Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Иммунопреципитация амилоидных фибрилл путем использования антитела, которое распознает общий эпитоп, общий для амилоидных фибрилл

Immunoprecipitation of Amyloid Fibrils by the Use of an Antibody that Recognizes a Generic Epitope Common to Amyloid Fibrils
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4140755/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: ERG JWK FLP. Выполнили эксперименты: ERG FLP. Проанализированы данные: ERG JWK FLP. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: JWK FLP. Вклад в рукопись: FLP.

Амилоидные фибриллы связаны со многими заболеваниями, включая болезнь Альцгеймера (AD). Выделение амилоидов из природных материалов является очень сложным, потому что экстремальная структурная стабильность амилоидных фибрилл затрудняет применение обычных протоколов к белкам для их очистки. Для диагностики амилоидных заболеваний и идентификации новых функциональных амилоидов необходим протокол для выделения и выявления амилоидов. Наша цель заключалась в разработке протокола для очистки амилоида от организмов, основанного на конкретных характеристиках амилоидной складчатости, таких как его устойчивость к протеолизу и способность распознавать специфические конформационные антитела. Мы использовали двухступенчатую стратегию с протеолитическим расщеплением в качестве первого шага с последующей иммунопреципитацией с использованием конъюгативного антитела L-амилоида. Мы тестировали эффективность этого метода, используя в качестве моделей амилоидные фибриллы, полученные in vitro, тканевые экстракты C. elegans, которые сверхэкспрессируют Aβ-пептид и цереброспинальную жидкость (CSF) у пациентов с диагнозом AD. Мы смогли иммунопреципитацию Aβ1-40 амилоидных фибрилл, продуцируемых in vitro, а затем добавили в сложные биологические экстракты, но не α-синуклеиновые и гельколиновые фибриллы. Этот метод был полезен для выделения амилоидных фибрилл из тканевых гомогенатов из модели C. elegans AD, особенно у пожилых червей. Хотя мы смогли захватить количество пикограмм Aβ1-40 амилоидных фибрилл, полученных in vitro при добавлении в сложные биологические растворы, мы не смогли обнаружить какие-либо агрегаты амилоида Аβ в CSF у пациентов с АД. Наши результаты показывают, что хотя иммунопреципитация с использованием LOC-антитела полезна для выделения Aβ1-40 амилоидных фибрилл, он не способен захватывать фибриллы других амилоидогенных белков, таких как α-синуклеин и гельсолин. Дополнительные исследования могут потребоваться для улучшения сродства этих амилоидных конформационных антител к набору амилоидных фибрилл без ущерба для их избирательности перед применением этого протокола для выделения амилоидов.

Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные приведены в документе.

Поддержание белкового гомеостаза или протеостаза осуществляется сетью протеостаза, включающей биологические пути, которые контролируют скорость синтеза белка и эффективность сгибания, торможения и деградации белка [1]. Агрегация пептидов или белков, усугубляемая старением, генетически и патологически связана с дегенеративными расстройствами, включая болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона и системные амилоидные заболевания [2]. Широкий спектр белков, включая те, которые обычно существуют в растворимом складчатом состоянии или в качестве внутренне неупорядоченного мономера, может образовывать фибриллы амилоида с поперечными β-листовыми связями из-за мутации или из-за изменений окружающей среды [3]. Амилоидные отложения могут быть обнаружены с использованием красной двулучепреломления в конго или флуоресценции тиофлавина Т и часто связаны с гликозаминогликанами, амилоидным P-компонентом или другими белками [3]. Амилоидные фибриллы состоят из нескольких взаимодействующих нитей, каждая из которых состоит из тысяч мономеров, расположенных по меньшей мере в виде двухслойных поперечных β-листов [4]. Амилоид, как правило, относительно устойчив к денатурации и протеолизу [5]. Поскольку амилоид стабилизирован с помощью гидрофобных взаимодействий основной цепи и боковых цепей, было предложено, чтобы любой белок, независимо от его аминокислотной последовательности, мог образовывать амилоидные фибриллы, если они были подвергнуты соответствующим условиям раствора [6], [7] ,

Поскольку амилоидные фибриллы из разных источников обнаруживают общие характеристики, у нескольких групп развились антитела, способные распознавать так называемый «универсальный амилоидный эпитоп» [8] — [11]. Все эти антитела способны различать зрелую структуру амилоида и мономерные или олигомерные промежуточные предшественники амилоидной агрегации [8] — [10]. Эти антитела могут быть важными инструментами для разрушения амилоидных фибрилл, выявления агрегатов, связанных с амилоидным заболеванием, и для выделения амилоидных фибрилл из сложных растворов [8] — [10]. Среди разработанных амилоидных конформационных антител LOC, первоначально продуцируемый группой Glabe [10], представляет собой коммерчески доступное кроличье поликлональное антитело, выращенное против зрелых фибрилл амилоида, полученных из ацетил-полипептида островков (IAPP). Это антитело может различать Aβ амилоидные фибриллы и Aβ в олигомерных и мономерных состояниях [10].

Конкретный и чувствительный протокол для выделения и выявления амилоидов очень необходим для диагностики амилоидных заболеваний. Например, для современных методологий требуется красное окрашивание конго в биопсии, метод с низкой специфичностью и чувствительностью [12], [13], который является обязательным критерием для включения в клинические испытания для периферического амилоидоза [14]. Кроме того, протокол для выделения амилоидных фибрилл был бы полезен для открытия новых амилоидов. В дополнение к ассоциации амилоидных фибрилл с несколькими патологиями белки, которые самоорганизуются в амилоиде, могут также служить специфическим биологическим функциям [15] — [17]. Эти функциональные амилоидные фибриллы используются организмами для выполнения разнообразных физиологических функций, таких как образование биопленки [18], [19], клеточная адгезия [20], синаптическое ремоделирование и обучение [21], матрица биосинтеза меланина [22], [23] , и пептидные гормоны [24]. Другие примеры включают митохондриальный белок MAVS [25], белки некросом RIP1 / RIP3 [26] и несколько десятков белков, участвующих в образовании гранулы РНК [27].

В этой работе мы использовали уникальные физические химические свойства амилоидных фибрилл, чтобы разработать метод, предназначенный для выделения амилоидных фибрилл из сложных биологических растворов, таких как клеточный лизат из многоклеточного организма. Для этой цели мы использовали фибриллы амилоида, продуцируемые in vitro из трех различных белков, а именно Aβ1-40, α-синуклеина (α-syn) и гельсолина, а также лизата дикого типа и модели AD Caenorhabditis elegans (C. elegans) черви. Здесь мы показываем, что амилоидные фибриллы из всех трех протестированных белков сохраняют свою амилоидную архитектуру после инкубации с протеолитической ферментной протеиназой K (PK) и после инкубации с органическим растворителем ацетоном. После осаждения PK и осаждения ацетона мы иммунопреципитировали амилоидные фибриллы с использованием фибрил-специфического конформационно-зависимого антитела LOC [10]. Эта стратегия была успешной для захвата Aβ1-40 амилоидных фибрилл, но не смогла захватить α-синуклеин (α-syn) и фибриллы гельколинов. Этот результат согласуется с способностью LOC-антитела распознавать эти три фибриллы амилоида при анализе с помощью точечного блоттинга. Мы применили этот метод к лизатам из AD-червячной модели CL2006 [28], в которой избыточный экспрессируемый человеческий Аβ-пептидный агрегат в виде амилоидных фибрилл. Мы иммунопреципитировали больше фибрилл Aβ у более старых червей (8 день) по сравнению с молодыми червями (дни 1 и 5), подтверждая нашу стратегию в биологической системе. Поскольку метод иммунопреципитации (IP) был достаточно чувствительным для захвата и обнаружения пикограмм фибрилл Aβ амилоида, полученных in vitro, мы искали агрегаты Aβ в спинномозговой жидкости пациентов с диагнозом AD, но мы не смогли обнаружить какие-либо агрегаты. Мы обсудим ограничения и возможные применения этого метода.

Aβ1-40
[29], α-syn [30] и фрагмент галлолина 8 кДа (остатки 173-242) [31] очищали, как описано ранее. Aβ1-40 при 216 мкг / мл агрегировали в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN3 при 37 ° С в течение 7 дней при перемешивании. α-syn при 1,960 мкг / мл инкубировали в 10 мМ Трис-буфере с рН 7,4, 100 мМ NaCl, 0,02% NaN3 в тех же условиях, что и для Aβ1-40. Пептид фрагмента галлолинов в 8 кДа инкубировали при 60 мкг / мл в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, 100 мМ NaCl, 0,02% NaN3 при 37 ° С при перемешивании в течение 24 часов. Затем образец центрифугировали (16000 г в течение 15 мин при 4 ° С) и осадок ресуспендировали в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN3, чтобы получить конечную концентрацию 600 мкг / мл.

Формирование фибриля оценивали с использованием анализов связывания конго красного и тиофлавина-Т (ThT). Для связывания красного цвета в Конго образцы разбавляли до конечной концентрации 65 мкг / мл в 5 мМ фосфате калия и 150 мМ NaCl при рН 7,4, содержащем 10 мкМ конго красного, и поглощение регистрировали при 540 и 477 нм [32]. Для анализов связывания ThT образцы разбавляли до 65 мкг / мл в 5 мМ фосфате калия и 150 мМ NaCl при рН 7,4, содержащем 20 мкМ ThT, и контролировали связывание с использованием спектрофлуориметра для измерения увеличения флуоресценции (возбуждение при 450 нм и флуоресцентное излучение при 465-520 нм) [33].

Фибриллы Aβ1-40, α-syn или gelsolin (65 мкг / мл) инкубировали с 0,23 мкг / мл (1:500 мас. / Мас.) Протеиназы K (Roche) в фосфатном буфере (50 мМ фосфата натрия, рН 7,4, 150 мМ NaCl), содержащую ThT (20 мкМ) при 42 ° С. Каждые 10 мин планшеты встряхивали в течение 5 с, а флуоресценцию (возбуждение при 440 нм, излучение при 485 нм) контролировали с использованием считывателя флуоресцентных планшетов Spectra Gemini EM.

Образцы Aβ1-40, α-syn или гельсолин (65 мкг / мл) (мономерные или фибриллярные, PK-переваренные (0,13 мкг / мл в течение 2 ч при 42 ° C) или нет) были замечены (2 мкл) на нитроцеллюлозной мембране , Мембрану блокировали с использованием 1 об. Блокирующего раствора PBS + 1 vol (Odyssey) в течение 1 часа. Мембрану инкубировали с LOC-антителом (1:000, Millipore), разбавленным в 1 об. TBST (50 мМ Tris, pH 7,6, 0,9% NaCl, 0,1% Tween 20) +1 объемный блокирующий раствор в течение 1 ч, 3 раза промывали TBST и затем инкубировали в течение 1 часа с козьим антикроличьим вторичным антителом, конъюгированным с IRDye 680 CW (1:5,000) и развивали / количественно определяли с использованием инфракрасной системы визуализации Odyssey.

Образцы кипятили в течение 15 мин в присутствии лаеммильного буфера + 4 М мочевины для мономеризации фибрилл. SDS-PAGE проводили в восстановительных условиях с использованием 16% тристрицин-гелей. Образцы переносили в нитроцеллюлозные мембраны и зондировали антителом 6E10 (1:10,000) для Aβ1-40, syn-1 антитело (1:10,000) для α-syn и моноклонального анти-тубулина (1:10,000) для тубулина. Для гельколинов использовали кроличье поликлональное антитело (1:10,000), разработанное группой Балха [34]. Затем кляксы затем зондировали козьим антимышиным вторичным антителом, конъюгированным с IRDye 800 CW (1:10,000) для фибрилл Aβ1-40, α-syn и тубулина и козьего кроличьего вторичного антитела, конъюгированного с IRDye 680 CW (1:10,000) для гелсолином и разработан / количественно с использованием инфракрасной системы визуализации Odyssey.

Образцы были приготовлены, как описано Азеведо и его коллегами [35].

Общая концентрация белка определялась с использованием анализа Pierce BCA в соответствии с инструкциями изготовителя (Pierce).

CL2006 (dvIs2 [unc-54p :: Aβ1-42 + rol-6]) [28] и штамм N2 дикого типа (Бристоль) были получены из Центра генетики Caenorhabditis (Университет Миннесоты, Миннеаполис, MN). Синхронизированные яйца собирали путем отбеливания, а черви выращивали в жидкой культуре, содержащей фтордезоксиуридин (FUDR, 0,12 мМ, Sigma) и OP50-бактерии (5 мг / мл), как описано ранее [36]. Черви выдерживали при 20 ° C, в возрасте до 1-го дня, 5-го дня и 8-го дня взрослой жизни, затем трижды промывали в буфере M9 и замораживали в жидком азоте до анализа вестерн-блоттинга. Сырые экстракты были приготовлены в буфере PBS, 1% Triton X100 с коктейлем ингибитора протеиновой кислоты (PIC, Roche) с использованием гомогенизатора Precellys 24 (Peqlab) и керамических гранул (диаметр 2,8 мм) [37] и центрифугировали при 700 g в течение 3 мин при 4 ° C для получения супернатанта после обломков (PDS), как описано ранее [38].

Человеческий CSF был приобретен у Biochemed Services, Winchester, VA и хранился при -80 ° C до использования. Мы использовали три независимых образца у разных пациентов с диагнозом болезнь Альцгеймера.

Триста микролитров червя PDS (N2 или CL2006) (концентрация конечного белка 50-500 мкг / мл) или человеческий CSF (концентрация конечного белка 100-500 мкг / мл), разбавленный в PBS pH 7,4 0,1% Tween 20 в отсутствие или в присутствии различных количеств амилоидных фибрилл обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин в Sonic Cleaner Fisher Scientific FS60 при 4 ° C. Образцы расщепляли протеиназой K (1:500) в течение 2 ч при 42 ° С. Затем к каждому образцу добавляли один объем холодного ацетона и образцы центрифугировали при 16000 г в течение 10 мин при 4 ° С. Осадок ресуспендировали в 300 мкл PBS с 0,1% Tween 20 с 1X ингибитором протеазы коктейля (Roche). Образцы обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин 4 ° С и добавляли 5 мкл LOC (Millipore) антитела и образцы инкубировали в течение 24 ч при 4 ° С при перемешивании. Добавляли суспензию шариков (60 мкл, суспензию геля на основе Восточного побережья Bio Protein G), и образцы инкубировали в течение дополнительных 24 ч при 4 ° С при перемешивании. После трехкратного промывания 300 мкл PBS образцы элюировали из гранул 30 мкл глицина с рН 2,3 при 65 ° С в течение 10 мин и 5 мин обработки ультразвуком. Для всех этапов, включающих центрифугирование / промывку гранул, образцы центрифугировали при 78 г в течение 1 мин при 4 ° С.

Мы продуцировали амилоидные фибриллы с использованием трех разных белков, а именно Aβ1-40, α-syn и 8 кДа-фрагмента гелсолина. Aβ1-40 представляет собой пептид, связанный с болезнью Альцгеймера [39], α-syn связан с болезнью Паркинсона [40] и гелсолином с семейным амилоидозом финского типа [41], [42] (рис. 1A). Фибриллы, образованные из трех разных белков, представлены типичной амилоидной структурой (панели B-D), как видно из просвечивающей электронной микроскопии (TEM). Агрегаты, образованные α-syn, были длинными и скрученными (рис. 1B), тогда как агрегаты гелсолина и Aβ1-40 были короче, с некоторыми кластерами (рис. 1C, 1D). Эти результаты были подтверждены связыванием Конго Красного (CR; Рисунок 1E, красные полосы) и ThT (Рисунок 1E, желтые полосы). Эти два соединения представляют собой амилоидоспецифические красители, которые изменяют свое спектроскопическое поведение при связывании с поперечным β-кратным, присутствующим в амилоидных фибриллах [32], [33]. В качестве отрицательного контроля мы оценивали связывание ThT и CR с использованием только одного буфера (рис. 1E) или растворимых пептидов Aβ1-40, α-syn или гелсолина (не показано из-за сходства с контролем буфера). В среднем мы наблюдали сигнал ThT и CR на 10-20 раз с агрегированными пептидами, чем только один буфер (рис. 1Е).

(A) Таблица, описывающая пептиды и условия агрегации, используемые в этом исследовании. (B-D), показывающие морфологию агрегатов, используемых в этом исследовании: (B) фибриллы α-синуклеина (α-syn), (C) фибриллы гельколина и (D) Aβ1-40 фибриллы , (E) Конго красный (CR, красные полосы) и Thioflavin T (ThT, желтые полосы), связанные с агрегатами, показанными в B-D. Все образцы использовали при 65 мкг / мл, а CR и ThT использовали при 10 мкМ и 20 мкМ, соответственно. Буфер для анализов связывания CR и ThT составлял 5 мМ фосфата калия и 150 мМ NaCl при рН 7,4. Для ThT: Ex = 450 нм и Em = 465-520 нм. Для CR: поглощение при 540/447 нм.

Затем мы сравнили восприимчивость амилоидных фибрилл против растворимых пептидов к протеолитическому ферменту, протеиназе K (PK), серин-эндопептидазе с широким спектром действия [43]. Мы использовали PK-переваривание для снижения молекулярной сложности протеома при сохранении фибриллярной амилоидной архитектуры. С этой целью мы инкубировали пептиды Aβ1-40, α-syn и gelsolin либо в виде растворимых пептидов, либо в агрегированном состоянии в присутствии PK (500:1, мас. / Мас.) В течение 2 ч при 42 ° С и затем оценивали стабильность пептидов с использованием Вестерн-блоттинга с пептид-специфическими антителами. Как и ожидалось [44], только фибриллярный материал был устойчив к расщеплению ПК (рис. 2А). Аналогичные результаты наблюдались с использованием окрашенных серебром гелей, что исключало возможность того, что расщепление PK разрушало эпитопы, распознаваемые пептид-специфическими антителами (данные не показаны). Правдоподобное объяснение полос с более высокой молекулярной массой на фиг. 2А для гелсолина и Аβ состоит в том, что некоторые димеры могут быть устойчивыми даже при продолжительном кипении в присутствии 2% SDS. Результаты, показанные на фиг. 2А, представляют собой переваривание PK, выполненное в солевом фосфатном буфере, но аналогичные результаты наблюдались, когда переваривание проводилось в более сложном растворе, таком как гомогенат ткани из дикарта C. elegans (не показан). Чтобы определить, действительно ли фибриллы являются амилоидами после расщепления ПК, мы контролировали ThT-флуоресценцию как функцию времени для оценки целостности фибрилл Aβ1-40, α-syn и gelsolin в присутствии PK (рисунок 2B). ThT-флуоресценция всех амилоидов, протестированных здесь, как правило, не изменялась во время переваривания PK (рисунок 2B), подтверждая, что PK-устойчивые фибриллы в значительной степени сохраняют свою амилоидную структуру.

(A) Пептиды Aβ1-40, α-syn или гелсолины (65 мкг / мл) в фибриллярном (верхнем геле) или растворимом (нижнем геле) состоянии инкубировали в отсутствие или в присутствии 0,13 мкг / мл (1:500, мас. / мас.) протеиназы K (PK) в течение 2 ч при 42 ° С. Переваривание проводили в 50 мМ фосфате натрия, pH 7,4, 150 мМ NaCl-буфере. Реакцию останавливали путем кипения образцов в буфере Леммли с 2% SDS и образцы разрешали на 16% SDS-PAGE. Представлено Вестерн-блоттинг с использованием 6E10 (Aβ1-40), син-1 (α-syn) или антитело, специфичное для гелсолина. (B). Те же реакции, описанные на панели A, проводили в присутствии 20 мкМ тиофлавина T (ThT), и флуоресценцию контролировали каждые 10 мин. Ex = 440 нм и Em = 485 нм. (C) Аβ1-40 амилоидные фибриллы при концентрации 65 мкг / мл разводили в 1 объем (1 В) PBS, гексана, ацетона или хлороформа и центрифугировали (16000 г) в течение 10 мин при 4 ° С. Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с 20 мкМ ThT и измеряли флуоресценцию. В качестве нагрузки использовалась аликвота неразбавленных / нецентрифугированных фибрилл. Ex = 450 нм и Em = 465-520 нм.

Клеточные лизаты представляют собой сложные смеси белков, липидов, углеводов и нуклеиновых кислот, и эти молекулы могут мешать и компрометировать очистку амилоидных фибрилл. Таким образом, мы искали второй шаг после переваривания PK, который можно было использовать для снижения сложности лизата. Так как липиды являются второй наиболее распространенной макромолекулой в клеточных лизатах [45], мы инкубировали фибриллы с несколькими органическими растворителями, хорошо известными для солюбилизации липидов. После инкубации фибрилл Aβ1-40, растворенных в PBS с 1 объемом органического растворителя, мы центрифугировали образцы и ресуспендировали осадок в новом растворе PBS, содержащем ThT и измеренной ThT-флуоресценции (экспериментальная схема внизу рисунка 2). Единственным протестированным растворителем, который не нарушал фибриллярную архитектуру Aβ1-40, был ацетон (фиг. 2C). Ацетон обычно используется для солюбилизации неполярных липидов, что в случае C. elegans на гомогенаты ткани приходится около 20% массы сухого тела [46]. Аналогичные результаты были получены с использованием фибрилл α-syn и gelsolin (не показаны).

Продемонстрировав, что тестируемые здесь амилоидные фибриллы устойчивы к расщеплению ПК и инкубации с ацетоном, мы спросили, какое влияние эти методы оказывают на протеом сложного многоклеточного лизата. Комплексный лизат получали путем механического лизиса штамма N2 дикого типа C. elegans с последующим центрифугированием (700 г в течение 3 мин) с получением супернатанта после обломков (PDS). Мы расширили PDS небольшим количеством фибрилл Aβ1-40 амилоида (0,2%, w / w белок), а затем переварили лизат с помощью PK и осадили PK-переваренный лизат 1 объемом ацетона. Как видно из окрашенного серебром SDS-PAGE (фиг. 3A, верхний гель) и количественно определяемого BCA (фиг. 3B), количество белка, оставшегося после расщепления PK и экстракции ацетоном, уменьшилось примерно на 80-85%. Тем не менее, количество Aβ1-40, выделенное из обработанных лизатов, не было затронуто этими суровыми условиями (фиг. 3A, нижний гель). Интересно отметить, что обработка только PDS PK и ацетоном приводила к образованию кольцевых агрегатов, подобных тем, которые описаны во время агрегации амилоидогенных белков (сравните рис. 3C с рисунком 3D) [47], [48]. Амилоидные фибриллы наблюдались только в образцах, которые были покрыты Aβ1-40 (сравните рисунок 3D с 3F), а синтетические фибриллы сохранили свою фибриллярную структуру после обработки PK и ацетоном (сравните рисунок 3E с рисунком 3F). Аналогичные результаты были получены с использованием фибрилл α-syn и gelsolin (не показаны). Предполагая, что функциональный амилоид существует у C. elegans и устойчив к расщеплению PK, наша неспособность обнаруживать какие-либо фибриллы функционального амилоида может отражать низкое содержание функционального амилоида, вероятно, менее 0,2% от общего количества протеома. Другая возможность заключается в том, что предполагаемые функциональные амилоиды C. elegans более восприимчивы к перевариванию PK по сравнению с синтетическими фибриллами. Фактически, функциональные амилоиды, описанные недавно группой McKnight, были динамичными и очень чувствительными; т. е. эти фибриллы были легко денатурированы методом SDS [27]. Важно отметить, что эксперимент, описанный на рисунке 3, был выполнен с использованием PDS от червей на 1-й день взрослой жизни. Есть некоторые свидетельства того, что эндогенный амилоид существует у пожилых червей [49], поэтому в будущем пожилые черви могут быть интересными моделями для идентификации функциональных амилоидов.

(А и В). Комплексный биологический экстракт был получен механическим разрушением червей дикого типа C. elegans с последующим кратковременным центрифугированием (700 г в течение 3 мин) для удаления нелизуемых червей. Фибриллы Aβ1-40 (концентрация белка в концентрации 0,2% по весу) добавляли к супернатанту для обломков червя (PDS), и образцы расщепляли ПК (1:500) в течение 2 ч при 42 ° С с последующим осаждением ацетона. Аликвоту перед перевариванием PK (нагрузкой) после расщепления PK (+ PK) и после расщепления PK и осаждением ацетона (+ PK / ацетон) разрешали SDS-PAGE (A) или белок определяли количественно с помощью анализа BCA (B). В панели A верхний гель окрашивают серебром, а нижний гель представляет собой Вестерн-блот для Aβ с использованием антитела 6E10. (C-F) TEM-изображений PDS. PDS инкубировали в отсутствие (C) или в присутствии 0,2% Aβ1-40 фибрилл (E) до стадии PK / ацетон. PDS, инкубированные в отсутствие (D) или в присутствии 0,2% Aβ1-40 фибрилл (F), расщепляли PK и осаждали ацетоном. Обратите внимание, что амилоидные фибриллы присутствуют только в образцах, к которым добавлены фибриллы Aβ1-40 (E и F).

Молекулярные инструменты, которые являются высокоспецифичными и чувствительными к структурным мотивам, которые присутствуют во всех амилоидных фибриллах, были бы полезны с целью выделения амилоидных фибрилл, присутствующих в сложных растворах [50], [51]. В этом контексте несколько групп разработали антитела, которые распознают универсальный амилоидный эпитоп [8] — [10]. Примерами таких соединений являются антитела WO1 и WO2 группы Wetzel [8] и антитела B10 и B10AP из лаборатории Fandrich [9], полученные с использованием амилоидных фибрилл, полученных из Aβ1-40 или Aβ1-42, и OC и LOC из группы Glabe [ 10], полученные с использованием амилоидных фибрилл из пептидов Aβ1-42 и IAPP, соответственно. Все эти антитела способны различать зрелые фибриллы амилоида и мономерные или олигомерные. Более того, эти антитела распознавали амилоидные фибриллы, полученные из нескольких белков, таких как Aβ1-40, Aβ1-42, α-syn, IAPP, прионы дрожжей, полиглютамин и транстиретин, среди прочего, подтверждающие существование общего универсального амилоидного эпитопа [8 ] — [10], [52]. Мы решили использовать LOC-антитело для иммунопреципитации, потому что это антитело коммерчески доступно и было получено с использованием IAPP, что уменьшает вероятность того, что антитело специфически распознает один из пептидов, используемых в этом исследовании (Aβ1-40, α-syn и gelsolin) вместо конформационный амилоидный эпитоп. Важно отметить, что первичная аминокислотная последовательность Aβ1-40 и IAPP имеет 23% идентичности и 38% сходства, что делает LOC-антитело более эффективным для Aβ, чем α-syn и gelsolin, как будет обсуждаться здесь. Чтобы исследовать эффективность LOC-антител, мы провели точечный анализ с использованием амилоидных фибрилл, описанных на фиг. 1, а также растворимых пептидов из Aβ1-40, α-syn и gelsolin. Чтобы сравнить сродство LOC для различных используемых фибрилл, мы обнаружили ту же массу каждого пептида на нитроцеллюлозной мембране. Мы обнаружили, что LOC удалось связывать со всеми тестируемыми амилоидными фибриллами (фиг. 4A); однако связывание с фибриллами Aβ1-40 было намного сильнее, чем фибриллы α-syn и gelsolin. Мы также обнаружили связывание с растворимым пептидом Aβ1-40. Это связывание было менее интенсивным, чем связывание с фибриллами Aβ1-40, но было более сильным, чем связывание с α-syn и gelsolin fibrils. При концентрации, используемой в этом исследовании, мы не обнаружили никакого связывания LOC с растворимыми α-син и пептидами гельсолинов. После переваривания ПК, LOC-антитело все еще связывается с амилоидными фибриллами Aβ1-40, α-syn и gelsolin в той же степени, что и у непереваренных фибрилл (рис. 4B). Связывание с растворимым Aβ1-40 больше не обнаруживается, так как растворимый пептид полностью разрушается с помощью PK (фиг. 2A). Аналогичные результаты были получены при расщеплении PK с последующим осаждением ацетона (не показано). Этот результат подтверждает результаты электронной микроскопии, показывающие, что фибриллы Aβ1-40, α-syn и gelsolin амилоида сохраняли свою амилоидную структуру, а также универсальный амилоидный эпитоп после переваривания PK и осаждения ацетона (рис. 3F).

Пептиды Aβ1-40, α-syn или gelsolin (65 мкг / мл) в фибриллярном или растворимом состоянии инкубировали в отсутствие (A) или в присутствии (B) ПК (1:500) в течение 2 ч при 42 ° C затем обнаруживают на нитроцеллюлозной мембране, нагруженной LOC-антителом.

Для проведения иммунопреципитации (IP) амилоидных фибрилл в сложном растворе мы использовали небольшое количество (0,2% мас. / Мас. Белка) амилоидных фибрилл, полученных in vitro (рис. 1), в PDS дикого типа и следовали протоколу, описанному в схема на рис. 5А. PDS + амилоидные фибриллы расщепляли ПК в течение 2 ч при 42 ° С, осаждали ацетоном и затем иммуноосаждали с LOC-антителом. Связанные амилоидные фибриллы затем элюировали с использованием комбинации низкого рН и ультразвука. В качестве контроля мы использовали только гранаты протеина G в отсутствие LOC-антител. Фибриллы, иммунопреципитированные LOC-антителом, были обнаружены SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом с использованием антител, специфичных к мономерному Aβ1-40, α-syn или гелсолину (см. Материалы и методы). Мы заметили, что для фибрилл Aβ1-40 значительное количество белка было выделено в элюате IP (фиг. 5B, дорожка 4), что указывает на то, что этот способ был способен очищать фибриллы амилоида от комплексного раствора. Не все связанные фибриллы Aβ1-40 были выделены в элюате, так как фибриллы Aβ1-40 были обнаружены после кипячения гранул, используемых в IP (рисунок 5B, дорожка 5). Важно отметить, что количество образца, нанесенного в SDS-PAGE для фракций элюата и гранул (полосы 4, 5, 8 и 9, рис. 5), было в 10 раз выше (10X) по сравнению с другими фракциями ( Load, Post IP и Wash в дорожках 1, 2, 3, 6 и 7-1X) (см. Подробности в легенде на рисунке 5). Мы использовали эту методологию для лучшего обнаружения любой возможной амилоидной фибриллы, иммунопреципитированной по нашему протоколу. Никаких амилоидных фибрилл не выделяли, когда IP проводили в отсутствие LOC-антитела (фиг. 5B, дорожки 8 и 9). Для фибрилл gelsolin и α-syn мы наблюдали, что большая часть фибрилл присутствовала во фракции, которая не связывалась с гранулами белка G (Post IP) даже тогда, когда присутствовало LOC-антитело, что указывает на то, что IP был неэффективным (фиг. 5C -Д). Увеличение количества добавленных гельколинов и α-syn фибрилл (0,5, 1 и 5%) или увеличение времени обработки ультразвуком образцов (60 мин) с целью усиления фрагментации фибрилл для обеспечения более высокого поверхностного контакта между фибриллами и антитела, не улучшали эффективность IP для фибрилл gelsolin и α-syn (данные не показаны). Мы также опустили переваривание PK и стадию осаждения ацетона, но снова мы не смогли иммунопреципитировать гельколины и фибриллы α-syn (данные не показаны).

(A) Схема протокола, используемого для выделения амилоидных фибрилл. (B) К червям PDS добавляли Aβ1-40, (C) гельколины или (D) α-syn амилоидные фибриллы (0,2% мас. / Мас.), Расщепляли ПК в течение 2 ч при 42 ° С и осаждали 1 объем холодной ацетон. Осадок ресуспендировали в буфере, содержащем LOC-антитело, и IP проводили, как описано в материалах и методах. В качестве отрицательного контроля мы проводили IP в отсутствие LOC-антител (бисер). Образцы разрешали с помощью SDS-PAGE (16% тристрицин-гелей) и исследовали на Aβ1-40, гельсолин или α-syn путем вестерн-блоттинга.

Поскольку подход IP был эффективен при извлечении экзогенно добавленных фибрилл Aβ1-40 из PDS дикого типа (рис. 5B), мы исследовали более физиологическое состояние с использованием тканевых гомогенатов из модели A. elegans AD. Штамм CL2006 C. elegans конститутивно экспрессирует человеческий Aβ1-42
[28], но из-за посттранскрипционной модификации этот червь накапливает агрегаты Aβ3-42 [53], [54]. Агрегаты Aβ3-42 присутствуют в бляшках головного мозга пациентов с AD, а пептид Aβ3-42 рекапилирует in vitro и in vivo амилоидогенную характеристику пептида Aβ1-42. В качестве отрицательного контроля мы использовали N2 дикого типа червя PDS, который мы использовали в предыдущих экспериментах (фиг. 3 и 5), но теперь в отсутствие каких-либо добавленных рекомбинантных амилоидных фибрилл. Мы разделили образцы на две части: нагрузку, то есть образец перед расщеплением ПК, осаждение ацетона и IP с использованием LOC-антитела и Элюат, образец после всех вышеупомянутых этапов. Опять же, на геле SDS-PAGE мы применили в 10 раз больше фракции элюата (10X) по сравнению с фракцией нагрузки (1X). После SDS-PAGE гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которая была прощупана антителами против Aβ (≈4 кДа) и хондуирующим белковым тубулином (≈55 кДа). Во-первых, мы подтвердили, что только червяки CL2006 экспрессируют Aβ-пептид (сравните полосу около 4 кДа в полосе 1 от червя PDS дикого типа N2 с таковой в полосе 3 от CLS6 червя PDS). Мы наблюдали эффективный захват амилоидных фибрилл из штамма CL2006 C. elegans, используя протокол, описанный на рисунке 5A (рисунок 6A, дорожка 4). Поскольку протокол был способен иммунопреципитации амилоидных фибрилл, полученных in vivo, мы спросили, можем ли мы видеть какую-либо разницу в количестве Aβ в штамме CL2006 в качестве возраста червей. Чтобы решить этот вопрос, мы культивировали червяков CL2006 в течение 1, 5 и 8 дней на стадии взрослой жизни. Удивительно, но мы наблюдали аналогичное количество общего Aβ во время старения червей CL2006 (сравните дорожки 3, 5 и 7 на рис. 6A и рис. 6B). В отличие от этого, используя описанную здесь стратегию IP, мы смогли иммунопреципитировать большее количество фибрилл Aβ у более старых червей (8-й день, дорожка 8, рис. 6B) по сравнению с более молодыми (дни 1 и 5, дорожки 4 и 6 Рисунок 6, соответственно). Интересно, что только через 8 дней взрослой жизни (рост при 20 ° C, те же условия, что и здесь) CL2006 начинает проявлять фенотипический паралич, вызванный протеотоксичностью экспрессии Aβ [55]. Мы отметили, что димерная полоса Aβ была восстановлена ​​в иммунопреципитированных образцах по сравнению с входом (например, сравните полосу 7 с дорожкой 8 на фиг.6A при ≈8 кДа). Поскольку буфер, используемый для элюирования образцов из гранул, является кислым, мы считаем, что комбинация SDS, 4 М мочевины, низкого рН и кипения может быть достаточной для разрушения фибрилл в мономеры, что приводит к небольшому количеству димеров. Мы пришли к выводу, что наша стратегия полезна для иммунопреципитации фибрилл Aβ амилоидов, продуцируемых in vitro (рис. 5B) и in vivo (рисунок 6), и что с помощью этого подхода мы обнаружили более агрегаты у более старых червей по сравнению с молодыми червями.

(A) Супернатант от мусора из червя (PDS) из червей N2 (дикого типа) или CL2006 (Aβ) наносят на SDS-PAGE (Load) или обрабатывают, как описано на рисунке 5A (Eluate), прежде чем наносить на SDS-PAGE. Черви N2 (дикого типа) использовали на 1-й день взрослой жизни, тогда как черви CL2006 (Aβ) использовали в дни 1, 5 или 8 взрослой жизни. Гель переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которая была исследована для Aβ (≈4 кДа) с использованием антитела 6E10 или для тубулина (≈55 кДа) в качестве контроля загрузки. Количество образца, нанесенного на гель, было в 10 раз выше для элюата (10X) по сравнению с нагрузкой (1X). На дорожке 9 в качестве стандарта для Aβ использовали синтетический пептид Aβ1-40 (2 нг). Обратите внимание, что пептид Aβ1-40 протекает быстрее, чем Aβ, синтезированный в червях CL2006. (B) Количественная оценка полос Aβ панели (A). Поскольку фракции элюата не содержат тубулина, мы нормализуем полосы элюата, используя тубулиновые полосы образцов нагрузки. Количественная оценка была сделана с использованием программного обеспечения Фиджи, а полосы представляют собой стандартное отклонение двух экспериментов.

Биомаркеры ищут, чтобы идентифицировать болезнь Альцгеймера до начала когнитивной дисфункции [56]. Среди потенциальных биомаркеров AD — обнаружение олигомерных или фибриллярных видов Aβ в цереброспинальной жидкости (CSF) пациентов с АД [56], [57]. Поскольку протокол IP был эффективен при обнаружении фибрилл Aβ амилоида, полученных in vitro и in vivo, мы исследовали, может ли наш метод изолировать фибриллы Aβ амилоида от CSF, собранные у пациентов с AD. В качестве положительного контроля мы увеличили количество синтетических предварительно сформированных фибрилл Aβ1-40 в CSF из здорового контроля. В качестве отрицательного контроля мы использовали здоровый контроль CSF. Мы наблюдали, что эндогенный Aβ, присутствующий в CSF, который мы смогли обнаружить путем вестерн-блоттинга, полностью переваривался ПК (данные не показаны). Поскольку LOC-антитело слабо реагирует с мономерным Aβ (фиг. 4A), переваривание PK имеет важное значение для обеспечения того, чтобы любой Aβ, обнаруженный после IP, поступал из фибрилл Aβ, а не из мономерного Aβ. Как видно на фиг. 7А, иммунопреципитация с использованием LOC-антитела способна захватывать и обнаруживать 78 пг Aβ1-40 фибрилл (≈90 пМ), высунутых в здоровый человеческий CSF. Это количество составляет приблизительно 0,00002% от общего содержания белка в CSF [58]. Однако мы не смогли обнаружить какие-либо фибриллы Aβ с использованием протокола LOC IP в CSF от здоровых пациентов или пациентов с АД (рис. 7B, строки 1 и 3 соответственно). Мы также опустили стадию осаждения протеиназы K и ацетона перед IP с помощью LOC-антитела, но мы не обнаружили никаких фибрилл Aβ как у здоровых пациентов, так и у пациентов с АД (данные не показаны). На сегодняшний день фибриллы Aβ были обнаружены в CSF пациентов с АД только в одном исследовании [59]. В этом изящном исследовании Пичко и его коллег были добавлены флуоресцентно меченые мономеры Aβ1-42 к CSF пациентов с АД, а наличие больших пиков, обнаруженных флуоресцентной корреляционной спектроскопией, указывало на полимеризацию флуоресцентного Aβ1-42, засеянного мультимерами Aβ, присутствующими в CSF , Эти пики отсутствовали или на более низкой частоте в CSF здорового контроля. Линейность этого подхода была проверена с использованием синтетических мультимеров Aβ, как в нашем исследовании, и показала, что она составляет от 1 до 50 мкг / мл, на 3 порядка менее чувствительной, чем наш протокол. Правдоподобное объяснение этого несоответствия может быть связано с различными методологическими подходами, используемыми нашей группой и группой Пичко. Недавно мы продемонстрировали, что механизм агрегации Аβ представляет собой механизм зарождения конформационного превращения [60], аналогичный механизму, наблюдаемому белком припоя дрожжей Sup35 [61], [62]. В этом механизме белковые агрегаты от олигомеров, которые кинетически компетентны для образования амилоидных фибрилл [60]. Поскольку Aβ-олигомерные виды были обнаружены в CSF у пациентов с АД с использованием разных подходов [63] — [66], обнаружение гранулометрических олигомеров вместо зрелых фибрилл амилоида группой Пицке нельзя отбрасывать.

(А). Различные количества фибрилл Aβ1-40 амилоида добавляли к человеческому CSF, и образцы обрабатывали, как описано в схеме на фиг.5А. Как отмечено вестерн-блоттингом с использованием Aβ-антитела 6E10, пикограммы фибрилл Aβ были обнаружены в элюированной фракции иммунопреципитированного образца. (B) Тот же эксперимент, описанный в панели A, проводился с CSF у пациентов с диагнозом болезни Альцгеймера и соответствующего контроля по возрасту. Показан репрезентативный пример одного из трех испытанных образцов CSF. В качестве положительного контроля мы выкачали 750 пг фибрилл Aβ1-40 амилоида в человеческий CSF из здорового контроля. Отсутствие обнаружения растворимого Aβ в CSF связано с его перевариванием с помощью ПК.

Несколько групп описали использование биоинформатики [67] — [69] и скрининг in vivo [70], [71], чтобы найти новый амилоид. Для этой цели полезны биохимические аналитические методы, но некоторые другие цели не были подтверждены другими аналитиками, что свидетельствует о том, что выделение амилоидных фибрилл является сложным [72]. Наша двухэтапная стратегия закладывает основу для разработки чувствительного анализа для очистки и обнаружения амилоидных фибрилл. Одним из ограничений нашей стратегии был шаг IP, вероятно, связанный с аффинностью LOC-антитела к α-син и фибриллам амилоида галсолина. Важно подчеркнуть, что LOC-антитело способно распознавать все амилоидные фибриллы, которые были испытаны ранее в группе Glabe [10]. Однако, вероятно, из-за сложности используемой в этой работе реакционной среды, способность LOC-антитела к иммунопреципитации различных видов фибрилл была нарушена. Тем не менее, мы могли бы иммунопреципитации пикограмм фибрилл Aβ с использованием протокола, описанного здесь. Мы предполагаем сценарий, в котором могут быть созданы новые конъюгативные антитела амилоида, что делает использование этой методологии общим и не ограничивается очисткой фибрилл Aβ. LOC-антитело было эффективным при иммунопреципитации фибрилл Aβ, полученных in vivo, и описанная здесь методика может быть полезна для очистки фибрилл Aβ от биологических образцов, что дает фибриллы для более точной структурной и биохимической характеристики. Мы надеемся, что цели и ограничения, представленные в этой работе, дают новое понимание научно-исследовательскому сообществу, чтобы дать возможность разработать метод, который может быть использован для выделения амилоидных фибрилл из сложных решений.

Авторы благодарят доктора Коллин Фернс за критическое чтение и помощь в подготовке этой публикации. Мы благодарим доктора Дебора Фогуэля, доктора Татьяну Домитрович и доктора Антонио Нето за важные предложения и полезные обсуждения.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *