозга затем смешивали с предварительно промытыми гранулами и инкубировали на качающейся платформе в течение ночи при 4 ° С, после чего смесь центрифугировали при 600 × g в течение 5 мин и супернатант переносили в новую пробирку, которая была помечена «вход».

Для получения гранул, связанных с антителом, соответствующее количество (~ 20 мкг) неиммунных сывороток и антител (мышь, 0N, 1N, 2N и Dako (Agilent Technologies, Glostrup, Дания)) инкубировали вместе с 120 мкл (MDPBS, pH 5,5) и инкубировали на качающейся платформе в течение ночи при 4 ° C (фиг.2). Затем смесь центрифугировали при 600 × g в течение 5 мин, затем три промывки связанных с антителом гранул в ледяном IP-буфере.

Для иммунопреципитации белковых комплексов к связанным с антителом гранулам добавляли 1 мг предварительно очищенных супернатантов и инкубировали на качающейся платформе в течение ночи при 4 ° С. После центрифугирования в течение 5 мин при 600 × g при 4 ° С супернатант осторожно удаляли и сохраняли как «проточный» (FT). Бусины интенсивно промывали (путем перевертывания трубки вверх ногами 10 раз) с IP-промывочным буфером для получения комплексов белков, связанных с гранулами, покрытыми антителом (сохраненными как IP). Набор образцов, предназначенных для анализа вестерн-блоттинга, непосредственно кипятили в 1 × SDS-PAGE буфере для образцов (50 мм Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 1% -меркаптоэтанола, 12,5 мм EDTA и 0,02 % бромфенолового синего) (24), с последующим SDS-PAGE и вестерн-блот-анализом. Набор образцов, предназначенных для анализа МС, выдерживали при -80 ° С до дальнейшего использования.

Для блок-схемы масс-спектрометрического анализа см. Рисунок 2. Анализ TMT проводился с тремя наборами биологических повторов. Образцы IP и соответствующие метки TMT приведены в таблице 1. Для триптического переваривания к каждому образцу IP добавляли 100 мкл тетраэтиламмонийбромида (Sigma). Образцы восстанавливали 10 мл трис (2-карбоксиэтил) фосфином (Thermo Scientific, Rockford, IL) при комнатной температуре в течение 15 мин и алкилировали 20 мм иодацетамидом при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Затем образцы подвергались 16-часовому перевариванию с 6 мкг трипсина (Sigma, № каталога T6567) при 37 ° C.

Пептиды извлекали и отделяли от гранул центрифугированием при 14000 × g в течение 20 мин с использованием спиновых фильтров (Millipore, Billerica, MA). Концентрацию определяли с помощью Direct Detect (Millipore). Оценку концентрации белка оценивали и 50 мкг каждого расщепленного образца помещали в набор TMT (Thermo Scientific, каталог № 90113). Вкратце, пептиды инкубировали с реагентами TMT в течение 1 часа при комнатной температуре в соответствии с инструкциями производителя, после чего добавляли 8 мкл 50% гидроксиламина для гашения реакции.

После маркировки TMT 2 мкл из каждого образца объединяли и очищали, используя колонну для удаления моющих средств (Thermo Scientific, каталог № 87777), высушивали и ресуспендировали в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты (ProteoChem, Loves Park, IL, № каталога LC6201). Этот образец подвергали анализу на основе нано-LC-ESI MS / MS. Меченые и очищенные пептиды разделяли с использованием системы Easy nano-LC 1000 (Thermo Scientific), которая была непосредственно сопряжена с масс-спектрометром Thermo Q Exactive. В качестве столбца пептидной ловушки использовали «внутреннюю» упакованную твердую колонку с твердой сердцевиной Halo C18 (160 Å, 2,7 мкм, 75 мкм × 3,5 см). Аналитическая колонка представляла собой внутреннюю упакованную твердую колонку с твердой сердцевиной Halo C18 (160 Å, 2,7 мкм, 75 мкм × 10 см). Использовали следующие буферы: подвижный фазовый буфер А состоял из 0,1% муравьиной кислоты, а подвижный фазовый буфер В состоял из 99,9% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты. Образец 10 мкл вводили в колонку с пептидным ловушкой, предварительно предварительно уравновешенную буфером А и обессоливали 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. После обессоливания колонка пептидной ловушки включалась в линию в аналитическую колонку. Пептиды элюировали из колонки с использованием градиента линейного растворителя со стадиями от 1 до 30% буфера В в течение 170 мин и 30-85% буфера В в течение 2 мин с последующим выдерживанием в 85% буфера В в течение 8 мин с скорость потока 300 нл / мин через градиент.

Элюент колонки был направлен в источник ионизационной ионизации масс-спектрометра. Напряжение электрораспыления 1,6 кВ подавалось через жидкий переход вверх по течению от колонны. Масс-спектр сканировали в диапазоне масс 350-2000 м / с при разрешении 70 000. Автоматическое распознавание пиков, 10-секундное динамическое исключение и тандем MS из 10 самых интенсивных ионов-предшественников при 30% нормализованной энергии столкновения выполнялись с использованием программного обеспечения Xcalibur (Thermo Scientific).

Спектры MS / MS от каждого прогона LC-MS / MS были исследованы с помощью версии Proteome Discoverer версии 1.3 с использованием версии Mascot 2.4 (Matrix Science, London, UK) в отношении базы данных белка мыши для домашних животных NCBInr (Национальный центр биотехнологической информации, Bethesda, запись последовательности 173591 для Mus musculus). Критерии поиска были следующими: требовалась полная триптическая специфика; разрешено одно пропущенное расщепление; окисление (M), карбамидометилирование (C) и TMT 6plex (K) были установлены как переменные модификации; TMT-маркировка (N-терминал) была установлена ​​как фиксированная модификация; допуск массы ионов-предшественников был установлен при 10 ppm; и был получен допуск массы ионного фрагмента на 0,1 Да для всех спектров МС2. Относительная количественная оценка белка также была выполнена с использованием программного обеспечения Proteome Discoverer, основанного на интенсивностях ионов тегов пептида TMT. Анализ MS / MS показал (как и ожидалось из показаний с переменной концентрацией белка), что для объединенных 2 мкл образцов значительная разница для каждого канала «TMT», отражающего общее количество меченого белка в соответствующих реакциях. Поэтому новые образцы были объединены из восьми помеченных образцов, регулирующих объемы соответственно, используя общие количественные соотношения количества белка, определенные программным обеспечением количественной оценки Proteome Discovery в качестве руководства. Данные Nano-LC ESI MS / MS были получены для новых объединенных образцов. Эти данные были обработаны с помощью Proteome Discovery, и относительное общее количество количеств белка между каналами было подтверждено, что оно находится в пределах 20% разницы, которое затем корректировалось для получения того же количества (фиг.2).

Анализ пути проводили с использованием MetaCore и IPA для оценки степени взаимодействия между идентифицированными белками. Обогащение KEGG, обогащение клеточных компонентов GO (Gene Ontology) и обогащение биологического процесса GO осуществлялось с использованием DAVID (25). Точный критерий Фишера был использован для анализа значимости обогащения. Ниже приведена дополнительная информация об этих инструментах анализа. (i) Metacore (Thomson Reuters) представляет собой интегрированный программный пакет для функционального анализа протеомических данных на основе высококачественной базы данных с ручным контролем. (ii) IPA (Qiagen Redwood City) используется для анализа, интеграции и понимания протеомных данных с акцентом на захват соответствующих сетей, (iii) DAVID (david.ncifcrf.gov) является акронимом для базы данных для аннотации, визуализации и Интегрированное обнаружение и представляет собой открытую, доступную через Интернет программу, которая предоставляет полный набор функциональных аннотаций. (iv) KEGG (Киотская энциклопедия генов и геномов) представляет собой ресурс базы данных с информацией о молекулярном уровне, особенно крупномасштабных молекулярных наборов данных, генерируемых секвенированием генома, и других высокопроизводительных экспериментальных технологий. (v) GO обеспечивает контролируемый словарь терминов для описания характеристик генных продуктов и данных о продуктах генов. Анализ пути проводился с помощью алгоритмов множественных сравнений с точным тестом Фишера. p были скорректированы для множественных ошибок тестирования с критическим значением Бенджамини-Хохберга для ложной скорости обнаружения 0,1.

Для обратных со-IP белков G-Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) предварительно связывали с 4 мкг следующих антител, соответственно: анти-митохондриальный креатин-киназный U-тип (MtCK, Abcam, San Francisco, каталог no ab76506); анти-β-синуклеин (Abcam, № каталога ab76111); anti-apoE (Abcam, № каталога ab1906); anti-apoAI (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, № каталога sc-30089); антисинтаксин 1B (Synaptic Systems, Гёттинген, Германия, номер каталога 110402); антисинапсин 1 (Abcam, № каталога ab8); анти-синаптогирин-3 (Santa Cruz Biotechnology, № каталога sc-68936); анти-синаптофизин (Santa Cruz Biotechnology, № каталога sc-9116); и антисинаптотамин (Millipore, номер каталога MAB5200). Затем эти образцы инкубировали с 1 мг лизата при 4 ° С в течение ночи. Чтобы проверить предпочтительность связывания изоформ Тау, использовали дефосфорилированные лизаты, адаптировав протокол дефосфорилирования, полученный из New England Biolabs. Бусины интенсивно промывали IP-промывочным буфером и элюировали в 2 × SDS-PAGE буфере для последующего вестерн-блот-анализа. Клетки зондировали следующими антителами: анти-креатинкиназы U-типа; митохондриальный (MtCK); анти-β-синуклеина; анти-ароЕ; анти-apoAI; антисинтаксин 1B; антисинапсин 1; анти-synaptogyrin-3; анти-синаптофизин; анти-синаптотагмин и антитау. Для количественной оценки использовался ImageJ.

Прямое связывание рекомбинантных изоформ Тау определяли с использованием ELISA. Все этапы промывки состояли из трех промывок PBS в течение 1 мин. Пластинки Immuno-96-MicroWell (Nunc) покрывали в течение ночи при 4 ° С рекомбинантным 0N, 1N и 2N Tau при 10 мкг / мл в PBS. Планшеты промывали и затем блокировали 3% BSA в PBS в течение 2 ч при комнатной температуре. Рекомбинантный β-синуклеин и синаптофизин инкубировали при 10 мкг / мл в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре, промывали и затем детектировали антителом против V5 (1: 2000, Sigma) с последующим конъюгатом антитела против мышиного пероксидазы хрена (1 : 5000) каждый в течение 1 часа при комнатной температуре с промывкой между ними. В каждую лунку добавляли раствор субстрата, одностепенный Ultra 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидин (Life Technologies, Inc.) и инкубировали в течение 15 мин. Поглощение измеряли с помощью фильтра 450 нм (CLARIOstar, BMG Labtech). Измерения проводили в трех повторностях и анализировали после вычитания абсорбции лунок, покрытых BSA.

Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения Prism 6 с использованием t-критерия Стьюдента. Все значения приведены как средства ± S.E.

Ранее мы генерировали Tau-изоформ-специфичные антитела для форм 0N, 1N и 2N Tau и пан-тау-специфического антитела, помеченного M (ouse) (11). Здесь нас интересовало определение специфического для изоформы взаимодействия. Чтобы изолировать белки, которые прямо или косвенно взаимодействуют с суммарными Tau и специфическими изоформами Тау, мы установили восемь параллельных IP-адресов из-за того, что для последующего мультиплексированного МСМ мультиплексированного MS было восемь TMT (одна реакция дублировалась, см. Таблицу 1) , TMT представляет собой изобарный метод мечения, используемый в количественной протеомике тандемной МС для определения количества белков из разных источников в одном эксперименте (26). В течение семи реакций мы использовали лизаты мозга, полученные от 2-месячных мышей дикого типа C57BL / 6, и для восьмой реакции мы использовали лизат мозга из сопоставимой по возрасту мыши Tau KO в качестве отрицательного контроля (127C tag). В двух реакциях использовали Dako Tau, пан-тау-специфическое антитело (метки 126, а также 127N для внутренней стандартизации). В одной реакции использовали антитела 0N, 1N и 2N (с метками 129N, 130N и 131 соответственно). Мы также провели одну реакцию с нашим пан-тау-специфическим антителом M (ouse) (тег 128C). Реакция IP с нормальной сывороткой мыши включалась в качестве второго отрицательного контроля для исключения помех из-за неспецифического связывания с иммуноглобулинами мыши (тег 128N).

IP-образцы и соответствующие метки TMT

Чтобы проверить реакцию IP, мы провели анализ вестерн-блоттинга, продемонстрировав, что общий Tau был успешно снесен как с Dako Tau, так и с M. 0N и 2N Tau также были успешно и специально снесены с соответствующими изоформ-специфическими антителами. Однако нам не удалось обнаружить 1N Tau в иммунопреципитированном материале с помощью Вестерн-блоттинга, возможно, из-за очень низкого количества 1N, в сочетании с низким сродством этого антитела по сравнению с 0N или 2N (фиг.1). Однако мы обнаружили 1N Tau от MS в этой IP-реакции (см. Ниже). Фоном на блоттинге является то, что вторичное антитело против кроличьих HRP-меченных антител не только распознает антитело кролика против тау, исследующее пятно, но также антитело против тау кролика, используемое для IP.

Вестерн-блот-валидация реакций иммунопреципитации Тау. 1-я строка указывает источник ткани, а вторая строка указывает на антитело, используемое для IP (Tau-изоформ-специфических антител 0N, 1N и 2N и пан-тау антител Dako Tau и M). Входные, IP и проточные (FT) были загружены для каждой реакции. В качестве отрицательных контролей были включены IP из мозга дикого типа с использованием нормальной сыворотки (IP: нормальная сыворотка) и из мозга Tau KO с использованием антитела Dao (IP: Dako с мышами Tau KO).

После TMT-маркировки иммунопреципитированных образцов мы провели анализ LC-MS / MS (жидкостная хроматография с тандемным MS) (рис.2). Это позволило идентифицировать белки, взаимодействующие с изоформами Tau, и количественно определить эти взаимодействия. Для обеспечения того, чтобы в масс-спектрометр вводили одинаковое количество каждого помеченного образца, интенсивность метки была подтверждена в пределах 20% отклонений между образцами.

Схематическая диаграмма количественного потока протеомики LC-MS / MS. Процедура объединяет инкубацию указанных антител с белками G (ProtG) с последующим добавлением указанных лизатов, переваривание в пептиды, оценку концентрации белка, маркировку изобарической тандемной массы (TMT) образца, объединенного из восьми реакций , разделение жидкостной хроматографией (LC), определение относительной TMT-маркировки, регулирование объемов образцов на основе относительного TMT-представления, соответственно регулирование объемов восьми образцов для получения смеси с равным TMT-представлением с последующим измерением с помощью масс-спектрометрии ( MS) и количественной оценки относительных интенсивностей белка по меткам. Восемь реакций со-IP проводились параллельно, при этом образцы 1 и 2 были помечены двумя разными тегами (таблица 1) для нормализации.

Вначале наш анализ показал, что MS смогла обнаружить изоформы 0N, 1N и 2N Tau (таблица 2), в которой, например, отношение TMT для Tau в реакции 1N IP было на 38% выше, чем для реакции KO IP , что указывает на то, что 1N антитело успешно иммунопреципитировало 1N Tau из лизата головного мозга. Интересно отметить, что для MAP2, принадлежащего к тому же семейству MAP, что и Tau, отношение TMT было примерно в четыре раза выше в образце Tau KO по сравнению с образцами дикого типа. Это подтверждает предыдущие результаты, которые показали повышение регуляции MAP1A у мышей Tau KO (27), вместе демонстрируя компенсаторные механизмы, когда Tau отсутствует.

TMT для Tau и MAP2

CV означает коэффициент вариации.

Затем мы стремились идентифицировать белки, которые взаимодействуют со всеми тремя изоформами Тау. Для этого количество белка для реакций IP: Дако C57BL / 6 и ткани мозга Tau-KO сравнивали после нормализации антител против тау Дако. Белки, для которых реакция IP: Dako / C57BL / 6 дали показания, которые были, по меньшей мере, на 10% выше (и имели значение р≤0,05), чем для реакции IP: Dako / Tau-KO считались тау-взаимодействующими белками. Таким образом, список 218 иммунопреципитированных белков был снижен до 101 Tau-взаимодействующих белков (дополнительная таблица 1). Следует отметить, что из-за химических проблем фона метода TMT наблюдаемое изменение складки всегда меньше фактического сгибания (28). Например, 10% -ное изменение, определенное TMT, вероятно, указывает на фактическое изменение на 20-50%. Поскольку многие изменения в связывании белков со-иммунопреципитированных белков составляли порядка 20-50%, использование более высокого отношения отсечения могло бы устранить многие взаимодействующие белки (дополнительная таблица 1).

Чтобы идентифицировать предпочтение связывания конкретных изоформ Тау, данные МС из иммунопреципитированных реакций с использованием лизатов мозга мозга дикого типа и антител Дако, М, 0N, 1N и 2N (IP: Dako, IP: M (ouse), IP : 0N, IP: 1N и IP: 2N) были нормированы на общую интенсивность (т.е. количество) выталкиваемых белков. Чтобы нормализовать выведенные количества белка, мы создали базу данных о конкретных образцах белка путем экспорта идентифицированных белков без антител. Это идентифицирует белки, которые были совместно иммунопреципитированы с помощью Тау, используя базу данных NCBInr M. musculus. Эта сбитая база данных белка использовалась для обработки данных TMT и количественной оценки. Мы использовали эту форму нормализации, потому что антитела различаются по их аффинности, и, следовательно, не может быть установлена ​​линейная зависимость между концентрацией конкретного антитела в реакции IP и количеством выведенного белка. Сродство конкретного антитела в реакции IP более адекватно отражается его способностью выталкивать связанные с приманкой белки. Поэтому мы исключили показания с антител, используемых для IP, и использовали только общее количество выталкиваемых белков для нормализации. К сожалению, данные IP: нормальные сыворотки не вписывались в два метода нормализации, которые мы приняли, один из которых использует интенсивность анти-Тау антитела Дако в качестве знаменателя, а другой — полное антитело против тау. Поскольку реакция IP: нормальная сыворотка использовала нормальную сыворотку мыши для раскрывающегося списка, которая не содержит знаменатель, использованный выше, мы исключили данные IP: нормальные сыворотки из анализа MS и использовали данные IP: Dako от мышей Tau KO в качестве единственного отрицательный контроль.

Наш анализ показал, что 24 из 101 идентифицированных белков связываются преимущественно с 0N Tau (дополнительная таблица 2), 23 связываются преимущественно с 1N (дополнительная таблица 3) и 32 связываются преимущественно с 2N (дополнительная таблица 4), тогда как 22 взаимодействуют со всеми изоформами в аналогичной степени (дополнительная таблица 5). Белок классифицировали как предпочтительное связывание, когда отношение связывания было по меньшей мере на 10% выше, чем для двух других изоформ. Чтобы назвать несколько, мы идентифицировали как 0N-взаимодействующие белки β-субъединицу ATP-синтазы, α-синуклеин, β-синуклеин, U-тип митохондриальной креатинкиназы (MtCK), креатинкиназу B-типа, синапсин 1 и синаптогирин-3; в качестве 1N-взаимодействующих белков АТФазы, нейромодулина, изоформы формы тропомиозина α-1 10, кальмодулина и изоформы основного белка миелина 3; как 2N-взаимодействующий белок apoA1, apoE, синаптогамин, синтаксин 1B и 14-3-3ζ; и в качестве белков без предпочтений различные субъединицы АТФазы, кофилин-1, синаптофизин и Dnm1 (также известный как Drp1). Однако мы не обнаружили Fyn, который, как известно, взаимодействует с Tau (см. Ниже).

Чтобы убедиться, что белковые взаимодействия, идентифицированные с помощью МС, происходят в естественных условиях, мы проводили реакции со-IP для нескольких ранее незарегистрированных Tau-взаимодействующих белков. Наши данные вестерн-блоттинга показали, что антитела против апоэфира, синаптофизина, синтаксина 1В, апоа1, -синуклеина, синаптогирина-3, MtCK, синаптотамина и синапсина 1 все со-иммунопреципитировали соответствующие белки с помощью Тау, когда использовали лизаты мозга мозга дикого типа (Фиг.3А). Это подтвердило, что эти белковые взаимодействия с Тау действительно происходят. Мы не обнаружили Fyn из-за буфера, используемого для реакции IP. Экстракция головного мозга мыши в IP-буфер дает супернатант (вход для IP) и осадок, который дополнительно экстрагируют 70% муравьиной кислотой для получения фракции гранул. Это показало, что фракция супернатанта (эквивалентная той, которая использовалась в наших реакциях с IP) содержала очень мало Fyn по сравнению с гранулой (фиг.3B).

Валидация идентифицированных тау-взаимодействующих белков путем совместной иммунопреципитации.
A, тау-взаимодействующие белки были иммунопреципитированы в естественных условиях из лизата головного мозга, полученного от 2-месячной мыши дикого типа, с использованием антител для апоэфира, синаптофизина, синтаксина 1B, apoA1, β-синуклеина, синаптогирина-3, MtCK, синаптогамина, и синапсин 1, а затем промокали анти-тау-антителом. Входной сигнал показан на дорожке 1; лизат дикого типа, который был иммунопреципитирован нормальным IgG, показан как отрицательный контроль в полосе 2; и IP с указанным антителом в полосе 3. B, Fyn, который, как известно, взаимодействует с tau, не был совместно иммунопреципитирован из-за буфера, используемого для реакции. Экстракция ткани мозга мыши в IP-буфер дает супернатант (Sup, вход для IP) и осадок, который дополнительно экстрагируют 70% муравьиной кислотой для получения фракции гранул. 20 мкг супернатантной фракции (эквивалент которой используется в вышеуказанных реакциях IP) содержит очень мало Fyn по сравнению с таблеткой.

Все белки, которые были идентифицированы в IP-реакциях MS, были отнесены к широким классификациям на основе как известных, так и предсказанных «субклеточных местоположений, клеточного компонента и функции» с использованием базы данных знаний белка UniprotKB, которая была вручную аннотирована и пересмотрена. Из 101 белка, идентифицированного из базы данных NCBInr, 93 рассмотрели аннотации в UniprotKB (дополнительная таблица 6). В терминах субклеточной локализации тау-взаимодействующих белков мембрано-связанные белки составляли большинство идентифицированных взаимодействующих белков (51%), за которыми следуют цитоплазматический (17%) и цитоскелетные белки (12%) (фиг.4А).

Классификация тау-взаимодействующих белков. Показаны диаграммы субклеточной локализации идентифицированных Tau-взаимодействующих белков (A), подмножества связанных с мембраной белков, идентифицированных как самая большая категория с использованием отсека ячеек аннотаций (B) и функциональных классов идентифицированных белков (C). Показаны только основные категории; категории с меньшим количеством белков кумулятивно отображаются как другие.

Далее мы более подробно рассмотрели категорию мембранно-связанных белков с терминами клеточного отделения. Интересно отметить, что в связанной с мембраной категории митохондриальные белки составляли наибольшую фракцию (40,4%), а затем плазматическую мембрану (25,5%), белки пузырьковых мембран (21,3%) и белки, принадлежащие аппарату эндоплазматического ретикулума / Гольджи (10,6% ) и эндосом (2,1%) (фиг.4В). Отдельной функциональной классификацией белков, идентифицированных как основные категории, являются энергетический метаболизм (31%), затем синаптическая сигнализация (22%), обработка цитоскелета (18%), регуляция фосфорилирования белка (9%) и другие (20%), (Фиг.4С).

Чтобы получить доступ к степени взаимодействия идентифицированных тау-взаимодействующих белков, все перечисленные белки (дополнительная таблица 1) были импортированы в эту базу данных для создания сети прямого взаимодействия идентифицированных 101 белков. Один крупный кластер взаимодействия Тау содержал 33 тау-взаимодействующих белка, которые были идентифицированы MS (данные не показаны). Среди белков были тубулин, актин, кофилин, динамин, основной белок миелина и белок теплового шока 90 (Hsp90).

Чтобы исследовать пути, с которыми взаимодействуют взаимодействующие белки в главном взаимодействующем с Тау кластером, эти белки подвергаются IPA. Это выявило два значительных перекрывающих друг друга пути: связь между клетками и взаимодействие (точное определение Фишера, p = 1,14е-16) (фиг.5A) и неврологическое заболевание (точный тест Фишера, скорректированный p = 3,93e- 18), который вышел как обогащенный (рис.5B). Канал передачи сигналов и взаимодействия между клетками выделяет три группы белков следующим образом: (i) АТФаза и АТФ-синтаза, которые обеспечивают энергию для везикулярного транспорта; (ii) белки, играющие роль в образовании синаптических пузырьков и стыковке, таких как синапсин и синаптотамин; и (iii) цитоскелетные белки, участвующие в везикулярном транспорте, включая актин и динамин. Путь неврологических заболеваний показывает белки, которые способствуют неврологическому заболеванию. Следует отметить, среди прочих, фосфатаза Tau Tau Tau и киназа Tau Tak (PKB). Чтобы выявить взаимосвязь между путями, содержащими Tau-взаимодействующие белки, все идентифицированные Tau-взаимодействующие белки были загружены в IPA, а карта отношений из 25 лучших канонических путей была создана с использованием программного обеспечения базы знаний Ingenuity. Два основных кластера путей были определены следующим образом: кластер, связанный с неврологическим процессом, и кластер, связанный с энергетическим обменом. Связь между двумя путями определяется общими общими компонентами, например, белком 14-3-3, который играет роль как в сигнальной передаче сигналов (10), так и в сигнале (10) с аксоном (25); таким образом, 14-3-3 является общим компонентом, связывающим эти два пути (фиг.6).

Анализ путей генерации идентифицирует две высокообогащенные сети для взаимодействующих с Тау белков. Этими сетями являются сигнализация и взаимодействие между ячейками и А (A) и сеть неврологических заболеваний (B). Тау и его взаимодействующие белки отмечены красными точками.

Анализ кластеров пут. 25 лучших канонических путей, обогащенных для взаимодействующих с Тау белков, следующие: 1) гликолиз I; 2) глюконеогенез I; 3) митохондриальная дисфункция; 4) цикл TCA II (эукариотический); 5) ремоделирование стыков эпителиальных адгезивов; 6) опосредованная клатрином сигнализация эндоцитоза; 7) сигнализация болезни Хантингтона; 8) биосинтез креатин-фосфат; 9) окислительное фосфорилирование; 10) 14-3-3-опосредованная сигнализация; 11) деградация сахарозы (млекопитающее); 12) деградация изолейцина I; 13) сигнализация глутаматного рецептора; 14) сигнализация болезни Паркинсона; 15) сигнализация GABA-рецептора; 16) биосинтез глутамина I; 17) сигнализация щелевого соединения; 18) сигнализация клеток-клеток Sertoli; 19) ввод вируса через эндоцитарный путь; 20) сигнализация кальция; 21) сигнализация амиотрофического бокового склероза, 22) регуляция рака молочной железы с помощью stathmin1; 23) сигнализация fMLP в нейтрофилах; 24) ремонт НАДХ; и 25) сигнализация осевого наведения. Пути были ранжированы по счету обогащения (-log (P)) с высокой до низкой. Порог оценки обогащения составил 1,3.

Используя инструмент функционального обогащения DAVID (29), мы создали список обогащенных категорий (в трех категориях — биологический процесс, клеточный компонент и путь KEGG) для всех взаимодействующих с Тау белков, идентифицированных MS, как для белков, преимущественно связывающихся с конкретными Tau и для белков, взаимодействующих со всеми изоформатами Тау с аналогичным коэффициентом связывания (таблица 3). Категории обогащения биологического процесса GO для всех идентифицированных тау-взаимодействующих белков включают гликолиз, биосинтетический процесс АТФ, синаптическую передачу, клеточный гомеостаз, нуклеотидное связывание, регуляцию системного процесса и клеточное дыхание (таблица 3). Мы также выполнили функциональное обогащение клеточного компонента, которое дает распределение тау-взаимодействующих белков в клеточных компартментах (табл. 3). Обогащение путей KEGG показало, что Tau-взаимодействующие белки были специфически связаны с неврологическими заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона (таблица 3). Интересно отметить, что анализ обогащения KEGG показал, что белки, предпочтительно связывающие 2NTau, обогащены неврологическим путем (таблица 3). Чтобы дополнительно подтвердить это наблюдение, мы использовали обогащение для биомаркеров болезни, которое управляется MetaCore. Интересно отметить, что для первых 10 обогащенных заболеваний показатель обогащения (-log (скорректированная величина p)) белков, которые преимущественно связываются с 2N Tau, всегда был самым высоким по сравнению с показателями для двух других изоформ (рис.7). Это говорит о том, что, хотя Tau-взаимодействующие белки в основном участвуют в энергетическом метаболизме и нейрофизиологических процессах, белки, которые связываются с 2N Tau, имеют более заметную роль в неврологическом заболевании.

Функциональное обогащение DAVID

A указывает на обогащение биологического процесса; B обозначает клеточный компонент; и C указывает путь KEGG.

Функциональное распределение и обогащение тау-взаимодействующих белков, классифицированных по «биомаркерам болезней» с использованием анализа Metacore.

Чтобы проверить предпочтительность связывания тау-взаимодействующих белков для конкретных изоформ Тау, идентифицированных MS, мы выполнили совместные IP-процессы для трех взаимодействующих с тау белков, синаптофизина, β-синуклеина и apoA1, используя дефосфорилированные лизаты головного мозга (фиг.8A). Анализ MS показал соотношение 0N: 1N: 2N = 1: 1,1,07: 1,09 для синаптофизина, что говорит о том, что синаптофизин не имеет строгого связывания для любой из трех изоформ. Когда мы квантифицировали вестерн-блотство обратного IP, мы получили отношение 0N: 1N: 2N = 1: 0,97: 0,93, подтверждающее анализ MS. Для β-синуклеина MS определяло отношение 0N: 1N: 2N = 1: 0,89: 0,48, что указывает на предпочтительное связывание для 0N Tau. Вестерн-блот для обратного IP дает отношение 0N: 1N: 2N = 1: 0,41: 0,37, снова поддерживающее данные MS. Наконец, для apoA1 данные MS дали отношение 0N: 1N: 2N = 1: 0,84: 4,85, что указывает на очень сильное предпочтение 2N Tau во взаимодействии с apoA1. Примечательно, что когда мы провели анализ вестерн-блоттинга обратного IP, мы обнаружили только изоформу 2N.

A, обратное IP-подтверждение выбранных взаимодействий. Чтобы проверить предпочтительность связывания Tau-взаимодействующих белков для специфических изоформ Тау, идентифицированных MS, дефосфорилированные экстракты дикого типа (ни нагретые, ни диализированные) были иммунопреципитированы антителами для синаптофизина, β-синуклеина и apoA1 соответственно, с последующим зондированием с помощью антитело Dako Tau. Количественное определение Вестерн-блоттинга (ВБ) показывает соотношение 0N: 1N: 2N = 1: 0,97: 0,93 для синаптофизина и 1: 0,877: 0,5 для β-синуклеина. В случае apoA1 была обнаружена только изоформа 2N. В каждой реакции имеется три полосы: дорожка 1, вход; полоса 2, проточная; и дорожка 3, IP. B, определение ELISA прямых взаимодействий. Чтобы определить, происходит ли прямое связывание тау-взаимодействующих белков с конкретными изоформами Тау, ELISA проводили с использованием пластинок, покрытых рекомбинантным 0N, 1N и 2N Tau, а затем инкубировали с рекомбинантным apoA1, β-синуклеином и синаптофизином. Связывание детектировали с использованием либо анти-apoA1 антитела, либо антитела против V5 для β-синуклеина и синаптофизина. Измерения проводились в трех повторах (n = 2) и анализировались после вычитания фоновой абсорбции. β-Synuclein связывается преимущественно с 0N Tau по сравнению с 1N (***, p <0,001) и 0N (****, p <0,0001) Tau с отношением 0N: 1N: 2N = 1: 063: 026. Синаптофизин показал очень слабое связывание со всеми изоформами Тау, тогда как apoA1 не обнаруживал никакого взаимодействия с Тау.

Для более точного подтверждения некоторых идентифицированных тау-взаимодействий связывание рекомбинантного 0N, 1N и 2N Tau с рекомбинантным apoA1, β-синуклеином и синаптофизином определяли с использованием ELISA (фиг.8B). Пластины покрывали 0N, 1N и 2N Tau, а связанный apoA1, β-синуклеин или синаптофизин детектировали с использованием либо антитела против апоА1, либо антитела против V5 для β-синуклеина и синаптофизина. В соответствии с данными MS и обратным IP (фиг.8A) β-синуклеин показал значительное преимущественное связывание с 0N Tau с отношением 0N: 1N: 2N = 1: 063: 0,26, демонстрируя прямое взаимодействие β-синуклеина с Тау. Напротив, синаптофизин показал очень слабое связывание со всеми изоформами Тау, и apoA1 вообще не связывался. Это говорит о том, что для взаимодействия между синаптофизином и apoA1 с Tau могут потребоваться дополнительные кофакторы. Чтобы определить функциональную значимость этих взаимодействий, один ограничивается тем, что трудно предсказать, повлияет ли какое-либо из взаимодействий Тау на сверхэкспрессию или удаление Тау, и будет ли это проявляться в различиях в субклеточной локализации, выражение уровни, активность и т. д., а также будет ли это проявляться только в определенных областях мозга и типах клеток.

Вместе наши результаты подчеркивают различные белковые взаимодействия различных изоформ Тау, предполагая, что они выполняют разные функции, которые могут быть ослаблены в разной степени в нейродегенеративном заболевании.

Используя как новые специфичные для формы Tau антитела, так и коммерчески доступные пан-тау-антитела, реакции IP с последующей маркировкой TMT и количественной МС идентифицировали 101 белок, которые прямо или косвенно взаимодействуют с Tau. Мы также определили предпочтительные взаимодействия для трех изоформ Tau, и, что важно, мы определили особую роль для 2N Tau при неврологическом заболевании, используя набор инструментов базы данных и путей.

Взаимодействующие с Тау белки, которые мы идентифицировали, можно разделить на несколько групп в соответствии с их субклеточной локализацией и биологической функцией. Хотя Тау хорошо известен своим взаимодействием с микротрубочками, цитоскелетные белки составляли лишь одну десятую всех идентифицированных белков и считались четвертой по величине категорией, основанной на субклеточной локализации. Напротив, почти половина тау-взаимодействующих белков были сгруппированы в виде мембранно-связанных белков, включающих самую большую категорию. Это проекционная область Tau (локализованная в ее N-концевой половине), которая играет решающую роль в мембранной ассоциации белка (30). Его богатый пролином домен содержит мотивы PXXP, которые облегчают взаимодействие с белками, содержащими домены Src homology 3, такие как Fyn (31, 32). Наши данные подтверждают, что Tau ассоциируется с внутриклеточными мембранами, включая эндоплазматический ретикулум (33), сеть Гольджи (34) и плазматическую мембрану (35). Однако мы не идентифицировали самого Fyn из-за буфера, используемого для реакции IP. Это указывает на ограничение, присущее всем подходам со-IP, в том, что необходимо использовать буфер, который (а) не содержит белки со-IP, которые не взаимодействуют, но (б) взаимодействуют со-IP-белки, которые взаимодействуют, не нарушая их взаимодействие (например, изоформы Тау и их взаимодействующие белки). Поэтому IP вряд ли идентифицирует полный интеллект любого представляющего интерес белка.

Оценивая субклеточные компартменты, к которым локализуются мембраны, связанные с мембранами, взаимодействующими с тау, мы обнаружили, что белки плазматической мембраны составляют вторую по величине категорию, а митохондриально локализованные белки — самые большие. Локализация митохондрий не удивительна, учитывая, что нарушенная функция этой органеллы характеризует тауопатии, такие как AD (36, 37). В моделях Drosophila и мыши было продемонстрировано, что избыточная экспрессия Tau может индуцировать гибель клеток удлиняющимися митохондриями; это достигается за счет уменьшения локализации митохондриального белка деления DRP1 до митохондрий (38), белка, идентифицированного на нашем экране. Изучение распределения митохондрий в мозге АД показало, что их количество было значительно снижено в тупо-несущих нейронах Тау по сравнению с нейронами при здоровом контроле (39). Аналогичные результаты были получены в штамме трансгенной мыши Tau rTg4510 (39). 3 × Tg-AD, которые проявляют как тау, так и амилоидную патологию, присутствующие при уменьшенном дыхании митохондрий и снижении уровней и активности белка пируватдегидрогеназы (40). У мышей tripleAD были обнаружены как отдельные, так и синергические эффекты Tau и амилоида в отношении различных митохондриальных функций (41). Наш со-IP также продемонстрировал взаимодействие между Tau и киназой MtCK. Этот фермент является центральным регулятором гомеостаза клеточной энергии, и его активность очень восприимчива к окислительному стрессу, с 86% -ным снижением у пациентов с АД (42). Tau трансгенные мухи имеют повышенную супероксидную продукцию по сравнению с контролем дикого типа, а также с увеличением смертности от нейронов (38). В сочетании с нашими данными это говорит о том, что Тау может интегрировать сигналы окислительного стресса, митохондриальную дисфункцию и нейродегенерацию. Возможно, что Тау может влиять на митохондриальные функции не только воздействуя на уровни реакционноспособных видов кислорода, но также взаимодействуя с митохондриальными белками, такими как MtCK.

При классификации тау-взаимодействующих белков в соответствии с их биологической функцией, основанной на аннотации в UniProtKB, верхними группами были синаптическая сигнализация (31%), а затем энергетический метаболизм и обработка цитоскелета. В последние годы синаптическая роль Тау вошла в центр внимания. Было обнаружено, что Тау нацеливает Fyn на рецептор N-метил-d-аспарагиновой кислоты, опосредуя индуцированную амилоидом экситотоксичность в синапсе (31). Впоследствии всестороннее исследование трех отдельных трансгенных мышечных моделей, связанных с AD (hAPPJ9, hAPPJ20 и TASD41), показало, что снижение уровней Tau восстанавливает нормальную синаптическую активность и сетевые обстрелы (43). Совсем недавно неправильная сортировка тау до дендритных шипов наблюдалась у мышей P301L, что приводило к потере глутаматных рецепторов и увлажнению синаптической сигнализации (44). Хотя Fyn не был в списке наших идентифицированных Tau-взаимодействующих белков, мы идентифицировали еще один постсинаптический белок, белок 14-3-3ζ каркаса, который ранее был продемонстрирован для ассоциирования с Tau и функционировал как эффектор фосфорилирования Тау (45). Совсем недавно в нескольких исследованиях было показано, что изоформы формулы 14-3-3 γ, θ и ζ обеспечивают платформу для гликогенсинтазы-киназы-3 (GSK-3) для регулирования фосфорилирования тау, участвуя в трафике белков, а также облегчают передачу сигнала экзоцитотических путей (46, 47). Кроме того, показано, что 14-3-3 связывает постсинаптический белок PSD-95, который высоко экспрессируется в глутаматергических синапсах гиппокампа, участвующих в взаимодействии Fyn-Tau, устанавливая непрямое взаимодействие между 14-3-3 и глутаматными рецепторами, K + каналов, и лесов и сигнальных белков (48). Аналогично, было обнаружено, что 14-3-3 взаимодействует с глутаматными рецепторами посредством связывания с гомомером Гомера 3 (Homer 3). Он также играет роль в цитоскелетной реорганизации и морфогенезе позвоночника, поскольку он может вызывать созревание шипов в культивируемых нейронах гиппокампа крысы (49). Вместе с нашими выводами это говорит о том, что 14-3-3 может функционировать не только как эффектор фосфорилирования Тау, но также обеспечивает платформу для взаимодействия Тау с другими сигнальными белками.

Стоит отметить, что в дополнение к постсинаптическому белку 14-3-3, многие пресинаптические везикулы связаны с нашим MS-анализом, таким как синапсин I, синаптофизин, синаптогирин-3, синаптогамин и синтаксин-1B. Эти белки все вовлечены в нейротрансмиссию и имеют решающее значение для стыковки и слияния везикул. Хотя прямое взаимодействие между тау и белками синаптического пузырька еще нужно продемонстрировать, эти пять пресинаптических белков были иммунопреципитированы нами в пяти отдельных реакциях с использованием различных антител против Тау и впоследствии были подтверждены со-IP. Это убедительное доказательство роли Тау в пресинаптической передаче сигнала. Синапсин I представляет собой белок, связывающий актин, который регулирует кластеризацию синаптических везикул и экзоцитоз вместе с актином (50). Было также показано, что Tau взаимодействует с актином in vitro и может опосредовать дегенерацию нейронов, изменяя организацию и динамику актинового цитоскелета (51). Вместе с нашими выводами, это показывает, что Tau взаимодействует с синапсином I через актин и тем самым также изменяет динамику актина и пресинаптический транспорт транспортных средств, что может привести к синаптической недостаточности и нейродегенерации. Кроме того, Tau может взаимодействовать с другим синаптическим транспортным белком, синтаксисом 1B, через dynamin-1. Сообщалось о взаимодействии Тау с этими двумя белками в секреторных гранулах (52). Синтаксины 1А и 1В совместно выражены в нейронах, и недавнее исследование доказало, что синтаксин 1В, но не синтаксин 1А, имеет решающее значение для регуляции экзоцитоза синаптических пузырьков (53). Hoover et al. (44) мутировали 14 сайтов фосфорилирования в богатой пролином области Тау до отрицательно заряженных остатков глутамата для имитации фосфорилирования; это приводило к более частым накоплению мутированного Тау в дендритных шипах, чем тау дикого типа, и нарушало синаптические функции. Более того, двойные трансгенные мыши, экспрессирующие мутацию P301S Tau вместе с мутацией, обнаруженной в семейной датской деменции, показали значительное увеличение осаждения Тау и значительное снижение уровней синаптофизина в мозге мыши (54). Хотя показано, что Tau непосредственно не взаимодействует с этими синаптически связанными белками, вышеупомянутые ранее исследования показали, что он может взаимодействовать с синапсином I, синтаксином 1B и другими синаптическими белками (или комплексом, образованным этими синаптическими белками) через цитоскелетные белки и удары на синаптической передаче через эти косвенные взаимодействия. Недавно мы показали, что Tau локализуется в головке позвоночника нейронов гиппокампа и что этой локализации способствует псевдофосфорилирование Tau на разных участках (55). Дальнейшие исследования необходимы для определения того, взаимодействует ли Tau непосредственно с синтаксином 1B и другими синаптическими белками (с ELISA, показывающим такое взаимодействие для синаптофизина, см. Ниже).

Наш со-IP также показал взаимодействие между Tau и apoE, а также apoA1 (с зависимыми от формы формами Tau, обсуждаемыми ниже). АоЭ44-аллель является основным фактором риска развития АД (56), причем апоэлемент обнаруживается в нейрофибриллярных клубочках (57). Интересно, что apoE3 и Tau, как было показано, взаимодействуют даже при наличии 2% SDS (58), и наше обнаружение того, что apoE является белком взаимодействия Тау, согласуется с этим наблюдением. Совсем недавно apoA1 был идентифицирован как маркер AD с концентрацией apoA1 в спинномозговой жидкости, отличающей AD от пациентов без сундука с 84% -ной чувствительностью и 72% -ной специфичностью, причем 78% субъектов были правильно классифицированы (59). Для сравнения, использование только Aβ42 дало 79% чувствительность и 61% специфичность, причем 68% субъектов были правильно классифицированы. Аполипопротеины регулируют липиды, включая холестерин. Какая роль Тау в метаболизме липидов не полностью понята; однако наша идентификация apoA1 как Tau-взаимодействующего белка делает эти связи более сильными.

Два дополнительных интересных Tau-взаимодействующих белков, идентифицированных MS, представляют собой α- и β-синуклеин, первые образующие агрегаты в телах Леви, поражающее поражение болезни Паркинсона. Оба синуклеина показывают аналогичный уровень экспрессии в головном мозге и совместно локализуются в пресинаптических терминалах (60, 61). Ранее эксперименты с аффинной хроматографией показали прямое связывание между α-синуклеином и Tau (62). Наше исследование со-IP с последующим ELISA далее выявило прямое взаимодействие между β-синуклеином и Tau. Было высказано предположение, что Tau и α-синуклеин способствуют накоплению друг друга, что является признаком сопутствующей болезни (63). Все большее число исследований подтверждают эту гипотезу, поскольку Tau продемонстрировала усиление агрегации α-синуклеина (64).

В то время как прямые белковые / белковые взаимодействия обычно определяются такими методами, как перенос энергии резонанса флуоресценции, поверхностный плазмонный резонанс или пропущенные анализы с очищенными белками, MetaCore, который использует запатентованную базу данных для выявления прямых белковых / белковых взаимодействий, идентифицировал кластер с центрированными белками на Tau, в котором показано, что три белка, тубулин, белок теплового шока 90 (Hsp90) и кальцинеурин, также известный как PPP3, непосредственно связывают Tau. На карте также показано, что тубулин не только непосредственно связывает Tau, но также связывает актин и dynamin-1, который связан с синапсином I и синапсином II и обеспечивает мост между тау и белками синаптического пузырька. Эта карта согласуется с нашим анализом аннотаций Uniprot и нашими результатами совместного IP. Кроме того, Hsp90 является основным клеточным шапероном, который собирает крупные комплексы шаперонов. Комплексы Hsp90 функционируют, чтобы поддерживать контроль качества белка и способствовать деградации белка. Когда Тау становится гиперфосфорилированным и образует агрегаты, образуется комплекс между Hsp90 и Tau, который запускает убиквитинирование Тау и активирует его деградацию (65, 66). Чтобы дополнительно проанализировать косвенные взаимодействия тех белков, которые тесно взаимодействуют с Тау, анализ канонических путей проводился с использованием базы данных IPA. Это выявило два высокообогащенных пути, передачу сигналов от клетки к клетке и взаимодействие и неврологические заболевания. Первая включает в себя группу белков, участвующих в формировании синаптических пузырьков, стыковке и слиянии, с важной ролью в высвобождении нейротрансмиттера, тогда как вторая группа включает белки, связанные с изменениями в неврологическом заболевании. Некоторые из них сильно коррелируют с развитием болезни, например, с Тау. Тот факт, что тау-взаимодействующие белки сильно обогащены этими двумя путями, указывает на то, что Тау является их критическим компонентом.

Новый вывод нашего исследования — это также идентификация белков с преимущественным связыванием с различными изоформами Тау, с помощью использования специфичных к изоформы антител и подтвержденных для подмножества этих белков обратными IP. Сгруппировав идентифицированные белки на основе их предпочтения связывания, мы получили четыре группы следующим образом: по одному с предпочтительным связыванием с любой из трех изоформ Тау и без предпочтений. Используя инструмент функционального обогащения DAVID, для этих групп были рассчитаны различные уровни обогащения. Это показало, что белки, которые предпочтительно связывают с 0N Tau, обогащены гликолизом, клеточным гомеостазом и клеточным дыхательным путем; белки, которые предпочтительно связывают с 1N Tau, обогащены гликолизом; и белки, которые предпочтительно связывают с 2N Tau, участвуют в процессе биосинтеза АТФ, синаптической передаче и регуляции пути системного процесса. Это открытие согласуется с нашим ранее опубликованным исследованием локализации изоформы (11).

Среди проверенных тау-взаимодействующих белков — синаптофизин, β-синуклеин и apoA1. Это показало, что отношение, полученное анализом МС, отражается тем, что получено вестерн-блоттингом обратной реакции IP. Для синаптофизина MS показало отношение 0N: 1N: 2N = 1: 1,1,07: 1,09, а обратный IP один из 1: 0,97: 0,93, что указывает на отсутствие выраженного связывающего предпочтения синаптофизина для любой из трех изоформ. Для β-синуклеина MS определяли соотношение 1: 0,89: 0,48 и обратный IP 1: 0,41: 0,37, что указывает на предпочтительное связывание для 0N Tau. Наконец, для apoA1 данные MS дали отношение 1: 0,84: 4,85, тогда как по обратному IP было обнаружено только 2N, что указывает на очень сильное предпочтение 2N Tau во взаимодействии с apoA1.

Интересно, что функциональное обогащение DAVID пути KEGG показало, что белки, которые предпочтительно связывают 2NTau, более обогащены болезнью Паркинсона (скорректировано p = 0,0073), болезнью Альцгеймера (с поправкой на p = 0,0121) и болезнью Хантингтона (с поправкой на p = 0,0082) тогда как белки, которые предпочтительно связывают 0N и 1N Tau, не показали значительного обогащения. Однако белки, которые предпочтительно связывают 0N и 1N Tau, обогащены гликолизом и глюконеогенезом, что согласуется с результатом обогащения с использованием термина GO биологического процесса. Чтобы убедиться в том, что белки, которые предпочтительно связывают 2N Tau, более обогащены этими нейродегенеративными заболеваниями, второй анализ функционального обогащения проводили с MetaCore с использованием биомаркеров болезней в качестве идентификатора, что снова давало последовательные результаты. Для нейродегенеративных заболеваний, деменции и тауопатии белки, которые преимущественно связывают 2N Tau, имели более высокие оценки обогащения. Таким образом, впервые было показано, что белки, связанные с конкретной изоформой Тау, сильно обогащены болезненным путем.

C. L. и J. G. задумали и скоординировали исследование; C. L., X. S. и R. N. провели эксперименты. Все авторы проанализировали и интерпретировали данные. C. L. и J. G. написал рукопись с вкладами от X. S. и R. N.

Эта работа была поддержана Фондом доктора Клема Джонса, орденом Австралии, правительством штата Квинсленд, федеральным правительством Австралии Грант ACT900116, грантом гранта DP13300101932 Австралийского исследовательского совета и Национальным советом по исследованиям в области здравоохранения и медицинских исследований Австралии APP1037746 и APP1003150 ( к JG). Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием этой статьи.

Эта статья содержит дополнительные таблицы S1-S6.

Используемые сокращения:
Связанный с MAP-микротрубочкой белок

болезнь Альцгеймера

аполипопротеин A1

аполипопротеин E

генная онтология

иммунопреципитация

анализ пути изобретательности

белковая фосфатаза 2А

тандемный массовый тег.

Мы благодарим Дилана Ксавьера за подготовку образцов TMT и сбор данных MS; Тишилу Паллиагуру и Линду Кунмер за экспертную техническую помощь и доктору Ханне Николас за гостеприимство.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *