Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Антрохинонол снижает уровень амилоида-β мозга и улучшает пространственное обучение и память в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера

Antroquinonol Lowers Brain Amyloid-β Levels and Improves Spatial Learning and Memory in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer’s Disease
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4606808/

Болезнь Альцгеймера (AD) является наиболее распространенной формой деменции. Отложение мозговых амилоидных β-пептидов (Aβ), которые расщепляются от белка предшественника амилоида (APP), является одним из патологических признаков AD. Aβ-индуцированный окислительный стресс и нейровоспламенение играют важную роль в патогенезе AD. Было показано, что антрохинонол, производное убихинона, выделенное из Antrodia camphorata, снижает окислительный стресс и воспалительные цитокины за счет активации ядерного фактора транскрипционного фактора, связанного с эритроидом-2-фактора 2 (Nrf2), который снижается в AD. Таким образом, мы исследовали, может ли противоокинонол улучшить AD-подобный патологический и поведенческий дефицит в модели трансгенной мыши APP. Мы обнаружили, что антрохинонол способен пересекать гематоэнцефалический барьер и не имеет побочных эффектов при приеме внутрь. За два месяца потребления антикинонола улучшилось обучение и память в тесте на водные лабирины Морриса, уменьшились уровни гиппокампа Aβ и уменьшилась степень астроглиоза. Эти эффекты могут быть опосредованы за счет увеличения Nrf2 и снижения уровней гистондезацетилазы 2 (HDAC2). Эти данные свидетельствуют о том, что антихинонол может оказывать благотворное влияние на AD-подобные дефициты в трансгенной мыши APP.

Болезнь Альцгеймера (AD), наиболее распространенная форма деменции, ежегодно поражает миллионы людей. К сожалению, на сегодняшний день нет эффективного лечения этого заболевания. Аномальное накопление внеклеточных амилоидных β-пептидов (Aβ) в амилоидных бляшках является одним из патологических признаков в головном мозге пациентов с АД. Aβ-пептиды, содержащие 40 (Aβ40) или 42 (Aβ42) аминокислот, расщепляют из белка предшественника амилоида (APP) β- и γ-секретазами1. Важность Aβ в этиологии AD была продемонстрирована во многих in vivo и in vitro системах. Были созданы множественные линии трансгенных мышей, содержащие семейные мутации AD в APP, которые развивают амилоидные бляшки в их мозгу и демонстрируют нарушения в обучении и памяти234. Снижение уровня Aβ через генетические или фармакологические подходы в этих моделях часто связано с уменьшением их когнитивных нарушений56.

Воспаление и окислительный стресс являются двумя основными факторами, приводящими к нейродегенерации при патогенезе AD7. А-индуцированная активация астроцитов участвует в производстве провоспалительных цитокинов и реактивных видов кислорода, которые способствуют синаптическому снижению и уменьшению памяти8. Астроциты являются иммуноподобными клетками, которые становятся реактивными в ответ на повреждение нейронов. Астроглиоз обычно наблюдается у пациентов с АД9 и мышей1011. Астроглиоз обычно приводит к образованию цитокинов и активных форм кислорода, тем самым вызывая воспаление и окислительный стресс. Повышенное перекисное окисление липидов, а также окисление белка и ДНК обнаружено в мозгах AD12, цереброспинальной жидкости 13 человека и нейронах, полученных из пациентов с АД14. Антиоксидантные методы лечения на ранних стадиях патогенеза способствовали ослаблению функционального нарушения15161718 и уменьшению мозга Aβ в моделях мышей AD171920.

Сигнализация с помощью ядерного транскрипционного фактора. Фактор 2, связанный с эритроидом-2 (Nrf2), фактор транскрипции, регулирующий антиокислительные гены, ослабляется у пациентов с AD21 и моделями мыши22. Активация передачи сигналов Nrf2 необходима для противодействия окислительному повреждению и токсичности, вызванной Aβ23. Antroquinonol, активное соединение, очищенное от polyporus mushroom Antrodia camphorata, обладает антиоксидантным и противовоспалительным эффектом242526. Antrodia camphorata была передана в безопасное место для использования человеком в клиническом исследовании (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01007656) и обычно используется в качестве лекарственного средства для лечения рака, гипертонии и похмелья. В этом исследовании мы изучили, может ли лечение антихинонолом улучшать AD-подобный фенотип, наблюдаемый у трансгенной мыши APP.

Перед исследованием эффективности антихинонола в модели AD биобезопасность антихинонола была исследована путем повторного введения 10, 30 и 100 мг / кг / день антихинонола или носителя крысам крыс Sprague-Dawley (SD) в течение 4 недель. У этих крыс не было значительных изменений в потреблении пищи, потерях массы тела или большинстве весов органов среди этих групп (рис.1 и дополнительная таблица 1). Тем не менее, женщины, которым вводили 100 мг / кг / день антрохинонола, имели более низкую массу головного мозга, чем контрольная группа транспортного средства (фиг.1с). Кроме того, наблюдались изменения в весах печени, тимуса и надпочечников у животных, получавших 100 мг / кг / день антрохинонола (дополнительная таблица 1). Животные, получавшие 30 мг / кг / день или ниже, не проявляли никаких очевидных ухудшений в клиническом состоянии, офтальмоскопии, потреблении пищи, гематологии, химии крови, анализе мочи, общей патологии или гистопатологии. Животные, получавшие 100 мг / кг / день, демонстрировали некоторые гистопатологические изменения (дополнительная таблица 2), и некоторые клинические признаки происходили спорадически, включая стойкость брюшной полости, рыхлые фекалии и слюноотделение. Подводя итог, дозы противооксинола ниже 30 мг / кг / день, по-видимому, не связаны с какими-либо неблагоприятными последствиями.

Чтобы оценить биодоступность и проникновение гематоэнцефалического барьера на антихинонол, мышам вводили перорально 30 мг / кг антрохинонола. Тканевую и плазму собирали через 0,5, 4 или 24 часа после введения через желудочный зонд, и их концентрацию антикинонола определяли с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS). Через 0,5 часа и 4 часа пероральная доза антрохинонола 30 мг / кг давала концентрацию в плазме 38,34 нг / г и 20,98 нг / г, а концентрация головного мозга 37,75 нг / г и 87,02 нг / г (фиг.2) , Через 24 часа концентрации антрохинонола в плазме и головном мозге были возвращены на неопределенный уровень. Антрохинонол также был обнаружен во многих других тканях, таких как селезенка, желудок и печень (дополнительная таблица 3). Эти результаты показывают, что антихинонол обладает хорошей биодоступностью и может пересекать гематоэнцефалический барьер при дозировке без отрицательного эффекта.

Мы использовали трансгенную мышь APP в качестве нашей модели животного AD для изучения того, может ли антихинонол уменьшать AD-подобные дефициты in vivo. Линия мыши APP (J20), используемая в этом исследовании, развивает нарушения пространственной памяти в возрасте 4 месяцев 27, поэтому все виды лечения начинались с 3-месячного возраста в течение 2 месяцев (рис.3a). Для определения эффектов дозировки мы кормили диету мышей, содержащую 0% (контроль), 0,003% (низкая доза) и 0,015% (высокая доза) антрохинонола. После измерения веса приема пищи каждая мышь в среднем потребляла 7,2 мг / кг / день (низкая доза) или 34,2 мг / кг / день (высокая доза) антихинонола, что примерно эквивалентно потреблению взрослого человека 0,58 мг / кг / день или 2,77 мг / кг / день28. Средний вес тела и потребление пищи не были существенно изменены в течение 2 месяцев лечения антихинонолом (рис.3b, c).

До и после потребления антрохинонола мы использовали открытый полевой тест для наблюдения за локомоторной активностью, повышенный плюс лабиринт для отображения поведения, связанного с тревожностью, и тест ротарода для изучения координации моторов этих мышей (рис. 3d-f) , Не было значительных изменений в общей двигательной активности (рис. 3d) или моторной координации (рис. 3е) среди всех групп. В тестах с повышенным плюсом лабиринт мышам APP удалось пройти более длинное расстояние в открытых объятиях по сравнению с мышами дикого типа (WT), как сообщалось ранее4 (фиг.3f), но антрохинонол существенно не изменял это тревожное поведение внутри групп.

Чтобы определить, может ли антихинонол улучшать нарушения памяти, обнаруженные у мышей APP, мы использовали тест лабиринта Morris для оценки их пространственного обучения и памяти после 2-месячного потребления антрохинонола. В тренировках с скрытой платформой более низкая латентность для достижения платформы в течение пяти последовательных дней обучения указывает на лучшее приобретение памяти. Мышам APP, которые потребляли контрольную диету, потребовалось больше времени, чтобы найти платформу побега, чем мыши WT (фиг.4a, b). Мышам APP, которые получали диету с низкой дозой антихинонола, существенно не уменьшали время достижения платформы по сравнению с контрольной диетической группой (фиг.4а). Тем не менее, мышам APP, которые получали высокодозную диету против мухинонола, потребовалось значительно меньше времени, чем при контрольной группе диеты, чтобы достичь платформы на четвертом и пятом днях обучения с скрытой платформой (рис.4b). В пробном исследовании мышей APP проводили меньше времени в целевой зоне, чем WT, что указывало на дефицит удержания памяти. Однако потребление мокротоксина не привело к существенному изменению этого дефицита (фиг.4с, г). Поэтому наш находка предположила, что antroquinonol, вероятно, помогает с приобретением памяти, но не может значительно улучшить удержание памяти у мышей APP.

Одним из гистопатологических признаков AD является накопление амилоидных бляшек, которые в основном состоят из Aβ, особенно высокотоксичных Aβ42. Поэтому для определения количеств всего Aβ и Aβ42 в гиппокампе мышей APP, обработанных контрольной или антихинонолоновой диетой, проводили иммуноферментные анализы с ферментом (ELISA). За два месяца потребления антихинонола значительно подавлялись общие уровни Aβ (рис.5a). Количество высокопатогенного Aβ42 значительно уменьшилось после 2-х месяцев потребления доз антрохинонола (рис.5b). Moroever, отношение Aβ42 к общему Aβ показало более низкую тенденцию к высокой дозе лечения антихинонолом (рис.5c). Тем не менее, полноразмерные уровни APP не изменялись у этих мышей (рис. 5d, e и дополнительный рисунок 2). Кроме того, накопление амилоидных бляшек контролировалось окрашиванием Тиофлавином-S (Thio-S). Обработанные антрохинонолом мыши APP имели значительно меньшие числа бляшек Aβ, чем контрольные мыши (фиг.6a-c, g).

Более того, Aβ может стимулировать нейровоспламенение для продуцирования различных воспалительных цитокинов, что вызывает нейротоксические эффекты в головном мозге. Таким образом, экспрессия глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) рассматривалась как показатель астроглиоза после потребления антихинонола. Мы обнаружили, что антрохинонол значительно снижает интенсивность GFAP гиппокампа, что указывает на то, что антрохинонол может снизить активацию астроцитов через 2 месяца потребления (фиг.6d-f, h). Подводя итог, эти результаты показывают, что антрохинонол может облегчить амилоидную и воспалительную патологию в этой модели мыши AD.

Мы также изучили, связано ли улучшение поведенческих дефицитов с спасением нейронной или синаптической потери. В соответствии с предыдущими отчетами мышей APP не было значительного количества нейронов смерти по сравнению с WT29, но показали потерю синапса маркера synaptophysin3. Тем не менее потребление антрохинонола не может обратить вспять эту потерю (см. Фиг. 1). Таким образом, защитный эффект антрохинонола может быть не непосредственно на выживание нейрона или синапса, но может быть вызван активированием других путей.

Нейровоспаление может способствовать окислительному стрессу, и это, как было показано, ускоряет отложение амилоидов и ухудшение памяти в мышиной модели AD30. Предыдущие исследования в почечной системе показали, что антрохинонол способен снижать окислительный стресс, активируя путь Nrf22425. Таким образом, мы исследовали, может ли 2 месяца потребления антихинонола изменять экспрессию Nrf2 в головном мозге мышей APP. Результаты иммуноблоттинга показали, что гиппокамп Nrf2 был увеличен после введения антрохинонола (фиг.7а, б и дополнительный рисунок 3а). Уровни Nrf2 были значительно выше у мышей, которые потребляли антихинонол, чем у тех, кто получал контрольную диету (рис.7b).

Активацию Nrf2 при окислительном стрессе можно контролировать с помощью гистондезацетилазы 2 (HDAC2) 31, что отрицательно регулирует обучение и память и чрезмерно обильно в гиппокампе моделей мышей AD32. Мы обнаружили, что уровни HDAC2 были снижены у мышей APP, которые потребляли антрохинонол (рис.7a, c и дополнительный рисунок 3b), что предполагает, что 2 месяца потребления антикинонола могут оказывать нейропротективное действие у мышей APP за счет снижения HDAC2 и увеличения уровней Nrf2.

Это исследование показало, что антрохинонол, природное соединение, выделенное из лекарственного гриба, не оказывал неблагоприятного воздействия на животных после длительного использования и имел возможность пересекать гематоэнцефалический барьер, поэтому его можно было использовать в качестве потенциального лекарственного средства для AD. Через 2 месяца потребления антрохинонола трансгенные мыши APP имели улучшенное пространственное обучение и память и меньшее количество бляшек Aβ по сравнению с потребляемой контрольной диетой. Защитный механизм антрохинонола может быть опосредовано несколькими путями. Мы обнаружили снижение астроглиоза, повышение активности Nrf2 и снижение регуляции уровней HDAC2 в головном мозге мышей, получавших антрохинонол.

В этом исследовании мышей, получавших антрохинонол APP, наблюдалось значительное снижение индуцированного Аβ реактивного астроглиоза в головном мозге. Астроглиоз обнаружен в AD и многих других нейродегенеративных заболеваниях10113334. Эти реактивные астроциты играют решающую роль в модулировании нейровоспаления и окислительного стресса, которые являются одним из основных факторов патогенеза AD833. Таким образом, нацеливание на нейровоспламенение на ранних стадиях считается одним из подходов к лечению или замедлению прогрессирования AD. Действительно, несколько терапевтических подходов, нацеленных на воспалительные пути, такие как нестероидные противовоспалительные препараты, были протестированы, но большинство клинических испытаний не удалось35. Антрохинонол проявлял сильные иммуномодулирующие эффекты, уменьшая экспрессию провоспалительных цитокинов и проявляющие сыворотку виды кислорода in vivo2526. Уменьшенный астроглиоз при инъекции Nrf2 показал улучшение снижения памяти в мышиной модели AD10. Таким образом, иммуномодулирующее действие антрохинонола может быть опосредовано посредством улучшенного уровня Nrf2.

Наши результаты показывают, что уровень Nrf2 может быть увеличен у мышей APP после потребления антихинонола, что согласуется с предыдущими результатами в почечной воспалительной мыши2425. Поскольку уровни Nrf2 снижаются в нейронах трансгенных мышей APP / PS122 и в головном мозге 21 AD, антрохинонол может восстановить основную активность Nrf2. Активированный путь Nrf2 может противодействовать Aβ-индуцированному окислительному повреждению, гибели нейронов in vitro2223 и усилить пространственное обучение и память в модели мыши AD10. При воздействии активных форм кислорода Nrf2 активирует транскрипцию генов, участвующих в антиоксидантной защите и детоксикации, включая супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, пероксиредоксины, гем-оксигеназы и NAD (P) H: хинон-оксидоредуктаза-136. Эти свободнорадикальные ферменты представляют собой мощный антиоксидантный защитный механизм для противодействия повреждению. Было обнаружено, что различные природные и синтетические Nrf2-активирующие соединения оказывают благотворное влияние на экспериментальные модели нейродегенерации36. Таким образом, антикинонол может потенциально использоваться в качестве поддерживающего лечения нейродегенеративных заболеваний, которые связаны с окислительным стрессом и состояниями нейровоспалительных заболеваний.

Кроме того, мы обнаружили, что антрохинонол может снижать уровень HDAC2, который, как известно, отрицательно регулирует формирование памяти и синаптическую пластичность32. HDAC2 является каталитической субъединицей дезацетилазных репрессорных комплексов и предпочтительно привлекается к промоторам генов, связанных с нейронами32. Уровни HDAC2 увеличиваются в нескольких моделях мышей AD и постмоторных мозгах АД через аллергономическое фосфорилирование вирусного онкогена мышиного лейкоза aelson1 (c-Abl )3738. Увеличение уровней HDAC2 и активности в AD связано с ухудшением нейрональной и синаптической функций. Лечение ингибиторами HDAC предотвращает когнитивные дефициты и поведенческие нарушения в моделях мышей AD посредством увеличения экспрессии генов, участвующих в синаптической пластичности и консолидации памяти в гиппокампе39. Наши результаты показали, что положительные эффекты антихинонола могут также опосредовать посредством снижения HDAC2.

Мы обнаружили, что 2 месяца потребления антрохинонола способны улучшать дефицит обучения и памяти, уменьшать осаждение амилоида головного мозга и астроглиоз, увеличивать экспрессию Nrf2 и снижать уровни HDAC2 в мыши APP. Это лечение было начато у мышей APP в возрасте 3 месяцев, до начала AD-подобной патологии и функциональных нарушений. Однако остается неизвестным, может ли антихинонол облегчить ухудшение после начала симптомов и будет ли антрохинонол задерживать начало или оказывать профилактическое действие AD. В заключение, наше исследование предполагает потенциальное использование антрохинонола в модулировании патогенеза AD.

APG-трансгенные мыши (линия J20), несущие ген APP человека со шведскими (K670N / M671L) и Indial (V717F) семейными мутациями, были использованы в качестве мышиной модели AD. Мышей размещали в помещении без патогенов со светло-темным циклом 12-часового света и 12-часовым темным. Пища и вода для мышей были предоставлены ad libitum. Пять-шесть недельных самцов и крыс SD-крыс для исследования токсичности были приобретены в Harlan Laboratories (Хантингдон, Великобритания). Клиническое состояние, офтальмоскопия, вес тела, потребление пищи, гематология, анализ мочи, вес органов, грубая патология и гистопатологические исследования были выполнены компанией (Aptuit, Greenwich, CT, USA). Тесты на биодоступность и тканевую абсорбцию проводили на мышах BALB / c из Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Пекин, КНР) и выполнялись WestChina-Frontier PharmaTech Co. (Чэнду, КНР). Исследование было одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Национального университета Ян-Минь. Все экспериментальные процедуры с участием животных и их уход проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Национальными институтами здравоохранения Соединенных Штатов (NIH).

Антрохинонол был выделен и охарактеризован как подробно описанный в предыдущем исследовании40. Для теста на биобезопасность крысам SD вводили 10 мг, 30 мг и 1 мг / кг в день (в растворе в оливковом масле) или в виде оливкового масла перорально через желудочный зонд ежедневно в течение 4 недель. Для тестов на биодоступность и тканевую абсорбцию мышам BALB / c аналогичным образом вводили перорально 30 мг / кг в течение 0,5, 4 и 24 часов. Для лечения модели мышей AD мы использовали antroquinonol от Golden Technology Corporation (New Taipei City, Taiwan) в сочетании с диетой грызунов (лабораторная диета грызунов 5010, LabDiet, Сент-Луис, Миссури, США) при концентрациях 0,003% и 0,015% ( мас. / мас.) для получения низко- и высокодозовой дозы антихондолола. Антрохинонол был заменен оливковым маслом для получения контрольных диет. Начиная с 3-месячного возраста, мышей делили на три группы, потребляющих низко- и высокодозную дозу антикинонола, и контрольные диеты в течение 2 месяцев. Открытое поле, повышенный плюс лабиринт и ротаровые тесты проводились до и после лечения, а тест на водную лабиринт Морриса проводили через 2 месяца потребления антикинонола. Патологические и биохимические исследования проводились после того, как все мыши были умерщвлены внутрисердечной перфузией.

Система жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS) состояла из масс-спектрометра (Quattro Ultima, Micromass Ltd, Manchester, UK), насоса и автосамплера (Waters Alliance 2790 LC, Waters, MA, США). Данные обрабатывались MassLynx (версия 4.0, Micromass Ltd, Манчестер, Великобритания). Условия высокоэффективной жидкостной хроматографии были следующими: колонка Biosil (ODS 4,6 мм × 150 мм, 5 мкм, Biotic Chemical Co., Ltd, Тайвань), подвижная фаза 90% CH3CN + 1,0% HCOOH и скорость потока 1,0 мл / мин, после разделения колонки 1/10 на массу. Режим ионизации включал электрораспыление / положительную ионизацию, а режим массового сканирования был установлен на «монитор с несколькими реакциями». Материнский ион G4 m / z составлял 391,3, а дочерний ион m / z составлял 180,89. Электрораспыление устанавливали на 3,2 кВ, температуру источника до 80 ° С и температуру десольватации до 400 ° С. Конус, столкновение и напряжение умножителя были установлены на 15 В, 15 В и 500 В соответственно.

Водный лабиринт состоял из водяного бассейна (122 см в диаметре), содержащего непрозрачную воду, и платформа (14 см в диаметре) погружалась на 1 см ниже поверхности воды. Обучение скрытой платформе состояло из 10 сеансов (два в день) в течение 5 дней; каждый сеанс состоял из трех 60-секундных испытаний с интервалом в 15 минут. Место на платформе оставалось неизменным на сеансах скрытой платформы, и точки входа были изменены в случайном порядке между днями. На следующий день после последнего дня тренировки с скрытой платформой проводилось пробное испытание, удаляя платформу и позволяя мышам исследовать бассейн в течение 1 минуты. Квадрант, в котором платформа была ранее расположена, определялась как целевой квадрант, а доля времени (в процентах) мышей, проведенных в целевом квадранте, использовалась для измерения их сохранения в памяти. Время дойти до платформы и скорость плавания были записаны и проанализированы с помощью системы отслеживания видеоизображения EthoVision (версия 3.1, Noldus, Wageningen, The Netherlands).

Повышенный плюс-лабиринт состоял из двух открытых рук и двух закрытых плеч. Мышей помещали индивидуально в центр аппарата и давали возможность исследовать в течение 10 минут. Время, проведенное, и расстояние, пройденное в каждом из рук, было записано и проанализировано с использованием системы видео-контроля EthoVision.

Локомоторная активность в открытом поле была протестирована с использованием автоматизированной системы фотоэлемента Flex-Field / Open Field (версия 2.0, TRU Scan Photobeam LINC, Coulbourn Instruments, PA, США) с прозрачной пластиковой камерой (41 × 41 × 38 см ). Для обнаружения движений в горизонтальной и вертикальной плоскостях использовались две камеры датчиков, каждая из которых состояла из фотобарабана размером 16 × 16 на 1,5 см и 6 см над нижней частью камер. Лучевые разрывы на арене подсчитывались в течение 15 минут.

Мышей помещали на стержень (RT-01, SINGA, Тайбэй, Тайвань). Шток начал вращаться с ускорением 20 об / мин / 10 секунд за первые 10 секунд, а затем скорость была увеличена с 20 об / мин до 90 об / мин с ускорением 10 об / мин / 10 секунд. Каждая скорость поддерживалась в течение 5 секунд. Латентность мышей, падающих с вращающегося стержня, давала меру их моторной координационной способности.

Гиппокампи из расчлененных мозгов гомогенизировали в 5 М гуанидине / 5 мМ Трис-буфере (рН 8,0). Образцы дополнительно разбавляли охлажденным 0,25% казеин-блокирующим буфером, содержащим 0,5 М гуанидин и ингибитор протеазы (04693116001; Roche, Basel, Switzerland). Уровни общего количества Aβ и Aβ42 были количественно определены наборами ELISA (27729 и 27711, IBL, Гамбург, Германия) в соответствии с протоколами производителя.

Устойчивые к параформальдегиду мозги секвенировали коронально (толщиной 20 мкм) с использованием скользящего микротома (CM1900, Lieca, Nussloch, Germany). Для иммуногистохимии (IHC) срезы блокировали забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), содержащим 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,5% тритона X-100 в течение 1 часа, инкубировали в течение ночи с первичным антителом против GFAP (Z0334, Dako Cytomation , Glostrup, Дания) и антисинаптофизиновое антитело (04-1019, Millipore), при 4 ° C, а затем в вторичном антителе IgG против IgM-антитела DyLight 488-AffiniPure (111-485-003, Jackson ImmunoResearch, Westgrove, PA, США) в течение 1 часа. Для окрашивания тиофлавином S срезы окрашивали 0,015% тиофлавином-S (T1892, Sigma, MO, США) в течение 15 минут при комнатной температуре. После монтажа слайды отображали с использованием флуоресцентного микроскопа Zeiss (Axio Observer A1, Zeiss, Oberkochen, Germany).

Гомогенаты гиппокампа в 0,5 М гуанидине разделяли через 10% -ный электрофорез в трис-глицин-полиакриламидном геле, переносили в нитроцеллюлозу (66485, Pall Corp., Glen Cove, NY, США) или мембраны из поливинилиденфторида (PVDF, IPVH00010, Millipore, Darmstadt, Germany) , и исследовали с использованием первичного антитела для APP (MAB348, Millipore), Nrf2 (sc-722, Santa Cruz, TX, USA), HDAC2 (Y461, abcam, Cambridge, UK) или актина (GTX23280; GeneTex, San Antonio, TX , США). Мембраны промывали и зондировали конъюгированным с аффинностью очищенным вторичным антителом с пероксидазой хрена (HRP): козьим антимышиным IgG, IgG козы и крысиным анти-кроличьим IgG (12-349, AP136P, AP132P, Millipore). Сигналы белка визуализировали с использованием хемилюминесцентной системы обнаружения субстрата HRP (WBKLS0500, Millipore) и определяли количественно с помощью системы визуализации люминесценции (LAS-4000, Fujifilm, Tokyo, Japan).

Статистический анализ выполнялся с помощью GraphPad Prism (версия 5.0; GraphPad, La Jolla, США) или SPSS v13.0 (версия 22, IBM, Нью-Йорк, США). Различия между несколькими способами оценивались односторонним, двусторонним или повторным методом ANOVA, после чего проводился постходовой тест Бонферрони. Различия между двумя способами оценивались с помощью парного или непарного t-теста. Порог значимости определялся как P <0,05.

Как процитировать эту статью: Chang, W.-H. и другие. Антрохинонол снижает уровень амилоида-β мозга и улучшает пространственное обучение и память в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера. Sci. По донесению
5, 15067; doi: 10.1038 / srep15067 (2015).

Эта работа была поддержана грантом Министерства науки и технологий Тайваня (NSC 102-2320-B-010-021-MY2), Национальным научно-исследовательским институтом здравоохранения (NHRI-EX103-10338NI), Больницей Чэн Синь (102F218C05), Йен Тин Линг Медицинский фонд (CI-102-4), Грант больницы ветеранов в Тайбэе (V103E4-002), Министерство образования Тайваня для высшего университетского гранта и Золотая биотехнологическая корпорация. Поведенческие исследования проводились в Поведенческом ядре животных в Исследовательском центре мозга, Национальном университете Ян-Минь.

WHC и IHC не объявляют конфликта интересов. MCC является сотрудником Golden Biotechnology Corporation.

Авторские вклады W.H.C. и I.H.C. написал основной текст рукописи. W.H.C. и M.C.C. провели эксперименты. Все авторы разработали эксперименты и рассмотрели рукопись.

SD крыс были разделены на четыре группы, получавших 0, 10, 30 и 100 мг / кг / день антихинонола через желудочный зонд в течение 4 недель. (а) Потребление пищи, (б) прирост массы тела регистрировали еженедельно, и (в) анализ массы мозга анализировали после 4 недель введения. (a, b) Ни у самцов, ни у самок крыс не наблюдалось значительных изменений в потреблении пищи или увеличении массы тела после лечения антрохинонолом по сравнению с носителем. (c) Потребление 10 и 30 мг / кг / сут антрохинонола существенно не изменяло вес мозга по сравнению с контрольной диетой. Однако потребление 100 мг / кг / сут антрохинонола уменьшало массу мозга у самок крыс. Данные представлены как среднее ± SD. Результаты были проанализированы ANOVA. Каждая группа включает 10 мужчин и 10 женщин.

Мышам вводили одну дозу 30 мг / кг антрохинонола перорально, а вскрытие проводили через 0,5, 4 или 24 часа после введения. Уровни антрохинонола были обнаружены в головном мозге (а) и в плазме (б) в течение 4 часов после введения. Уровень антрохинонола не определялся через 24 часа после введения. Данные представлены как среднее ± SEM. n = 6 для каждой временной точки.

(a) Экспериментальная конструкция: начиная с 3-месячного возраста мышам WT и APP давали низкие дозы (7,2 мг / кг / день) и высокие (34,2 мг / кг / день) дозы антикинонола в течение 2 месяцев. Испытания открытого поля, ротарода и повышенного плюс лабиринта проводились до и после лечения. Тест на водную лабиринт проводили через 2 месяца потребления мокрокинонола. Патологические и биохимические исследования проводились после того, как все мыши были умерщвлены. (b, c) Изменение массы тела (b) и потребление пищи (c) регистрировались еженедельно в течение 2-месячного периода лечения. (d) В открытом полевом испытании мыши WT и APP демонстрировали сходное время передвижения до и после потребления антихинонола. (e) В тесте ротарода у мышей WT и APP были сходные затухания. (f) В тестах с повышенным плюсом лабиринта мыши APP продвигались на большие расстояния в открытых объявках, чем мыши WT, и потребление антихинонола не меняло этого. Данные представлены как среднее ± SEM. Результаты анализировали с помощью повторных измерений ANOVA (b, c) и двухстороннего ANOVA (d-f). Количество мышей: WT + control = 15, WT + низкий antro = 6, WT + высокий antro = 8, APP + контроль = 11, APP + низкий antro = 8, APP + высокий antro = 6. *** P <0.001 против контроля WT +.

В тесте на водный лабиринт Морриса трансгенные мыши APP показали более низкое обучение и память по сравнению с мышами WT в течение пяти последовательных дней обучения скрытой платформе (a, b) или пробной тропы (c, d). (a, b). В скрытом тестировании на платформе мышей APP, которые потребляли диету с низкой дозой антрохинонола (антро) (a), существенно не уменьшали задержку латентного периода, но мышей APP, которые потребляли диету с высокой дозой андрохинонола (b), показали значительно более низкая латентность по сравнению с однопометниками, учитывая контрольную диету. Результаты были проанализированы с помощью повторных измерений ANOVA и обнаружили взаимодействие между потреблением доз антрохинонола и временными факторами в когортах мышей APP. Ежедневные показатели были определены по t-критерию Стьюдента. (c, d) В пробном исследовании потребление антихинонола существенно не уменьшало дефицит удержания памяти. Результаты были проанализированы односторонним ANOVA. Данные представлены как среднее ± SEM. Количество мышей в группе с низкой дозой: WT + контроль = 6, APP + контроль = 4, WT + низкий antro = 6, APP + низкий антро = 8. Количество мышей в группе с высокой дозой: WT + control = 9, WT + высокий анти = 7, APP + контроль = 8, APP + высокий antro = 6 * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001.

Общий уровень Hippocampal Aβ и Aβ42 у трансгенных мышей APP измеряли с помощью ELISA. (a-c) По сравнению с контрольной диетической группой, общий уровень Aβ (a) и Aβ42 (b) был значительно снижен через 2 месяца потребления антихинонола. (c) Отношение Aβ42 / общее Aβ было снижено через 2 месяца потребления высококонтрактинонола. (d) Представитель обрезал изображение вестерн-блоттинга для уровней APP после потребления антрахинонолом. Целый блок показан в дополнительном рисунке 2. (e) Количественный анализ результатов вестерн-блоттинга показал, что уровни APP не изменялись после 2 месяцев потребления антрохинонола. Результаты были определены количественно из трех независимых экспериментов и представлены как среднее ± SEM. Соотношение мышей, получавших контрольную диету APP, было установлено равным 1. Результаты анализировали односторонним анализом ANOVA и t. Число мышей: APP + control = 11, APP + низкий antro = 8 и APP + высокий antro = 6. * P <0,05, ** P <0,01 против контроля APP +.

(a-c) Репрезентативные изображения тиофлавина-S у мышей APP с или без лечения антихинонолом. (d-f) Представитель GFAP, окрашивающий изображения у мышей APP с или без лечения антихинонолом. (g) Потребление потребляемой дозы мокрохинонола с низкой и высокой дозой уменьшало количество амилоидных бляшек в гиппокампе мышей APP. (h) Количественные результаты для интенсивности GFAP, нормированные по размеру измеренной площади. Как потребление низкой дозы, так и высокая доза мокроты снижали экспрессию GFAP в гиппокампе мышей APP. Данные представлены как среднее ± SEM. Результаты были проанализированы односторонним ANOVA. Число мышей: APP + control = 11, APP + низкий antro = 8 и APP + высокий antro = 6. Пять-десять срезов, содержащих гиппокамп, окрашивали на мышь. * P <0,05, ** P <0,01 против контроля APP +. Шкала шкалы = 200 мкм.

(a) Представитель обрезал изображения вестерн-блоттинга, показывающие уровни Nrf2 и HDAC2 у трансгенных мышей APP. Актин использовался как контроль загрузки. Цельное пятно показано в дополнительном рисунке 3. Через 2 месяца потребления антрохинонола (b) уровни Nrf2 были увеличены и (c) уровни HDAC2 были уменьшены. Результаты были усреднены в четырех независимых экспериментах и ​​представлены как среднее ± SEM. Результаты анализировали с помощью ANOVA и t-теста в виде доли уровней Nrf2 и HDAC2 у мышей с контрольной диетой, которые были установлены на 1. * P <0,05 по сравнению с контролем APP +.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *