Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Уменьшенная β-амилоидная патология в модели трансгенной мыши APP болезни Альцгеймера, лишенной функциональных B и T-клеток

Reduced β-amyloid pathology in an APP transgenic mouse model of Alzheimer’s disease lacking functional B and T cells
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4642668/

При болезни Альцгеймера накопление и патологическая агрегация амилоидного β-пептида сопровождается индукцией комплексных иммунных реакций, которые были приписаны как полезными, так и пагубными свойствами. Такие ответы затрагивают различные типы клеток врожденного и адаптивного плеча иммунной системы, как внутри центральной нервной системы, так и на периферии. Чтобы исследовать роль адаптивной иммунной системы в мозговом β-амилоидозе, трансгенные мыши PSAPP, установленная модель мыши болезни Альцгеймера, были скрещиваны с мышами-нокаутами, активирующими рекомбинацию гена-2 (Rag2 ko), лишенными функциональных B и Т-клеток. Во второй экспериментальной парадигме, старые мыши PSAPP были восстановлены с клетками костного мозга либо из контрольных мышей Rag2 ko, либо из контрольных мышей дикого типа.

Анализ обоих экспериментальных подходов показал снижение β-амилоидной патологии и снижение уровня β-пептида головного амилоида у мышей PSAPP, у которых отсутствовали функциональные адаптивные иммунные клетки. Снижение патологии β-амилоидов мозга было связано с усиленным микролиозом и повышенным фагоцитозом амилоидных β-пептидных агрегатов.

Результаты этого исследования демонстрируют влияние адаптивного иммунитета на церебральную β-амилоидную патологию in vivo и свидетельствуют о влиянии на опосредованный микроглии амилоидный β-пептидный клиренс в качестве возможного основного механизма.

Онлайн-версия этой статьи (doi: 10.1186 / s40478-015-0251-x) содержит дополнительный материал, доступный для авторизованных пользователей.

Несмотря на давний взгляд на центральную нервную систему (ЦНС) как место, защищенное иммунитетом, важность местных и системных иммунологических ответов при нейродегенеративных заболеваниях головного мозга, таких как болезнь Альцгеймера, получила широкое признание в последние несколько лет [1]. При болезни Альцгеймера накопление неправильных фосфолипидных амилоидных β-пептидных (Aβ) пептидов играет центральную роль в патогенезе болезни и связано с широким спектром неблагоприятных реакций, что в конечном итоге приводит к дисфункции нейронов и нейродегенерации [2, 3]. Локальные иммунные ответы на агрегаты головного мозга Aβ являются патологическим признаком болезни Альцгеймера, включающей активацию клеточных компонентов врожденного иммунитета головного мозга, таких как микроглия и астроциты, и выделение различных иммунных молекул и воспалительных медиаторов, включая цитокины, белки острой фазы и факторы каскад комплемента, среди прочих [4-7]. Эта активация врожденной иммунной системы мозга, как представляется, является обоюдоострым мечом, поскольку он был связан как с полезными, так и с пагубными последствиями [8]. Microglia, резидентные фагоциты ЦНС, например, способны связываться с Aβ через различные рецепторы клеточной поверхности и способствовать фагоцитозу и очистке агрегатов Aβ [5]. Однако их хроническая активация при болезни Альцгеймера также связана с нарушенными функциями разминирования и увеличением продуцирования провоспалительных и нейротоксических факторов, которые могут дополнительно способствовать повреждению нейронов и усугублять потерю нейронов [9].

В отличие от активации врожденной иммунной системы мозга, роль адаптивного иммунитета в церебральном β-амилоидозе представляется гораздо менее заметной и до сих пор не полностью понятна. Было показано, что, согласуясь с ролью гуморального адаптивного иммунитета в патогенезе болезни Альцгеймера, ошибочные Аβ-пептиды индуцируют специфические B-клеточные иммунные ответы, причем встречающиеся в природе аутоантитела против Aβ находятся в спинномозговой жидкости (CSF) и крови пораженных пациентов , а также здоровых людей [10-17]. Интересно, что эти аутоантитела, по-видимому, делятся конформационно-специфическими связывающими эпитопами и способностью способствовать опосредованному микроглии клиренсом β-амилоидных бляшек, а также снижению нейротоксичности [12, 18-20]. В подтверждение этих данных Бричи и коллеги продемонстрировали, что естественные аутоантитела к широкому спектру амилоидогенных пептидов могут проявлять нейропротекторную активность [21], при этом аналогичные данные сообщаются другими исследователями [22, 23]. Помимо участия опосредуемых B-клеток гуморальных иммунных ответов, несколько авторов начали рассматривать роль клеточного адаптивного иммунитета при болезни Альцгеймера. Предыдущие невропатологические анализы неоднократно подтверждали наличие Т-клеток в головном мозге болезни Альцгеймера [14, 24-29]. Кроме того, Aβ-реактивные Т-клетки легко обнаруживались в периферической крови пациентов с болезнью Альцгеймера и здоровых пожилых людей, у которых их доля была значительно увеличена по сравнению с лицами, контролируемыми в возрасте среднего возраста [30]. Анализ профиля отдельных лимфоцитов приводил к неоднозначным результатам. Например, Richart-Salzburger сообщил о значительном снижении CD3 + CD8 + и CD19 + лимфоцитов в периферической крови пациентов с болезнью Альцгеймера, что свидетельствует об общем снижении адаптивного иммунитета при патогенезе болезни [31]. Другие авторы, напротив, наблюдали значительное увеличение активированных CD4 + и CD8 + T-клеток в периферической крови [32-35]. Недавно Lueg et al. также оценивали изменения подмножеств Т-клеток в интратекальном отделении когнитивно-ослабленных и когнитивно неповрежденных пожилых пациентов, а также здоровых молодых людей с контролем и обнаружили значительно увеличенную долю CD8 + лимфоцитов в CSF пациентов с болезнью Альцгеймера, но не у пациентов, страдающих другие деменции — которые коррелируют с когнитивными дефицитами [33]. В целом эти результаты дали дополнительные доказательства участия адаптивного иммунитета при болезни Альцгеймера.

В этом исследовании мы рассмотрели роль врожденного дефицита адаптивной иммунной системы на патологию, связанную с β-амилоидом in vivo, и сгенерировали трансгенные мыши APP, продуцированные B и T клетками, путем скрещивания мышей PSAPP, с установленной мышиной моделью болезни Альцгеймера [36], с мышами, активирующими рекомбинацию гена-2 (Rag2 ko), лишенными функциональных B и T-лимфоцитов [37]. Во втором эксперименте эффекты приобретенного дефицита адаптивного иммунитета изучались у летально облученных пожилых мышей PSAPP, восстановленных с помощью костного мозга Rag2 ko. Наши результаты обеих экспериментальных парадигм демонстрируют влияние функциональных адаптивных иммунных клеток на церебральное β-амилоидное осаждение in vivo и предполагают увеличение Aβ-зазора, вероятно, опосредованного микроглиальными клетками, в качестве возможного механизма, лежащего в основе снижения патологии Aβ в отсутствие функционального B и Т-клеток.

Линии мыши Rag2 ko [37] и линия мыши дикой природы (WT), экспрессирующие аллель Ptprca (CD45.1 или Ly5.1) (модель 4007), были приобретены у Taconic (Ry, Дания). Трансгенные мыши PSAPP экспрессируют химерный белок-предшественник амилоида мыши / человека (Mo / HuAPP695swe) и мутантный человеческий пресенилин 1 (PS1-dE9) и были приобретены в Лаборатории Джексона (штат Мэн, США) [36, 38]. Все мыши были на генетическом фоне C57Bl / 6 (H2b). Мыши Rag2 ko (модель RAGN12, иммунофенотип H2b (C57B / 6), CD45.2) были сшиты с мышами PSAPP (иммунофенотип H2b (C57B / 6), CD45.2), чтобы генерировать четыре генотипа PSAPP / Rag2 ko, PSAPP, Rag2 ko и WT в гене F2. Для экспериментов по переносу костного мозга (BM) были использованы донорские мыши Rag2 ko, экспрессирующие иммунофенотип H2b (C57B / 6), CD45.1 (модель 461). Все мыши были помещены в группы (от двух до пяти животных на клетку в клетках 396 × 215 × 172 мм (Indulab, Gams, Switzerland)) при определенных условиях без патогенов (SPF) при 22 ° C ± 1 ° C и 12-часовом свете -dark начинается в 7:00. Состояние здоровья животных контролировалось два раза в неделю, за исключением мышей, перенесших BM, которые контролировались каждый второй день в течение первых двух недель после облучения. Никаких серьезных нежелательных явлений не наблюдалось. Вода и еда были предоставлены ad libitum за исключением времени когнитивного тестирования. Экологическое обогащение включало постельные принадлежности, один картонный домик для мыши и бумажную ткань в качестве материала для гнездования.

Для всех биохимических и гистологических анализов использовались гендерно-сбалансированные группы мышей. Мышей глубоко анестезировали кетамин / ксилазин. Образцы крови собирали из правого желудочка в пробирках с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) (Sarstedt, Sevelen, Switzerland) и центрифугировали для приготовления плазмы при 2000 г в течение 10 мин при 4 ° С. После сбора крови мышей транскрипционно перфузировали ледяным фосфатным буферным раствором (PBS), и их мозг быстро удалялся. Мозги рассекали на два полушария, причем левое полушарие помещалось в 4% (мас. / Об.) Параформальдегида (PFA) в PBS, после фиксирования в течение ночи в той же среде при 4 ° С и переносили в 30% раствор сахарозы (в PBS ) в течение 72 ч (криозащита). Правое полушарие замораживали и хранили при -80 ° C для последующего биохимического анализа.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с швейцарским законодательством в отношении ухода и использования животных («455.163 Tierversuchsverordnung» 2010) и были одобрены ветеринарными властями кантона Цюрих (номера лицензий 079/2010 и 102/2013). Все разделы этого отчета соответствуют рекомендациям ARRIVE для отчета об исследованиях животных [39]. В комплект входит полный контрольный список рекомендаций по ARRIVE.

Гомогенизацию ткани головного мозга проводили с использованием стеклянного гомогенного тефлона в пятикратном количестве влажного веса буфера A (100 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, коктейлей ингибитора фосфатазы 2 + 3 (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) и полного коктейля ингибитора протеазы (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Швейцария)). Супернатанты собирали (= трис-фракцию) после центрифугирования при 100000 г в течение 1 часа. Гранулы повторно гомогенизировали в буфере А, содержащем 2% додецилсульфата натрия (SDS). Центрифугирование повторяли и снова добавляли супернатанты (= фракция SDS). Полученные гранулы растворяли в 70% муравьиной кислоте (FA), обрабатывали ультразвуком два раза в течение 30 с при 30% мощности, ультрацентрифугировали при 100000 г в течение 30 мин, супернатанты экстрагировали, лиофилизировали и восстанавливали в буфере А для дальнейшего анализа. Экстракты отделяли электрофорезом SDS-полиакриламидного геля, промокали на нитроцеллюлозу, блокировали в забуференном Трисом физиологическом растворе, содержащем 5% молока в течение 1 часа при комнатной температуре. Блоты инкубировали с первичным антителом в течение ночи при 4 ° С, затем визуализировали с помощью конъюгированного с пероксидазой антитела и реакции ECL (Amersham Biosciences, Otelfingen, Switzerland). При разведении 1: 2000 использовали первичный анти-C-терминальный APP кролика (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland). Моноклональное антитело против GAPDH мыши (Meridian Life Science, Memphis, USA) использовалось в качестве внутреннего контроля загрузки и для нормализации денситометрического анализа иммунореактивных полос (разведение 1: 10 000). Программное обеспечение Image J (rsb.info.nih.gov/ij/) использовалось для количественной оценки иммунореактивных полос путем денситометрии сканированных пленок в условиях ненасыщенного сигнала.

Уровни Аβ40 и Аβ42 измеряли в вышеупомянутых фракциях гомогената мозга и в плазме с использованием набора MSD 3plex multi-SPOT Aβ (Gaithersburg, MD, USA), как описано ранее [40]. Пластины измеряли на планшетном считывателе MSD SECTOR Imager 600 (Gaithersburg, MD, USA) после добавления MSD Read Buffer T (Gaithersburg, MD, США). Программное обеспечение MSD DISCOVERY WORKBENCH (версия 3.0.17) (Gaithersburg, MD, USA) с помощью Data Analysis Toolbox использовалось для расчета концентраций проб, сравнивая их с стандартной кривой.

PFA-фиксированные и криозащитные гемибраины непрерывно разрезали на кубические ломтики толщиной до 35 мкм при -20 ° C с использованием микротома (Leica Jung HN40, Leica Microsystems AG, Heerbrugg, Switzerland) и хранили при -20 ° C в антифризном растворе ( фосфатный буфер 0,50 М в воде MilliQ: этиленгликоль: глицерин = 1,3: 1: 1) до использования. Для каждого окрашивания шесть эквидистантных срезов на мышь анализировали с позиций от -1,94 мм до +1,70 мм от брегмы [41]. Для иммуногистохимии срезы сначала промывали PBS + 0,2% Triton X-100, блокировали соответствующими нормальными сыворотками в течение 1 часа и инкубировали с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C. Использовали следующие первичные антитела: глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP, разведение 1: 400, поликлональное кроличье, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland), ионизированная связывающая адгезивная молекула 1 (разведение Iba1, 1: 500, поликлональ кролика; Wako Chemicals, Осака, Япония) и анти-β-амилоид 1-16 (разведение клона 6E10, 1: 500, моноклональное мышь, BioLegend, Fell, Германия). Вторичные антитела были получены от Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA, USA). Окрашивание тиофлавина S проводилось в соответствии со стандартными протоколами, как описано ранее [42]. 4 ‘, 6-диамидин-2-фенилиндол (DAPI, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland) использовали в качестве противогрибкового агента. Для количественного анализа изображения коры (включая конусообразную, моторную и соматосенсорную кору головного мозга) анализировали на шести эквидистантных участках коронарного полушария с позиций от -1,94 мм до +1,70 мм от брегмы [41]. Средние значения для мыши вычислялись и включались в статистический анализ. Средние числа бляшек относятся к одиночным участкам полушария. Количественный анализ изображений был выполнен с использованием программного обеспечения ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Для специфических микроглиальных анализов вокруг амилоидных бляшек серийные конфокальные изображения Z-стека, содержащие в среднем от 30 до 40 секций мозга коры головного мозга с интервалами 0,26 мкм, были получены с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Leica TCS SP8, Leica Microsystems AG, Heerbrugg, Switzerland) , В среднем было проанализировано 12 кортикальных S-позитивных амилоидных бляшек тиофлавина на мышь. Бляшки среднего размера от 20 до 30 мкм случайным образом выбирались слепым исследователем между кортикальными слоями II и V на шести последовательных эквидистантных участках (2 бляшки на секцию) с позиций от -1,94 мм до +1,70 мм от брегмы [41]. Подсчет микроглии проводился диаметром 100 мкм вокруг центра амилоидной бляшки, как описано ранее [43].

Для генерации химерных клеток костного мозга (BM) 12-месячные трансгенные реципиентные мыши PSAPP (CD45.2, 12 женщин и 7 мужчин) облучались в течение всего времени двумя дозами по 600 рад каждый (второе облучение через 12 часов). 3-месячный Rag2 ko (модель 461, Taconic, Ry, Дания) и возрастные контрольные мыши-доноры WT (модель 4001, Taconic, Ry, Дания), экспрессирующие аллель CD45.1, умерщвляли путем ингаляции СО2, а кости (включая бедра, голени и таза) промывали стерильным PBS для получения стволовых клеток BM. В общей сложности 5 × 106 клеток в 0,2 мл стерильного солевого раствора Хэнкса (HBSS, Life Technologies, Цуг, Швейцария) вводили i.v. (10 собак PSAPP (включая 6 женщин и 4 мужчин) получали Rag2 ko BM, 9 мышей PSAPP (включая 6 женщин и 3 мужчин) получали WT BM). Восстановление BM мышей-реципиентов проводили с BM от доноров, согласованных по полу. Автоклавированную питьевую воду, дополненную антибиотиками, вводили в течение двух недель (2 г / л сульфата неомицина, Sigma Aldrich). Эффективность восстановления с положительными клетками CD45.1 оценивали в день жертвоприношения (через 6 месяцев) с помощью проточной цитометрии образцов цельной крови EDTA.

Аммиачно-хлоридно-калийный (ACK) лизис красных кровяных клеток проводили на образцах ЭДТА крови, а затем буферов HBSS и FACS (HBSS, 2% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 10 мМ EDTA, 0,01% NaN3). После использования живого / мертвого отключающего красителя (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) для снижения неспецифического связывания использовали стадию блокировки Fc (антимышиный CD16 / 32, TruStain fcX ™, Biolegend, CA, USA). Затем клетки окрашивали в течение 15 мин при 4 ° С поверхностными маркер-специфическими антителами: анти-CD45 (РЕ конъюгировали, крысиный против мыши, клон 30-F11, BioLegend, Fell, Германия), анти-CD45.1 (PE анти-CD45-2 (FITC-конъюгированный, мышь-мышь, клоун 104, BioLegend, Fell, Германия), анти-CD11b (APC или APC-Cy7), анти-CD45-2 (FITC или APC конъюгированный, крысиный против мыши, клон RM4-5, BioLegend, Fell, Германия), анти-Ly6C, анти-CD4 (FITC или APC, конъюгированные, крысиные мышиные мышиные мышиные мыши, клоун M1 / ​​70, BioLegend, Fell, Германия) (FITC конъюгированный, крысиный антимышиный, клон AL-21, BD Biosciences, Allschwil, Швейцария), анти-Ly6G (APC-конъюгированный, крысиный против мыши, клон 1A8, BioLegend, Fell, Германия) и анти-B220 / CD45R (Конъюгированный с PerCP-Cy5.5 или APC-Cy7, крысиный антимышиный / человеческий, клон RA3-6B2, BioLegend, Fell, Германия). После дополнительной промывки буфером FACS образцы анализировали с помощью анализатора клеток BD LSRFortessa ™ (BD Biosciences, Allschwil, Switzerland). В качестве контролей были включены одиночные окрашивающие и контрольные антитела изотипа.

Для оценки двигательного и когнитивного поведения мышей была использована батарея проверенных тестов. Для всех когнитивных тестов в качестве автоматизированной системы отслеживания движений животных и завершения конкретных задач теста использовалось современное программное обеспечение для отслеживания видеосигнала ANY-лабиринт (Stoelting Co., США). Все животные были проверены наивно в произвольном порядке. Тестируемые группы были сбалансированы по полу. Экспериментатор был ослеплен во время тестирования.

Тест Open Field измеряет локомоторную активность и беспокойство. Мышей помещали в центр белого ящика (49 х 49 х 33 см) с косвенным освещением (22 люкс), и их движения отслеживались в течение 15 мин. Промежуточное расстояние, средняя скорость и время, проведенное в центральной (внутренняя площадь 33 х 33 см) по сравнению с периферийными зонами открытого поля, были рассчитаны с использованием программного обеспечения ANY-maze [44].

Этот тест измеряет память и память распознавания у мышей и выполняется в соответствии с опубликованными протоколами [45]. NORT был спроектирован как двухпроцессорная задача, включая пробную пробную версию (ST) и пробную пробную версию (TT) и была выполнена после теста Open Field с задержкой в ​​5 минут в том же поле. Во время ST в коробке были помещены два похожих объекта, 34 см друг от друга (симметрично). Каждому животному разрешалось исследовать коробку в течение 5 мин. Предполагалось, что животные исследуют объект, когда голова животного находилась в пределах определенной области диаметром 12 см вокруг объекта. Размеры объектов варьировались в пределах диаметров от 3-4 см, поэтому животное считалось исследованием объекта, когда голова животных находилась вблизи объекта около 4 см. После ST мышам сразу же возвращали их в удерживающие клетки и после 10-минутной задержки ТТ проводили. Один из объектов, используемых во время ST, был заменен новым, отличающимся по форме и цвету, перед тем как каждая мышь была помещена обратно в ту же коробку, что и во время ST. Затем мышам разрешалось свободно исследовать в течение 5 мин, и время, проведенное с исследованием каждого объекта, было записано. Отношение было рассчитано путем деления мер нового объекта по сравнению со старым.

Y-Maze использовался для оценки пространственной рабочей памяти у мышей и проводился в соответствии с опубликованными протоколами [40]. Y-Maze состоит из трех горизонтальных рукавов (длиной 40 см, шириной 11 см и высотой 21 см), симметрично расположенных под углом 120 ° друг к другу. Свет был отрегулирован до 28 люкс. Мышей помещали на один конец первого плеча и затем позволяли свободно исследовать в течение 5 мин. Мышей отслеживали записи записи и время исследования в каждой руке. Общее количество позиций рукоятки измерялось как показатель двигательной активности, чтобы исключить интерференцию изменений подвижности с параметрами обучения и памяти [46, 47]. Процентное изменение было рассчитано как отношение фактического к возможным чередованиям (определяемое как общее количество позиций рычагов -2) x 100%.

Первичный экспериментальный результат нашего исследования включал патологию Aβ (патологию бляшек амилоида, уровни Aβ) и глиальную патологию. Вторичные критерии результата включали когнитивную эффективность и обработку APP. Анализ данных выполнялся с использованием программного обеспечения SPSS 19.0 (16 M, Цюрих, Швейцария). Экстремальные значения в соответствии с аналитическим анализом данных SPSS были исключены из дальнейшего анализа. Тесты для нормального распределения выполнялись перед статистическим тестированием. Согласно результатам теста Шапиро-Вилька и Колмогорова-Смирнова для нормальности либо двухкаскадный тест Стьюдента, либо двухсторонний Манн-Уитни-U-Тест для двух групп образцов или ONEWAY ANOVA или Kruskal- Уоллис-тест для множественных групповых сравнений (с последующим постходовым Bonferroni или Mann-Whitney-U-Tests с коррекцией Бонферрони). Для NORT был проведен тест Wilcoxon, чтобы проверить, действительно ли отношение значительно отличается от 1. Для Y-лабиринта был проведен t-тест с одной выборкой, чтобы проверить, был ли процент правильных чередований значительно выше 50. Значение p <0,05 было считается статистически значимым. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 показывают значительно отличающиеся характеристики. Полосы ошибок представляют собой SEM.

Чтобы исследовать влияние специфической врожденной абляции функциональных B и T-клеток на связанную с Aβ патологию in vivo, мышиные мышечные мыши PSAPP, экспрессирующие белок-предшественник амилоида мыши / человека (Mo / HuAPP695swe) и мутантный пресенилин 1 (PS1-dE9) под контролем промотора белка прионного мыши (PrP) были скрещены с мышами Rag2 ko. B и T-клеток с PSAPP / Rag2 ko анализировали вместе с иммунокомпетентными трансгенными мышами PSAPP, не трансгенными мышами Rag2 ko и контрольными мышами WT в двух разных возрастных группах. Как и ожидалось, анализ FACS цельной крови подтвердил отсутствие функциональных лимфоцитов в двух линиях мыши Rag2 ko, Rag2 ko и PSAPP / Rag2 ko (дополнительный файл 1: рисунок S1). Примечательно, что числа B и T-клеток были одинаковыми между WT и трансгенными мышами PSAPP, и никаких существенных различий в системном миелоидном отделении среди четырех генотипов не наблюдалось (дополнительный файл 1: Рисунок S1). Гистологический анализ в возрасте 3 месяцев (стадия перед бляшкой) не выявил обнаруженного осаждения амилоидных бляшек у Rag2-дефицитных мышей PSAPP / Rag2 ko, а также у мышей PSAPP, соответствующих возрасту; количественный анализ MSD кортикальных экстрактов головного мозга и плазмы выявил сходные уровни Aβ в двух генотипах через 3 месяца (дополнительный файл 2: рисунок 2). Напротив, в возрасте 8 месяцев окрашивание тиофлавином-S для фибриллярных отложений Aβ (фиг.1a, b) и иммуноокрашивание моноклональным анти-Aβ-антителом 6E10 (данные не показаны) продемонстрировали обильную патологию бляшек амилоида у мышей PSAPP, которая была значительно уменьшен у сопоставимых по возрасту PSAPP / Rag2 ko мышей. Снижение на 25-30% нагрузки на бляшку амилоида и числа бляшек Aβ у мышей PSAPP / Rag2 ko, дефицитных по B и T, сопровождалось заметным снижением уровней растворимого и нерастворимого уровня Aβ40 и Aβ42 в головном мозге и сопровождалось мягким увеличением плазмы Aβ42 по сравнению с мышами PSAPP (фиг.1a-c). Эти эффекты на патологию Aβ не были связаны ни с изменениями экспрессии APP, ни с изменениями в обработке APP, как было обнаружено в блоттинговых анализах, что указывает на то, что снижение нагрузки Aβ и уровней Aβ вряд ли будет опосредовано измененной продукцией Aβ (дополнительный файл 3 : Рисунок S3). 1 Исчерпана патологию амилоидов и уменьшены уровни Aβ у 8-месячных мышей PSAPP / Rag2 ko по сравнению с мышами PSAP, сопоставимыми с возрастом. a, b Количественный анализ окрашивания тиофлавина S показывает снижение амилоидной нагрузки на 25% и число амилоидных бляшек у мышей PSAPP / Rag2 ko, опущенных B и T, по сравнению с мышами PSAPP с функциональной адаптивной иммунной системой (типичные изображения кортикальные окраски показаны в (а)). Шкала шкалы = 300 мкм. *** р <0,001. n = 13-15 на группу. c Количественный анализ MSD Aβ40 и Aβ42 в плазматических и кортикальных экстрактах головного мозга показывает значительное снижение растворимых растворимых в растворителе TRS растворимых растворимых и муравьиных кислот Aβ40 и Aβ42 у мышей PSAPP / Rag2 ko, по сравнению с мышами PSAPP. Снижение уровня Aβ в мозге сопровождается значительным увеличением плазмы Aβ42. * Р <0,05. ** р <0,01. *** р <0,001. n = 9-14 на группу

Для оценки того, было ли снижение Aβ-патологии у 8-месячных PSAPP / Rag2 ko мышей связано с изменениями в ответах на глиальные клетки, были проведены иммуноокраски GFAP для астроцитов и окрашивания Iba1 для микроглии. Никаких существенных различий в астроглии и микроглиальных клетках не наблюдалось среди четырех генотипов в возрасте 3 месяцев (дополнительный файл 4: рисунок S4). У 8-месячных животных, как и ожидалось, степень астроглиоза и микроглиоза была значительно увеличена у мышей PSAPP и PSAPP / Rag2 ko, несущих бляшки, по сравнению с мышами WT и Rag2 ko (рис.2a-d). Наблюдаемое снижение амилоидной патологии у мышей PSAPP / Rag2 ko сопровождалось значительно сниженной иммунореактивностью GFAP по сравнению с мышами PSAPP (рис.2a, b). Напротив, иммунореактивность Iba1 оказалась сходной между PSAPP / Rag2 ko и мышами PSAPP, что указывает на относительное увеличение микроглиоза, связанного с β-амилоидом, в отсутствие функциональных B и T-клеток (фиг.2c, d). 2Glial ответы при отсутствии функциональных B и T клеток через 8 месяцев. a, b иммуногистологический анализ GFAP для астроцитов и (c, d) иммуноокрашивание Iba1 для микроглии выявляют значительное увеличение микроглиоза у трансгенных мышей с амилоидным осаждением APP (PSAPP / Rag2 ko и PSAPP) по сравнению с нетрангеном Rag2 ko и WT мышей. Иммунореактивность GFAP (b) — но не иммунная реактивность Iba1 (d) — значительно снижается у мышей PSAPP / Rag2 ko по сравнению с мышами PSAPP (типичные изображения корковых пятен показаны слева). Шкала шкалы = 300 мкм (Вставка: шкала шкалы = 40 мкм). * Р <0,05. *** р <0,001. n = 10-14 на группу

Чтобы проверить, влияет ли абляция B и T-клеток и наблюдаемые эффекты на патологию Aβ в PSAPP / Rag2 ko, какое-либо влияние на показатели когнитивных результатов, мы проанализировали когнитивные характеристики, зависящие от гиппокампа, в четырех генотипах (WT, PSAPP, Rag2 ko и PSAPP / Rag2 ko). Пространственная рабочая память была оценена в лабиринте Y, в то время как память распознавания была протестирована в Задаче распознавания новых объектов (NORT). В возрасте 8 месяцев трансгенные мыши PSAPP характеризовались значительными нарушениями по когнитивным задачам по сравнению с контрольными мышами с контролем времени (рис. 3a, b). В соответствии с предыдущими сообщениями, демонстрирующими снижение когнитивных характеристик у мышей, у которых отсутствовали функциональные адаптивные иммунные клетки [48-50], аналогичные результаты наблюдались как для иммунокомпрометированных линий мыши (Rag2 ko, так и для PSAPP / Rag2 ko), не зависящих от экспрессии трансгена APP (фиг.3a , б). Эффективность памяти гиппокампа 3Impaired у трансгенных мышей PSAPP и обеих линий мыши с недостатком Rag2 по сравнению с контролем WT. Эффективность лабиринта Y оценивалась с помощью правильных чередований в%. b Память распознавания в задаче распознавания новых объектов (NORT) была измерена путем сравнения времени, проведенного с новым и знакомым объектом. В Y-лабиринте и в новой задаче распознавания объектов сравнивались результаты с вероятностью (50% и 1 соответственно). Показаны существенные различия. * Р <0,05. n = 9-21 на группу

Основываясь на наших результатах в мышах PSAPP / Rag2 ko, у которых отсутствуют функциональные B и T-клетки от рождения, мы в дальнейшем стремились определить эффекты приобретенного дефицита адаптивного иммунитета на установленную связанную с Aβ патологию в модели β-амилоидоза PSAPP. Для достижения этой цели химерные мыши из костного мозга (BM) были получены путем приемной передачи клеток BM из контрольных мышей Rag2 ko и WT в 12-месячных мышечных мышей PSAPP с летальным облучением (фиг.4а). Анализ FACS цельной крови через 6 месяцев после переноса BM показал пятикратное снижение зрелых B (B220 +) и T (CD4 +) лимфоцитов у Rag2 ko BM-восстановленных мышей PSAPP, что подтвердило успешное снижение адаптивных иммунных клеток в этой модели (рис. . 4b). Гистопатологический анализ секций головного мозга, обработанных тиофлавином-S, у 18-месячных мышей выявил аналогичную бляшку амилоида между мышами PSAPP, привитыми BM WT, и мышами PSAPP, переносимыми Rag2 ko BM, что указывает на то, что восстановление с B и T-клетками с дефицитом BM не оказало существенного влияния на компактные фибриллярные отложения Aβ в этой модели (дополнительный файл 5: рисунок S5 A, B). Однако иммуноокрашивание моноклональным антителом 6E10, которое распознает широкий спектр агрегатов Aβ, включая диффузные отложения Aβ, показало значительно уменьшенную (около 35%) нагрузку на бляшку Aβ, но без изменения числа бляшек Aβ в PSAPP, переданном Rag2 ko BM мышей по сравнению с мышами, восстановленными WT BM (фиг.5a, b). Это уменьшение на 6E10-окрашенной нагрузки Aβ было связано со значительным снижением содержания нерастворимых в растворе (FA растворимых) коры головного мозга Aβ40 и Aβ42 и параллельного увеличения плазмы Aβ40 и Aβ42 (фиг.5c). Эксперимент по переносу костного мозга (BM). 12-месячные мыши PSAPP (иммунофенотип H2b, CD45.2) подвергали левому облучению двумя дозами 600 рад, затем воссоздавали с помощью 5 × 106 клеток BM от мышей-доноров Rag2 ko или WT (иммунофенотип H2b, CD45.1). b через 6 месяцев после трансплантации реципиенты Rag2 ko BM показали пятикратное снижение В-клеток и CD4 + Т-клеток, как определено FACS-окрашиванием лейкоцитов CD45 + крови антителами против CD4 и маркером B220 катетера В-клеток. ** р <0,01. *** p <0,001. n = 9-10 на группу

Снижение нагрузки Aβ у мышей PSAPP, восстановленных с помощью Rag2 ko BM a, b). Количественный анализ свободно плавающих участков, окрашенных моноклональным анти-Aβ-антителом 6E10, показывает 35% -ное снижение Аβ-иммунореактивности, но существенного изменения числа Aβ-иммунореактивных бляшек у Rag2 ko BM-переносимых мышей PSAPP по сравнению с WT BM-переносимые мыши PSAPP через 6 месяцев после восстановления (в возрасте 18 месяцев, репрезентативные изображения корковых пятен показаны в (a)). Шкала шкалы = 300 мкм. * Р <0,05. n = 8-10 на группу. (c) Количественный анализ MSD плазменных и кортикальных экстрактов головного мозга показывает значительное снижение растворимых в муравьиной кислоте Aβ40 и Aβ42 наряду с увеличением уровней Aβ в плазме у мышей PSAPP, перенесенных с Rag2 ko BM по сравнению с мышами PSAPP, переносимыми ВТ BM. * Р <0,05. n = 9-10 на группу

Как и наши данные у кроссбрайтных мышей, уменьшение Aβ-патологии у мышей PSAPP, реконструированных Rag2 ko BM, не было связано с изменениями уровней полноразмерного APP или изменений AP-C-терминальных фрагментов, что опять-таки предполагало, что приобретенные дефицит функциональных B и T-клеток не влиял на уровни Aβ, влияя на метаболизм APP (дополнительный файл 6: рисунок S6).

Чтобы определить, было ли снижение патологии Aβ у мышей PSAPP, восстановленных с помощью Rag2 ko BM, было связано с измененными клеточными ответами врожденной иммунной системы мозга, иммуноокраски GFAP и Iba1 были выполнены через 6 месяцев после восстановления BM (в возрасте 18 месяцев). Количественный иммунохимический анализ показал сходный астроглиоз между WT и Rag2 ko BM-переносимыми мышами PSAPP (рис.6a, b), но значительное увеличение микроглиальных клеток у мышей Rag2 ko BM-реципиента (рис.6c, d). Анализ конфокального микроскопа Iba1-позитивных клеток, украшающих тиофлавин S-окрашенные амилоидные бляшки, которые были сопоставлены по размеру, выявил тенденцию к увеличению среднего числа связанных с бляшками микроглии у мышей PSAPP, переносимых Rag2 ko BM, по сравнению с WT BM- (дополнительный файл 7: рисунок S7 A, B). Важно отметить, что как количество Aβ-фагоцитозирующей микроглии, так и общий объем фагоцитированного S-позитивного материала тиофлавина на бляшку были значительно увеличены у мышей PSAPP, восстановленных с помощью Rag2 ko BM, что указывает на усиленный фагоцитоз Aβ в отсутствие функциональных T и B-клеток (Фиг.7а, б). 6Глиальные ответы у мышей PSAPP, восстановленных с помощью WT и Rag2 ko BM. Астроглиоз не изменяется у мышей, перенесших Rag2 ko BM, по сравнению с мышами PSAPP, переносимыми WT BM через 6 месяцев после восстановления (через 18 месяцев, показаны репрезентативные изображения корковых пятен слева). b Количественный анализ иммуноокращений GFAP. c, d иммуногистологический анализ Iba1 выявляет значительное увеличение микроглиоза у мышей PSAPP Rag2 ko BM-реципиента по сравнению с мышами PSAPP, переносимыми ВТ BM. Шкала шкалы = 300 мкм (Вставка: шкала шкалы = 40 мкм). * Р <0,05. n = 8-10 на группу

Увеличение количества Aβ-фагоцитизирующей микроглии у мышей PSAPP, восстановленных Rag2 ko BM. Репрезентативное конфокальное изображение максимальной проекции (левая панель) связанной с бляшкой микроглиальной клетки, содержащей S-положительный Aβ-материал тиофлавина (наконечник стрелы). На изображении показаны микроглия (Iba1, красный) и амилоидные отложения (тиофлавин S, зеленый). Ядра были контрастированы DAPI (синий). Ортогональные представления изображений z-стека показаны на правой панели. Шкала шкалы = 20 мкм (б) значительно увеличилось количество амилоидных бляшек-ассоциированных Iba1-позитивных микроглиальных клеток, содержащих S-позитивный Aβ-материал тиофлавина у мышей PSAPP Rag2 ko BM-реципиента. * Р <0,05. n = 9 мышей на группу (в среднем 12 бляшек на каждую анализируемую мышцу) (c) значительно увеличенный общий объем фагоцитированного Aβ-материала в Rag2 ko BM-восстановленных PSAPP-мышах по сравнению с контрольными мышами ВМ-реципиента WT. * Р <0,05. n = 9 мышей на группу (в среднем 12 бляшек на каждую анализируемую мышцу)

Процесс старения является основным фактором риска спорадической болезни Альцгеймера и отрицательно влияет на способность человека реагировать на иммунные проблемы, что называется иммуногенностью [51]. Иммуногенность человека сопровождается ухудшением адаптивных иммунных ответов, опосредованных B и Т-клетками, в то время как врожденный иммунитет скорее сохраняется или даже усиливается [51]. Еще более выраженное снижение системных Т и В клеток ранее сообщалось некоторыми авторами у пациентов с болезнью Альцгеймера [31], что указывало на фенотип «преждевременного иммуногенеза», специфически влияющий на адаптивный иммунитет в патогенезе заболевания [52]. В настоящем исследовании мы применили две различные экспериментальные парадигмы для исследования вклада адаптивной иммунной системы в церебральную β-амилоидную патологию в установленную модель трансгенной мыши APP болезни Альцгеймера. Последствия врожденного дефицита адаптивного иммунитета оценивали у гибридных мышей PSAPP / Rag2 ko, которые были сопоставлены с иммунокомпетентными мышами PSAPP. Чтобы подтвердить отсутствие Т и В клеток в этой модели и исключить потенциальные эффекты APP / мутантного пресенилина 1 на системные иммунные клетки у мышей PSAPP [53], анализы FACS цельной крови, а также других периферических иммунных органов (данные не показаны ). Примечательно, что значительных изменений периферических лимфоцитов и миелоидных клеток не наблюдалось между трансгенными и контрольными мышами PSAPP, что исключало основные системные иммунные изменения в этой модели. Гистологический и биохимический анализ выявил снижение β-амилоидной патологии наряду со снижением уровня АА головного мозга у пожилых мышей PSAPP / Rag2 ko по сравнению с мышами PSAPP после начала осаждения амилоидных бляшек. Это снижение патологии Aβ было связано с увеличением уровней Aβ в плазме и относительным увеличением Iba1-положительных клеток микроглии, что не наблюдалось у 3-месячных мышей PSAPP / Rag2 ko, предшествующих бляшке, что указывает на то, что снижение Aβ мозга в отсутствие функциональных B и T-клеток происходило только в присутствии отложений Aβ-бляшек и, вероятно, опосредовано амилоид-реактивной микроглии. В соответствии с этими результатами аналогичные результаты были получены в нашей второй модельной системе приобретенного адаптивного иммунного дефицита: у пожилых мышей PSAPP, восстановленных с помощью клеток Rag2 ko BM, была обнаружена сниженная β-амилоидная нагрузка, снижение Aβ животных и повышенные уровни Aβ в плазме вместе с увеличением микроглиоз и повышенное количество связанных с бляшками Aβ-фагоцитозирующих микроглий. В отличие от наших выводов в гибридных мышах PSAPP / Rag2 ko, восстановление трансгенных мышей PSAPP с Rag2 ko BM привело к более мягким последствиям для патологии Aβ, что было обнаружено при уменьшенной нагрузке Aβ на 6E10, но никаких изменений в тиофлавиновом S-окрашенном компактные фибриллярные отложения Aβ, снижение уровней Aβ головного мозга исключительно в детергентной нерастворимой фракции белка и аналогичных уровнях β-амилоидоподобного астроглиоза по сравнению с контрольными PSAPP BM-реципиента WT. По нашему мнению, наблюдаемые более мягкие эффекты на патологию Aβ могут быть по меньшей мере частично объяснены неполной абляцией T и B-клеток в парадигме передачи BM (по сравнению с полной абляцией лимфоцитов в методе скрещивания). Кроме того, дополнительные аспекты, например, более старшего возраста трансгенных мышей PSAPP в эксперименте по переносу BM и / или более коротких периодах наблюдения (6 месяцев против 8 месяцев в методе скрещивания) должны быть приняты во внимание.

В нашей экспериментальной установке использовались мыши Rag2 ko с комбинированным дефицитом Т и В-клеток. Этот подход позволил нам смоделировать условия «преждевременной иммуногенерации» в мышиной модели церебрального β-амилоидоза и исследовать влияние общего адаптивного иммунного дефицита на патологию Aβ. Однако на основе этого экспериментального проекта мы не смогли определить конкретную субпопуляцию лимфоцитов, которая учитывает влияние на микроглии и отложение амилоидов головного мозга. Хотя мы не можем исключить, что отсутствие опосредуемого B-клеточным иммунитетом, возможно, способствовало наблюдаемым эффектам, эта возможность представляется менее вероятной, по нашему мнению, по нескольким причинам. С одной стороны, В-клетки, в отличие от Т-клеток, не были обнаружены в паренхиме головного мозга пациентов с болезнью Альцгеймера [54], ни в мозге трансгенных мышей PSAPP, что выявлено с помощью иммуногистохимии и анализа FACS мозга (Ferretti et al., Представленный) , С другой стороны, на основании нескольких предыдущих исследований, предполагающих роль аутоантител, встречающихся в природе для ограничения амилоидоза головного мозга [12, 18-20], ожидается, что отсутствие Aβ-реактивных В-клеток приведет к усугублению, а не уменьшению амилоида патология. В соответствии с этим понятием прогрессирующее возрастное осаждение амилоидного бляшка ранее ассоциировалось со специфическим снижением аутоантител к аутоантителам, встречающимся в природе, на модели трансгенной мышиной мышиной мышиной модели Tg2576 при болезни Альцгеймера [55]. В отличие от В-клеток, Т-клетки неоднократно обнаруживались как инфильтрирующие ткани головного мозга как в мозге человека, заболевшем болезнью Альцгеймера, так и в животных моделях заболевания [24-29, 56, 57] Ferretti и др., Представленные). Хотя точная роль Т-лимфоцитов в процессе болезни остается не полностью понятой, как провоспалительные, так и нейротоксичные, а также противовоспалительные и нейротропные механизмы объясняются их присутствием в паренхиме головного мозга [58]. Например, в некоторых крысиных и APP-трансгенных моделях болезни Альцгеймера специфические эффекторные CD4 + Т-клетки, секретирующие IFN-γ, IL-17 или IL-22, были связаны с увеличением нейровоспаления и обострением прогрессирования заболевания [59, 60]. В других исследованиях на животных, однако, было показано, что IFN-γ-зависимый нацеливание Aβ-специфичных Th1-поляризованных CD4 + клеток на амилоидные бляшки уменьшает патологию амилоидов без повышения токсического нейровоспаления [61, 62].

Роль адаптивной иммунной системы при нейровоспалении и патологии головного мозга также была предложена в других нейродегенеративных условиях (без болезни Альцгеймера). Например, удаление CD4 + T-лимфоцитов, но не CD8 + лимфоцитов, ранее ассоциировалось с уменьшенной потерей нейронных клеток, вызванной MPTP, в мышиной модели болезни Паркинсона [63]. Было показано, что та же популяция Т-клеток обеспечивает нейропротекцию в животной модели семейного амиотрофического бокового склероза (БАС) [64, 65]. В этой работе мышей mSOD1G93A / Rag2 ko и мышей с CD4 + T-клетками mSOD1G93A / CD4 ko показали ускоренную прогрессию заболевания и повышенную дегенерацию мотонейрона, что было связано с увеличением уровней мРНК для провоспалительных цитокинов и NOX2 и снижением уровней трофических факторов и глутамата транспортеров [64]. Интересно, что восстановление костного мозга mSOD1G93A / Rag2 ko мышей с Т-клетками приводило к длительной выживаемости и подавленной цитотоксичности [64]. Эти полезные эффекты сопровождались индукцией М2-защитного микроглиального фенотипа, что в основном объяснялось наличием CD4 + CD25 + FoxP3 + регуляторных Т-лимфоцитов (Tregs) [65]. Подавляющее влияние как на адаптивную, так и на внутреннюю руку иммунной системы было хорошо документировано для Tregs [66-68]. Их отсутствие у трансгенных мышей с транскрипцией PSAP с дефицитом Rag2 может, по крайней мере частично, объяснять наблюдаемый повышенный фенотип нейровоспалительного и опосредованный микрогемами фагоцитоз агрегатов Aβ. Эта возможность также подтверждается недавними выводами в модели мышиной мыши ADX 5XFAD AD, в которой кратковременное истощение Foxp3 + Tregs или фармакологическое ингибирование их активности аналогичным образом уменьшали клиренс амилоидной бляшки [69]. Tregs выделяют различные противовоспалительные цитокины (такие как IL-4, IL-10 и IL-13) и, как было показано, способствуют альтернативно активированным (M2) ответам и ослабляют провоспалительные (M1) микроглиальные ответы [68, 70, 71]. Примечательно, что микроглазная поляризация к ответу M1 была связана с уменьшенной патологией амилоидов [72, 73], что также соответствовало бы нашим выводам у мышей с PS и P, выделенных клетками T и B. Несмотря на значительно уменьшенные уровни Aβ, повышенный провоспалительный фенотип в отсутствие функциональных адаптивных иммунных клеток может быть обоюдоострым мечом. Фактически, провоспалительные микроглиальные реакции также были связаны с пагубными последствиями, такими как повышенная патология тау и усугубленная нейротоксичность [73]. В нашем исследовании положительное влияние на патологию Aβ не сопровождалось изменением дефицита памяти, зависящего от гиппокампа, у мышей PSAPP / Rag2 ko. Однако не трансгенные мыши Rag2 ko были одинаково повреждены по двум различным задачам, зависящим от гиппокампа, по сравнению с контролем WT, что указывает на дополнительные Aβ-независимые эффекты абляции T и B клеток на когнитивные характеристики. В соответствии с этими данными ранее было показано, что правильно функционирующая адаптивная иммунная система участвует в поддержании когнитивного здоровья и формировании памяти гиппокампа на нескольких иммунокомпрессорных моделях мыши, не имеющих функциональных Т-клеток [48-50]. Предполагалось, что эти эффекты будут в основном опосредованы неспецифическими CD4 + Т-клетками, не являющимися ЦНС, играющими роль в пластичности мозга и способствующими нейрогенезу зависимым от BDNF образом во взрослом гиппокампе [48-50].

Таким образом, результаты нашего текущего исследования демонстрируют влияние адаптивного иммунитета на патологию β-амилоидов, вызванную болезнью Альцгеймера, in vivo и предполагают перекрестные помехи между адаптивной иммунной системой и микроглиальными клетками как вероятным основным механизмом. В двух независимых экспериментальных подходах абляция функциональных T- и B-клеток приводила к уменьшению патологии Aβ головного мозга и снижению уровней Aβ наряду с увеличением микроглиоза и очисткой агрегатов Aβ. Однако аблация адаптивной иммунной системы не влияла на уровни Aβ и глиальные клетки у более молодых трансгенных мышей APP на стадии предварительного зубного налета, предполагая, что модуляция микроглиальных ответов на Aβ специфически связана с присутствием амилоидных отложений. Взятые вместе, наши результаты указывают на еще неидентифицированную роль адаптивного иммунитета в модулировании и увлажнении микроглиальных ответов на неправильные Аβ-пептиды в головном мозге. С эволюционной точки зрения это может быть защитный компенсационный механизм адаптивной иммунной системы, направленный на контроль или уменьшение потенциально токсичных нейровоспалительных реакций на агрегаты Аβ, хотя и за счет увеличенного осаждения амилоидных бляшек. Будущие исследования будут необходимы для определения специфических субпопуляций (я) лимфоцитов и основных иммунных медиаторов, участвующих в этих процессах. Лучшее понимание лежащих в основе нейроиммунологических механизмов может в конечном счете проложить путь к более эффективным и безопасным методам лечения адаптивного иммунитета для лечения церебрального β-амилоидоза.

Дополнительный файл 1: Рисунок S1.
              
                Отсутствие лимфоцитов в обеих линиях линии Rag2 ko. 8-месячные мыши Rag2 ko и PSAPP / Rag2 ko практически не содержат В-клеток и CD4 + Т-клеток, тогда как у трансгенных животных WT и PSAPP, сопоставленных по возрасту, сопоставимое количество B и CD4 + T-клеток определено по FACS-окрашиванию лимфоцитов CD45 + антитела против CD4 и маркер В2 клеток панкреатина B220. Кроме того, среди четырех генотипов не наблюдаются существенных различий в миелоидном моноцитарном отделении (Ly6Chigh и Ly6Cintermediate). #
р = 0,05-0,1. * Р <0,05. n = 4-6 на группу. (TIFF 41631 kb)

Отсутствие осаждения амилоидных бляшек через 3 месяца. (A) окрашивание тиофлавином-S подтверждает отсутствие осаждения амилоидных бляшек у 3-месячных PSAPP и совпадающих по возрасту PSAPP / Rag2 ko (показаны изображенные изображения кортикальных пятен). (B) Количественный анализ MSD Aβ40 и Aβ42 в плазме и кортикальной ткани, гомогенизированный с использованием последовательной экстракции для получения различных фракций белка: Tris растворимый; SDS детергент растворимый; Растворимая фракция муравьиной кислоты (B). Статистический анализ не выявил различий уровней Аβ между мышами PSAPP / Rag2 ko и мышами PSAPP через 3 месяца. Шкала шкалы = 300 мкм. n = 14-15 на группу. (TIF 26755 kb)

Нет разницы в обработке APP через 8 месяцев. (A) Вестерн-блот-анализ экстрактов кортикальных SDS у 8-месячных мышей по сравнению с мышами PSAP, сопоставимыми с возрастом. Значения были нормализованы для GAPDH. (B) Количественная оценка не показывает существенных различий в полноразмерных APP и AP-C-концевых фрагментах (C99 и C83) между PSAPP / Rag2 ko и PSAPP-мышами. n = 7 на группу. (TIF 29174 kb)

Никакая разница в глиозе в возрасте 3 месяцев (A, B) иммуногистологический анализ GFAP для астроцитов и (C, D) иммуноокрашивание Iba1 для микроглии (репрезентативные изображения корковых пятен показаны слева). Статистический анализ не выявил существенных различий в глиозе между четырьмя генотипами в возрасте 3 месяцев. Шкала шкалы = 300 мкм (Вставка: шкала шкалы = 40 мкм). n = 11-13 на группу. (TIFF 158644 kb)

Никакой разницы в тиофлавиновых S-окрашенных амилоидных отложениях между Rag2 ko и WT BM-переносимыми мышами PSAPP. (A) Репрезентативные изображения окклюзионных кортикальных амилоидных отложений тиофлавина S. (B) Количественный анализ окрашивания тиофлавина S через 6 месяцев после трансплантации (в возрасте 18 месяцев) не выявил различий в амилоидной нагрузке и числе амилоидных бляшек. Шкала шкалы = 300 мкм. n = 8-10 на группу. (TIF 16319 kb)

Никакой разницы в обработке APP. (A) Вестерн-блот-анализ экстрактов кортикальных SDS от 18-месячных мышей PSAPP, восстановленных с помощью WT или Rag2 ko BM за 6 месяцев до жертвоприношений. Значения были нормализованы для GAPDH. (B) Количественная оценка не выявляет существенных различий в полноразмерных APP и AP-C-концевых фрагментах (C99 и C83). n = 6 на группу. (TIF 26355 kb)

Аналогичный размер амилоидных бляшек анализируется конфокальной микроскопией. (A) Сопоставимый средний размер анализируемых амилоидных бляшек между WT и Rag2 ko BM-восстановленными мышами PSAPP в возрасте 18 месяцев. В среднем 12-тиофлавин S-окрашенных амилоидных бляшек на мышь (n = 9 мышей на группу) анализировали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. р = 0,711. (B) Тенденция к увеличению среднего количества Iba1-положительных клеток на бляшку у мышей PSAPP Rag2 ko BM-реципиента по сравнению с мышами PSAPP, восстановленными WT BM, через 18 месяцев. Опять-таки, в среднем 12 фолликулярных бляшек с тиофлавином S на мышь (n = 9 мышей на группу) анализировали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. #
р = 0,086. (TIF 8887 kb)

Конкурирующие интересы

Ребекка Дерунг, Мария Тереза ​​Ферретти, Кристоф Герике, Лука Кулич, Роджер М. Нич, Клаудия Спани, Тобиас Сутер, Тобиас Уэлт и Фабиан Вирт не имеют никаких конкурирующих интересов.

Вклад авторов

LK, CS и RMN разработали эксперименты. LK, CS, TS, RD, MTF, TW, FW, CG провели эксперименты. LK, CS, TS и MTF проанализировали данные. LK и CS написал рукопись. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Это исследование было частично поддержано грантом Forschungskredit K-82031-02-01 Цюрихского университета (LK, CS). TS была поддержана программой «Рассеянный склероз клинических исследований» Университета Цюриха.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *