Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Возраст-зависимые послеоперационные когнитивные нарушения и связанная с болезнью Альцгеймера невропатология у мышей

Age-dependent postoperative cognitive impairment and Alzheimer-related neuropathology in mice
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3895908/

Послеоперационная когнитивная дисфункция (POCD) связана с увеличением стоимости ухода, заболеваемости и смертности. Однако его патогенез остается в значительной степени определяемым. В частности, неизвестно, почему пожилые пациенты с большей вероятностью развивают POCD и зависит ли POCD от общей анестезии. Поэтому мы поставили задачу исследовать влияние периферической хирургии на познание и невропатологию, связанную с болезнью Альцгеймера, у мышей разного возраста. У мышей была установлена ​​абдоминальная хирургия под местной анестезией. Операция индуцировала пост-оперативное повышение уровня β-амилоида (Aβ) в головном мозге и когнитивные нарушения у 18-месячных диких и 9-месячных трансгенных мышей с болезнью Альцгеймера, но не у 9-месячных мышей дикого типа. Скопление Aβ, вероятно, было связано с повышением фермента расщепления белка предшественника бета-сайта амилоида и фактора инициации трансляции фосфорилированного эукариота 2α. Ингибитор γ-секретазы E улучшил вызванное хирургическим вмешательством накопление Aβ головного мозга и когнитивные нарушения у 18-месячных мышей. Эти данные свидетельствуют о том, что периферическая хирургия способна вызвать когнитивные нарушения, не зависящие от общей анестезии, и что комбинация периферической хирургии со скоплениями, связанными с мутацией со старением или альцгеймером, была необходима для возникновения POCD. Эти данные, вероятно, будут способствовать дальнейшему исследованию для исследования патогенеза POCD.

Каждый год от одного до двух миллионов американцев старше 65 лет страдают пост-оперативной когнитивной дисфункцией (POCD), что является одним из наиболее распространенных послеоперационных осложнений у пациентов старшего возраста1 и связано с увеличением стоимости, заболеваемости и смертности234 , Однако причины и патогенез POCD остаются в значительной степени определяемыми.

В предыдущих исследованиях были оценены эффекты общей анестезии или операции плюс общая анестезия на когнитивные нарушения у грызунов5678. Но есть все больше клинических доказательств, свидетельствующих о том, что операция при отсутствии общей анестезии может также индуцировать POCD у людей9. Поэтому важно определить, зависит ли POCD у людей и когнитивные нарушения у животных в зависимости от наличия общей анестезии.

Сообщалось, что операция может вызвать нейровоспаление, включая повышение уровня провоспалительного цитокина, например, TNF-α7, и активацию микроглии8, приводящую к POCD [обзор в 10]. Тем не менее, почти у всех хирургических пациентов развивается определенная степень воспаления, и у некоторых хирургических пациентов может развиться нейровоспламенение, у большинства хирургических пациентов не развивается POCD. Причина этого наблюдаемого факта в значительной степени неизвестна. Сообщается о чрезмерном накоплении β-амилоида (Aβ) как части нейропатогенеза болезни Альцгеймера (AD) и когнитивных нарушений (обзор в 11). Поэтому мы постулировали многофакторную модель патогенеза POCD, в которой периферическая хирургия (факторы осаждения) плюс накопление Aβ от старения [например, 18-месячные мыши дикого типа (WT)] или мутация AD гена [например, 9-месячный AD-трансгенный (Tg)] (предрасполагающие факторы), чтобы вызвать когнитивные нарушения у мышей.

Поэтому мы установили доклиническую модель периферической хирургии в животе под местной анестезией для определения эффектов периферической хирургии без влияния общей анестезии на накопление Aβ и когнитивные нарушения у 9 и 18-месячных мышей WT и 9 месяцев -гладными мышами AD Tg. Исследования, направленные на: (1) создание доклинической модели POCD без присутствия общих анестетиков для оценки того, был ли POCD независимым от общих анестетиков; и (2) выявить патогенез POCD, исследуя, может ли периферическая хирургия индуцировать возрастную зависимость Aβ и когнитивные нарушения. Мыши AD Tg [B6.Cg-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo / J] имеют тот же генетический фон, что и мыши WT (C57BL / 6J), и повышенные уровни Aβ из-за мутаций APP и PSEN1, генов AD1213] ,

Aβ образуется из его белка предшественника белка амилоида белка предшественника (APP) путем последовательного протеолитического расщепления через две протеазы, фермент расщепления APP с бета-сайтом (BACE1) и γ-секретазой (рассмотрен в 11). Клеточный стресс может усиливать фосфорилирование эукариотического фактора инициации трансляции (eIF) 2α, что приводит к увеличению уровней BACE1 и, следовательно, накопления Aβ14. Ингибитор γ-секретазы E может уменьшить генерацию Aβ15. Поэтому мы определили влияние периферической хирургии на уровень мозга BACE1 и фосфорилированного eIF2α и оценили, может ли соединение E ослаблять когнитивные нарушения, вызванные периферической хирургией, и накопление головного мозга Aβ у 18-месячных мышей WT.

Мыши, получившие периферическую хирургию, не показали значительных изменений в поведении (например, при еде и питье), интраоперационном артериальном давлении, крови, уровне глюкозы в крови и эпинефрине, пороге боли и послеоперационной двигательной активности по сравнению с контрольными мышами (Таблица 1). У мышей была хирургическая процедура при местной анестезии бупивакаина. Только одна местная анестезия не вызывала когнитивных нарушений у старых мышей (18-месячных мышей) через 7 дней после абдоминальной хирургии (рис. 1).

Система кондиционирования страха (FCS) является одним из наиболее часто используемых поведенческих тестов для выявления когнитивных нарушений, вызванных анестезией56 и анестезией плюс хирургия78. Поэтому мы сначала оценили и сравнили эффекты периферической хирургии без общих анестетиков (под местной анестезией) по когнитивной функции у взрослых (9-месячных) и пожилых (18-месячных) мышей WT с использованием FCS. Мы обнаружили, что периферическая хирургия в отсутствие общей анестезии нарушает когнитивную функцию, о чем свидетельствуют сокращения времени замораживания в обоих случаях и тоновые тесты ФТС в 72 часа, 7, 30 и 60 дней, но не 24 часа, хирургию у 18, но не 9, месячных мышей WT (рисунок 2). Двусторонний ANOVA показал, что возраст потенцировал когнитивные нарушения, вызванные периферической хирургией (рисунок 2). Относительно короткое время замораживания, которое 9-месячные мыши WT, проявленные в контексте теста FCS, могут быть вызваны гиперактивным ответом мышей, находясь в камере FCS.

Более того, периферическая хирургия уменьшала количество раз, когда мыши пересекали платформу в пробном тесте Морского водного лабиринта 18 (рис. 3Е), но не 9 (фиг. 3В), месячные мыши WT. Периферическая хирургия существенно не изменяла латентность побега (рис. 3A и 3D) и скорость плавания (рис. 3C и 3F) мышей в тесте MWM.

В совокупности эти данные указывают на то, что периферическая хирургия без влияния общих анестетиков индуцировала ассоциативный78 и пространственный характер 16 нарушений когнитивной функции у старых мышей.

Сообщалось, что нейровоспламеняемость после операции может быть связана с когнитивными нарушениями у животных78 и у пациентов17. Однако, несмотря на то, что у всех пациентов может быть вызвано периферической хирургией увеличение провоспалительных цитокинов в крови (что может вызвать нейровоспламенение18), не у всех пациентов развивается POCD. Таким образом, вполне вероятно, что у пациентов, у которых развивается POCD, есть другие изменения в мозге, которые облегчают когнитивные нарушения. Мы предположили, что одно из этих изменений представляет собой повышенный уровень головного мозга Aβ и поэтому оценивает влияние периферической хирургии на уровни Aβ в гиппокампе мышей.

Энзим-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) Aβ показал, что периферическая хирургия (черная полоса) значительно не увеличивала уровни Aβ40 (фиг. 4A) и Aβ42 (фиг. 4B) в гиппокампе 9-месячных мышей WT по сравнению с состояние управления (белая полоса). Однако у 18-месячных мышей WT периферическая хирургия значительно увеличила уровни Aβ в гиппокампе у мышей через 12 часов после операции (рис. 4C и рисунок 4D). Наконец, ELISA показал, что базовые уровни Aβ в гиппокампе 18-месячных мышей WT были выше, чем у 9-месячных мышей WT (рис. 4E и 4F). Эти данные свидетельствуют о том, что периферическая хирургия увеличивала уровни Aβ40 и Aβ42 в гиппокампе у пожилых мышей WT, но не у взрослых мышей WT. Эти результаты согласуются с результатами предыдущих исследований, что старение связано с повышенными уровнями Aβ в головном мозге19.

Затем мы использовали мышей AD Tg для дальнейшей проверки гипотезы о том, что периферическая хирургия исключительно индуцировала когнитивные нарушения и улучшала уровни Aβ головного мозга у мышей с повышенными исходными уровнями головного мозга Aβ. Мы обнаружили, что периферическая хирургия индуцировала когнитивные нарушения (фиг. 5A и 5B) и накопление Aβ (фиг. 5C) у 9-месячных мышей AD Tg [B6.Cg-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo / J], но не в 9-месячные мыши WT, 7 дней и 12 часов после операции, соответственно. Мыши AD Tg [B6.Cg-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo / J] имеют повышенные уровни Aβ1213]. В совокупности эти данные также предположили, что периферическая хирургия только усиливает накопление головного мозга Aβ и индуцирует когнитивные нарушения у мышей с уже повышенными исходными уровнями головного мозга Aβ. Обратите внимание, что время замораживания мышей в тесте теста FCS в этом эксперименте, когда мышей тестировали один раз через 7 дней после операции (рис. 5А), было выше, чем в эксперименте, когда мышей повторно тестировали в FCS через 24 часа, 72 часов, 7 дней, 30 дней и 60 дней после операции (рисунок 2). Точная причина такого различия неизвестна в настоящее время. Мы постулируем, что у мышей может быть снижение времени замораживания теста тонов FCS при повторном тестировании в FCS после операции. Будущие исследования для проверки этой гипотезы оправданы.

Сообщается, что клеточный стресс усиливает фосфорилирование фактора инициации трансляции эукариот (eIF) 2α, что приводит к увеличению уровней BACE1 и, следовательно, накопления Aβ14. Поэтому мы оценили влияние периферической хирургии без влияния общих анестетиков на уровни мозга BACE1 и фосфорилированного eIF2α (P-eIF2α) у мышей. Количественное вестерн-блоттинг показало, что периферическая хирургия увеличивала уровни BACE1 и P-eIF2α в гиппокампе 18-месячных мышей WT через 12 часов после операции (рис. 6A, 6B и 6C). Эти данные свидетельствуют о том, что периферическая хирургия может индуцировать генерацию Aβ путем увеличения уровней P-eIF2α и BACE1.

Учитывая, что периферическая хирургия без влияния общих анестетиков увеличивала накопление Aβ и индуцировала когнитивные нарушения у старых мышей, в дальнейшем мы оценили причинно-следственную связь, используя соединение E, ингибитор γ-секретазы, который уменьшает генерацию Aβ20. Мы обнаружили, что соединение E ослабляет индуцированное периферической хирургией увеличение уровней Aβ40 (фиг. 7A) и Aβ42 (фиг. 7B) в гиппокампе 18-месячных мышей через 12 часов после операции. Наконец, соединение E улучшило вызванное периферической хирургией когнитивное расстройство (рис. 7C и 7D) через 7 дней после операции. Эти результаты также предположили, что периферическая хирургия, вероятно, вызвала когнитивные нарушения, усиливая накопление головного мозга у старых мышей.

Многие исследования направлены на определение роли общей анестезии (62122; обзор в23) или общей анестезии плюс хирургия8242526 в патогенезе POCD. Тем не менее, увеличение числа доказательств свидетельствует о том, что нет существенной разницы в частоте ПОЗД между операциями с общей анестезией и хирургией без нее (с эпидуральной, спинальной или местной анестезией) (2728, рассмотрено в 29). Поэтому мы создали доклиническую модель у мышей и поставили задачу определить, может ли POCD встречаться даже при отсутствии общих анестетиков. Мы обнаружили, что периферическая хирургия в животе при отсутствии общих анестетиков (под местной анестезией) все еще вызывает когнитивные нарушения у пожилых мышей WT (рис. 2 и 3). Эти результаты показали, что POCD может не зависеть от наличия общих анестетиков. Тем не менее, все же возможно, что общие анестетики могут потенцировать индуцированный хирургией POCD у людей и когнитивные нарушения у животных. Дальнейшие исследования должны включать сравнение эффектов анестезии, хирургии и анестезии, а также операции на когнитивной функции и лежащих в ее основе механизмов.

Более того, мы обнаружили, что периферическая хирургия увеличивала уровни Aβ исключительно в гиппокампе у пожилых мышей WT (рис. 4) или мышей AD Tg (рис. 5), но не взрослых мышей, которые были параллельны когнитивным нарушениям у мышей (рисунок 2 , 3 и 5). Уровни базовой линии гиппокампа у пожилых мышей WT были выше, чем у взрослых мышей WT (рисунок 4), а уровни базовой линии гиппокампа Aβ у мышей AD Tg были выше, чем у мышей WT (рис. 5). В совокупности эти данные предполагали гипотетический мультифакториальный режим POCD, что сочетание периферической хирургии и накопления Aβ от старения или мутации гена AD потребовалось для того, чтобы вызвать когнитивные нарушения у мышей. Эти данные согласуются с клиническим наблюдением о том, что старшие пациенты с более высоким уровнем Аβ в головном мозге 19 более уязвимы для развития POCD30. Эти результаты также согласуются с результатами предыдущего исследования, что частичная гепатэктомия у мышей индуцировала образование Aβ8.

Было показано, что клеточный стресс, вызванный лихорадкой глюкозы, усиливает фосфорилирование eIF2α, что приводит к увеличению уровней BACE1 и, следовательно, накопления Aβ14. Мы обнаружили, что периферическая хирургия увеличивала уровни P-eIF2α, BACE1 и Aβ в гиппокампе у пожилых мышей WT (рис. 4 и 6). Эти данные свидетельствуют о том, что периферическая хирургия также может вызвать клеточный стресс, что в конечном итоге приводит к накоплению Aβ.

Наконец, соединение ингибитора γ-секретазы E (фиг. 7), которое уменьшает генерацию Aβ15, могло бы уменьшить накопление Aβ и когнитивные нарушения, вызванные периферической хирургией, у 18-месячных мышей WT. Эти данные продемонстрировали потенциальную причинно-следственную связь накопления Aβ с периферической хирургией и когнитивных нарушений. Кроме того, эти данные свидетельствуют о возможном применении будущего анти-Aβ-лечения в профилактике и лечении POCD в ожидании дальнейших исследований. Наблюдалось умеренное увеличение уровней Aβ40 в гиппокампе мыши после лечения соединения E. Увеличение могло быть неспецифическим, однако точная причина этого увеличения оставалась неизвестной. Тем не менее, данные свидетельствуют о том, что соединение Е может не уменьшать уровни АА в головном мозге при отсутствии хирургического оскорбления, но может смягчить вызванное хирургическим вмешательством повышение уровня Аβ в головном мозге.

POCD может возникнуть в результате вызванного хирургическим вмешательством нейровоспламенения, включая повышение уровня мозговых уровней провоспалительного цитокина и активации микроглии [78, рассмотренного в 10]. В частности, нейровоспламенение может вызывать когнитивную дисфункцию через синаптическую дисфункцию, ингибирование нейрогенеза, гибель нейронов, микроглиевое праймирование и другие, способствующие POCD [обзор в 10]. Сообщалось, что Aβ и нейровоспалительное действие усиливают нейротоксичность друг друга [3132; рассмотрено в [33]. Поэтому мы предложили многофакторную модель патогенеза POCD, которая необходима для возникновения POCD для нейровоспаления от операции плюс накопление Aβ от старения или мутации гена AD. Для проверки этой гипотезы необходимы дальнейшие исследования.

Stress34 и pain35 могут вызывать когнитивную дисфункцию [см. Обзор36]. Мышам в текущих исследованиях проводили периферическую хирургию только с местной анестезией, и мышей сдерживали бумажной лентой для этой процедуры. Таким образом, мы не можем полностью исключить влияние стресса и боли на периферическую хирургическую нейротоксичность и нейроповеденческие дефициты у мышей. Действительно, наблюдалось небольшое увеличение уровней глюкозы в крови (но не адреналина) и шкалы боли у мышей-хирургов, чем у контрольных мышей (таблица 1), что указывало на то, что периферическая хирургия также может вызывать минимальные уровни ответа на стресс и боль. Однако не было других альтернативных способов определения эффектов периферической хирургии без влияния общей анестезии на когнитивные нарушения и основные механизмы. Эти находки, мы надеемся, будут способствовать дальнейшему изучению ПОКД, в том числе и связанные с периферической хирургией боли и стресса также способствуют развитию ПОКД.

В заключение мы сообщили, что периферическая хирургия у мышей в животе при отсутствии общих анестетиков (под местной анестезией) вызывала накопление головного мозга Aβ и когнитивные нарушения у пожилых мышей WT и мышей AD Tg, но не у взрослых мышей WT. P-eIF2, BACE1 и Aβ могут быть задействованы как, по крайней мере, частично, лежащие в основе механизмы. Наконец, ингибитор γ-секретазы (соединение E) улучшал побочные эффекты, вызванные периферической хирургией. В совокупности эти данные имеют глубокие последствия для хирургического ухода за пожилыми пациентами и свидетельствуют о том, что периферическая хирургия в сочетании с накоплением АГ, ассоциированным с возрастом или AD, может способствовать POCD. В ожидании дальнейших исследований может быть полезно рассмотреть будущие анти-Аβ-терапии, чтобы снизить риск заражения POCD у пожилых пациентов и, в частности, у тех, кто страдает от AD.

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами и положениями Национального института здоровья. Протокол животных был одобрен Постоянной комиссией штата Массачусетс (Бостон, штат Массачусетс) по использованию животных в исследованиях и преподавании. Были предприняты усилия по минимизации количества используемых животных. Поскольку технически трудно выполнять эпидуральную или спинальную анестезию у мышей, мы создали животную модель периферической хирургии в области живота под местной анестезией у мышей. Мышей WT C57BL / 6J (9 месяцев, Лаборатории Джексона, Бар-Харбор, ME и 18-месячного Национального института старения, Bethesda, MD) и мышей AD Tg [B6.Cg-Tg (APPswe, PSEN1dE9 ) 85Dbo / J, 9-месячный, Лаборатория Джексона] были использованы в исследованиях. Мышей случайным образом назначали в хирургическую или контрольную группу по весу. Мышей осторожно удерживали на нагревательной подушке (37 ° С) с использованием бумажной ленты. Местный анестетик-бупивацин (0,5% и 0,1 мл) вводили в кожу и подкожную ткань брюшной области. Разрез 2,5 см был сделан посередине живота, чтобы открыть, а затем закрыть брюшную полость в мыши. Процедура длилась около пяти минут. Мы не использовали седативную медицину, чтобы выявить эффекты одной операции и свести к минимуму все другие переменные. Крем EMLA (2,5% лидокаин и 2,5% прилокаина) использовался каждые 8 ​​часов в течение первого и второго послеоперационных дней для лечения связанной с хирургией боли. Мы не использовали антибиотики, потому что процедура была асептической. Нехирургические (контрольные) мыши проходили такую ​​же процедуру, только без разреза. В интервенционных исследованиях каждая мышь получала соединение E (ингибитор γ-секретазы, который может уменьшать генерацию Aβ) (3 мг / кг, IP, Enzo Life Sciences Inc., Farmingdale, NY, номер кат .: ALX-270- 415) или физиологический раствор в течение 7 дней после операции20.

Для измерения артериального давления использовалась манжета кровяного давления с мышью (научное сотрудничество Кента, Торрингтон, КТ). Уровень крови и уровень глюкозы в крови определяли с помощью газовой машины (Trupoint, ITC, Edison, NJ). Уровни адреналина крови определяли с помощью набора иммуноферментного анализа (ELISA) с ферментным соединением (American research products, Inc., Belmont, MA). Локомоторная активность подсчитывалась записанным видеоизображением мышей. Порог боли определяли по волокну фон Фрей (North Coast Medical, Inc., Gilroy, CA), как описано в предыдущем исследовании37. Волокно Фона было применено к брюшной ране для оценки порога боли.

Исследования ФТС проводились, как описано в наших предыдущих исследованиях6 с модификацией. В частности, спаривание в FCS (Stoelting Co., Wood Dale, IL) проводилось через 24 часа после операции, подражая условию, что пациенты могут испытывать трудности с изучением новых вещей после операции. Для спаривания каждой мыши разрешалось исследовать камеру FCT в течение 180 секунд перед представлением пульсационного тона 2 Гц (80 дБ, 3600 Гц), который сохранялся в течение 60 секунд. Тон сразу же сопровождался мягким ударом ноги (0,8 мА на 0,5 секунды). Сопряжение выполнялось дважды с промежутком в две минуты. Первый контекстный тест FCT был выполнен через 30 минут после окончания спаривания. Каждой мыши оставалось находиться в одной и той же камере в течение 390 секунд. Когнитивную функцию (например, обучение и память) в контексте теста оценивали путем измерения времени, в течение которого мышь демонстрировала «поведение при замораживании» (время замораживания), которое определяется как полностью неподвижное положение, за исключением респираторных усилий в течение вторых 180 секунд , Первый тест тона был выполнен через 90 минут после окончания спаривания. Каждой мыши разрешалось оставаться в другой камере в течение 390 секунд. Тот же тон был представлен на следующие 180 секунд без удара ноги. Когнитивную функцию в тесте также оценивали путем измерения времени замерзания. Те же когорты 9 и 18-месячных мышей повторно тестировали в FCT через 24 и 72 часа, 7, 30 и 60 дней после операции без дополнительного спаривания. Эта конструкция соответствовала наблюдению, что пациенты могут иметь определенные когнитивные нарушения в течение продолжительных периодов времени после операции. Чтобы контролировать последовательное тестирование тех же мышей, мы наблюдали когнитивные нарушения, вызванные хирургическим вмешательством, через 7 дней после операции, независимо от повторения теста FCT (рисунок 7). Мы использовали метод двойной спаривания, чтобы проиллюстрировать, что периферическая хирургия может ухудшить познание в течение длительного периода времени (например, 60 дней) после операции. Однако этот метод заставил 9-месячных мышей проявлять относительную гиперактивность в контексте теста FCS, что привело к более короткому времени замораживания, что является предостережением метода.

Обе 9 и 18-месячные мыши (другая когорта от мышей в исследованиях ФКС) из периферической хирургии и контрольной группы были протестированы в MWM (Stoelting Co.), начиная со следующего дня после периферической хирургии, как описано ранее22. Мышей помещали в MWM через день после операции. Мы вымыли рану мышей сразу после каждого теста MWM, и никаких признаков инфекции у мышей не было выявлено в исследованиях. Мы не включали период обучения как для исследований FCS, так и для MWM, потому что мы хотели конкретно определить, может ли хирургия нарушить когнитивную функцию мышей при изучении новых вещей. Аналогичный подход был применен и в других исследованиях [222].

Ткани мозга (гиппокамп) мышей собирали через 12 часов после операции. Собранные ткани головного мозга гомогенизировали на льду с использованием иммунопреципитационного буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 0,5% Nonidet P-40) плюс ингибиторы протеазы (1 мкг / мл апротинина, 1 мкг / мл лейпептин, 1 мкг / мл пепстатина А). Лизаты собирали, центрифугировали при 12000 об / мин в течение 15 минут и количественно определяли для общего количества белков комплексом для анализа белка бициньонной кислоты (BCA) (Pierce, Iselin, NJ). Затем ткани головного мозга подвергали Вестерн-блот-анализу, как описано Xie et al.

6E10 (разведение 1: 200, Covance, Princeton, NJ, номер по каталогу: SIG-39320) использовали для распознавания Aβ (4 кДа). Для распознавания BACE1 (65 кДа) использовали бета-сайт-предшественник белка-расщепляющего белка фермента 1 (BACE1) (разведение 1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, Cat. Number: ab2077). Для распознавания фосфорилированного (eIF) 2α (P-eIF2α) (38 кДа) использовали фосфа-эукариотное антитело для трансляции (E51) 2α (Ser51, 119A11) (разведение 1: 1000, клеточная сигнализация, номер по каталогу: 3597) , Антитело анти-β-актин (1: 10000, Sigma, St. Louis, MO) использовали для определения уровней β-актина (42 кДа). Вестерн-блот-квантификацию проводили, как описано Xie et al. 100% изменений уровня белка относятся к контрольным уровням с целью сравнения с экспериментальными условиями.

Уровни Aβ40 и Aβ42 измеряли с использованием ELISA (Invitrogen, San Francisco, CA), как описано в наших предыдущих исследованиях39. Набор для иммуноанализа мыши Aβ40 и Aβ42 (Invitrogen, номер по каталогу: KMB3481 и KMB 3441) использовали для определения уровней Aβ40 и Aβ42 соответственно в гиппокампе 9 и 18-месячных мышей WT.

Обнаружение иммуноблота Aβ в гиппокампе измеряли, как описано в предыдущих исследованиях 384041. В частности, образцы головного мозга гомогенизировали (150 мМ NaCl с коктейлем ингибитора протеазы в 50 мМ Трис, рН 8,0) и центрифугировали (65 000 об / мин × 45 минут) и супернатант удаляли. Затем осадок ресуспендировали ультразвуком в буфере для гомогенизации, содержащем 1% SDS. После гранулирования нерастворимого материала (18 000 об / мин × 15 минут) SDS-экстракт подвергали электрофорезу на SDS-PAGE (4-12% полиакриламидного геля Bis-Tris из Invitrogen), блоттировали на PVDF-мембрану и исследовали разведении 1: 200 6E10 (Covance).

Характер проверки гипотезы был двухсторонним. Данные были выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Данные для времени пересечения платформы обычно не распределялись, поэтому они были выражены как средний и межквартильный диапазон (IQR, от 25% до 75%). Количество образцов варьировалось от 6 (исследования биохимии) до 10 (поведенческие исследования). Для сравнения различий между группами использовали двухсторонний t-тест и однонаправленный ANOVA. Взаимодействие между временными и групповыми факторами в двухстороннем ANOVA с повторными измерениями использовалось для анализа взаимодействия возраста и времени между мышами в контрольной группе и периферической хирургической группой в MWM. Двухсторонний ANOVA также использовался для определения взаимодействия эффектов мутации в хирургии и возраста или мутации AD в исследованиях. Во время анализа данных отсутствовали данные по переменным MWM (время ожидания ожидания и время пересечения платформы). Наконец, тест Манна-Уитни был использован для определения разницы в временах пересечения платформы между периферической хирургией и условиями контроля. Значения P менее 0,05 (*, # и ∧) и 0,01 (**, ## и ∧∧) считались статистически значимыми. Программное обеспечение Prism 6 (La Jolla, CA, USA) и программное обеспечение SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC) (версия 9.2) использовалось для всех статистических анализов.

Z.X., D.C., G.C., E.R. и R.T. задумал и разработал проект. Z.Xu., Y.D., H.W., Y.Z. и Z.X. выполнили все эксперименты и подготовили цифры. Z.X. написал рукопись. Все авторы рассмотрели рукопись.

Дополнительные цифры

Это исследование было поддержано грантами Национального института здравоохранения (Бетесда, Мэриленд) (R21 AG029856, R21 AG038994, R01 GM088801 и R01 AG041274); Исследовательский грант, инициированный исследователем, из Ассоциации Альцгеймера (Чикаго, Иллинойс) и Фонда Cure Alzheimer’s (Wellesley, MA) доктору Zhongcong Се. Доктор Эдвард Маркантонио поддерживается премией Midcareer Investigator Award в исследованиях, ориентированных на пациента из Национального института по проблемам старения [K24 AG035075]. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Марка Бакстера из Медицинской школы Горы Синай за конструктивное обсуждение, доктор Хуэй Чжэн из Массачусетской общей больницы за помощь в статистическом анализе данных, а Джошуа Дж. Буссчер и д-р Синь Синь из Массачусетса Больница для оказания технической помощи.

Местная анестезия с бупивакаином не вызывает когнитивных нарушений в контексте теста (A) и теста тона (B) FCS у 18-месячных мышей через 7 дней после операции. N = 10. FCS, система кондиционирования страха.

Периферическая хирургия уменьшает время замерзания в контексте теста FCS (* P <0,05 или ** P <0,01) в 72 часа (B), 7 (C), 30 (D) и 60 (E) дней, но не 24 часов (A), после операции у 18-месячных мышей WT, но не у 9-месячных мышей WT. Двунаправленная ANOVA показывает, что возраст потенцирует когнитивные нарушения, вызванные периферической хирургией (контекстный тест, ≤ P <0,05), через 72 часа (B) и 7 дней (C) после операции. Периферическая хирургия уменьшает время замерзания при тоном тестах FCS (* P <0,05 или ** P <0,01) в 72 часа (G), 7 (H), 30 (I) и 60 (J) дней, но не 24 часов (F), после операции у 18-месячных мышей WT, но не у 9-месячных мышей WT. Двунаправленная ANOVA показывает, что возраст потенцирует когнитивные нарушения, вызванные периферической хирургией (тест на тонус, ≤ P <0,05), через 7 (H) и 30 (I) дней после операции. N = 10. FCS, система кондиционирования страха; дикого типа, WT; анализ дисперсии, ANOVA.

Периферическая хирургия при отсутствии общих анестетиков не вызывает ни увеличения латентности бегства, ни уменьшения времени пересечения платформы у 9-месячных мышей WT (A и B) в тесте MWM. Однако у 18-месячных мышей WT периферическая хирургия уменьшает время пересечения платформы: 4, 3-5,25 (средний, межквартильный диапазон) по сравнению с 2, 3-1 (средний, межквартильный диапазон), ** P = 0,0052 (E ) в тесте MWM. Периферическая хирургия не увеличивает латентность ожидания (D) у 18-месячных мышей WT в исследованиях MWM. Нет существенной разницы в скорости плавания между контрольными и хирургическими состояниями у 9-месячных WT (C) или 18-месячных мышей WT (F). Морской водный лабиринт, MWM; дикого типа, WT. Значения выражаются как среднее ± SEM. N = 10.

ELISA показывает, что периферическая хирургия не увеличивает уровни Aβ40 (A) и Aβ42 (B) в гиппокампе 9-месячных мышей WT. Периферическая хирургия значительно увеличивает уровни Aβ40 (C) и Aβ42 (D) в гиппокампе 18-месячных мышей WT. ELISA показывает, что в гиппокампе 18-месячных WT-мышей имеются более высокие исходные уровни Aβ40 (E) и Aβ42 (F), чем у 9-месячных мышей WT. β-амилоидный белок, Aβ; дикого типа, WT. N = 6-8.

Периферическая хирургия при отсутствии общих анестетиков уменьшает время замерзания в контексте теста (A) и теста тона (B) FCS через 7 дней после операции у 9-месячных мышей AD Tg, но не у 9-месячного Мыши WT. Двунаправленная ANOVA показывает, что мутации гена AD (APP и PSEN1) потенцируют когнитивные нарушения, вызванные периферической хирургией, через 7 дней после операции: контекстный тест, ∧∧ P = 0,002; тональный тест: ∧ P = 0,021. N = 10. (C). Базовые уровни Aβ в гиппокампе 9-месячных мышей AD Tg выше, чем у 9-месячных мышей WT, а периферическая хирургия увеличивает уровни A гиппокампа у 9-месячных мышей AD Tg, но не в 9-месячные мыши WT. Болезнь Альцгеймера, AD; β-амилоидный белок, Aβ; трансгенный, Tg; дикого типа, WT; анализ дисперсии, ANOVA; предшественник амилоидного белка, APP; пресенилин 1, PSEN1.N = 10 (поведенческие тесты), N = 6 (исследования биохимии, но для представления результатов использовался только один образец). Полноразмерные пятна / гели представлены в дополнительном рисунке 1.

(А). Периферическая хирургия (полосы 4-6) увеличивает уровни BACE1 и P-eIF2α в гиппокампе 18-месячных мышей через 12 часов после операции по сравнению с контрольным состоянием (полосы 1-3). Количественная оценка Вестерн-блоттинга показывает, что периферическая хирургия (черная полоса) увеличивает уровни BACE1 (B) и P-eIF2α (C) в гиппокампе 18-месячных мышей WT через 12 часов после операции по сравнению с контрольным состоянием ( белый бар). Бета-сайт амилоидного белка-расщепляющего фермента, BACE1; фосфорилированный эукариотический фактор инициации трансляции 2α, P-eIF2α. Полноразмерные пятна / гели представлены в дополнительном рисунке 2.

Соединение E (3 мг / кг / день в течение 7 дней) уменьшает индуцированное периферической хирургией увеличение уровней Aβ в гиппокампе 18-месячных мышей WT через 12 часов после операции (* или **: разница между контролем и группа периферической хирургии; #: разница между физиологическим раствором и соединением E, ∧ или ∧∧: взаимодействие между группой и лечение) (A и B). Соединение E улучшает когнитивные нарушения, вызванные периферической хирургией, у 18-месячных мышей WT через 7 дней после операции (C и D) (* или **: разница между группой контроля и периферической хирургии, #: разница между физиологическим раствором и соединение E, ∧∧: взаимодействие между группой и лечение). β-амилоидный белок, Aβ; дикого типа, WT. N = 6 (исследования биохимии) и N = 10 (поведенческие исследования).

Мыши C57BL / 6J получали периферическую хирургию, как описано в разделе «Методы». По сравнению с контрольными мышами мышей периферической хирургии не наблюдалось значительных изменений в поведении (например, при еде и питье), внутриоперационном артериальном давлении, кровяном газе, послеоперационной двигательной активности, уровнях глюкозы в крови, уровнях адреналина крови и боли порог. Значения выражаются как среднее ± SEM. N = 6-10.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *