Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Прионы: генерация и распространение против нейротоксичности

Prions: Generation and Spread Versus Neurotoxicity
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4106307/

Нейродегенеративные заболевания характеризуются агрегацией несогласованных белков в головном мозге. К числу этих нарушений относятся прионные заболевания, которые являются трансмиссивными, и в которых засоренные белки («прионы») также являются инфекционным агентом. По-видимому, все чаще возникают несогласованные белки при болезнях Альцгеймера и Паркинсона, а также тауопатии также распространяются «прионно». Однако связь между образованием прионов, распространением и нейротоксичностью неясна. Недавно мы показали, что при прионном заболевании белковая диссоциация приводит к нейродегенерации путем дисрегуляции общих протеостатических механизмов, в частности, разложенного белкового ответа. Генетическая и фармакологическая манипуляция разложенным белковым ответом была нейропротекторной, несмотря на продолжение репликации приона, следовательно, отделяя ее от нейротоксичности. Данные имеют явные последствия для лечения во всем спектре этих расстройств, нацеливая патогенные процессы ниже по течению от белковых нарушений.

«Прион-подобный» характер нескольких нейродегенеративных заболеваний был предложен в течение ряда лет. Центральным понятием является распространение самораспространяющихся несогласованных белков от нейрона к нейрону по всему мозгу, связанное с более или менее стереотипными образцами нейродегенерации для конкретных заболеваний. Помимо прионного белка (PrP) 2 при архетипических прионных заболеваниях (типично заболевание Крейтцфельдта-Якоба (CJD)), доказательства того, что амилоид-β1-42 (Aβ), Tau и α-синуклеин все распространяются через мозг, являются убедительными , с явными последствиями для патогенеза болезни Альцгеймера, лобно-височных деменций и других тауопатий и болезни Паркинсона. Распространение (в мозге, по крайней мере) нейродегенеративных заболеваний с помощью белкового расщепления, по-видимому, является действительно общим явлением. Однако распространение несоизмеримого белка не является свидетельством нейродегенерации, и это вызывает критические вопросы о связи или ее недостатке между передачей патологических белков и их нейротоксическими эффектами. Какова взаимосвязь между токсичностью и «инфекционностью» при классических заболеваниях прионов и других нарушениях расстройства белков? Этот обзор рассмотрит эту взаимосвязь и обсудит преимущества сосредоточения внимания на нейротоксических путях ниже процесса репликации прионов для лечения этой группы расстройств.

Прионные заболевания являются смертельными трансмиссивными нейродегенеративными расстройствами людей и других млекопитающих (см. Watts and Prusiner (53) в этой серии). Классическое ветеринарное расстройство — скребок у овец; наиболее распространенным заболеванием человека является CJD. Инфекционный агент в настоящее время широко признается белком, который самореплицирует, не нуждаясь в нуклеиновых кислотах (1), подтверждая «гипотезу только для белка» передачи этих нарушений, впервые постулированную Гриффитом (2). Скребковый агент представляет собой белок, присутствующий в агрегированной форме, сильно нерастворимый в неионных детергентах и ​​частично протеазо-резистентный, с относительной молекулярной массой 27-30 кДа (3). Было установлено, что он известен как прионный белок PrP, он был кодирован эндогенным геном PRNP (4), который, как ни удивительно, был одинаково экспрессирован как у инфицированных, так и неинфицированных животных (4, 5). Нормальным продуктом гена PRNP является PrPC, для клеточного прионного белка, протеазочувствительный белок 33-35 кДа, тогда как ранее выделенный специфический для белков белок был назван PrPSc для ассоциированного с scrapie прионного белка. Эти две изоформы PrP имеют идентичные первичные структуры, но различаются по вторичной и третичной структуре. Центральный механизм инфективности включает изменение нормальной клеточной изоформы PrPC в PrPSc (6). Это превращение считается посттрансляционным изменением конформации, которое инициирует автокаталитическое превращение PrPC в PrPSc путем взаимодействия с существующими молекулами PrPSc. По мере того, как нейроны истощаются PrPC, недавно синтезированный PrPC обеспечивает больше субстрата для преобразования в PrPSc, который накапливается, преобразуя больше PrPC и т. Д. (Рис.1).

Схема прионного преобразования. Нативный прионный белок (PrPC, синие круговые формы) превращается в PrPSc (черные гексагональные формы) в автокаталитическом процессе во время репликации приона. Два белка имеют идентичную основную, но различную вторичную структуру. PrPSc богат β-листом, устойчив к протеазе и накапливается, рекрутируя больше PrPC для дальнейших циклов конверсии.

Выводы, что Tau, Aβ и α-синуклеин способны к типу шаблонных конформационных изменений, которые были впервые описаны для классических приосов спринсов и что эти изменения могли распространяться между клетками, были впервые установлены в моделях клеток (7-9). Подобно классическим прионам, эти белки также образуют четкие конформеры in vivo, и ряд изящных экспериментов подтвердил, что Aβ, мутантный Tau и мутантный α-синуклеин вызывают распространение в региональной патологии и прогрессировании болезни в моделях мыши (10-13). В последнее время сообщалось о распространении и рассогласовании α-синуклеина дикого типа, приводя к возникновению фенотипов «спорадических» типов у мышей (12, 14). Сообщалось также о распространении между животными (см. Holmes and Diamond (54) в этой серии), но передача через повторный проход, как определяет классические прионные заболевания, не наблюдалась.

Несмотря на универсальность явления, связанного с прионным распространением, не все эти модели, включая как классические CJD / scrapie, так и другие белковые складки, показывают, однако, связанную нейродегенерацию. Это поднимает важное понятие о том, что расстройства, связанные с расстройством белков, имеют два аспекта: во-первых, внутри клеточных (т.е. клеточно-автономных) процессов, которые вызывают клеточную дисфункцию и, в конечном счете, нейродегенерацию, а во-вторых, между клеточными (т.е. неэлементно-автономными) процессами, через которые развивается патология распространяется. Связь между ними неясна, но она важна как для понимания механизмов заболевания, так и для направления лечения.

В классических заболеваниях прионов репликация прионов включает превращение природного прионного белка (PrPC) в протеазоустойчивую, связанную с болезнью изоформу, которая совместно очищает с инфекционностью PrPSc (см. Выше). Учитывая его накопление в мозге и его способность передавать эти фатальные нейродегенеративные состояния, PrPSc обычно считался нейротоксичным видом. Однако диссоциация токсичных видов (то, что убивает нейроны) и инфекционный агент (распространяющийся прионный белок) в настоящее время хорошо установлена ​​(15-17). Доказательства этой диссоциации появились еще в 1993 году, с ориентировочными экспериментами первого Büeler et al. (18), а затем Manson et al. (19), который показал, что при отсутствии PrPC PrPSc не токсичен для мозгов инокулированных мышей PrP-нокаутом. Аналогично, только ткань дикого типа, экспрессирующая PrPC, привитая в мозг мышей PrP-нуль, проявила нейротоксическое действие прионной инфекции (20). Тем не менее, основные данные были получены при открытии субклинических состояний прионной инфекции, которые характеризовались экспериментальными животными, которые были бессимптомными носителями инфекционности, никогда не развивали клиническое заболевание на протяжении всей их продолжительности жизни (широко рассмотрены Хилл и Коллинг (16)). Аналогичные субклинические состояния наблюдались другими (21-23), и обратная ситуация, нейродегенерация с минимальными уровнями PrPSc, которая наблюдалась у некоторых унаследованных прионных заболеваний человека (24, 25) и на животных моделях (26), также поддерживала диссоциации. Интересно отметить, что отключение прионного превращения в нейронах во время прионной инфекции, но позволяющее продолжить его в астроцитах, приводит к глубокой нейропротекции и спасению нейронов от прионной токсичности, несмотря на массивное внеполональное накопление PrPSc (15, 27, 28). Удаление ангидрида гликозилфосфатидилинозитола из PrP высвобождает его с поверхности нейронных клеток и аналогично предотвращает нейротоксичность (29), несмотря на обширное экстраннурональное накопление PrPSc (это происходит со временем, несмотря на низкий уровень экспрессии анкерного PrP в этой модели). Опять же, результаты, о которых говорилось выше, подтверждают идею о том, что сам PrPSc непосредственно не токсичен для нейронов, а скорее указывает на то, что процесс превращения прионов внутри них приводит к побочным (косвенным) токсическим эффектам. Это критический вывод, поскольку он подразумевает наличие родовых, клеточных путей, опосредующих токсичность в классическом прионе, и, вероятно, в других нейродегенеративных заболеваниях.

Эта диссоциация между распространением прионов и нейротоксическим эффектом иногда наблюдается в других нейродегенеративных заболеваниях. Значительное исследование Clavaguera et al. (10), описывая прион-подобную передачу мутантного человеческого P301S Tau у мышей, аналогично показал распространение патологии без нейродегенерации, как и недавний отчет α-синуклеина дикого типа (14). Это контрастирует с распространением и болезнью в других моделях (12, 13, 30). Таким образом, автономные автономные и неэлементно-автономные механизмы сосуществуют, но они не обязательно одинаково влияют на нейротоксичность во всех случаях. Оба, однако, явно вытекают из одного и того же центрального явления: накопление неправильно скопленных белков.

Прион-подобные нейродегенеративные расстройства, в том числе классические прионные заболевания, а также болезни Альцгеймера и Паркинсона, а также тауопатии, а также боковой амиотрофический склероз, разделяют две ключевые особенности: накопление несогласованных белков (независимо от распространения) и потеря нейронов. Мы использовали прион-инфицированных мышей, чтобы понять связь между белковым расстройством и нейродегенерацией. Прион-пораженные мыши являются уникальными среди мышиных моделей нейродегенерации, поскольку они действительно рекапилируют человеческие расстройства и имеют обширную потерю нейронов в сочетании с накоплением несоответствующего белка.

Мы изучали мышей tg37, использованных в наших предыдущих исследованиях (15, 27, 28, 31-33). Эти мыши сверхэкспрессируют PrP примерно на 3-х уровнях дикого типа и поддаются прионной инфекции в Rocky Mountain Laboratory (RML) примерно через 12 недель (31). Наше первое ключевое наблюдение биохимически заключалось в том, что в контексте увеличения репликации прионов и повышения уровня ошибочного PrP произошло внезапное резкое сокращение количества синаптических белков через 9 недель после инфицирования (wpi). Это коррелирует с критическим снижением как числа синапсов, так и нейротрансмиссии, а также сопутствующего снижения поведения и потери памяти распознавания объектов. За ней следовали потери нейронов при 10 wpi (33). Снижение уровней синаптических белков при 9 wpi было явно катастрофическим событием, происходящим в критический момент во время процесса болезни. Мы спросили, отражает ли эта капля повышенная деградация белков или снижение синтеза. Известно, что путь ubiquitin proteasome ингибируется прионным заболеванием, что приводит к снижению, а не увеличению деградации белка (34). Поэтому мы спросили, был ли синтез белка уменьшен с помощью измененных механизмов трансляционного контроля. В частности, мы рассмотрели роль развернутого белкового ответа (UPR).

UPR является защитным клеточным механизмом, который индуцируется в периоды стресса клеточного и эндоплазматического ретикулума (ER), который направлен на поддержание гомеостаза, сгибающего белок в ER (35). УПО состоит из трех основных ветвей, все из которых активируются повышающимися уровнями несогласованных белков в ER. Два из них (ветви ATF6 и IRE1) приводят к изменениям транскрипции, которые увеличивают экспрессию шаперона для улучшения правильной складки белка. Третья ветвь PERK / eIF2α приводит к сигнальному каскаду, который приводит к временному отключению синтеза белка. Связывающий иммуноглобулиновый белок (BiP) обычно удерживает PERK в его неактивном состоянии, но когда он связан с разворачивающимися белками, он высвобождает PERK, который автодимеризуется и автофосфорилирует. Фосфорилированный PERK (PERK-P) фосфорилирует eIF2α, который затем ингибирует образование тройного комплекса, который нагружает 40 S рибосому на транскрипцию mRNA, которая должна быть переведена (36). Фосфорилированный eIF2α (eIF2α-P) плотно связывается с eIF2B, фактором обмена гуанином, который подает энергию для образования тройного комплекса, не позволяя ему поставлять ГТФ, необходимый для загрузки.

Таким образом, индукция UPR приводит к комплексным изменениям, включая перевод молекулярных шаперонов, синтез липидов для увеличения объема ER и уменьшение глобального синтеза белка для облегчения эффектов перегрузки разворачиваемых белков внутри ER. Активация UPR обычно является переходным событием; eIF2α-P быстро дефосфорилируется экспрессией фосфатазы GADD34 / PP1, позволяя перезапустить нормальный перенос белка (37).

Мы проанализировали активацию UPR при повышении уровня накопления прионного белка в течение болезни (см. Рис.3), поскольку PrP синтезируется в ER. Мы обнаружили, что прогрессирующее увеличение PERK-P и eIF2α-P сопровождалось прогрессированием заболевания (см. Рис. 3a). Уровни GADD34 не изменились, несмотря на рост уровней eIF2α-P, что указывает на недостаточность GADD34 для дефосфорилирования повышенных количеств eIF2α-P. Это показывает, что рука PERK / eIF2α UPR активируется прионной болезнью, ингибируя трансляцию белка и приводя к снижению уровней синаптических белков. Мы также исследовали мыши, выражающие еще более высокие уровни PrP, с более быстрыми временами инкубации прионов и мышами дикого типа. В каждом случае повышающиеся уровни несоответствующего прионного белка вызывали устойчивую активацию eIF2α-P и снижение синтеза белка на стадии последовательно ~75% через инкубационный период.

Мы измеряли общие скорости синтеза белка в гиппокампе путем включения радиоактивного метионина в белок в срезы гиппокампа, а также измеряли трансляцию специфической мРНК путем профилирования полисом. Наблюдалось 50% -ное снижение глобального синтеза белка (см. Рис. 3b) с одновременным уменьшением общего числа активных трансляций рибосом при 9 wpi (33). Нозерн-блоты SNAP-25 и β-актиновой мРНК также демонстрировали снижение активного трансляции. В отличие от мРНК АТФ4, которая ускользает из-за опосредованного eIF2α-P ингибирования трансляции из-за присутствия открытых открытых кадров считывания в его 5′-UTR (38), проявляется повышенный активный перевод. PrP-мРНК не проявляла сокращенного перевода, вероятно, из-за наличия аналогичных трансляционных контрольных элементов в гене PrP как ATF4.

Несмотря на то, что переходное фосфорилирование eIF2 является полезным для клеток, испытывающих стресс ER из-за неправильно скопленных белков, устойчиво высокие уровни eIF2α-P, вероятно, будут пагубными. Чтобы проверить, действительно ли eIF2α-P участвует в нейродегенерации приона in vivo, мы спросили, будет ли снижение уровня eIF2α-P при прионном заболевании быть нейропротективным. Для этого мы сверхэкспрессировали GADD34 с использованием лентивирусного вектора, чтобы напрямую уменьшить уровни eIF2α-P, и параллельно мы использовали целевые RNAi PrP для удаления источника активации UPR и предотвращения образования eIF2α-P (рис.2). Мы также задали вопрос о том, повышают ли повышенные уровни eIF2α-P прионную нейротоксичность с помощью салбринила, ингибитора дефосфорилирования eIF2α-P.

Схематическое представление PERK-подразделения UPR, приводящее к поступательным репрессиям и точкам вмешательства. Повышающиеся уровни несогласованных белков обнаруживаются путем связывания белка иммуноглобулина (BiP) в ER, активирующего PERK, который аутофосфорилирует и, в свою очередь, фосфорилирует eIF2α, что приводит к уменьшению трансляции. Снижение синтеза белка приводит к потере основных белков и, следовательно, синаптической недостаточности и нейродегенерации. Показаны точки действия GSK2606414 (специфического ингибитора PERK), лентивирус, опосредующего RNAi PrP (LV-shPrP), и лентувирус, сверхэкспрессирующий фосфатазу eIF2α-P, GADD34 / PP1 (LV-GADD34). Путем ингибирования / предотвращения фосфорилирования PERK (GSK2606414 и LV-shPrP) или дефосфорилирования eIF2α-P (LV-GADD34) восстанавливается синтез белка. (Salubrinal предотвращает дефосфорилирование eIF2α-P, усугубляя сокращение трансляции).

При 9 wpi мыши, которым вводили лентивирус, экспрессирующий GADD34, показали аналогичный уровень PERK-P в качестве необработанных мышей, демонстрируя, что UPR все еще активировался, но уровни eIF2α-P были уменьшены (рис.3) (33). RNAi против PrP предотвращало индуцированное PrP повышение PERK-P и eIF2α-P у необработанных животных, что подтверждает предотвращение активации UPR. Сверхэкспрессией GADD34 и нокаутом PrP были восстановлены глобальные скорости перевода по 9 wpi. В результате уровни синаптического белка, синаптическая трансмиссия и число синапсов у мышей с прионами, получавших нокдаун GADD34 или PrP, были защищены и эквивалентны уровням у неинфицированных контрольных мышей. Были предотвращены запаздывающие дефициты, и в гиппокампе была обширная защита нейронов, без потери нейронов и заметно уменьшенных губчатых изменений (рис.3). Важно отметить, что целевое выражение GADD34 и фокального нокаута PrP имело скромный, но весьма значительный эффект на выживание.

Манипулирование УПО спасает трансляцию и является нейропротективным у мышей с прионами.
a, lentivirally-опосредованная RNAi против PrP (синие полосы) или сверхэкспрессия GADD34 (зеленый) снижает уровни eIF2α-P. LV-shPrP, лентивирус, опосредующий RNAi PrP; LV-GADD34, lentivirus, сверхэкспрессирующий фосфатазу eIF2α-P, GADD34 / PP1. b, восстановление числа синапсов, глобальных скоростей синтеза белка, ропового поведения и числа нейронных клеток по сравнению с необработанными мышами с прионами (черные) или пустым контролем вектора (серый). Салюбринал (оранжевый) имел пагубные последствия в тех же экспериментах. Все данные на гистограммах показывают среднее значение ± S.E. *, р <0,01; **, р <0,001; ***, р <0,005. c, нейропротекторные эффекты RNAi избыточной экспрессии PrP или GADD34 в CA1 пирамидальной клеточной ленте гиппокампа от мышей, зараженных прионами. Адаптировано из Ref. 33.

Критически, лечение салбриналином имело противоположный эффект, предотвращая дефосфорилирование eIF2α-P. Таким образом, уровни eIF2α-P были заметно выше при 9 wpi, чем в контроле только прион, что приводило к дальнейшему подавлению глобального перевода. Салебринальное лечение приводило к более ранней тяжелой потере нейронов и значительно ускоренному заболеванию по сравнению с необработанными прион-инфицированными мышами.

Поразительная нейропротекция, достигнутая путем генетической манипуляции UPR, заставила нас предсказать, что фармакологическое ингибирование PERK / eIF2α-P будет также защищать. Мы использовали высокоселективный ингибитор PERK GSK2606414 (39), первоначально разработанный как противораковое соединение (рис.2). Поэтому мы обработали прион-инфицированные мыши tg37 GSK2606414, вводили перорально, через 7 недель после инфицирования. Ингибитор PERK предотвращал высокие уровни eIF2α-P и восстанавливал глобальные скорости синтеза белка. Как и в случае генетической манипуляции с УПО, мышей клинически вылечили (32), и по всему мозгу наблюдалась заметная нейропротекция (фиг.4), хотя воздействие на выживаемость нельзя было оценить из-за экзокринной поджелудочной токсичности, связанной с соединением, что привело к в потере веса, что требует прекращения эксперимента, несмотря на отсутствие прионных клинических признаков. Благоприятные эффекты сохранялись для животных, которые лечились как на доклинической стадии, так и позже при болезни, когда появились признаки поведения (32). Критически, соединение действует вниз по течению и независимо от первичного патогенного процесса репликации приона и эффективно, несмотря на продолжающееся накопление PrP. Интересно, что мы считаем, что UPR инициируется повышением уровня общего синтеза PrP в ER, а не прямым эффектом агрегации PrPSc, поскольку это происходит в основном внеклеточно или внутри эндосомального отделения. Ранее мы обнаружили, что общий уровень ПРР мРНК увеличивается во время прионной инфекции, что говорит о том, что усиленный синтез нативного PrP может привести к неправильной работе и активации UPR (33), и есть данные, что чрезмерная экспрессия продукции белка может индуцировать маркеры UPR (40).

Ингибирование PERK GSK2606414 предотвращает клиническое заболевание у прион-инфицированных мышей.
a, мышей обрабатывали GSK2606414 (синий) или носителем (красный) от 7 wpi. b-c, GSK2606414 восстановили глобальные скорости синтеза белка (b), предотвратили потерю новой памяти объекта (c) и дали выраженную нейропротекцию в гиппокампе (d). e, уровни общего PrP и PrPSc (как показано расщеплением протеиназы K (PK)) не подвергались лечению. f и g, клиническое лечение у обработанных мышей с нормальной позой и движением задних ног. Все данные на гистограммах показывают среднее значение ± S.E. Контроль представляет собой мышей, инокулированных нормальным гомогенатом головного мозга (белый бар) (n = 12 для каждого) (*, p <0,01). Адаптировано из Ref. 32.

Повышенные уровни активации UPR и PERK-P и eIF2α-P были описаны в мозгах болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и пациентов с прионными заболеваниями (41-45), а генетические полиморфизмы в PERK предрасполагают к прогрессирующему надъядерному параличу тауопатии (46 ). Значение переопределения UPR не ясн, но несколько нитей доказательств указывают на то, что здесь также стимулирование синтеза белка, когда это хронически ингибируется, было бы нейрозащитным. Изучение и память зависят от синтеза белка (47), и недавние данные показали, что ингибирование этого пути увеличивает познание у мышей дикого типа (48) и предотвращает когнитивные дефициты в моделях мыши болезни Альцгеймера (49). Восстановление переноса белка в модели дрозофилы Drosophila и модели нейронов млекопитающих из амиотрофического бокового склероза с использованием GSK2606414 также показало преимущества в снижении токсичности (50). Поэтому данные связывают этот путь с памятью и познанием, а также с глобальным здоровьем нейронов и жизнеспособностью в области здоровья и болезней. Программы поддержки лекарств, поддерживающие данные, нацелены на PERK и других участников этого пути для лечения приона и, возможно, других индуцирующих UPR, нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона.

Взаимосвязь между токсичностью и инфекционностью прионных заболеваний и другими расстройствами, связанными с расстройством белков, сложна, и мы сделали наш случай для нацеливания на последующие эффекты разворачиваемого накопления белка. Однако интуитивно, включая распространение и снижение стимула к индукции UPR, должно быть полезным, предотвращая прогрессирование, которое характеризует клиническую эволюцию этих заболеваний, поскольку дальнейшие области мозга «завербовываются» со временем. Вопрос в том, как это сделать. Один из подходов состоит в том, чтобы назначать специфические для болезни антитела против насекомых-белков, которые были предложены для Tau и SOD1 (см. Обзор Holmes and Diamond (54) в этой серии). В качестве альтернативы существуют ли общие механизмы распространения, которые могут быть нацелены? Ясно, что существуют общие структурные особенности олигомерных форм этих белков; антитела, выращенные против олигомеров PrP, также обнаруживают олигомерные формы ряда других амилоидных белков, включая Aβ (51). Если бы такие структурные особенности были задействованы в универсальном механизме распространения белка, они могли бы представлять собой общую терапевтическую мишень для многих нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, могут существовать общие клеточные пути, включая механизмы экзосомального и синаптического высвобождения, лежащие в основе патологического распространения, которые также могут быть потенциально нацелены. Действительно, нейроанатомическая основа этой пропаганды была недавно установлена ​​демонстрацией транссинаптического распространения мутанта Тау (39, 52), хотя точно так же это происходит до сих пор неясно.

Таким образом, обнаружение родовых явлений, таких как распространение несогласованных белков и их влияние на протеостаз, стимулирует новое понимание нейродегенеративных заболеваний, которые могут привести к новым терапевтическим подходам. Однако нам все еще нужно понимать гораздо больше об этих процессах на молекулярном уровне и о том, как автономные клетки и автономные механизмы, не связанные с клеткой, связаны друг с другом в этих нарушениях, прежде чем мы сможем определить баланс, необходимый при ориентации этих процессов на терапию ,

Используемые сокращения:
Белок PrPprion

сотовый PrP

ошибочный PrP

болезнь Крейтцфельдта-Якоба

амилоид-β1-42

разложенная реакция белка

эндоплазматический ретикулум

протеинкиназа РНК-подобная ER-киназа

фосфорилированный PERK

фосфорилированный eIF2α

недель после заражения.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *