Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Icariin снижает экспрессию APP и BACE-1 и уменьшает бета-амилоидное бремя в APG-трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера

Icariin Decreases the Expression of APP and BACE-1 and Reduces the β-amyloid Burden in an APP Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3927130/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Цель: Целью данного исследования было исследование влияния и фармакологических механизмов икариина, который является основным компонентом традиционной китайской травы Epimedium, на продукцию β-амилоида (Aβ) в трансгенном (Tg) амилоидного предшественника (APP) мышиная модель болезни Альцгеймера (AD).

Методы: мыши APPV717I Tg были случайным образом разделены на модельную группу и обработанные icariin (30 и 100 мкмоль / кг в день) группы. Возможности обучения-памяти были определены с помощью лабиринта Морриса и тестов распознавания объектов. Содержание Aβ измеряли с помощью иммуноферментных иммуноферментных анализов и иммуногистохимии. Амилоидные бляшки были обнаружены красным окрашиванием Конго и окрашиванием серебра Бельшовского. Уровни экспрессии APP и β-сайта APP-расщепляющего фермента 1 (BACE-1) измеряли путем вестерн-блоттинга и иммуногистохимии.

Результаты: десятимесячные мыши Tg продемонстрировали очевидные нарушения памяти для обучения и значительное увеличение содержания Aβ, амилоидных бляшек и уровней APP и BACE-1 в гиппокампе. Внутрижелудочное введение мышей icariin to Tg в течение 6 месяцев (от 4 до 10 месяцев) улучшало способности к обучению и значительно уменьшало содержание Aβ, амилоидные бляшки и уровни APP и BACE-1 в гиппокампе.

Вывод: Icariin уменьшил нагрузку Aβ и осаждение амилоидных бляшек в гиппокампе трансгенных мышей APP, уменьшив уровни APP и BACE-1. Эти новые данные свидетельствуют о том, что icariin может быть перспективным лечением у пациентов с AD.

Болезнь Альцгеймера (AD) является нейродегенеративным расстройством, которое характеризуется накоплением амилоидных бляшек, образованием нейрофибриллярных клубок и селективной гибелью нейронов в мозге 1. Отложение β-амилоида (Aβ) является ключевым патологическим событием в этом 2. Он был идентифицирован как основной компонент старческих бляшек в головном мозге AD, и, таким образом, он является главной целью терапии AD. Aβ-пептиды, содержащие 40 или 42 аминокислоты, получают путем последовательного расщепления белка-предшественника амилоида (APP) β-секретазой и γ-секретазой 3. β-сайт APP-расщепляющий фермент-1 (BACE-1, то есть β-секретаза ) играет критическую роль в производстве Аβ и амилоидозе в центральной нервной системе, поэтому он считается высокоприоритетной терапевтической мишенью 4, 5. Было показано, что мутации в APP человека в местах расщепления β- или γ-секретазы связанный с ранним началом семейного AD, который характеризуется повышенными уровнями Aβ1-42. 6. Следовательно, трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют человеческий мутантный APP на высоких уровнях, широко используются при изучении AD-патогенеза или анти-AD-препаратов.

APG-трансгенные мыши, которые проявляют нейродегенеративные изменения в поведенческих, биохимических и гистопатологических аспектах, которые аналогичны тем, которые наблюдаются у пациентов с AD, являются ценной моделью животных для исследований профилактики и лечения AD 7. В нашем предыдущем исследовании трансгенные мыши APPV717I, которые сверхэкспрессировали нейрон специфические трансгены с лондонскими мутациями (V717I) в APP человека проявили дефицит в обучении и памяти со старением, ультраструктурными повреждениями и уменьшением экспрессии белка в синапсах 8.

Icariin (C33H40O15, молекулярная масса 676,65) является основным активным компонентом, выделенным из традиционной китайской травы Epimedium 9, и, как сообщается, имеет различные фармакологические эффекты, такие как защитные эффекты сердца 10, противовоспалительные эффекты 11 и даже противоопухолевые свойства 12. Согласно некоторым исследованиям, посвященным фармакокинетике икариина, было доказано, что икариин может проходить через гематоэнцефалический барьер 13, 14. Несколько исследований показали, что икариин улучшает способности к обучению и памяти у пожилых крыс или инъекции гиппокампа Аβ25-35 крыс 15, 16, но эти модели не были точными моделями AD. Urano et al. сообщили, что введение icariin улучшает ухудшение пространственной памяти в модели трансгенной мышиной мыши (5xFAD) и аттенуированную атрофию нейрита в модели клеток in vitro, индуцированную Aβ1-42 17, но они не обнаруживали APP, секретазы, Aβ и амилоидные бляшки in vivo , Поэтому было неясно, может ли icariin влиять на основные белки и ферменты в амилоидогенном пути Aβ в модели трансгенной мыши мыши.

Трансгенные мыши APPV717I, которые размножаются на штамме C57 / BL6, экспрессируют высокие уровни APP751 человека, содержащие мутацию в Лондоне (V717I) под промотором 18 фактора роста тромбоцитов, что приводит к заметному увеличению продукции Aβ1-42 19. В в настоящем исследовании мы исследовали фармакологические эффекты и механизмы icariin на ключевых этапах продуцирования и осаждения Aβ в модели трансгенной мыши ADPV717I AD.

Это исследование было одобрено Комитетом по этике животных Госпиталя Xuanwu Capital Medical University.

Икарий с молекулярной массой 676,65 (C33H40O15) был получен из Национального института контроля за продуктами и лекарствами (Пекин, Китай). Порошок icariin (с чистотой 99%, определяемый с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографического анализа) растворяли в дистиллированной воде и внутрижелудочно вводили мышам между 8 и 9 утрами каждый день.

В настоящем исследовании трехмесячные APPV717I трансгенные (Tg) мыши были получены из Института экспериментальных животных Китайской академии медицинских наук (Пекин, Китай). Мутация гена у каждой мыши была подтверждена полимеразными цепными реакциями периферической крови. Жилье для животных и все экспериментальные процедуры соответствовали требованиям Положений и общих рекомендаций китайского законодательства об экспериментальном управлении животными. Животных размещали в 12/12-часовом темном / световом цикле и в стандартных условиях без патогенов. У них был свободный доступ к еде и воде на протяжении всего эксперимента.

После 4-недельной акклиматизации в их домашнюю клетку 4-месячные мыши APPV717I Tg были случайным образом разделены на 3 группы: APP Tg, APP Tg + ICA 30 мкмоль / кг и APP Tg + ICA 100 мкмоль / кг. Каждая группа состояла из 18 мышей (половина женщин и половина мужчин). Такое же количество трансгенно-негативных и нетрансгенных мутантов C57 / BL6 служило как контроль Tg (-), так и нормальный контроль соответственно.

Мышам в группах APP Tg + ICA ежедневно вводили желудочный раствор растворенного икариина (0,1 мл / 10 г веса), и все мыши в других группах внутрижелудочно вводили равный объем дистиллированной воды один раз в день в течение 6 месяцев, начиная с 4-месячного возраста.

Этот MWM состоял из 4-х дней обучения в учебной памяти и пробного исследования, которое было применено на 5-й день. Животных обучали в круглом бассейне (диаметром 120 см), который располагался в освещенной комнате с визуальными репликами. Эвакуационная платформа (диаметром 9,5 см) была погружена на 1,0 см ниже поверхности воды в бассейне, которая поддерживалась на уровне 23 ± 2 ° С и смешивалась с молочным порошком, чтобы замаскировать платформу. Расположение платформы оставалось в центре северо-западного квадранта в течение 4-дневного периода обучения. В каждый день мышей обучали в 1 утреннем и дневном блоках. Каждый блок состоял из 2 испытаний, и каждое испытание длилось 120 с или заканчивалось, как только мыши достигли погруженной платформы, таким образом вырвавшись из водного лабиринта. Перед первым тропом каждую мышь помещали на платформу в течение 15 с, за которой следовало свободное плавание на 60 секунд, а затем мышам помогали на платформу, где она оставалась еще на 15 секунд отдыха. Затем началось испытание: мышь была выпущена в воду, обращенную к стене бассейна, поворачиваясь на север, юг, восток и запад для каждого испытания. Независимо от того, находилась ли мышь или не находила платформу в течение 120 с, она была размещена на платформе в течение 15 с. Были собраны данные об лавинных побегах из водного лабиринта, которые были определены как обнаружение погруженной платформы для эвакуации, и расстояния, на которых проходили мыши, и были рассчитаны скорость плавания каждой мыши в каждом отдельном исследовании. Испытание зонда было сформировано путем удаления платформы и позволяя каждой мыши свободно плавать в течение 60 с внутри бассейна. Время и расстояние для плавания каждой мыши в целевом квадранте, когда платформа была удалена, были записаны с помощью компьютеризированной видеосистемы. Отношение времени и расстояния в квадранте к числу во всем пуле рассчитывалось и сравнивалось между группами.

Наблюдательная арена размером 45 см × 35 см × 20 см состояла из белого пластика и находилась в испытательной комнате, которая была тускло освещена постоянным освещением около 40 лк на испытательной площадке. Выбранными объектами были 3 одинаковых кубических синих пластиковых блока (A, 4,5 см × 4,5 см × 5 см) и белый цилиндрический пластиковый флакон (B, высота: 7 см, диаметр: 4 см), который был заполнен водой. Эти объекты были достаточно тяжелыми, чтобы предотвратить перемещение мышей. Согласно нашему экранирующему тесту, эти 2 вида объектов вызвали примерно одно и то же время исследования относительно другого. Два идентичных набора арен и объектов использовались 2 наблюдателями, которые проводили тесты самостоятельно в одной комнате, но которые были скрыты друг от друга. Каждый человек случайно тестировал половину мышей в каждой группе. Испытание продолжалось 3 дня. В первый день мышей помещали на арену в течение 10 мин, чтобы уменьшить неофобные реакции и приучить животных к стимулам, которые были представлены на пустой арене. На второй день 2 одинаковых объекта (A1A2 или B1B2) были размещены с противоположных сторон на каждой арене на расстоянии 8 см от стен и между ними 29 см. Мышей помещали в середину пространства между объектами, чтобы начать 10-минутный период обучения и обучения объекта. На третий день на арену были помещены 1 знакомый (ранее наблюдаемый) объект и 1 новый объект (A3B или B3A для каждой арены), а мыши были помещены посередине пространства между объектами, чтобы начать 10-минутный объект распознавание тест. Исследование объекта определялось как выставка ориентации, в которой рыло животного было перемещено к объекту, а мышь находилась на расстоянии не более 2 см от объекта. Инциденты мыши, бегущие вокруг объекта или сидящие на нем, не были зарегистрированы как исследовательское поведение. Объекты промывали этанолом после каждого отдельного испытания, чтобы приравнять обонятельные сигналы. Время, проведенное с изучением знакомого объекта и нового объекта в дни 2 и 3, наблюдалось визуально и приурочено к секундомерам. Позиции объектов (по сторонам арены) чередовались для каждого животного, чтобы уменьшить ошибки в наших собранных данных. Время, в течение которого мыши выставляли исследуемое поведение, регистрировалось и использовалось для расчета индекса дискриминации памяти (DI), как сообщалось ранее 21. DI = (N — F) / (N + F), где N — время, потраченное на изучение нового объект, а F — время, потраченное на изучение знакомого объекта. Высшее значение ДИ считалось отражением большей способности памяти.

Для анализа вестерн-блоттинга мы использовали антитела против APP, анти-BACE-1 и анти-PS-1 от Sigma-Aldrich Co. LLC (Сент-Луис, Миссури, США). Гиппокампи из 5 отдельных мышей в каждой группе гомогенизировали в ледяном буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,5 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты, 150 мМ NaCl и 1% коктейля ингибитора протеазы (Sigma- Aldrich Co. LLC). Анализ вестерн-блоттинга проводили, как описано ранее 22. Белки отделяли электрофорезом додецилсульфата натрия (SDS) -полиакриламида, блоттировали на мембране из поливинилиденфторида и взаимодействовали с первичным антителом. В качестве вторичного антитела использовали конъюгированный с конъюгированной с лошадиным конъюгатом козьим антимышиным IgG (1: 5000). Иммунореактивные полосы были визуализированы с помощью улучшенной хемилюминесценции (ECL system, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, США) и подверглись воздействию рентгеновской пленки (Kodak, Rochester, NY, USA).

Для иммуногистохимического окрашивания мы использовали анти-Aβ, анти-APP, анти-BACE-1 и анти-PS-1 моноклональные антитела (Sigma-Aldrich Co. LLC). Пять мышей в каждой группе умерщвляли и немедленно перфузировали через сердце 0,9% NaCl, за которым следовал 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере в течение 10 мин. Мозги постфиксали погружением в течение 4 дней, а затем криозащиты в 20% сахарозе. Мозги быстро замораживали в среде внедрения OCT, а замороженные участки толщиной 20 мкм пропускали через гиппокамп и обрабатывали в условиях свободного плавания. Иммуногистохимические процедуры для легких микроскопических исследований проводили, как описано ранее 22 с небольшими изменениями. Разделы обрабатывали 0,1 М фосфатно-буферным солевым раствором, содержащим 0,3% Triton X-100 (PBST) в течение 4 дней и сначала инкубировали с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C. Затем секторы инкубировали со вторым биотинилированным козьим антимышиным IgG-антителом (1: 1000) при комнатной температуре в течение 2 часов и, наконец, конъюгированным с хрена стрептавидином (1: 1000) при комнатной температуре в течение 1 часа. Активность пероксидазы была обнаружена 0,02% 3,3′-диаминобензидином в 0,05 М буфере Tris-HCl, pH 7,6, содержащем 0,005% Н2О2 и 0,3% сульфата никеля аммония. Витражные секции были установлены на стеклянных предметных стеклах, обезвожены, очищены и покровные. Количественный анализ нагрузки Aβ выражали как процентную площадь отложений Aβ во всей области ткани головного мозга, которая была исследована.

Три слайда от каждой мыши регидратировали в градуированных спиртах, погружали в гематоксилин в течение 2 мин и затем погружали в соляной спирт в течение 10 с. Во-первых, секции промывали в проточной водопроводной воде, пока она не стала синей и дистиллированной водой 2 раза. Затем секции окрашивали в Конго красным цветом в течение 40 мин при комнатной температуре перед промыванием в проточной воде; Затем их погружали в карбонат лития в течение 5 с и промывали проточной водопроводной водой. Алкоголь (80%) использовали для дифференциации неспецифического фонового окрашивания, и секции затем промывали в проточной водопроводной воде в течение 10 мин, очищали в ксилоле и покрывали нейтральной смолой.

Три слайда от каждой мыши были повторно гидратированы в градуированных спиртах до промывания в дистиллированной воде 3 раза. Затем их погружали в 2-4% раствор нитрата серебра в течение 25-35 мин при 37 ° С в темноте. Слайды промывали в дистиллированной воде 3 раза после удаления раствора нитрата серебра. Окрашивание дезоксидировали 10% формальдегидом до тех пор, пока слайд не изменился до бледно-желтого цвета. Слайды 3 раза промывали дистиллированной водой и удаляли избыток воды. Раствор аммиачного серебра (200 мкл) добавляли к каждому слайду в течение 5 мин. Избыток раствора удаляли, а слайды погружали в 8% -ный формалин в течение 2 мин. Слайды вращались несколько раз, пока желтый краситель не остался стабильным. Секции фиксировали в 5% тиосульфате натрия в течение 5 мин. Слайды высушивали на открытом воздухе, очищали в ксилоле, а затем посыпались для микроскопических исследований.

С высокоспецифическими антителами и чувствительным сэндвич-ELISA мы количественно определяли Aβ1-42 в фракциях гомогената головного мозга, которые экстрагировали TBS (50 мМ Трис-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl) или 2% SDS и 70% муравьиной кислоты, соответственно, как описано ранее. Замороженные образцы гиппокампа гомогенизировали гомогенизатором в 1 мл TBS / полного ингибитора протеазы плюс 20 мкг / мл пепстатина A (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия), а затем центрифугировали при 100000 × g в течение 1 часа при 4 ° C с Optima Ультрацентрифуга TLX (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, США). Супернатанты TBS хранили при -80 ° С и гранулы гомогенизировали в 1 мл 2% SDS / TBS с помощью ингибитора протеазы (Roche Diagnostics GmbH). Затем их центрифугировали при 100000 × g в течение 1 часа при 25 ° C после инкубации в течение 15 минут при 37 ° C. Гранулы, которые соответствовали нерастворимой фракции, промывали один раз и затем экстрагировали дополнительно 1 мл 70% муравьиной кислоты. Затем их центрифугировали при 100000 × g в течение 1 часа. Супернатанты нерастворимых экстрактов 70% муравьиной кислоты нейтрализуют 1 М Трис-HCl (рН 8,0) при разведении 1:20. Для количественной оценки Aβ1-42 мы использовали специфический набор ELISA (№ 27711, распознающий человеческий Aβ1-42, а перекрестная реактивность с мышью Aβ1-42 составляла 70,9%, Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd., Gunma, Japan) в соответствии с к инструкциям производителя.

Все данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Различия между группами были проанализированы с односторонним анализом дисперсии (ANOVA) с последующим сравнительным сопоставлением пост-hoc Duncan. Значения Р менее 0,05 считались статистически значимыми.

В настоящем исследовании водный лабиринт Морриса использовался для изучения пространственного обучения и памяти у мышей. Задержка латентности в первом испытательном испытании среди групп варьировалась от 89,94 с до 97,18 с, что не указывало на существенную разницу между группами. «Escape latency» на рисунке 1 — это данные в последнем испытании после 4-дневного обучения. Обе мышей Tg (+) с 4 и 10 месяцами показали значительно длительные латентные задержки при сравнении с сопоставимой по возрасту трансгенно-отрицательной [Tg (-)] контрольной группой (P <0,05, P <0,01). Летные задержки 10-месячных мышей Tg (+) были значительно длиннее, чем у 4-месячных Tg (+) мышей (P <0,01), тогда как между нормальной контрольной группой и возрастом (-) группа (рис. 1А). Тем не менее, 10-месячные мыши Tg (+), которые внутрижелудочно обрабатывались icariin (100 мкмоль / кг) в течение 6 месяцев, начинающихся с 4 месяцев, показали значительно более короткие задержки задержек, чем 10-месячные Tg, обработанные обработкой Tg (+) мышей (Р <0,01, фиг.1В).

В пробных испытаниях водного лабиринта Морриса мышам было разрешено искать платформу в течение 60 с в пустом лабиринте. На фиг.1С показаны групповые различия среднего процентного времени поиска в целевом квадранте по сравнению со всем пулом во время пробного исследования. По сравнению с группой Tg (-), сопоставимой с возрастом, мышей Tg (+) в 4 месяца и 10 месяцев показали значительно меньшее время в целевом квадранте (P <0,05, P <0,01). Время в целевом квадранте показало значительное снижение у 10-месячных мышей Tg (+) по сравнению с таковыми у 4-месячных мышей Tg (+) (P <0,05), в то время как между нормальным контрольная группа и возрастная группа Tg (-) (рис.1C). 10-месячные мыши Tg (+), которые были обработаны icariin (100 мкмоль / кг) в течение 6 месяцев, начиная с 4 месяцев, показали значительно более длительное время в целевом квадранте, чем 10-месячный Tg (+) мышей (P <0,01, фиг.1D).

В тесте распознавания объектов (ORT) не было существенной разницы в времени исследования до 2 идентичных объектов на второй день среди групп (данные не показаны). На 3-й день 10-месячные мыши Tg (+) показали значительное снижение индекса дискриминации памяти (DI) по сравнению с обеими по возрасту Tg (-) мышами (P <0,05) и 4-месячным Tg ( +) мышей (Р <0,01, фиг.2А). DI был значительно увеличен у мышей, которые обрабатывались icariin (100 мкмоль / кг) в течение 6 месяцев по сравнению с модельными мышами Tg (+) (P <0,05), что свидетельствует об улучшении памяти распознавания объектов с помощью лечения icariin (рис.2B ). Не было существенной разницы в общем времени исследования (N + F), которое наблюдалось среди групп.

Эти результаты свидетельствуют о том, что icariin улучшал дефицит обучения и памяти у мышей Tg (+).

Иммуногистохимическое окрашивание анти-Aβ1-16 использовали для оценки общей нагрузки Aβ в мозге мыши. Число Aβ-позитивных клеток было значительно увеличено в области CA1 гиппокампа у мышей Tg (+) в возрасте 10 месяцев по сравнению с таковой в контрольной группе Tg (-), соответствующей возрасту. Мыши Tg (+), которые были обработаны 100 мкмоль / кг icariin, показали очевидное снижение числа Aβ-положительных клеток по сравнению с таковыми у мышей Tg (+) (фиг.3A).

Поскольку антитело против Aβ1-16 не может различать Aβ1-40 и Aβ1-42, а Aβ1-42 является более цитотоксичным и более вероятно, что он будет агрегатироваться с образованием бляшек, чем Aβ1-40, мы дополнительно изучили Aβ1-42 с помощью ELISA. В результате было установлено, что уровни Aβ1-42 значительно увеличиваются в гиппокампе мышей Tg (+) в возрасте 10 месяцев по сравнению с контрольной группой Tg (-), соответствующей возрасту (P <0,01). Эти увеличенные уровни были уменьшены путем лечения 30 и 100 мкмоль / кг icariin в течение 6 месяцев (от 4 до 10 месяцев) по сравнению с таковыми у модельных мышей Tg (+) (P <0,01) (фиг.3B).

Конго красный использовали для окрашивания амилоидных бляшек в мозге мышей, а положительно окрашенные области измеряли с помощью системы анализа изображений, чтобы определить количество амилоидных бляшек. Результаты показали, что амилоидные бляшки были рассеяны в молекулярном / полиморфном слое гиппокампа, а редкие амилоидные бляшки были распределены в пирамидальном клеточном слое. Амилоидные бляшки демонстрировали светло-красную дисперсию без четких границ, а окраска бляшек была плотнее в гиппокампе Tg (+) мышей (фиг.4А). Молекулярный слой в гиппокампе 10-месячных мышей Tg (+) имел больший процент областей, которые были положительными для амилоидных бляшек, чем контрольная группа Tg (-), соответствующая возрасту (P <0,01). После введения icariin (30 и 100 мкмоль / кг) в течение 6 месяцев окрашивание бляшек было легче, а положительно окрашенные области амилоидных бляшек были значительно уменьшены (P <0,01) (фиг.4B).

Результаты серебряного окрашивания Bielschowsky также показали, что амилоидные бляшки были в основном рассеяны в молекулярном слое гиппокампа, и эти результаты были согласуются с результатами красно-красной окраски Конго. Зрелые амилоидные бляшки демонстрируют круглые, овальные или неправильные формы, глубоко окрашенные ядра и мелкие окружающие ореолы при большом увеличении. Диффузные бляшки появились как свободные ретикулярные сферы со светлой окраской и без глубоко окрашенного и плотного ядра. Количество амилоидных бляшек было увеличено в молекулярном слое гиппокампа, а преобладающе зрелые амилоидные бляшки были плотными и глубоко окрашенными у мышей Tg (+) в возрасте 10 месяцев, тогда как мыши Tg (-), не соответствующие возрасту, не имели бляшек в гиппокамп. Амилоидные бляшки в этих областях мозга у 30 и 100 мкмоль / кг мышей, обработанных акарином Tg (+), оказались диффузно и слегка окрашены, а количество бляшек было уменьшено по сравнению с количеством в модели Tg (+), сопоставимой по возрасту (+ Фиг.4С).

Уровни APP, которые были обнаружены вестерн-блоттингом, были значительно увеличены у мышей Tg (+) по сравнению с уровнями в контрольной группе Tg (-), соответствующей возрасту (P <0,05). После введения икариина в дозах 30 и 100 мкмоль / кг в течение 6 месяцев уровни экспрессии APP были явно уменьшены по сравнению с уровнями в модельной группе Tg (+) (P <0,05, P <0,01) (фиг.5A и B ). 6-месячная обработка 100 мкмоль / кг icariin не показала значительного изменения экспрессии APP у обычных мышей C57 / BL6 (данные не показаны).

Экспрессия APP также наблюдалась в областях CA1 гиппокампа с иммуногистохимическим окрашиванием. N-конец APP-положительных маркеров представлен в виде коричневых гранул, которые в основном были распределены в нейронной цитоплазме гиппокампа, наблюдаемой под световым микроскопом. По сравнению с контрольной группой Tg (-), APP-положительные клетки были значительно увеличены при глубоком окрашивании в цитоплазме в областях CA1 гиппокампа 10-месячных мышей Tg (+). В группе, обработанной icariin на 100 мкмоль / кг, было показано меньше APP-положительных клеток в областях CA1 гиппокампа по сравнению с таковыми у модельных мышей Tg (+) (фиг.5C).

Уровни экспрессии BACE-1 (β-секретазы) в гиппокампе 10-месячных мышей были обнаружены вестерн-блоттингом. Результаты показали значительно более высокие уровни экспрессии BACE-1 у мышей Tg (+) по сравнению с таковыми в контрольной группе Tg (-) (P <0,01). Высокие уровни экспрессии BACE-1 у мышей Tg (+) были значительно снижены путем введения иариина в дозе 100 мкмоль / кг в течение 6 месяцев (P <0,05) (фиг.6A и B).

Экспрессия BACE-1 также наблюдалась в области CA1 мышиного гиппокампа с иммуногистохимическим окрашиванием. Гранулы коричневого цвета, которые представляли собой положительное иммуногистохимическое окрашивание BACE-1, наблюдались в нейронной цитоплазме с помощью световой микроскопии. По сравнению с контрольной группой Tg (-) положительные клетки BACE-1 были значительно увеличены, и они проявили плотное окрашивание в цитоплазме в гиппокампе CA1 у 10-месячных Tg (+) мышей. У Tg (+) группы, обработанной icariin на 100 мкмоль / кг, было меньше BACE-1-положительных клеток в области CA1 гиппокампа по сравнению с группой модели Tg (+) (фиг.6C).

Трансгенные мышиные модели с мутантным APP широко использовались как для исследования механизмов AD, так и для оценки эффектов лекарств. Сообщалось, что APP V717I (валин, превращенный в изолейцина) -мышечные мыши, которые чрезмерно экспрессируют APP человека с мутантом в аминокислоте 717, являются высокоценной моделью патологии амилоидов 23. В настоящем исследовании мы подтвердили, что трансгенные мыши APPV717I ухудшение способности к запоминанию памяти уже в течение 4 месяцев, и это усугублялось у 10-месячных мышей Tg. Внутрижелудочное введение icariin в течение 6 месяцев значительно сокращало задержки лавин в тесте на водный лабиринт Морриса и, очевидно, увеличивало показатель дискриминации в тесте распознавания объектов у мышей Tg (+) в возрасте 10 месяцев. Icariin улучшило дефицит памяти обучения в модели животных AD, предполагая, что icariin может иметь потенциал для лечения пациентов с АД и улучшить их симптомы когнитивных нарушений.

Амилоидные бляшки являются одним из характерных патологических признаков AD, и отложение Aβ является основной причиной образования бляшек. Чтобы исследовать положительные эффекты терапии icariin в AD, мы исследовали амилоидные бляшки и бремя Aβ в мозге мышей APP Tg. Результаты показали значительное увеличение амилоидных бляшек и бремя Aβ в гиппокампе 10-месячных мышей APP Tg (+), что согласуется с другими сообщениями 23, 24. Введение icariin у мышей Tg (+), очевидно, уменьшилось амилоидные бляшки и бремя Аβ. Так как Aβ1-42 является более цитотоксичным и, более вероятно, агрегирует с образованием бляшек, чем Aβ1-40
25, мы дополнительно изучили Aβ1-42 с ELISA в нашем исследовании. В возрасте 10 месяцев уровни Aβ1-42 в гиппокампе были значительно выше у мышей Tg (+), чем у контрольных мышей Tg (-). Существенных различий между мышами APP Tg (-) и не-Tg нормальными мышами не было в общих данных всего исследования. Следовательно, можно предположить, что трансгенная операция не повлияла на результаты. Обработанные Icariin Tg (+) мышей показали значительное снижение содержания Aβ1-42 в гиппокампе по сравнению с таковыми у совпадающих по возрасту Tg (+) мышей. Лечение икариина могло бы уменьшить Aβ1-42 у мышей Tg (+), близких к уровням Tg (-) мышей Aβ1-42, тогда как уровни окрашивания амилоидов у мышей с высокой дозой Tg (+) в иммуногистохимии (IHC) срезы были выше, чем у мышей Tg (-). Это может быть связано с тем, что моноклональное антитело против Aβ1-16, которое мы использовали при окрашивании IHC, не может различать Aβ1-40 и Aβ1-42, таким образом, результат окрашивания IHC может представлять собой общее бремя Aβ. Эти результаты свидетельствуют о том, что icariin может в основном уменьшить Aβ1-42, а не Aβ1-40. Снижение регуляции Aβ1-42 было бы важным положительным эффектом icariin, поскольку это ингибировало бы образование амилоидных бляшек и, следовательно, улучшало бы когнитивные нарушения у мышей APP Tg (+).

Aβ генерируется из APP путем последовательного расщепления β- и γ-секретазой. β-секретаза (β-сайт-предшественник белка-расщепляющего белка амилоида 1, BACE-1) расщепляет эктодомен APP и генерирует C-концевой фрагмент APP. Затем γ-секретаза расщепляет трансмембранный домен и высвобождает Aβ-пептиды (Aβ1-40 или Aβ1-42) 26. Таким образом, APP, BACE-1 и γ-секретаза связаны с образованием Aβ. Чтобы выяснить фармакологические механизмы, с помощью которых icariin уменьшало содержание Aβ, мы исследовали экспрессию этих ключевых белков и ферментов у мышей Tg.

В качестве инициирования генерации Aβ APP является основной мишенью в патологических механизмах у мыши Tg. У 2-месячной или 4-месячной мыши APPV717I TG человеческий APP-белок выражается более чем в 2 раза от эндогенного уровня APP 25. В настоящем исследовании вестерн-блоттинг и иммуногистохимические результаты показали тенденцию к увеличению экспрессии APP через 4 месяца возраста в гиппокампе мышей Tg (данные не показаны). В возрасте 10 месяцев экспрессия APP была значительно увеличена в гиппокампе Tg-мышей. Уровни APP в гиппокампе в возрасте 10 месяцев были явно выше, чем в возрасте 4 месяцев, что соответствовало другим сообщениям 23. Это указывало на то, что увеличение экспрессии APP, которое наблюдалось при старении, возможно, было связано с инициирование AD-патологии у мышей APP Tg. В настоящем исследовании мы обнаружили, что 6 месяцев лечения икарином снижали уровень экспрессии APP в гиппокампе мышей APP V717I Tg в возрасте 10 месяцев. Поскольку APP является белком-предшественником Aβ, избыточный APP может увеличить продукцию Aβ. Ингибирующее действие icariin на чрезмерную экспрессию APP может быть одним из механизмов, с помощью которых лечение акарином снижает содержание Aβ в головном мозге мышей APP Tg. Механизм icariain для ингибирования избыточной экспрессии APP не ясен. Подобно нашему результату icariain, лечение церебролизином значительно уменьшало уровни полноразмерного APP у мышей APP Tg 27. NeuroAiD®, также известный как MLC601, явно уменьшал полноразмерные уровни APP в трансфицированных APP клетках SH-SY5Y 28. В этих отчеты, авторы не объяснили основополагающий механизм измененных уровней APP.

Полноразмерный APP участвует в нескольких функциях нейронов, таких как клеточная адгезия, нейронная дифференциация, миграция нейронов, рост нейритов и формирование синапса 29. В нашем настоящем исследовании не было значительного изменения полноразмерного APP в мозге нормального C57 / BL6 с 6-месячной обработкой 100 мкмоль / кг icariin (данные не показаны). Некоторые исследования в других лабораториях также доказали, что не было существенного изменения морфологии нейронов и окрашивания Aβ1-40 в головном мозге после 3-месячного лечения икариина нормальным или фиктивным контрольным крысам 30, 31.

Трансмембранный белок BACE-1 (β-сайт APP-расщепляющий фермент 1) является основной β-секретазой, которая участвует в процессе генерации Aβ. В предыдущих исследованиях сообщалось о повышении уровня нейронов BACE-1 в мозге 3-месячных трансгенных мышей APPV717I 32, а экспрессия BACE-1 в лобных корах с осаждением Aβ была в 3 раза больше, чем в мозжечке без нагрузки Aβ 33. Чтобы определить фармакологическую мишень icariain, уровни экспрессии BACE-1 в головном мозге мышей APP Tg были измерены в настоящем исследовании. Экспрессия BACE-1 в гиппокампе показала умеренное увеличение мышей APPV717I в возрасте 4 месяцев (данные не показаны) и значительное увеличение в возрасте 10 месяцев. Наше исследование показало, что уровни BACE-1 незначительно повышались в ранние периоды расстройств гиппокампа, но впоследствии они значительно возросли со старением. Эта растущая тенденция BACE-1 соответствовала изменению APP. Это может способствовать высоким уровням Aβ в мозге мышей APP Tg. Администрация Icariin в течение 6 месяцев значительно уменьшала уровни экспрессии BACE-1 в гиппокампе мышей APP V717I Tg в возрасте 10 месяцев. Ингибирование экспрессии BACE-1 было бы новой мишенью для icariin в лечении AD.

Бремя Aβ связано как с чрезмерной экспрессией BACE-1, так и с усиленной активностью BACE-1. В настоящем исследовании активность BACE-1 не выявлялась. Однако в нашем предыдущем исследовании мы обнаружили, что флавоноиды Epimedium (> 50% из которых являются icariin) уменьшали продукцию Aβ в клетках нейробластомы SH-SY5Y, трансфицированных кДНК, и ингибировали активность β-секретазы in vitro 34. Поскольку icariin составляет> 50 % флавоноидов Epimedium, существует вероятность того, что икариин также может ингибировать активность BACE-1, но это необходимо доказать в будущем исследовании.

Помимо BACE-1, другим ключевым ферментом, участвующим в генерации Aβ, является γ-секретаза, которая, как считается, имеет по меньшей мере 4 интегральных мембранных белка, таких как пресенилин 1 (PS-1), nicastrin, APH1 и PEN2. Среди них PS-1 является наиболее важным компонентом в γ-секретазе 35. В нашем настоящем исследовании PS-1 не обнаруживает явных изменений в мозге мышей APPV717I Tg в возрасте 10 месяцев, а icariin не имеет значительных эффектов на уровнях PS-1 в гиппокампе мышей APP Tg после его введения в течение 6 месяцев (данные не показаны).

Настоящее исследование показало, что иараин уменьшал содержание Aβ и его осаждение и уменьшал амилоидные бляшки в гиппокампе трансгенных мышей APPV717I, уменьшая экспрессию APP и BACE-1, тем самым улучшая способности к запоминанию памяти. Эти новые данные свидетельствуют о том, что icariin может иметь потенциал для блокирования или замедления патологической прогрессии AD. Будучи эффективным компонентом традиционной китайской медицины, icariin обещает профилактику и лечение AD.

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№№ 81274120, 81273498), Фондом естественных наук в Пекине (№ 7112061), Фондом Пекинской основы традиционной китайской медицины (№ KJTS2011-04), «Капитальное здоровье» (№ 2011-1001-05) и Пекинский медицинский и технический персонал высокого уровня (№№ 2009-3-66, 2011-1-7). Мы хотели бы поблагодарить Li Zhang и Hou-xi Ai за техническую помощь.

Болезнь Альцгеймера

белок-предшественник амилоида

β-амилоид

β-сайт APP-расщепляющий фермент

APPV717I трансгенный.

Влияние icariin на обучение и нарушения памяти у трансгенных мышей APP V717I (водный лабиринт Морриса). Icariin (ICA) в дозах 30 мкмоль / кг (L) и 100 мкмоль / кг (H) внутрижелудочно вводили мышам APP Tg в течение 6 месяцев (от 4 до 10 месяцев). «Escape latency» — это данные в последнем испытании после 4-дневного обучения. A. Сравнение летучих задержек у разных групп мышей в возрасте 4 месяцев и 10 месяцев. B. Влияние icariin на лавины побега у 10-месячных трансгенных мышей APP (Tg). C. Групповые различия среднего процентного времени поиска в целевом квадранте по сравнению со всем пулом во время пробного исследования. D. Влияние icariin на время в целевом квадранте. п = 18. Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение (SD); ▲ P <0,05, ▲ уровень Р <0,01, по сравнению с трансгенно-отрицательными [Tg (-)] мышами; △△ P <0,01, по сравнению с 4-месячными мышами APP Tg; ** P <0,01, по сравнению с модельными мышами APP Tg (+).

Влияние icariin на обучение и нарушения памяти у трансгенных мышей APP V717I (тест распознавания объектов, ORT). Icariin (ICA) в дозах 30 мкмоль / кг (L) и 100 мкмоль / кг (H) внутрижелудочно вводили мышам APP Tg в течение 6 месяцев (от 4 до 10 месяцев). A. Сравнение индекса дискриминации (DI) в разных группах мышей в возрасте 4 месяцев и 10 месяцев. B. Влияние icariin на DI у 10-месячных мышей APP Tg. На второй день не было существенной разницы в времени исследования до 2 одинаковых объектов среди групп. На третий день не было существенной разницы в общем времени исследования (N + F) среди групп. п = 18. Данные показаны как среднее ± SD; ▲ P <0,05 по сравнению с мышами Tg (-); △△ P <0,01, по сравнению с 4-месячными мышами APP Tg; * P <0,05, по сравнению с модельными мышами APP Tg (+).

Влияние icariin на содержание Aβ в гиппокампе 10-месячных трансгенных мышей APP V717I. Icariin (ICA) в дозах 30 мкмоль / кг (L) и 100 мкмоль / кг (H) внутрижелудочно вводили мышам APP Tg в течение 6 месяцев (от 4 до 10 месяцев). A. Бремя Aβ в области CA1 гиппокампа, которая была обнаружена с иммуногистохимическим окрашиванием с использованием антитела против Aβ1-16 (шкала шкалы = 50 мкм). п = 5. B. Содержимое Aβ1-42 во всем гиппокампе, которое было измерено с помощью иммуноферментных анализов, связанных с ферментом. п = 8-10. Данные показаны как среднее ± SD; ▲▲
P <0,01, по сравнению с мышами Tg (-); ** P <0,01, по сравнению с модельными мышами Tg (+).

Влияние icariin на амилоидные бляшки в гиппокампе 10-месячных трансгенных мышей APP V717I. Icariin (ICA) в дозах 30 мкмоль / кг (L) и 100 мкмоль / кг (H) внутрижелудочно вводили мышам APP Tg в течение 6 месяцев (от 4 до 10 месяцев). A. Конго красное окрашивание. B. Полуколичественный анализ красно-красной окраски Конго. C. Bielschowsky серебряное окрашивание. п = 5. Данные показаны как среднее ± SD; ▲▲ P <0,01, по сравнению с мышами Tg (-); ** P <0,01, по сравнению с модельными мышами APP Tg (+). Шкала шкалы = 50 мкм.

Влияние icariin на экспрессию белка предшественника амилоида (APP) в гиппокампе 10-месячных трансгенных мышей APP V717I. Icariin (ICA) в дозах 30 мкмоль / кг (L) и 100 мкмоль / кг (H) внутрижелудочно вводили мышам APP Tg в течение 6 месяцев (от 4 до 10 месяцев). A. Вестерн-блот. B. Полуколичественный анализ вестерн-блоттинга. C. Иммуногистохимическое окрашивание (шкала бар = 50 мкм). п = 5. Данные показаны как среднее ± SD; ▲ P <0,05 по сравнению с мышами Tg (-); * P <0,05, ** P <0,01, по сравнению с модельными мышами Tg (+).

Влияние icariin на β-сайт APP-расщепляющий фермент 1 (BACE-1) экспрессия в гиппокампе 10-месячных APP V717I трансгенных мышей. Icariin (ICA) в дозах 30 мкмоль / кг (L) и 100 мкмоль / кг (H) внутрижелудочно вводили мышам APP Tg в течение 6 месяцев (от 4 до 10 месяцев). A. Вестерн-блот. B. Полуколичественный анализ вестерн-блоттинга. C. Иммуногистохимическое окрашивание (шкала бар = 50 мкм). п = 5. Данные показаны как среднее ± SD; ▲▲ P <0,01, по сравнению с мышами Tg (-); * P <0,05, по сравнению с модельными мышами Tg (+).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *