Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Пассивная иммунизация с Phospho-Tau антителами снижает Tau патологии и функциональные недостатки в двух различных моделей таутопатии мышей

Passive Immunization with Phospho-Tau Antibodies Reduces Tau Pathology and Functional Deficits in Two Distinct Mouse Tauopathy Models
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4416899/

Конкурирующие интересы: я прочитал политику журнала, и авторы этой рукописи имеют следующие конкурирующие интересы: SS, DB, ND, LY, GC, NH, LD, SK, AL, YC, BS, GH, NB, CP, PW , VR, AC, CA, JM, MA являются сотрудниками Bristol-Myers Squibb, чья компания частично профинансировала это исследование. Патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов не существует. Это не изменяет приверженность авторов ко всем политикам PLOS ONE по обмену данными и материалами.

Задуманные и разработанные эксперименты: SS DB LV ND PW AC CA JMJ JT VL KB MA. Выполнены эксперименты: SS LV ND LY GC NH LD SK AL YC BS BZ MN GH NB CP. Проанализированы данные: SS DB LV ND LY NH LD SK AL YC BS BZ MN CP PW JMJ KB. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: LY BZ MN CP VR. Написал документ: SS DB LV ND LY GC NH LD AL YC BZ MN JMJ JT VL KB MA.

При болезни Альцгеймера (AD), обширное накопление внеклеточных амилоидных бляшек и интраневральных тау-клубок, наряду с потерей нейронов, проявляется в отдельных областях мозга. Постановка тау-патологии путем посмертного анализа субъектов АД предполагает последовательность инициации и последующего распространения нейрофибриллярных тау-клубок по определенным анатомическим путям мозга. Кроме того, тяжесть когнитивных дефицитов коррелирует со степенью и степенью тау-патологии. В этом исследовании мы демонстрируем, что антитела фосфотау (р-тау), PHF6 и PHF13, могут препятствовать индукции тау-патологии в первичных культурах нейронов. Влияние пассивной иммунотерапии на формирование и распространение тау-патологии, а также функциональный дефицит, впоследствии оценивали с помощью этих антител в двух различных моделях тауопатии трансгенных мышей. Трансгенная мышь rTg4510 характеризуется индуцируемой чрезмерной экспрессией мутантного P301L tau и обладает устойчивой возрастной патологией мозга tau. Системное лечение PHF6 и PHF13 в возрасте от 3 до 6 месяцев привело к значительному снижению уровня p-tau мозга и CSF. Во второй модели введение предварительно сформированных тау фибрилл (PFF), состоящих из рекомбинантного тау-белка, охватывающего области повторения микротрубочек, в кору и гиппокамп молодых экспрессирующих мышей мутантов P301S tau (PS19) приводило к устойчивой тау-патологии на ипсилатеральной стороне с доказательством распространения на отдаленные участки, включая контралатеральный гиппокамп и двустороннюю кость энторинала через 4 недели после инъекции. Системное лечение с помощью PHF13 привело к значительному снижению распространения тау-патологии в этой модели. Снижение количества тау после лечения p-tau-антителом было связано с улучшением теста памяти распознавания новых объектов в обеих моделях. Эти исследования свидетельствуют о поддержке использования тау-иммунотерапии в качестве потенциального варианта лечения AD и других тауопатий.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации.

Болезнь Альцгеймера (AD) является разрушительной и дорогостоящей болезнью, которая составляет 50-80% случаев старческого слабоумия. Во всем мире более 35 миллионов человек страдают от деменции, и, согласно прогнозам, в ближайшие 20 лет их число удвоится [1-2]. В AD очевидна прогрессирующая разработка внеклеточных амилоидных агрегатов и внутриклеточных таусодержащих нейрофибриллярных клубок (NFT), а также нарушения нейронов и дисфункция памяти. [3-5]. Семинарные исследования, основанные на посмертной постановке тау-патологии у пациентов с АД, показали, что тау-патология распространяется по различным анатомическим путям мозга, а тяжесть когнитивных нарушений, по-видимому, коррелирует с количеством и степенью патологии NFT [6-8]. Эти исследования и другие привели к гипотезе о том, что распространение тау-патологии может быть связано с передачей токсичных тау-разновидностей вдоль синаптически связанных областей мозга, а ряд недавних исследований обеспечивает поддержку этой модели патологического распространения тау [9, 10] , Фактически, эта модель согласуется с общей темой передачи специфических для белка патологий в различных нейродегенеративных расстройствах, включая другие тауопатии, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона и другие прионные заболевания [11-13].

В то время как природа трансмиссивных видов тау неизвестна, продолжается обширная работа по разработке моделей in vitro и in vivo для понимания основополагающей природы и механизма распространения этого клеточно-клеточного тау [14, 15]. В различных сотовых системах, включая первичные нейроны, лечение экзогенно приготовленными фибриллами тау, полученными из рекомбинантных белков или экстрактов из пораженных мозгов, привело к увеличению уровней нерастворимого детергента тау и фосфотау (п-тау) [16, 17]. Хотя клеточное распространение тау-патологии проявляется в клеточных системах, сверхэкспрессирующих мутантный тау, это очень низкочастотные события, возможно, из-за отсутствия синаптического оборудования для рециклинга и сотовой связи в этих системах in vitro [18, 19]. Однако надежная индукция и распространение тау-патологии очевидна у трансгенных мышей, экспрессирующих мутантные мутанты P301S (мыши PS19) после интрапанхимальной инъекции предварительно сформированных фибрилл (PFF), полученных из рекомбинантной мутантной формы P301L тау, состоящей только из четырех повторов связывания микротрубочек tau (K18PL), или из полноразмерного P301L tau [10, 20, 21]. Подобная, но менее прочная тау-патология и распространение были очевидны у трансгенных мышей дикого типа (WT) или тау, инъецированных экстрактами головного мозга у людей AD или тауопатии [9, 22]. Эти исследования показали, что тау-патология может быть индуцирована не только на месте неправильной инъекции тау, но и в синаптически связанных областях мозга, что указывает на передачу тау-патологии in vivo. Фактически, у трансгенной мыши тау, предназначенной для экспрессии мутантного P301L tau, особенно в энторинальной коре, наблюдался зависящий от возраста распространение тау-патологии в клетках первого порядка, синаптически связанных зубчатых гранулах в гиппокампе, что свидетельствовало о прямом синаптическом распространении тау патологии [23, 24]. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что транснейрональное поглощение и распространение трансмиссивных видов тау может приводить к патологии, приводящей к синаптическому и когнитивному дефициту в человеческих AD и связанных с ним тауопатиях.

Еще до разработки моделей передачи тау многие группы пытались определить способы нацеливания и уменьшения патологии в моделях тауопатии. Активная иммунизация пептидами, состоящими из конкретных областей белка тау, или пассивная иммунизация с использованием моноклональных антител, направленных на различные p-тау, конформационные или линейные тау-эпитопы, привела к уменьшению тау-патологии в моделях старения с избыточным экспрессией тау [25 -30], с некоторыми исследованиями, показывающими функциональное улучшение в двигателе [25, 28, 31] или когнитивные меры [27, 30]. Хотя эти исследования предполагают потенциальную роль для таутов с антителами в AD и других тауопатиях, остается неясным, связано ли возрастное развитие патологии с применяемыми трансгенными моделями с трансмиссивным распространением патологического тау и / или с разными скоростями клеток автономное развитие патологии. Более того, механизм (ы), с помощью которого антитела уменьшили тау-патологию в этих исследованиях, до конца не поняты; то есть, иммунизация может привести к уменьшению передачи, увеличению клеточного зазора или к тому же [32, 33]. Примечательно, что ни пассивные, ни активные исследования эффективности иммунизации не затрагивали прямое воздействие на передачу патологических тау.

Здесь мы провели оценку двух различных антител p-tau, нацеленных на сайты pT231 (PHF6) и pS396 (PHF13) для их связывания in vitro, а также их способности предотвращать индукцию тау-патологии в первичных культурах нейронов и в двух различные мышиные модели тауопатии. Как в модели индуцируемой tau over-expression модели rTg4510 индуцибельной тау, так и в модели индукции и распространения тау-патологии после введения TFF PFF в паренхиму мозга у мышей PS19 лечение антителами, нацеленными на p-tau, привело к значительному уменьшению видов тау и улучшенные функциональные характеристики в тесте распознавания новых объектов. Мы также определили влияние обработки антител на уровни CSF tau и p-tau и провели оценку системных воздействий на антитела, которые опосредуют эти эффекты in vivo. Эти данные являются важным доказательством эффективности тау-иммунотерапии как при экспрессионных, так и в передающих моделях тауопатии у мышей.

Аффинности антител измеряли с использованием системы Octet Red (Fortebio-Pall, CA), которая использует Bio-Layer Interferometry для анализа антител-антиген в реальном времени. Октатные красные стрептавидиновые зонды (Cat # 18-5019, Fortebio-Pall, CA), нагруженные биотинилированными фосфопептидами, использовали в качестве захватного пептида для антител PHF13 (анти-pS396 tau) и PHF6 (анти-pT231) соответственно. В качестве пептидов захвата использовали биотинилированный pS396-пептид (Biotin-HGAEIVYK-pS-PVVSGDT, aa 388-403) и биотинилированный pT231-пептид (Biotin-TREPKKVAVVR-pT-PPKSPSSAKSR, aa 220-240). Промывали промытые зонды, а затем связывание антител и вымывание для мониторинга ассоциации и кинетики диссоциации в диапазоне концентраций антител. Различные этапы включали: уравновешивание зонда (50 с), загрузку пептида (200-300 с), исходный сигнал после стадии промывки (100 с), ассоциацию антител (600 с) и диссоциацию (600 с) соответственно. Данные были обработаны после того, как базовая линией вычитания в пределах каждого зонд и изотип контрольного антитела в качестве опорного сигнала для определения ассоциации и диссоциации кинетики и выводит константу аффинности связывания (KD) соответствующих антител.

Первичные нейроны крысы, полученные из эмбриональных щенков 18-го дня, и культивировали в среде минимальной сущности с добавкой B27 в 96-луночных планшетах с покрытием из поли-d-лизина (Corning, NY). Нейроны были инфицированы адено-ассоциированным вирусом, несущим P301L T40 (2N4R) tau (Genedetect, FL) через 4 дня in-vitro (DIV). Затем нейроны DIV 7 обрабатывали либо 100 нМ K18PL tau PFF, либо растворимыми экстрактами головного мозга у 8-месячных мышей rTg4510 при разбавлении 3000X (эквивалент 1-5 нМ общего количества тау). Экстракты головного мозга были приготовлены, как описано в разделе «Методы» по экстракции мозга. Отрицательный контроль имел только медиа-дополнения без PFF. Для экспериментов с иммунодептированием экстракты мозга rTg4510 инкубировали в течение ночи с 30 нМ соответствующих антитау-антител, связанных с гранулами белка G. В DIV14 нейроны фиксировали 4% параформальдегидом в присутствии 0,1% TritonX100 для выделения детергент-нерастворимых агрегатов тау. Исправленные нейроны затем окрашивали для тау, используя конформационное антитело MC1 (моноклональное антитело мыши, любезно предоставленное д-ром Питером Дэвисом) и β3-тубулин-кроличьего поликлонального антитела (Covance). Нейроны были противопоставлены ядерному маркеру Hoechst, а Alexa 488 — мечеными антителами против мыши и антител против мыши и алекса 555 (Invitrogen, CA). Пластины были отображены с использованием системы Arrayscan (Thermo Scientific) и проанализированы с использованием алгоритма профилирования нейронов. Определяли смену интенсивности MC1 в нейритных процессах относительно необработанных колодцев. Определяли относительное изменение с и без иммунодеплектирования экстрактов rTg4510 с соответствующими антителами. Степень иммунодекуляции общего tau и p-tau определяли с использованием сэндвич-ELISA с HT7 в качестве захватного антитела и конъюгированных с щелочной фосфатазой BT2, PHF13 или PHF6 в качестве детектирующего антитела, как описано в разделе методов анализов Tau ELISA.

Экспрессию rTg4510 мыши, экспрессирующей мутантную форму человека 0N4R P301L человека tau, использовали для оценки влияния антитау-антител на возрастную патологию тау [34]. Мыши rTg4510 имеют два трансгена: активатор транскрипции с контролируемым тетрациклином (tTA), приводимый в действие Ca2 + / кальмодулин-зависимым протеинкиназой IIα-промотором и P301L-тау-трансгеном, приводимым в действие элементом, чувствительным к тетрациклину (TRE). Контрольные мыши или двойные отрицательные мыши (DN) не содержали ни tTA, ни трансгена P301L tau. В исследованиях по лечению использовались мышиные мыши rTg4510, которые демонстрируют устойчивую возрастную зависимую патологию тау в возрасте 3-6 месяцев. Мыши PS19, чрезмерно экспрессирующие изоформа T34 человека Tau (1N4R) с мутацией P301S под контролем мышиного прионного промотора [35], использовались во всех исследованиях патологии, вызванных Tau PFF [10]. Исследования PFF-инъекций проводились у мышей PS19 у мужчин, поскольку они проявляют более устойчивую патологию, чем женщины [36]. Мышей размещали с 6:00 A.M. до 6:00. свет / темный цикл и разрешал свободный доступ к пище и воде.

Все операции по обработке мышей, операции и послеоперационные процедуры в этом исследовании, выполненные в Bristol-Myers Squibb, были специально одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Bristol-Myers Squibb. Все операции по обработке мышей, операции и послеоперационные процедуры в этом исследовании, проведенные в Университете Пенсильвании, были специально одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Пенсильвании.

Укороченная форма человеческого тау, содержащего четыре MT-связывающих повтора, и мутация P301L (K18PL), с или без метки myc на 5′-конце, были получены из бактериального вектора экспрессии pRK172 [10]. Очищенный пептид K18PL был фибриллирован в присутствии гепарина, как описано ранее [19]. Устойчивый сигнал флуоресценции тиофлавина Т проявляется после фибриллизации, причем более 80% выделяется в нерастворимой фракции гранул после ультрацентрифугирования по сравнению с небриллизированным пептидом. Аликвоты K18PL PFF хранят замороженными при -80 ° C и обрабатывают ультразвуком до инъекции в мозг мышей PS19. Все операции по стероидальной терапии выполнялись в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом по уходу за животными и их использованием в Bristol-Myers Squibb (BMS) или Университетом Пенсильвании. Самцы мышей PS19 (2-6 месяцев) были иммобилизованы и глубоко анестезированы изофлурановым газом, связанным с носовым конусом, прикрепленным к стереотаксической системе (David Kopf Instruments, CA) или путем внутрибрюшинной (ip) инъекции гидрохлорида кетамина (1 мг / 10 г) и ксилазина (0,1 мг / 10 г). Для исследований, проведенных в BMS, стереотаксические инъекции проводили с помощью 10 мкл гамильтонового шприца с использованием иглы 30 калибра в асептических условиях только в гиппокампе (брегма, -2,0 мм, латеральная, + 1,6 мм и глубина -1,7 мм от поверхность мозга). Для исследований, проведенных в Университете Пенсильвании, протокол включал как гиппокампальные, так и корковые инъекции (брегма, -2,5 мм, латеральный, + 2 мм и глубина, -1,8 мм, с поверхности мозга) для гиппокампа, а затем инъекция при -0,8 мм в кору). Инъекции (2,5 мкл) либо K18PL PFF (2 мкг / мкл), либо PBS были сделаны во всех местах инъекции. Все введенные мыши наблюдались до тех пор, пока они не восстановились от анестезии, а анальгетик вводили один раз в день в течение 4 дней после операции. Хирургии были очень успешными без смертности во время 4-недельного лечения. Мышей оценивали в поведенческих анализах за последнюю неделю перед урожаем.

Клоны гибридомы PHF13.6 и PHF6.10 выращивали в 20-литровых культурах, а антитело очищали от супернатантов с использованием колоночной хроматографии на основе HeTrap с использованием системы очистки AKTA (GE Healthcare, NJ). Антитело элюировали, используя 0,1 М этаноламиновый буфер (рН 11,5) и сразу же нейтрализовали глициновым буфером (1 М глицин HCl, pH 2,5). Образцы концентрировали и заменяли буфер на PBS, а затем на фильтровальную стерилизацию 0,2 мкм. Уровни эндотоксинов были <0,5 единиц / мг.

Женским rTg4510 мышам вводили i.p. с 25 мг / кг PHF13.6, PHF6.10 или IgG2b (Bio X Cell, NH), один раз в неделю в течение 12 недель, от 3 до 6 месяцев. Животные были подвергнуты эвтаназии через 2 дня после окончательной дозы и плазмы, CSF и мозг были собраны для анализа.

K18PL PFF-инъецированные мыши PS19 дозировали, т.пл. с 30 мг / кг PHF13.6 или IgG2b, начиная со дня операции один раз в неделю, в общей сложности 5 инъекций в течение 4 недель. Мышей подвергали эвтаназии через 2 дня после окончательной дозы, а плазму и мозг собирали для анализа.

Мышей rTg4510 оценивали в поведенческих анализах через 11-12 недель после лечения антитау-антителами (~ 6 месяцев). Мышей PS19 тестировали в поведенческих анализах через 4 недели после инъекций K18PL PFF для сравнения влияния антитау-антител против лечения контрольным антителом. Все тесты проводились с ослеплением до лечения; различные операторы проводили дозирование in vivo и тесты на поведение. Неполадка была сделана после завершения поведенческого анализа.

Тревожное поведение оценивали с использованием теста с повышенным плюсом лабиринта. Лабиринт состоял из двух открытых и двух закрытых рук, поднятых на 65 см над землей. После акклиматизации в тускло освещенной комнате для тестирования в течение 60 мин мышей размещали на стыке между открытым и закрытым рукавами лабиринта и позволяли исследовать в течение 5 мин. После тестирования каждой мыши лабиринт очищали 70% этанолом. Расстояние, записи и время, проведенное в каждой руке, были записаны видеокамерой, установленной над лабиринтом, и проанализированы с использованием системы анализа Topscan (Cleversys Inc., VA).

Спонтанную активность измеряли с использованием автоматизированного монитора активности мыши TruScan (25 см в длину х 25 см в ширину и 40 см в высоту, Coulbourn Instruments, Аллентаун, шт. Пенсильвания), оснащенного системой фотобумаги 16х16, определяющей горизонтальные и вертикальные движения. После акклиматизации в испытательном помещении в течение 60 мин мышей индивидуально помещали в испытательную камеру и активность регистрировали в течение 15 мин. Данные собирали с частотой 2 Гц и усредняли в течение 1 мин. Аппарат очищали 70% этанолом после оценки каждой мыши. Общее количество движений (т. Е. Перемещение), выращивание и время, проведенное в центре и на периферии камеры, записывались автоматически для последующего анализа.

В качестве открытого поля использовались испытательные камеры из плексигласа (40 см в длину х 38 см в ширину и 20 см в высоту), в качестве тестовых изделий использовались объекты различной формы (каждый 7,5 см). Объекты размещались на расстоянии 10 см от стены по диагонально противоположным сторонам камеры. Мышей в течение 60 минут до тренировки проводили акклиматизацию в испытательной комнате. Обучение включало размещение мышей в тестовой коробке из плексигласа с двумя идентичными объектами и позволяя мышам исследовать коробку и предметы в течение 10 минут. Активность была записана с использованием служебных камер и проанализирована с помощью программного обеспечения TopScan (Cleversys Inc. Reston, VA). Для последующего анализа данных было записано количество подходов, время, затрачиваемое на изучение каждого объекта, и общее расстояние, пройденное в камере. Исследование было оценено положительно, если нос животного находился в пределах 1 см от объекта. Животные с общим временем исследования объектов менее 20 с во время тренировки были исключены в конечном счете. Арены и объекты очищали 70% этанолом между тестированием каждой мыши. Память распознавания была протестирована через час, причем каждую мышь возвращали в ту же камеру, снабжали знакомым и новым объектом и позволяли исследовать в течение 10 мин. Для последующего анализа данных было записано количество подходов, время, затрачиваемое на изучение каждого объекта, и общее расстояние, пройденное в камере. Для каждой мыши объекты и их местоположения были случайным образом назначены. Общая разведка в течение 10 минут была рассчитана на мышах PS19, тогда как в исследовании rTg4510 мышей более 5 минут анализировали из-за снижения общей активности после этого. Статистический анализ процента времени, потраченного на новый объект, использовал общий ANOVA, за которым следовал тест Бонферрони или t-тест против контрольного генотипа или контрольная терапия. Для оценки различий между новым и знакомым объектом внутри группы использовались парные t-тесты. Все анализы проводились в Prism (GraphPad, CA).

Животные были подвергнуты эвтаназии методами, одобренными Комитетом по уходу и использованию животных BMS или Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Пенсильвании. CSF собирали из цистерны магна сразу после сбора крови с помощью сердечной пункции [37]. Температура тела поддерживалась на нормальном уровне во время процедуры сбора с использованием нагревательных колодок. Цистерна-магна была обнажена, рассекая мышцы на задней части шеи, затем прорези прокололи иглой 30 калибра под рассекающим микроскопом, а CSF собрали с помощью пипетки P20. После центрифугирования при 1000 об / мин в течение 10 мин для удаления любых эритроцитов CSF замораживали на сухом льду в пробирках с низким содержанием белка в эппендорфе. Для исследований мыши PS19 мозг удаляли и фиксировали в свежеприготовленном 4% параформальдегиде (BMS) или в 10% нейтральном буферном формалине (Пенсильванский университет). Для исследований rTg4510 мозг был полупрозрачен, одно полушарие было зафиксировано, как указано выше, в то время как второе полушарие было разрезано для удаления гиппокампа, передней и задней коры и хранилось замороженное до анализа.

Уровни антител в плазме и CSF оценивали с использованием одностороннего ELISA-анализа, в котором использовали фосфорилированный пептид, конъюгированный с биотином, иммобилизованный на пластинке Нейтравидина, с последующим антителом против мышиного антитела, конъюгированным с щелочной фосфатазой. Для оценки уровней PHF13 в качестве захватного пептида использовали биотинилированный pS396-пептид (Biotin-HGAEIVYK-pS-PVVSGDT), соответствующий tau aa 388-403. Для оценки уровней PHF6 в качестве захватного пептида использовали биотинилированный пептид pT231 (Biotin-TREPKKVAVVR-pT-PPKSPSSAKSR), соответствующий tau aa 220-240. Образцы плазмы разводили при 1: 10000 до 1: 1 000 000, в то время как образцы СМЖ разводили при 1: 300 до 1: 1000. Нейтравидиновые пластины (Thermo Scientific, MA) покрывали 50 мкл соответствующего фосфопептида при 100-300 нг / мл и инкубировали при RT в течение 1 часа, трижды промывали PBS и блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре с PBS, содержащим 3% БС. После удаления блокатора добавляли 50 мкл стандартов и образцов, а затем через час конъюгированным с щелочной фосфатазой козьим антимышиным антителом. После часа инкубации при комнатной температуре планшеты трижды промывали PBS, содержащим 0,05% твин. После окончательной промывки планшеты удаляли сушкой и обрабатывали с использованием щелочного фосфатазного субстрата (T-2214, Life Technologies, CA) в течение 30 минут. Величины люминесценции измеряли с помощью считывателя планшета Envision (Perkin Elmer, MA). Сырые количества были лог-трансформированы, стандартные кривые были пригодны с использованием полинома 3-го порядка и неизвестных, преобразованных в концентрацию антител.

Растворимые и саркозил нерастворимые тау выделяли с использованием модификации ранее описанной процедуры [37]. Вкратце, гиппокампы гомогенизировали в буфере с высокой солью / сахарозой (10 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 800 мМ NaCl, 10% сахарозы (масса / объем), 1 мМ EGTA), дополненной наборами коктейлей ингибиторов фосфатазы I и II (Calbiochem, CA) , полный коктейль ингибитора протеазы EDTA-свободный (Roche, IN) и 1 мМ PMSF (Sigma, MO). Гиппокампи экстрагировали в холодном буфере (10X мас. / Об.) С использованием гомогенизатора Potter-Elvehjem. Экстракты затем центрифугировали при 20000 g в течение 20 минут при 4 ° C. Аликвоту растворимой фракции супернатанта (300-400 мкл) хранили замороженным при -80 ° С, в то время как медленнодействующий осадок отбрасывали. Оставшиеся 200 мкл супернатанта обрабатывали Sarkosyl (N-лауроилсаркозин, Sigma L-7414), доводили до 1% саркозила (об. / Об.) И инкубировали в течение 60 мин при 4 ° С с качанием. Этот экстракт затем центрифугировали при 100000 × g в течение 1 ч при 4 ° С и полученный нерастворимый в саркозиле осадок промывали с использованием большого раствора соли / сахарозы и повторно центрифугировали. Затем этот осадок ресуспендировали в 200 мкл 50 мМ Трис-HCl, буфера с рН 7,4, содержащего 2,3% SDS, 1 мМ EGTA, 1 мМ ЭДТА, дополненного наборами коктейлей ингибитора фосфатазы I и II (Calbiochem, San Diego, CA), полной протеазой ингибиторный коктейль EDTA-free (Roche, Indianapolis, IN) и 1 мМ PMSF (Sigma, St. Louis, MO). Осадок обрабатывали ультразвуком на водяной бане в течение 30 минут при комнатной температуре и аликвоты хранили замороженными при -80 ° С. Это состояло из нерастворимой в Саркозиле фракции.

Экстракты головного мозга оценивали на общие уровни tau и pS202 / pT205 tau, тогда как CSF оценивали на общие уровни tau и pT181 tau. В общих тестах tau и p-tau использовали следующие мышиные моноклональные антитела (все от Thermo Scientific, MA); HT7 (aa 159-163, MN1000), BT2 (aa 194-198, MN1010), клон AT8 (pS202 / pT205, MN1020), клон AT270 (pT181, MN1050). Определение общих уровней таула головного и CSF использовало ELISA-анализ с использованием HT7 в качестве захватного антитела с последующим детекцией с антителом, специфичным к щелочной фосфатазе BT2 [38]. Мозг pS202 / pT205 оценивали с помощью ELISA, содержащего антитело к захвату HT7 с последующим детектированием с антителом AT8 с щелочной фосфатазой. CSF pT181 tau оценивали с использованием ELISA, содержащего антитело к захвату HT7 с последующим обнаружением с антителом AT270 с конъюгированной с щелочной фосфатазой [38]. Антитело захвата HT7 использовали во всех анализах в концентрации 1-2,5 мкг / мл, тогда как антитела обнаружения были непосредственно конъюгированы с щелочной фосфатазой (AP) (Novus Biologicals, CO).

Черные 96-луночные планшеты (Corning-Costar 3925) покрывали 100 мкл соответствующих захватных антител в бикарбонатном буфере (рН 9,4) (# 28382, Thermo Scientific, MA) в течение ночи при 4 ° C. На следующий день планшеты четыре раза промывали PBS Dulbecco (Ca & Mg) и затем блокировали 3% BSA / DPBS в течение по меньшей мере 3 часов при комнатной температуре (RT) или в течение ночи при 4 ° C. Для полного тау-ELISA для определения относительных уровней мозгового тау использовали рекомбинантный пептидный стандарт Tau441 (rPeptide, Bogart, GA). Для ELISA HT7-AT8 был синтезирован пользовательский стандарт, содержащий последовательность тау от aa 153-211, с фосфорилированными сайтами S202 и T205. Для ELISA HT7-pT181 tau был синтезирован стандарт, содержащий aa 155-207 of tau, с сайтом T181, фосфорилированным. Стандарты были подготовлены в PBS, дополненном 0,1% BSA и 0,05% Tween. Образцы мозга и CSF были разбавлены, поэтому сигнал находился в середине линейных диапазонов для соответствующих анализов. Стандарты и образцы головного мозга или CSF добавляли в двух экземплярах при 50 мкл / лунку с последующим конъюгированием с AP-антителом (50 мкл / лунку) в 3% BSA / PBS с 0,2% Tween 20. После инкубации в течение ночи при 4 ° C пластины промывали четыре раза при комнатной температуре с помощью PBS, содержащего 0,05% Твин. После последней промывки планшеты были разработаны с использованием 100 мкл субстрата щелочной фосфатазы (T-2214, Life Technologies, CA) в течение 30 минут. Величины люминесценции измеряли с помощью считывателя планшета Envision (Perkin Elmer, MA). Исходные значения были лог-трансформированы, стандартные кривые были пригодны с использованием полинома 3-го порядка и неизвестных, преобразованных в соответствующую концентрацию tau или p-tau. Уровни мозгового тау и п-тау были исправлены и нормированы на вес мозга до дальнейшего анализа. Все графики и статистика были выполнены с помощью программного обеспечения Prism (GraphPad, CA).

Для исследований, проведенных в BMS, ткань головного мозга откладывалась в 4% параформальдегиде (PFA), обрабатывалась через 15% и 30% сахарозы и разрезалась на горизонтальных участках по 40 мкм с использованием скользящего микротома. Секции фиксировали в 3,7% формальдегиде в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) в течение 10 минут и промывали PBS. Эндогенную пероксидазную активность удаляли инкубацией в 3% перекиси водорода / 10% метаноле в PBS в течение 30 минут. После промывки в PBS слайды блокировали в 10% нормальной сыворотке коз / 0,3% Triton X-100 в PBS в течение одного часа. Разделы окрашивали антителом против pS202 / pT205 tau (мышиный IgG мыши AT8-биотина, 1: 1000, Thermo Scientific, Rockford, MD), конформационное тау-антитело MC1 (1: 10 000 мышиных IgG, добрый подарок от доктора Питера Дэвиса), антитело против Iba-1 (мышиный IgG, 1: 60 000, Wako Chemicals USA, Richmond, VA) или антитело против глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) (поликлональное кроличье анти-GFAP, 1: 20000, Dako, Carpinteria , CA). Разделы окрашивали антителами, разведенными в блокирующем растворе в течение ночи при 4 ° С, промывали PBS и затем инкубировали либо с биотинилированным антителом против мышиного, либо против кроликов (Vector Labs, Burlingame, CA), за исключением случая AT8-биотина , в течение 1 часа при комнатной температуре. Слайды были разработаны с использованием набора Vectastain ABC Elite Kit (Vector Labs, Burlingame, CA) в течение 1 часа с последующим обнаружением с помощью диаминобензидинового реагента с интенсификацией никеля. Ядра контрастировали с пятном гематоксилин-эозин.

Для исследований, проведенных в Университете Пенсильвании, мозг фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине (NBF) и хранили в течение ночи при 4 ° С. Чтобы избежать чрезмерного префиксации, NBF промывали из ткани головного мозга на следующий день путем обмена 3 раза в течение 1 часа в 50 мМ Трисе, содержащем 150 мМ NaCl. Каждый мозг разрезали на 2 мм корональные срезы перед введением парафина (Thermo-Shandon). Вложенную ткань разрезали на 6 мкм корональные секции с помощью скользящего микротома и сушили в течение ночи в печи при 42 ° C. Разделы были окрашены в серии 1-в-5. Разделы депарафинировали в ксилоле и регидратировали в нисходящей серии этанола. Активность эндогенной пероксидазы прекращали с использованием метанола / пероксида водорода (150 мл метанола + 30 мл 30% перекиси водорода) в течение 30 мин, затем промывали 10 минут в проточной воде и погружали в 0,1 М Tris pH 7,6 буфер. Слайды блокировали в течение 5 минут в 2% фетальной бычьей сыворотке в 0,1 М Tris pH 7,6 буфера и инкубировали с АТ8 (1: 10000) или MC1 (1: 7000) антителами, разведенными в блокирующем буфере в течение ночи при 4 ° С. Остальную процедуру окрашивания проводили на следующий день с использованием метода обнаружения небиотин-полимера-HRP с реагентом диоаминобензидина (DAB) и миером гематоксилинов Myers (Biogenex).

Для исследований, проведенных в Bristol-Myers Squibb, секции мозга, смонтированные на стеклянных слайдах, были отображены с использованием вертикального микроскопа Nikon E800 или Leica DM6000, оснащенного моторизованной ступенью XYZ (Prior Scientific, MA). Система формирования изображения использовала цвет QiCam, камеру с защитой от пожара, чтобы получить изображения (QImaging, Canada). Микроскоп, каскад и камера контролировались через карту Oasis PCI с использованием программного обеспечения Surveyor (Objective imaging, Cambridge, UK). Параметры автофокуса были настроены с использованием четырех сайтов / секции мозга, а затем предсказательной автофокусировки во время захвата изображения. Это позволило визуализировать весь слайд секций головного мозга с оптимальным фокусом, обычно 1-2 минуты / слайд. В этом исследовании было проанализировано ~ 2 слайда от каждого животного, каждый из которых состоял из 7-10 горизонтальных секций головного мозга в общей сложности 14-20 секций на животное. Все слайды из исследования были отображены с использованием одинаковой мощности освещения и экспозиции камеры. Кроме того, для каждого изображения были применены соответствующие корректировки оттенков и цветового баланса. После получения изображения для каждого животного были идентифицированы разделы мозга, содержащие области гиппокампа и энторинальной коры (ЕС), и изображения, экспортированные для анализа. Регионы гиппокампа были выбраны из верхних и нижних областей горизонтальных участков головного мозга (Bregma: от -1,2 до -3,3 мм, Interaural: от 4,6 до 2,5 мм, горизонтальный мозговой атлас) [39], тогда как медиальные и боковые области мозга EC были выбраны из нижнего мозга регионы (Брегма: от -2,2 до -3,8 мм, межобъемный: от 3,6 до 2,2 мм, горизонтальный атлас мозга) [39]. Затем изображения из отдельных разделов мозга анализировались с использованием пользовательских макросов, написанных в программном обеспечении Imagepro Plus (Media Cybernetics, MD). Идентичные настройки порога были использованы во всех изображениях для определения положительно окрашенных областей. Очертания были сделаны вокруг ипси и контралатерального гиппокампа и / или ЕС, чтобы ограничить анализ изображений в этих регионах. Для гиппокампа общая площадь, занимаемая AT8 или MC1, и в EC, общее количество клеток и площадь, занимаемая окраской AT8 или MC1, определяли количественно по меньшей мере от 4-5 разделов мозга на животное.

Для исследований в Университете Пенсильвании были получены изображения из пяти секций серии 1 в 5 из переднего гиппокампа каждой мыши (приблизительно от -2,0 до 2,5 мм от Брегмы) при 4-кратном увеличении с использованием микроскопа Olympus DP71. Анализ выполнялся с использованием программного обеспечения ImageJ, где каждое изображение было преобразовано в 16-битное черно-белое изображение и впоследствии порождено с использованием опции MaxEntropy. Область, занятая иммуноокрашиванием после порога, определялась с использованием программного обеспечения Image J.

Статистические вычисления выполнялись с использованием GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния). Различия в конечных точках между обработкой и контрольной группой изучались с использованием непарного двухстороннего студенческого t-теста. В экспериментах, где было более 2 групп лечения, значение по сравнению с соответствующей группой контроля определяли с использованием ANOVA с последующим тестом Dunnett. В экспериментах с повторными сравнениями, такими как NOR, парные t-тесты проводились во времени, проведенном на знакомых и новых объектах.

Для оценки в первичной нейронной модели формирования включения тау были отобраны две различные р-тау-антитела, нацеленные на pT231 (PHF6) и pS396 (PHF13). Эти антитела были получены в результате иммунизации с помощью парных спиральных нитей тау, полученных из головного мозга АД, и продемонстрировали надежную маркировку патологического тау [40, 41]. Антитела демонстрируют сопоставимые скорости ассоциации на иммобилизованные пептиды, содержащие соответствующий эпитоп p-тау, но PHF6 демонстрирует ~ 3-кратную более высокую константу скорости диссоциации, чем PHF13 (фиг.1A и 1B). Вычисленное сродство PHF13 составило 1,6 нМ, тогда как PHF6 составляло 3,9 нМ.

A. Кинетика ассоциации и диссоциации антитела PHF6 и антитела PHF13. В таблице приведены расчетные скорости ассоциации, скорости диссоциации и значения KD для PHF6 и PHF13. Вертикальные пунктирные линии демаркируют, слева направо — пептидную нагрузку, промывку / уравновешивание, ассоциацию антител и диссоциацию антител. B. Репрезентативные изображения от окрашивания Тритон-нерастворимого MC1 первичных нейронов, которые не получали PFF-обработки (PFF), обработки 100 нМ K18PL PFF (+ PFF), экстракта мозга rTg4510 (Tg4510) или экстракта головного мозга tTA (tTA). C. Изменение интенсивности окрашивания, нерастворимой в тритоне, в первичных нейронах, обработанных как в В, относительно необработанных культур (n = 6 лунок / состояние, ANOVA с тестом Dunnett против лечения). D. Иммуноделение экспрессии rTg4510 с PHF6 или PHF13 приводило к значительному снижению содержания нерастворимого в тритоне MC1 (красный бар) в нейронах по сравнению с контрольным антителом (ANOVA с тестом Dunnett против контрольного IgG). Также показаны общие уровни tau (черный стержень) и p-tau (синяя полоса), измеренные ELISA после иммунодеплета (* p <0,05, *** p <0,001, n = 3 на группу).

Антитела оценивали в модифицированной версии ранее описанной первичной нейронной модели индукции тау, при которой tau PFF-обработка сверхэкспрессирующих нейронов P301S tau приводит к увеличению деградации нерастворимых агрегатов тау, которые являются положительными для p202 / p205 tau (признанные антителом АТ8) и неправильным tau (признанным MC1-антителом) [16]. Первичные нейроны эмбриональных 18-й крысиных щенков инфицировали в течение 4 дней in vitro (DIV) адено-ассоциированным вирусом, несущим полноразмерную тау-конструкцию P301L. Устойчивое 30-кратное увеличение окрашивания МС1 наблюдалось как в клеточных телах, так и в нейритах после экстракции и фиксации клеток Triton X100 через 7 дней после лечения 100 нМ K18PL PFF (рис. 1B и 1C, p <0,001). Обработка растворимым экстрактом головного мозга, полученная от 8-месячных мышей rTg4510, которые содержали существенную тау-патологию, также привела к устойчивому увеличению положительного T1-окрашивания, не содержащего тритонов, (1B и 1C, p <0,001). Этот эффект не наблюдался, когда культуры нейронов обрабатывали мозговыми экстрактами от контрольных (tTA) мышей (фиг.1В и 1С). Эти результаты показывают, что нерегулярные виды тау, либо как синтетические фибриллы, либо из экстрактов головного мозга rTg4510, могут индуцировать патологию тау в первичном нейроне, чрезмерно выражающем мутантный тау.

Способность PHF6 и PHF13 предотвращать индукцию тау-патологии гетными экстрактами rTg4510 была впоследствии оценена в модели первичных нейронов. Экстракты мозга rTg4510 были иммунодептированы с использованием 30 нМ контрольных антител (26D6, анти-Aβ), PHF13 или PHF6, а затем не связанные фракции из экстрактов головного мозга тестировались на их способность индуцировать патологию в первичной нейронной системе. Иммуноделение pS396 tau с PHF13 и pT231 tau с PHF6 приводило к снижению окрашивания, не содержащего тритонов MC1, на 30-45% по сравнению с контрольным антителом (фиг.1D, PHF6 p <0,05, PHF13 p <0,001). Снижение на 30-40% соответствующих уровней p-tau (pT231 для PHF6 и pS396 для PHF13) и небольшое снижение общих уровней тау были очевидны с помощью ELISA (рис. 1D). В совокупности эти результаты показывают, что иммунодекуляция тау, содержащая эпитопы pT231 или pS396 из мозговых экстрактов, содержащих патологические тау, может уменьшить индукцию нерастворимых включений тау в первичных нейронах и предположить, что эти антитела могут ингибировать передачу тау in vivo.

Поскольку антитела PHF6 и PHF13 уменьшали образование включения тау в тау-экспрессирующих первичных нейронах, которые были засеяны экстрактами мозга rTg4510, было установлено, что эти антитела могут быть способны ослаблять развитие патологических тау-разновидностей у мышей rTg4510. В ожидании этих исследований мы оценивали окрашивание AT8 p-tau и уровни tau и p-tau в растворимых и нерастворимых экстрактах головного мозга, а также в CSF в зависимости от возраста у мышей rTg4510. Значительное возрастающее увеличение окраски АТ8 наблюдалось от 3 до 6,5 месяцев (рис. 2А). У 3-месячных мышей окрашивание АТ8 проявлялось в коре с минимальным окрашиванием в гиппокампе, которое было локализовано в клеточных телах в области CA3. В возрасте 6 месяцев интенсивное окрашивание АТ8 было очевидным в коре, наряду с обширной соматосендритной маркировкой в ​​областях СА3 и СА1 гиппокампа (рис. 2А).

A. окрашивание AT8 p-tau в 3-и 6-месячных сегментах мозга rTg4510. Шкала шкалы = 500 мкм. БЫТЬ. Возраст-зависимое изменение в растворе растворимого полного тау, C. hippocampal растворимого AT8 p-tau, D. hippocampal нерастворимого полного tau и E. hippocampal нерастворимого AT8 p-tau. Индивидуальные сравнения были сопоставлены с 3,5-месячными мышами, использующими ANOVA с пост-hoc-тестом Dunnett (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; n = 7-11 на группу). F. Растворимые уровни H4-Hypocampal AT8, нормированные на общие уровни tau, коррелировали с оценками окраски AT8 от иммуногистохимии (R2 = 0,51, p <0,001).

Суммарные уровни tau и p-tau в гиппокампе у мышей rTg4510 определяли количественно в зависимости от возраста с использованием количественных ELISA. Небольшое, но значительное снижение (~ 20%) в разрешаемом мозге суммарном тау было очевидным в возрасте 6,4 месяцев по сравнению с 3,5-месячным возрастом, как было описано ранее [34, 37] (рис. 2B, p <0,05). Для оценки уровня мозгового AT8 p-tau был разработан специфический и чувствительный ELISA (S1 Fig). Значительное возрастное увеличение уровней растворимого АТ8-тау было очевидным в возрасте 5,2 и 6,4 месяцев по сравнению с 3,5-месячным возрастом (37%, p <0,01 и 59%, p <0,001) соответственно, на рис. 2C). Увеличение как общего tau, так и AT8 p-tau наблюдалось с возрастом в детергент-нерастворимых экстрактах головного мозга (рис. 2D и 2E). В то время как нерастворимый общий тау показал увеличение на 10-20% в возрасте от 3 до 6 месяцев (рис. 2D), уровни нерастворимого в мозге уровня AT8 p-tau увеличивались в два раза в возрасте 5-6 месяцев по сравнению с 3-месячными мышами (Фиг. 2Е, р <0,01). Мы также наблюдали значительную корреляцию между относительным окрашиванием АТ8 с помощью IHC и уровнями растворимого АТ8, нормированными на общее тау у отдельных мышей rTg4510 с возрастом (рис. 2F; R2 = 0,51, p <0,001). Эти результаты демонстрируют устойчивое возрастающее увеличение уровней мозгового AT8 p-tau, одновременно с увеличением патологии AT8.

Уровни CSF tau также были исследованы у мышей rTg4510, и увеличение общего значения CSF tau и p-tau наблюдалось как мышей в возрасте (рис. 3A). Увеличение в 2 раза было очевидным у 5,2 против 3,5 месяцев, без дальнейшего увеличения в возрасте 6,4 месяцев, в соответствии с предыдущими результатами [37] (5,2 мес p <0,01, 6,4 моль p <0,05). У пациентов с АД повышение уровня CSF pT181 и общих уровней тау было доказано как ранний биомаркер начала и прогрессирования заболевания [42]. Таким образом, мы разработали чувствительный ELISA pT181 tau ELISA для измерения p-tau от старших мышей rTg4510 и для оценки влияния обработки антител p-tau (S2 Fig [38]. 2-кратное увеличение уровней CSF pT181 tau наблюдалось в более ранние мыши rTg4510 (фиг. 3B, 5.2 мес p <0,001, 6,4 моль p <0,001), при этом уровни CSF pT181 tau сильно коррелировали с полными тау-уровнями CSF (фиг. 3C, R2 = 0,86, p <0,001). Общее количество CSF tau и pT181 tau также показали корреляцию с растворимым в мозге AT8, нерастворимым в мозге AT8-тау и нерастворимым в мозге общим tau (таблица 1). Кроме того, уровни растворимого в мозге AT8 tau коррелировали с растворимым в мозге и нерастворимым общим тау и нерастворимыми уровнями AT8 tau (таблица 1 ). Эти результаты демонстрируют возрастающее увеличение растворимого и нерастворимого АТ8-тау в мозге мыши rTg4510, что связано с увеличением общих уровней тау и pT181 tau в CSF.

Возраст-зависимое увеличение A. total tau и B. pT181 tau наблюдается в CSF у мышей rTg4510. Индивидуальные сравнения против 3,5-месячных мышей с использованием ANOVA с пост-hoc-тестом Dunnett (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; n = 7-11 на группу). C. Общее количество CSF было сильно коррелировано с CSF pT181 tau (R2 = 0,86, p <0,001).

Антитела PHF6 и PHF13, которые вызвали снижение тау-патологии в первичных нейронах (фиг. 1E), были оценены у мышей rTg4510, чтобы определить, могут ли они изменять уровни мозга или CSF tau или p-tau. Мышей rTg4510 обрабатывали антителами с контролем изотипа PHF13, PHF6 или IgG2b при 25 мг / кг внутрибрюшинно. один раз в неделю, начиная с 3 месяцев до 6 месяцев. Анализ уровней PHF13 и PHF6 в плазме после 12 недель дозирования выявил 100-500 мкг / мл (0,7-3,5 мкМ), тогда как уровни антител CSF находились в диапазоне 150-500 нг / мл (1-3,5 нМ) (суммированы в Таблица 2). Отношение CSF / плазмы составляло ~ 0,2%, что соответствовало воздействию CSF на антитела в исследованиях человека [43].

Хотя лечение PHF13 или PHF6 не приводило к значительным изменениям в разрешаемом мозге тотальном тау (рис. 4А), значительное снижение разрешающего способность мозга AT8 tau наблюдалось после обеих обработок антителом (фиг. 4B, PHF13 p <0,05, PHF6 p <0,01) , Никаких существенных изменений не было обнаружено ни в отношении нерастворимого общего tau, ни AT8 p-tau после лечения PHF13 или PHF6 (фиг. 4C и 4D). В соответствии с отсутствием изменений в нерастворимом AT8 p-tau существенных изменений не наблюдалось при иммуноокрашивании AT8 в мозге мышей rTg4510 (S3 Fig). Мы также оценили группу генов, содержащих микроглиальные и иммунные маркеры с помощью ОТ-ПЦР. Возрастное и гендерно-зависимое увеличение различных маркеров было очевидным у мышей rTg4510, но никаких существенных изменений в этих генах не наблюдалось при лечении PHF6 или PHF13 (таблица S1).

Влияние PHF-13 и PHF-6 (25 мг / кг внутрибрюшинно) на A. hippocampal растворимое общее количество тау; B. hippocampal растворимый AT8 (p202 / p205) tau; C. hippocampal нерастворимый общий тау; D. hippocampal нерастворимый AT8 tau; E. CSF общее количество тау; и F. CSF pT181 tau. Данные анализировали с помощью ANOVA с пост-фокусными сравнениями с обработанными IgG2b мышами с использованием теста Dunnett (* p <0,05, ** p <0,01, n = 14-18 / группа). Красные пунктирные линии указывают уровни тау в начале лечения (3-месячный возраст). G. Влияние п-тау-антител на эффективность НОР. Общее время, затрачиваемое на новый (заполненный бар) и знакомые объекты (открытый бар), нанесено на каждую группу лечения. DN представляет собой двойную отрицательную (-tTA и-tau) мышей. Статистические сопоставления времени, затраченного на новые и знакомые объекты для каждого животного в группе, проводились с использованием парного Т-теста. (DN, p <0,05, IgG2b p = 0,8, PHF13, p <0,05, PHF6, p <0,01, n = 6-8 / группа).

Интересно отметить, что значительное снижение общего количества тау у CSF было получено обработкой PHF13 (p <0,05), с тенденцией к снижению у мышей, обработанных PHF6 (рис. 4E). Значительное снижение уровней CSF pT181 tau наблюдалось также в группах лечения PHF13 и PHF6 (фиг. 4F, PHF13 p <0,05, PHF6 p <0,01). Снижение разрешающей способности мозга AT8 p-tau и общее количество тау и p-тау CSF у мышей, получавших PHF6 и PHF13, на 20-40% уменьшало возрастное увеличение этих маркеров, наблюдаемое у контрольных мышей от 3 до 6 месяцев (уровни при начале лечения, обозначенные красными пунктирными линиями на рис. 4). Снижение уровня растворимых в мозге уровней AT8 p-tau и уровней CSF pT181 tau не было вызвано прямой интерференцией антител PHF13 или PHF6 в соответствующих анализах p-tau, так как эти антитела не влияли на показания ELISA при экспозиции более 10x CSF уровни (S4, S5 и S6 Рис.).

Известно, что мыши rTg4510 развивают когнитивные дефициты в зависимости от возраста, и есть данные, что олигомерные виды тау могут влиять на обучение и память у этих мышей [34]. Несмотря на отсутствие существенных различий в уровнях нерастворимого тау в мозге мышей rTg4510, обработанных PHF6- и PHF13, снижение растворимого AT8 p-tau в головном мозге и общее tau и p-tau в CSF предполагало возможность что растворимые патогенные виды тау могут быть снижены путем лечения антителами и показывают функциональные преимущества. Поэтому мы оценили NOR у мышей rTg4510, обработанных IgG2b, PHF6 и PHF13, и сравнили их с мышами DN. Мыши rTg4510, обработанные IgG2b, не показали разницы во времени, потраченном на новые и знакомые объекты, демонстрируя дефицит в обучении по сравнению с контрольными мышами DN, которые проводят значительно больше времени, исследуя новый объект (p <0,05; рис. 4G). Обработка PHF13 и PHF6 приводила к улучшению общего времени, затрачиваемого на новый объект, по сравнению со знакомым объектом (рис. 4G, PHF13 p <0,05, PHF6 p <0,01), при этом производительность приближалась к характеристике мышей DN. Мы также тестировали животных в анализе локомоторной активности и лабирине с повышенным плюсом. В то время как мыши rTg4510 проявляли большую локомоторную активность и проводили больше времени на открытых плечах лабиринта с повышенным плюсом по сравнению с мышами DN, существенное влияние обоих антител на эти конечные точки не наблюдалось (данные не показаны). В совокупности эти результаты показывают, что лечение мышей rTg4510 либо антителом PHF6, либо PHF13 приводит к значительному уменьшению растворимого мозга AT8 и CSF tau с функциональным улучшением памяти NOR.

Растущее количество доказательств показывает, что развитие и распространение тау-патологии можно существенно ускорить трансгенными мышами тау путем инъекции гомогенатов головного мозга, полученных из тау-трансгенных мышей с существующими NFT-подобными включениями [9]. Эти исследования подтвердили гипотезу о том, что тау-патология может передаваться от одного нейрона к другому, возможно, через существующие нейронные сети. Через месяц после интрагиппокампальной инъекции KFFPL PFF в молодых мышей PS19 [35] значительное увеличение антител p-tau (антитело AT8) и иммуноокрашивание эмбрионами tau (MC1) проявлялось как в ипсилатеральном, так и в контралатеральном гиппокампе и на двусторонней основе в EC и locus coeruleus [10], в возрасте, когда обычно нет патологии p-tau. Эти данные свидетельствуют о том, что тау-патология распространяется на районы, удаленные от места инъекции PFF. Поэтому мы использовали эту модель патологической индукции и передачи тау для проверки последствий иммунотерапии PHF13 по тау-патологии и памяти распознавания новых объектов.

Чтобы дополнительно охарактеризовать эту модель до использования в исследованиях иммунотерапии, мышам PS19 вводили 5 мкг KFFPL PFF в гиппокамп в возрасте 2,5 месяцев, а ткани собирали 4 недели спустя. Наблюдалось достоверное распространение патологии AT8 через разные области мозга относительно места инъекции PFF (S7 Fig) со значительной патологией AT8 tau в ипсилатеральном и контралатеральном гиппокампе в верхней горизонтальной плоскости (Bregma -1,8 мм, Interaural 4,0 мм , горизонтальный мозговой атлас [39]) (рис. 5А). Никакая патология AT8 или MC1 не была очевидна у животных, которым вводили PBS (S7 Fig). В более низкой горизонтальной плоскости (Bregma -3,3 мм, Interaural 2,5 мм) интенсивное окрашивание AT8 проявлялось в ипсилатеральном и контралатеральном гиппокампе и в двусторонней коре хвоста (EC) (рис. 5B). Надежное тело клетки и некоторое нейритическое окрашивание были очевидны в CA3 и в областях CA1 ипсилатерального гиппокампа с соответствующей, но меньшей интенсивностью в контралатеральных областях CA3 и CA1. Окрашивание АТ8 наблюдалось в слоях 2/3 нейронов в медиальном и боковом EC на двусторонней основе (рис. 5B). В дополнение к EC, различное окрашивание AT8 проявилось в боковых и медиальных септальных ядрах вдоль средней линии (рис. 5B). Мы количественно оценивали tau патологию, оценивая как площадь, занимаемую окрашиванием AT8, так и количество клеток, положительное для окрашивания AT8 в гиппокампе и EC (S7 Fig). Общая площадь, занимаемая AT8, была в 5 раз больше в ипсилатеральном гиппокампе по сравнению с контралатеральным гиппокампом (рис. 5C, p <0,05). Аналогично, площадь, занимаемая иммунореактивностью AT8, была в 5-10 раз выше в ипсилатеральном гиппокампе по сравнению с ипсилатеральным EC (рис. 5C, p <0,05). Как количество клеток, положительных для АТ8, так и площадь, занимаемая окрашиванием АТ8, была значительно больше в ипсилатеральной ЭК по сравнению с контралатеральной ЕС (рис. 5С и 5D, р <0,01). Эти результаты показывают надежное распространение Tau-патологии K18PL, основанной на PFF, от гиппокампа до EC, контралатерального гиппокампа и других отдаленных областей мозга.

K18PL PFF вводили в гиппокамп, а мышей оценивали через 4 недели. A. Надежное гиппокампальное окрашивание AT8 на ипсилатеральной (Ipsi) стороне инъекции PFF и на противоположной противоположной стороне (Contra) в верхней горизонтальной плоскости. Правые панели показывают увеличенные виды ипсилатерального и контралатерального гиппокампа. Шкала шкалы составляет 500 мкм. B. Различное окрашивание АТ8 в гиппокампе (H) и в энторинальной коре (EC) в областях, уступающих сайту инъекций PFF. Правые панели показывают увеличенные виды ипсилатерального и контралатерального гиппокампа и EC. Шкала шкалы составляет 500 мкм. C. Площадь, занятая иммуноокрашиванием AT8 p-tau на ипсилатеральной и контралатеральной сторонах гиппокампа и EC. D. Тело клетки считается положительным для AT8 p-tau на ипсилатеральной и контралатеральной сторонах гиппокампа и EC. Статистический анализ в C. и D сравнивал все группы с ипсилатеральным гиппокампом, местом инъекции PFF, с помощью ANOVA, а затем с тестом Даннета (* p <0,05, ** p <0,01). E. Влияние генотипа и инъекций PFF на новые характеристики распознавания объектов. Общее время, затрачиваемое на новый (заполненный бар) и знакомые объекты (открытый бар), нанесено на каждую группу лечения. Различные группы включали WT, наивные (неинъекционные) и PBS-или K18PL PFF-инъекционные мыши PS19. Статистические сопоставления времени, затраченного на новые и знакомые объекты для каждого животного в группе, проводились с использованием парного Т-теста. (** p <0,01; n = 8-14 / группа).

Анализ CSF у мышей PS19, инъецированных PFF с P18, показал небольшое, но статистически достоверное увеличение тау по сравнению с мышами, инъецированными PBS (S8 Fig). Отсутствие надежного увеличения CSF tau у мышей, инъецированных PFF-инъекцией K18PL, как мы видели у пожилых Tg4510-мышей (рис. 3), вероятно, связано с большей степенью общей церебральной тау-патологии у более старых мышей Tg4510 по сравнению с более регионально-ограниченная тау-патология, наблюдаемая у молодых мышей PS19, которые были инфицированы KFFPL PFF.

Влияние на когнитивные характеристики, вызванное быстрым началом гиппокампальной и патологической патологии ЕС после введения K18PL PFF молодым мышам PS19, оценивали с использованием теста NOR. Подходящие по возрасту однопометники WT из когорты PS19 показали значительно большее время, затрачиваемое на изучение нового объекта по сравнению с знакомым объектом (рис. 5Е, р <0,01). Аналогично, наивные и PBS-инъецированные мыши PS19 показали предпочтение новым исследованиям объектов в этом возрасте (рис. 5Е, р <0,01). Напротив, мышей PS19, инъецированных PFF, были нарушены и не показали разницы во времени, затрачиваемом на роман против знакомого объекта (рис. 5Е). Эти результаты показывают, что индукция и распространение тау-патологии после инъекции K18PL-PFF в кору и гиппокамп у молодых мышей PS19 привели к функциональному дефициту в NOR.

Степень и распределение тау-патологии, которая наблюдалась у молодых мышей PS19 после инъекции K18PL PFF в сочетании с полученным дефицитом в NOR, подтвердили, что эта модель может быть полезной при оценке эффективности антител p-tau в аннулировании распространения патологический тау. Молодые 2-3-месячные мыши PS19, таким образом, обрабатывали PHF13 или IgG2b при 30 мг / кг внутрибрюшинно. в течение 4 недель, начиная со дня инъекций K18PL PFF (в общей сложности 5 доз) для оценки воздействия лечения на патологию тау и эффективность в задаче NOR. Следует отметить, что антитело PHF13 не взаимодействует с PFF K18PL, которые используются для индуцирования патологии мозга у мышей PS19, поскольку этот рекомбинантный белок не содержит эпитоп pS396. Таким образом, лечение PHF13 не должно препятствовать первоначальному посеву тау-патологии в нейронах, которые могли бы интернализировать введенные K18PL PFF. Уровни плазмы PHF13, измеренные во время жертвоприношения, находились в диапазоне 1-2 мкМ, тогда как уровни CSF PHF13 составляли 1-2 нМ (таблица 2). Надежное увеличение патологии Hippopampal AT8 tau проявилось как у мышей, обработанных IgG2b, так и у PHF13, причем ипсилатеральная патология в 3-5 раз выше, чем у контралатеральной стороны (рис. 6A). Не было обнаружено существенных различий между группами лечения PHF13 и IgG2b в области, занимаемой в ипсилатеральной или контралатеральной области гиппокампа, занятой иммуноокрашиванием AT8 (фиг. 6A). Общее количество AT8- и MC1-положительных клеток было получено как от ipsi, так и от контралатерального EC, поскольку они представляют собой сайты с распространением тау-патологии после инъекции PFF. Значительное снижение AT8 (p <0,05) и положительных показателей MC1 (p <0,01) было очевидным в EC после лечения PHF13 по сравнению с группой IgG2b (фиг. 6B и 6C). Эти результаты демонстрируют снижение распространения тау-патологии от гиппокампа до EC после лечения PHF13. Было также оценено влияние лечения PHF13 на NOR; Обработанные PHF13 мыши проводили значительно больший процент времени на новом объекте по сравнению с мышами, получавшими лечение IgG2b (рис. 6D; p <0,01).

K18PL PFF вводили в гиппокамп и мыши оценивали после лечения PHF13 или IgG2b в течение 4 недель. A. Область гиппокампа, занятая иммуноокрашиванием АТ8 на ипсилатеральной (Ipsi) и контралатеральной (Contra) сторонах после лечения 30 мг / кг в.г. IgG2b или PHF13. B. Количество АТ8-положительных клеток в EC мышей, обработанных IgG2b- и PHF13. C. MC1-положительные количества клеток внутри EC IgG2b- и PHF13-обработанных мышей. D. Процентное время, потраченное на новый объект в анализе NOR. Статистический анализ проводили с использованием сравнения t-тестов между группами лечения IgG2b и PHF13 (* p <0,05, ** p <0,01, n = 10-12 / группа).

Для дальнейшей оценки влияния пассивной иммунизации на PHF13 у мышей PS19, инъецированных PFF, PS19, дополнительные исследования проводились другой исследовательской группой (Университет Пенсильвании). Были проведены два больших эксперимента с аналогичной конструкцией, в которых мышей PS19 в возрасте от 2 до 6 месяцев вводили еженедельно, начиная со дня инъекции K18PL PFF с 30 мг / кг PHF13 или контрольного IgG2b один раз в неделю в течение 4 недель. Поскольку контралатеральный гиппокамп представляет собой область относительно отдаленного тау-патологического распространения по полушариям, эта область была в центре внимания этих дополнительных анализов. Несоответствующий патологический тау оценивали с помощью иммуногистохимического анализа МС1 серии корональных разрезов, которые охватывали весь ипсилатеральный и контралатеральный гиппокамп, с определением средней площади, занимаемой на каждую секцию после автоматического порогового значения (рис. 7А). Когда результаты двух больших, но аналогично разработанных исследований были объединены (что привело к 22-26 мышам / лечение), значительное снижение MC1-положительной тау-патологии наблюдалось в контралатеральном гиппокампе обработанных PHF13 мышей PS19 по сравнению с контрольная группа, обработанная IgG2b (p <0,01), несмотря на относительно большое изменение в степени патологии тапот гиппокампа (рис. 7B). Не было различий в иммуноокраске МС1 между двумя группами в ипсилатеральном гиппокампе. Отсутствие опосредованного антителом снижения иммунного окрашивания АТ8 (фиг. 6А) или МС1 (фиг. 7В) в ипсилатеральном гиппокампе, вероятно, связано с быстрой и надежной индукцией патологии в этом регионе, что является результатом интернализации KFFPL PFF, что не распознаются антителом PHF13. Когда результаты исследований с K18PL PFF-инъецированным молодым PS19 из обеих лабораторий рассматриваются в общей сложности, есть данные о том, что лечение PHF13 может уменьшить тау-патологию в ЕС и контралатеральный гиппокамп в модели, в которой происходит быстрое распространение тау-патологии от начальных участков инъекции PFF, что привело к повышению производительности в тесте NOR.

Степень патологии тазобедренного сустава гиппокампа оценивали у мышей PS19, которые получали инъекции KFFPL PFF в гиппокамп и вышележащую кору, и лечение либо IgG2b, либо PHF13 (30 mpk i.p. в течение 4 недель). A. Контралатеральные изображения гиппокампа из корональных срезов, окрашенных MC1 от мышей, обработанных либо IgG2b (верхние панели), либо PHF13 (нижние панели). Правые панели отображают изображения после непредвзятого порогового значения для идентификации MC1-положительной патологии для количественной оценки. B. Процент площади гиппокампа, занятой окрашиванием MC1 от мышей, обработанных IgG2b- и PHF13. Левая ось Y и панели (черные символы) показывают ипсилатеральную (Ipsi) гиппокампальную область (HP)%, тогда как правая ось Y и панели (красные символы) показывают контралатеральную (Contra) область гиппокампа%. Статистический анализ был основан на сравнении t-тестов между группами лечения IgG2b и PHF13 (** p <0,01).

Антитела, нацеленные на эпитопы pT231 и pS396 тау, с аффинностью 1-4 нМ, оценивались в модели первичной нейронной культуры тау-патологии, а также в двух различных тау-трансгенных мышиных моделях, которые развивают заметные включения тау со старением, которые очень напоминают те, которые наблюдаются в AD и связанные с ними тауопатии. Иммуноделектирование видов p-tau из экстрактов головного мозга, полученных от пожилых rTg4510 мышей с PHF13 или PHF6, уменьшало способность этих препаратов индуцировать патологию тау в первичном нейроне, сверхэкспрессирующем мутант P301L tau. Более того, обе эти антитела p-tau уменьшали виды p-tau in vivo с сопутствующим улучшением когнитивных характеристик. В связи с этим, как PHF13, так и PHF6 были оценены у мышей rTg4510, которые чрезмерно выражают индуцибельный человеческий P301L tau и показывают возрастное накопление тау-патологии, а также увеличение CSF tau и p-tau. Мы наблюдали значительную корреляцию растворимого в воде и нерастворимого AT8 p-tau с общим тау и CST-pau-tau у мышей rTg4510. Эти возрастные увеличения маркеров CSF происходят в согласии со снижением уровня растворимого в мозге уровня тау и увеличения нерастворимого AT8 tau. Таким образом, изменения в CSF tau и p-tau могут отражать начало и распространение патологии головного мозга и могут давать суррогатное прочтение общей патологии головного мозга.

Примечательно, что лечение мышей rTg4510 либо PHF6, либо PHF13 приводило к ослаблению растворимого АТ8-иммунореактивного п-тау в головном мозге, а также уменьшению общего количества тау и РТ181 тау. Было показано, что лечение с помощью N-концевого специфического антитела специфически уменьшает N-терминальные содержащие тау-фрагменты в интерстициальной жидкости головного мозга (ISF) и CSF [44]. Однако влияние обработки антител на общие уровни tau или p-tau не оценивалось. Это первое исследование, демонстрирующее значительное снижение общего уровня тау и р-тау CSF после лечения тау-антителом. Тем не менее, были минимальные эффекты этих обработок на нерастворимые тау. Это повышает вероятность того, что увеличение нерастворимого тау у мышей rTg4510 может быть обусловлено в значительной степени автономной сверхэкспрессией тау с автономной тау, с антителами, имеющими номинальное влияние на внутриклеточный нерастворимый пул. Таким образом, временная прогрессия патологии от гиппокампала до корковых областей, которая наблюдается с возрастом у мышей rTg4510, может быть не вызвана передачей тау-патологии, а скорее различием уровня экспрессии тау или внутриклеточной среды, которая влияет на скорость формирования включения тау в отдельных популяциях нейронов. Тем не менее, улучшение эффективности NOR наблюдалось после лечения антителами p-tau, что согласуется с результатами исследований у мышей rTg4510, где подавление экспрессии tau обработкой доксициклином привело к значительному снижению растворимого тау и улучшению поведения в отсутствие значительного изменения в tau NFT-патологии [34]. Недавние исследования показали, что сверхэкспрессия мутантов тау, особенно в ЕС, приводила к синаптическому дефициту внутри андрогинально-гиппокампальной сети до агрегации тау и явной потери нейронов [45]. Это, наряду с исследованиями в моделях douophila tau-overexpression [46], предполагает, что растворимые формы тау могут быть вредными, а нерастворимые агрегаты тау могут действовать для секвестра токсичных видов тау.

Ранее мы сообщали, что CSF tau существует преимущественно в виде усеченного фрагмента, который может быть надежно измерен с помощью средних и N-концевых тау-анализов, но близок к пределу обнаружения при измерении антителами, распознающими С-концевые эпитопы [37, 38] , Обработка PHF13 снижает уровни CSF tau и pT181 tau у мышей rTg4510, но связывается с C-терминальным эпитопом (pS396), который не обнаруживается в CSF. Кроме того, сообщалось, что ISF содержит полноразмерные тау [47, 48]. Эти данные показывают потенциальную модель для объяснения результатов, полученных с помощью антител р-тау (рис. 8). Мы выдвигаем гипотезу о том, что полная или почти полная длина тау секретируется из нейронов в интерстициальную жидкость. Внеклеточное тау, вероятно, гиперфосфорилируется у старших мышей rTg4510, отражающих высоты p-tau мозга (рис. 2). При перемещении ISF в CSF tau расщепляется на среднедоменные и N-концевые фрагменты, которые в изобилии присутствуют в CSF. Судьба C-концевых фрагментов, полученных в результате такой схемы, неясна, но они потенциально могут быть «передаваемыми» видами, которые распространяют распространение тау-патологии. При такой схеме антитела p-tau, используемые в этом исследовании, будут секвестрировать часть секретируемого тау и способствовать зазору, тем самым уменьшая p-tau и общие tau-фрагменты, обнаруживаемые в CSF. Таким образом, мы полагаем, что опосредованное антителом снижение внеклеточного р-тау может частично приводить к снижению CSF tau и p-tau у мышей rTg4510.

Отдельная модель, изображающая уровни тау и антитела (IgG) в головном мозге, интерстициальная жидкость (ISF), цереброспинальная жидкость (CSF) и плазма. CSF tau усекается с уровнями ~ 1 нМ, тогда как tau в ISF существует как полноразмерная молекула с уровнями 3-5 нМ (в 4-5 раз больше, чем в CSF) [47]. По оценкам, концентрации p-tau составляют около 1-10% от общего количества тау. Концентрации антител Тау составляют 1-3 нМ в CSF и ISF [44]. Взаимодействие антител p-tau в CSF и ISF позволило бы разрешить тау через различные механизмы, опосредованные антителами. Полная длина tau указывается как молекула, содержащая N-концевую (оранжевую линию), среднюю область (синяя линия), область повторения микротрубочек (черный ящик) и области C-конца (серая линия), тогда как усеченная tau in отсек CSF обозначается средними и N-концевыми фрагментами.

Ключевой вопрос заключается в том, достаточно ли для исследования тау-антител в наших исследованиях полностью задействовать внеклеточные тау-виды в ЦНС. В модели PS19 tau ISF tau находится в диапазоне 200-300 нг / мл (3-6 нМ), тогда как уровни CSF tau составляют 20-40 нг / мл [47]. У мышей rTg4510 общие уровни тау CSF (с использованием среднеспециальных анализов) составляли 20-40 нг / мл (0,3-0,8 нМ) (это исследование и [37]). Поскольку уровни p-tau оцениваются как <10% от общего количества тау (на основании рис. 2А и 2В), мы ожидаем разумного участия внеклеточного р-тау при низких концентрациях НМ-антител, достигнутых в CSF. В частности, наши данные о 20-40% -ном снижении уровней p-tau и CSF головного мозга с PHF6 и PHF13, как правило, согласуются с проявлениями CSF-антител 1-3 нМ и антителом KD 1-4 нМ. Уровни CSF и ISF антитела составляют ~ 0,1% от уровней в плазме, после системного дозирования (табл. 2 и [44]. Тот факт, что только малая часть растворимого тау фосфорилируется, может установить предел на степень растворимого уменьшения тау, наблюдаемого с анти-p-tau антитела. Взятые вместе, наблюдаемая эффективность в моделях первичных нейронов и in vivo при лечении антителом p-tau предполагает, что токсические виды тау могут быть фосфорилированы.

В дополнение к исследованиям у мышей rTg4510 антитело PHF13 также исследовали в модели, в которой тау патологию индуцировали внутримозговой инъекцией KFFPL Tau PFFs в молодых мышей PS19. У этих молодых мышей PS19 начальное образование тау-патологии зависит от восприятия экзогенных PFF, которые затем служат в качестве шаблонов для набора и неправильного введения трансгенного человеческого тау и в меньшей степени эндогенного мышиного тау [10]. Считается, что зависящий от времени распространение тау-патологии, наблюдаемый в этой модели, представляет собой комбинацию внутриассонного переноса инъецированных PFF с сайтов инъекции PFF, а также аналогичную транспортировку нерезонансных эндогенных видов тау через нейронные сети [10 ]. Введение PHF13 в PFF-инъецированные мыши PS19 приводило к значительному уменьшению тау-патологии в ЕС и улучшению когнитивного анализа NOR. Кроме того, в другом крупном исследовании, использующем эту модель, имелись данные об уменьшенной патологии тау в контралатеральном гиппокампе. Контралатеральный гиппокамп был исследован, потому что вполне вероятно, что развитие тау-включений зависит, по крайней мере частично, от передачи нейронов к нейрону неправильной тау. Однако, поскольку существуют двусторонние проекции CA3 [49], возможно, что некоторая часть наблюдаемой контралатеральной патологии гиппокампа является результатом прямого аксонового переноса tau PFF. Фактически, тонкие различия в месте инъекции K18PL PFF в гиппокамп могут влиять на долю тау-патологии из-за распространения нейронов на нейроны индуцированной PFF тау-патологии от ипсилатерального до контралатерального гиппокампа. В этом отношении небольшие различия в координатах инъекции K18PL PFF могут объяснить, почему лечение PHF13 уменьшало контралатеральную гиппокампальную тау-патологию в исследованиях, проводимых в одной лаборатории, но не в другом. Несмотря на этот диссонирующий вывод, наблюдение, что лечение PHF13 не влияет на нерастворимую патологию тау в предположительно клеточной автономной модели rTg4510, подтверждает идею о том, что уменьшение тау-патологии в модели PS19 tau PFF-инъекции обусловлено, по меньшей мере частично, замедления патологической передачи тау. В целом, результаты двух различных моделей мышей tauopathy обеспечивают дополнительную валидацию лечения тау-антителом в качестве потенциальной терапевтической стратегии для снижения патологического тау и улучшения функционального дефицита с клинически достижимыми проявлениями антител [43].

Основные проблемы по-прежнему сохраняются с точки зрения понимания влияния лечения антитау-антителами на модели мышей-тауопатии. Многие опубликованные исследования были посвящены хорошо охарактеризованным тау-эпитопам для активной или пассивной иммунизации, включая эпитоп pS396 / pS404 (PHF1), или использовали конформационные антитела, такие как MC1 [25-29, 31]. В одном недавнем исследовании сравнивались как N-концевые, так и MTBR-связывающие антитела с помощью прямой интрацеребровентрикулярной инфузии (ICV) [30] в модели мыши PS19. Хотя воздействие CSF-антитела составляло ~ 50 нМ после инфузии ICV (на 20-50% больше, чем IP-дозировка), относительно умеренные и переменные эффекты наблюдались на растворимом и нерастворимом в мозге tau, без четких отношений с поведенческими конечными точками [30]. Ограничения на диффузию антител от желудочков до паренхимы головного мозга могут повышать изменчивость уровней антител в областях мозга и, следовательно, частично объяснять умеренные эффекты в конечных точках головного мозга. Подобные частичные сокращения уровней головного мозга, измеренные биохимическими или гистологическими методами, очевидны как в пассивных, так и в активных исследованиях лечения антителами [25-30, 50]. Как правило, в моделях тау-мыши, которые являются довольно агрессивными, с очень высокими уровнями экспрессии тау (4-10x) над эндогенными уровнями мышиного тау, может быть трудно предотвратить или спасти патологию. Тем не менее, достоверное снижение тау-патологии было зарегистрировано в модели тау-мыши [51], которая выражается вблизи физиологических уровней тау [52]. Отсутствие надежного сокращения головного мозга в некоторых из этих исследований также может быть связано с неспособностью антител к воздействию внутриклеточного тау, с первичными эффектами на внеклеточное тау и клеточную патологическую передачу. Измерение ISF tau до и после лечения антителом может обеспечить лучшее понимание воздействия антител и фармакодинамических эффектов на животных моделях, но может все еще создавать проблемы, связанные с чувствительностью, требуемой для обнаружения низких уровней ISF p-tau. Хотя тау-патология в человеческих AD и tauopathies сходна с точки зрения увеличения патологии Tau NFT, существуют ключевые различия в отношении скорости прогрессирования заболевания, типов клеток, затронутых тау-патологией, и места инициации и распространения тау-патологии и формы тау, которые присутствуют в нерастворимых агрегатах. Таким образом, необходима дальнейшая работа для выяснения характера трансмиссивных видов тау в нейродегенеративных заболеваниях человека и определения лучшего эпитопа (ов) для тау-иммунотерапии.

В заключение мы продемонстрировали, что антитела p-tau, нацеленные на pT231 и pS396, могут снижать уровни p-tau мозга и CSF и улучшать функцию у пожилых тау-трансгенных мышей. Более того, эти антитела уменьшают tau патологию и улучшают поведение в Tau PFF-индуцированной модели передачи тауопатии. Эти исследования, таким образом, дают важную информацию о потенциале пассивной тау-иммунотерапии для лечения АД и связанных с ней тауопатий.

A. Tg4510 мыши, растворимые в мозге экстракты, показывают линейное разведение сигнала в ELISA AT8. Сигнал вблизи уровней фона в Tau KO, t-TA (тетрациклиновый трансактиватор) и DN (двойные трансген-отрицательные) мыши. B. Tg4510 мыши, нерастворимые в мозге экстракты, показывают линейное разведение сигнала в ELISA AT8. Сигнал вблизи уровней фона у Tau KO, tTA и DN мышей. C. Сигнал головного мозга AT8 tau специфичен и не зависит от Tau441, но конкурирует с фосфопептидом AT8 (RSGYSSPGS- (PO4) PGT (PO4) PGSRSR), но не контролирует пептид AT8 без фосфорилированных сайтов на S-202 и T-205 ( RSGYSSPGSPGTPGSRSR) или pT181-фосфопептид (KTPPAPK-T (PO4) -PPSS). D. Стандартная кривая AT8 ELISA по сравнению с образцами-растворимыми экстрактами. E. Стандартная кривая AT8 ELISA по сравнению с образцами-нерастворимыми экстрактами головного мозга (фиг. 2).

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Ранее мы сообщали о надежном анализе ELISA pT181 tau для человеческого CSF [38]. A. У мышей Tg4510, экспрессирующих человеческий P301L tau, образцы CSF показали устойчивую линейность сигнала с разбавлением. Пунктирная линия указывает фоновый сигнал. B. Tg4510 демонстрируют специфический сигнал tT181 tau без вмешательства из нефосфорилированного тау (Tau441) и конкурируют с фосфопептидом pT181 (KTPPAPK-T (PO4) -PPSS). Сигнал CSF pT181 tau был низким у мышей с выбиванием Тау (TauKO), экспрессию трансактиватора тау-тетрациклинов (tTA) и двойных отрицательных мышей (DN). C. D. Общий сигнал Tau и pT181 tau от TG4510 от Tg4510 снижался в диапазоне стандартных кривых Tau441 и pT181 tau соответственно (рис. 3).

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Показаны изображения от 3 отдельных животных из каждой группы. Никаких различий в окрашивании не наблюдалось среди групп.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

PHF13 и PHF6 высушивали в образцах при концентрациях 0, 0,3, 3 и 10 мкг / мл, соответственно. Стандартные кривые Total Tau — Отсутствие помех с A. PHF13 и B. PHF6. Стандартные кривые AT8 ptau. Отсутствие помех C. PHF13 и D. PHF6. pT181 tau стандартные кривые — отсутствие помех E. PHF13 и F. PHF6.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

PHF13 и PHF6 высушивали в образцах при концентрациях 0, 0,3, 3 и 10 мкг / мл, соответственно. Общий анализ тазобедренного сустава — отсутствие помех A. PHF13 и B. PHF6. Анализ Brain AT8 ptau — Отсутствие помех C. PHF13 и D. PHF6.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

PHF13 и PHF6 высушивали в образцах при концентрациях 0, 0,3, 3 и 10 мкг / мл, соответственно. CSF человека использовали в качестве суррогата из-за ограниченной доступности образцов CSF для мышей Tg4510. Общий анализ таблеток CSF. Отсутствие интерференции с A. PHF13 и B. PHF6. CSF pT181 tau assay-Недостаток интерференции с C. PHF13 и D. PHF6.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

A. Региональное распределение тау-патологии после инъекции PFF в гиппокамп. Мультфильм показывает расположение ипсилатеральной инъекции PFF в кору и гиппокамп и распространяется на энторинальную кору (EC) и локус ceruleus (LC). Верхняя правая панель — изображения из 2 слайдов из всех разделов мозга, окрашенных AT8 от одного животного. Нижняя панель-изображения из горизонтальных участков, расположенных сверху донизу мозга, чтобы проиллюстрировать распределение окрашивания AT8. Красные контуры рисуются вокруг региона ЕС. Синие контуры вокруг области LC. B. Отсутствие окрашивания AT8 у мышей PS19, вводимых внутричерепно PBS. C. Порог изображения и сегментация АТ8-положительных областей в гиппокампе и EC.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Общие уровни тау CSF оценивали у мышей PS19, интрацеребрально вводимых PBS или K18PL PFF. Небольшое, но значительное увеличение CSF tau наблюдалось при инъекции PFF. Тенденция снижения уровней CSF tau наблюдалась с PHF13 по сравнению с мышами, обработанными IgG2b.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарны Марио Доносе, Рою Хаскелу, Джеффри Тредипу и Марку Уитмеру за характеристики физкультуры Тау, Майклу Ленарду за создание модулей анализа изображений и Джошуа Дэниелса и Мичио Ибы за техническую помощь в этом исследовании.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *