Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Анализ протеома Гиппокампа при прионной болезни ME7 выявляет предимоинтрацитарную подпись и указывает на ограниченное мозгом производство кластерина при хронической нейродегенерации *

Analysis of the Hippocampal Proteome in ME7 Prion Disease Reveals a Predominant Astrocytic Signature and Highlights the Brain-restricted Production of Clusterin in Chronic Neurodegeneration*
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3924314/

Предпосылки: Прионное заболевание вызывает хроническую нейродегенерацию путем осаждения внеклеточного несогласованного белка, сходного с болезнью Альцгеймера.

Результаты. Протеомический анализ выявил крупный непролиферативный астроглиоз, охватывающий GFAP, EAAT-2, Prdx6 и острый фазовый белок Clusterin.

Вывод: изменения в мозге не отражают измеренный циркулирующий Clusterin.

Значение. В наших данных подчеркивается осторожность при использовании циркулирующих уровней биомаркера в качестве клинических показателей фактической нейродегенерации.

Прионные заболевания характеризуются накоплением несоответствующего белка, глиоза, синаптической дисфункции и, в конечном счете, потерей нейронов. Эта последовательность, отражающая ключевые особенности болезни Альцгеймера, хорошо моделируется при прионном заболевании ME7. Мы использовали iTRAQTM / масс-спектрометрию для сравнения протеома гиппокампа в контроле и животных ME7 поздней стадии. Наблюдаемые изменения, связанные с реактивной глией, выявили некоторые специфические белки, которые доминируют над протеомом при поздней стадии заболевания. Четыре из вышеперечисленных белков (GFAP, высокоаффинный глютамат-транспортер (EAAT-2), apo-J (Clusterin) и пероксиредоксин-6) избирательно экспрессируются в астроцитах, но пролиферация астроцитов не способствует их регуляции. Известная функциональная роль этих белков свидетельствует о том, что этот ответ действует против белковой диссоциации, эксцитотоксичности и нейротоксичных реакционноспособных видов кислорода. Недавняя конвергенция исследований в области генома и периферическое измерение циркулирующих уровней белков острой фазы сосредоточили внимание на Clusterin как модификаторе поздней стадии болезни Альцгеймера и биомаркера для продвинутой нейродегенерации. Поскольку животные ME7 допускают независимое измерение белков острой фазы в мозге и кровообращении, мы продолжили наше исследование, чтобы выяснить, могут ли изменения в протеоме мозга обнаруживаться в крови. Мы не обнаружили различий в циркулирующих уровнях кластерина при позднем прионном заболевании, когда животные проявляют поведенческий спад, накопление несогласованного белка и драматические синаптические и нейронные потери. Это не исключает важной роли Clusterin в поздней стадии заболевания, но оно предостерегает от предположения, что уровни мозга обеспечивают суррогатную периферическую меру для прогрессирования дегенерации мозга.

Прионная болезнь и болезнь Альцгеймера (AD) 2 относятся к числу хронических нейродегенеративных расстройств, в которых накопление несоответствующего белка связано с невропатологией (1-3). При прионных заболеваниях генерация ошибочного оскорбления может быть спорадической, генетической или инфекционного происхождения (4). Приоральная прогрессия заболевания характеризуется активированной микроглии, астроглиозом, вакуоляцией, губчатой ​​дегенерацией и потерей нейронов (5), и многие из этих невропатологических признаков наблюдаются в AD (6). Центральным в этой невропатологии является неправильное расположение локализованного плазматической мембраны клеточного прионного белка (PrPc), что приводит к преимущественно внеклеточному накоплению конформационно измененной изоформы PrPSc (7-10). Хотя дегенерация нейронов связана с накоплением несоответствующего белка, существует значительная поддержка идеи о том, что как внутриклеточные, так и внеклеточные несогласованные белки играют решающую роль в потере нейрона приона и других нейродегенеративных заболеваниях (11-13).

Дегенерация нейронов при прионном заболевании может быть автономным явлением клетки или включать взаимодействия с другими клетками (14). При прионном заболевании имеются свидетельства того, что экспрессия PrPc только в астроцитах достаточна для поддержки распространения прогрессирования заболевания и нейродегенерации (15). Помимо того, что астроциты были вовлечены в патогенез болезни, было показано, что астроциты являются нейрозащитными (16). Как правило, астроциты способствуют множеству функций в мозге, включая гомеостаз, нейротрансмиссию, образование синапсов, пластичность и обмен веществ. В AD ключевые компоненты патологии непосредственно ощущаются глиальными популяциями, которые обычно поддерживают нейронный гомеостаз, приводящий к глиозу с плохо разрешенными функциональными последствиями (17, 18).

При прионном заболевании хорошо охарактеризованная микроглиальная сигнатура показывает, что эти клетки связаны с воспалительным ответом, но не типичным и показательным для клеток, которые могут способствовать фагоцитарному разминированию мусора (19, 20). Несмотря на противовоспалительный профиль, связанный с микроглиа при прионном заболевании, ингибирование пролиферации микроглии даже при возникновении симптомов болезни может задержать появление поведенческих дефицитов, уменьшить нейродегенерацию и продлить жизнь (21). Чтобы лучше понять роль различных типов клеток при прогрессировании прионных заболеваний, мы провели сравнительный анализ протеома гиппокампа контрольных животных и животных ME7 на поздней стадии с использованием изобарических меток для относительной и абсолютной количественной оценки (iTRAQTM) и масс-спектрометрии. Мы профилировали и количественно определяли различия в экспрессии мРНК и белка гиппокампы у контрольных и больных животных в определенные моменты времени прогрессирования заболевания и относили их к ранее описанной клеточной и поведенческой дисфункции (22). Этот анализ показывает, что астроциты доминируют над протеомом больных животных и устанавливают сложный биохимический ответ. Реакция включает целый ряд видов деятельности, которые могут улучшить смещение белков (apo-J и Clusterin), токсичность глутамата (EAAT-2) и окислительный стресс (пероксиредоксин-6, Prdx6).

Эти эксперименты проводились в соответствии с Законом 1986 года о животных животных (научные процедуры) и придерживались рекомендаций ARRIVE по представлению экспериментов с животными (23). Все хирургические процедуры проводились, как описано ранее (24). Вкратце, мышечные самки C57BL / 6J с возрастом анестезировали и стереотаксически вводили на двусторонней основе в гиппокамп с 1 мкл 10% (мас. / Об.) Гомогената головного мозга, приготовленного из нормального мозга (NBH), или у пациентов с неизлечимо больными ME7-инфицированными. Начало клинического заболевания измеряли еженедельно путем определения массы тела. Мышей, инфицированных NBH- и ME7, умерщвляли через 8, 13 и 21 неделю после инъекции, чтобы характеризовать раннюю, среднюю и позднюю стадии заболевания. Мышей размещали в условиях, контролируемых температурой и влажностью, и имели свободный доступ к пище и воде. Животных окончательно анестезировали и перфузировали гепаринизированным солевым раствором, а микроотсеченный гиппокамп замораживали на сухом льду.

Мы объединили и гомогенизировали гиппокампы у животных NBH и ME7 (n = 5 на группу) через 21 неделю после инъекции в 10% по весу 0,5 м бикарбоната триэтиламмония (комплект iTRAQ, Applied Biosystems), содержащий 0,1% SDS и полные ингибиторы протеазы (Roche Прикладная наука). Концентрацию белка оценивали, используя белковый анализ от Bio-Rad и 100 мкг из гомогенатов NBH и ME7, изотопически меченых с использованием iTRAQ мультиплексных реагентов (Applied Biosystems), как описано нами и другими (25, 26). Лизаты восстанавливали 2,5% трис (2-карбоксиэтил) фосфином при 60 ° С в течение 1 ч и затем алкилировали, используя 10 мм метилметантиосульфонат в течение 10 мин при комнатной температуре. Эти образцы подвергали протеолитически расщеплению с использованием трипсина при 37 ° С в течение 20 ч и лиофилизировали под вакуумом перед ресуспендированием в 20 мкл 0,5 м бикарбоната триэтиламмония. Реактивы 115 и 117 iTRAQ ресуспендировали в 70 мкл этанола и добавляли к образцам NBH и ME7, соответственно. Эту смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа перед тем, как ее закаливали с 5 объемами 0,1% TFA в воде. Эти меченые образцы объединяли и подвергали сильному фракционированию катионообменной хроматографии на системе Dionex Ultimate HPLC (Dionex-LC Packings, Саннивейл, Калифорния) с использованием сильной катионообменной колонки Phenomenex Luna (5,5 × 4,6 мм, внутренний диаметр). Сорок фракций собирали при 200 мкл / мин и сушили в вакууме. Эти фракции восстанавливали в 30 мкл 5% ацетонитрила / воды перед анализом nanoLC-MS / MS.

NanoLC-MSMS выполняли с использованием системы CapLC (Waters, Manchester, UK), соединенной с модулем коммутации микросетевого потока Streamselect (Waters) на линии с Q-Tof Global Ultima (Waters). Одна треть каждого образца загружалась через автосамплер на защитную колонку PepMap RP-C18 (внутренний диаметр 5 × 300 мкм, Dionex) для предварительной концентрации и обессоливания до того, как ее разрешали аналитической колонкой PheMap с нано-обращенной фазой (150 × Внутренний диаметр 75 мкм, Dionex). Разделение было достигнуто путем формирования градиента 5-85% растворителя В (растворитель А: ацетонитрил / вода, 5:95 (об. / Об.), 0,1% муравьиной кислоты (об. / Об.), Растворитель В: ацетонитрил / вода, 95: 5 (об. / Об.), 0,1% муравьиной кислоты (об. / Об.)) В течение 100 мин. Скорость потока поддерживали на уровне 200 нл / мин и подвергали электросфере в масс-спектрометре с использованием источника nanoLC Z-spray (Waters). Масс-спектрометр работал в режиме сбора данных. Обследование проводилось с 350 до 1700 м / с в режиме положительного иона с переключением MS на MS / MS, включая интенсивность и состояние заряда предшественника. Спектры MS / MS были получены от 50 до 1700 м / z, а энергия столкновения варьировала в зависимости от состояния заряда. RF-объектив был отрегулирован для оптимального обнаружения низких m / z-репортерных ионов.

Сервер ProteinLynx Global использовался для обработки данных MS / MS для создания списков пиков. Пиковые списки были представлены в MASCOT (Matrix Science, London, UK) и искали в формате FASTA мышиной базы данных белка NCBI, используя следующие параметры поиска: 150 ppm толерантность к пептиду; 0.25-Da MS / MS-устойчивость к пептидам; 1 максимальное пропущенное расщепление; переменное окисление метионина и две фиксированные и одно переменные модификации для химии iTRAQ. Для идентификации и количественной оценки были сохранены только пептиды, превышающие доверие 70%. Все спектры идентифицированных белков проверяли вручную, чтобы обеспечить присутствие по меньшей мере трех y- и связанных с ними ионов b. Интенсивные интенсивности ионных реакторов экстрагировали из соответствующих спектров MS / MS, используя собственный сценарий, и репортерные ионы ниже порога интенсивности в 20 отсчетов были исключены. Коэффициенты пептидов, которые пусты, 0 или> 9999, также были удалены. Затем мы вручную повторно проверяли каждый случай, чтобы гарантировать, что такое значение не было связано с внутренним биологическим эффектом и что идентификация белка основана на точном назначении ионов фрагмента MS / MS. Исходя из этих критериев, мы не обнаружили доказательств того, что пептид может показать значение выражения> 9999 (27, 28). Относительное количество пептида в каждом образце рассчитывали путем деления площадей пиков на 117,1 наблюдаемой массой при m / z 115,1. Пиковые области были скорректированы для перекрытия изотопов в соответствии с инструкциями производителя. Эти отношения были собраны и построены на коррелограмме. Мы использовали самоналоженное 2-кратное обрезание для сообщения о белке как показательном значении. Строгое отсечение было установлено, потому что ряд белков, которые удовлетворяют критериям для включения, были достигнуты на основе индивидуальных пептидов. Более того, мы видели ограниченные технические изменения в предыдущих исследованиях iTRAQ, которые мы провели (26, 29). Это отсечение является более строгим, чем 1,3-кратное, используемое несколькими другими (27, 30).

Рассеянные гиппокампы из животных NBH и ME7 8, 13 и 21 недели после инокуляции (n = 5 на группу) гомогенизировали в 10 объемах PBS (содержащего 0,11% диэтилпирокарбоната) и расщепляли и на 2 равные аликвоты, которые хранились при -80oC. Затем общий объем белка и суммарную РНК экстрагировали из этих образцов, соответственно, позволяя проводить корреляционную экспрессию белка и мРНК на одной и той же ткани у одного животного.

В наших предыдущих исследованиях не было заметной разницы в экспрессии белка у животных NBH через точки времени заболевания, поэтому мы использовали пул 8-, 13- и 21-недельных образцов NBH в качестве контроля (контроль НБН, n = 15), которые мы сравнивали с животными ME7 в 8, 13 и 21 неделе после инокуляции (n = 5 на группу). Протеиновые / химические образцы объединяли с равным объемом буфера для лизиса (4% SDS, 40 мм HEPES, 200 мм KCl, содержащего смесь ингибиторов фосфатазы и полной смеси ингибиторов протеазы). Образцы инкубировали в течение 1 ч и затем центрифугировали при 15000 об / мин в течение 30 мин при 4 ° С. Супернатант собирали в виде SDS-растворимой фракции и содержание белка количественно определяли с использованием анализа белка из Bio-Rad. Эти экстракты SDS из общих образцов белков гиппокампа затем разбавляли в буфер для образца, разрешали PAGE и переносили в нитроцеллюлозу перед анализом с помощью Вестерн-блоттинга (31).

Мембраны блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 1 ч при комнатной температуре и затем инкубировали в TBS, содержащем 0,1% Tween 20 и один из следующих первичных антител: поликлональное антитело против фибриллярных кислых белков против коров (1: 5000, DAKO Laboratories); анти-EAAT-2 поликлональное антитело (1: 1000; Sigma); анти-Clusterin mAb (1: 1000; сигнализация клеток); анти-пероксиредоксин-6 mAb (1: 1000, сигнализация клеток) и 6H4 анти-PrP mAb (1: 5000, Prionics). Мембраны инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° С. Блоты промывали и инкубировали в течение 1 часа с флюоресцентно мечеными антителами против овец при комнатной температуре. Интенсивность белковых зон анализировали с использованием инфракрасной системы обнаружения LiCor Odyssey (LI-COR Biosciences) в соответствии с рекомендациями производителя и нормировали на общую загрузку белка, как измерено коллоидным окрашиванием Coomassie Blue с помощью подхода, описанного в другом месте (32).

Полные РНК экстрагировали из гомогенизированной ткани гиппокампа, которая была разделена на аликвоты для анализа белка и транскрипта, как описано выше. Аликвоты этих гомогенатов экстрагировали RNeasy (Qiagen). После обработки без РНКазы ДНКазы (Promega) концентрацию полной РНК, очищенной для каждого образца, измеряли с использованием спектрофотометра NanoDrop. 400 нг общей РНК реконструировали в кДНК в 20 мкл конечного объема с использованием набора обратной транскриптазы iScript (Bio-Rad). Оптимальные условия ПЦР для каждого исследованного транскрипта были экспериментально определены с использованием функции градиента температуры ДНК Engine Opticon 2 (MJ Research, Waltham, MA) (данные не показаны). Реакции проводили в системе обнаружения PCR в реальном времени DNA Engine Opticon 2 (MJ Research), а эффективность ПЦР в реальном времени рассчитывалась на основе данных наклонов в программном обеспечении Opticon 2 Monitor (MJ Research). Предварительные эксперименты позволили проанализировать амплификации в линейном диапазоне. Следующие последовательности праймеров и зондов были разработаны с использованием программного обеспечения Primer Express (Applied Biosystems): EAAT-2 (праймерная последовательность 5′-CCC AGC GCC GGG CTG GTC-3 ‘, 5′-GGA CTG CGT CTT GGT CAT TTC G-3′ , и 5’Fam-GCT GTG GGC CTG CCA ACG-3’Tamra); пероксидетоксин-6 (праймерная последовательность 5’-CCC GGA GGG TTG CTT CTC-3 ‘, 5’ CGT GGT GGC AGG GTA GAG GA-3 ‘и 5’Fam-CCA GTG TGC ACC ACA GAA C-3’Tamra зонд) ; PrP (праймерная последовательность 5’-AGT CCA ATT TAG GAG AGC CAA GC-3 ‘, 5′-TCA GTC CAC ATA GTC ACA AAG AGG-3’ и 5’Fam-AGC AGC CAG TAG CCA AGG TTC GCC-3 ‘ Tamra); GFAP (праймерная последовательность 5’-TTT CTC CAA CCT CCA GAT CC-3 ‘, 5′-CCG CAT CTC CAC AGT CTT TA-3′ и 5’Fam-CCA GCC TGG ACA CCA AAT CCG-3’Tamra probe) и Clusterin (праймерная последовательность 5’-AGG AGC TGA ACG ACT CGC T-3 ‘, 5′-GCT TTT CCT GCG GTA TTC C-3’ и 5’Fam-CAG AGC AGT ACA AGG AGC TG-3’Tamra зонд). экспрессию мРНК количественно определяли с использованием набора TaqMan RT-PCR (Applied Biosystems). Экспрессия EAAT-2, пероксиредоксин-6, PrP, GFAP и Clusterin мРНК в разных образцах была нормализована для уровней экспрессии гена GAPDH с помощью набора реагентов GAPDH для грызунов (Applied Biosystems), в частности для стандартизации уровней экспрессии генов в гену для домашнего хозяйства и результаты были выражены как увеличение или уменьшение относительной складки между обработками (ME7 / NBH).

Концентрацию Clusterin в плазме у 21-недельных животных NBH и ME7 анализировали с использованием количественного набора ELISA для коммерческого мыши (набор ELISA для мыши Clusterin Quantikine, R & D Systems). Все реагенты, стандартные разбавления и образцы были приготовлены в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, сыворотки разбавляли 1: 2000 калибраторным разбавляющим буфером и затем добавляли в пластину ELISA в двух экземплярах и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре на горизонтальном шейдере для микропланшета, установленном со скоростью 500 об / мин. После инкубации с конъюгатом мыши Clusterin реакцию останавливали и анализировали спектрофотометрически при 450 нм. Концентрация Clusterin определялась относительно стандартной кривой, генерируемой рекомбинантным кластерином. Положительный контрольный образец был снабжен набором, который имел диапазон анализа 0,781-50 нг / мл.

Иммуногистохимический анализ проводили на (10 мкм) парафиновых тканевых срезах у животных NBH и ME7 с использованием антител, направленных против (PrP, синаптофизин, GFAP, Clusterin, EAAT-2 и Prdx6) с ранее описанными протоколами (22, 24). В частности, гистологическое обнаружение PrPSc было достигнуто путем взятия корональных срезов от животных NBH и ME7 и иммуноокрашивания с помощью mAb 6H4 против PrP после лечения муравьиной кислотой и автоклавированием для удаления PrPc, оставляя только виды PrPSc (22, 24). Специфическое связывание детектировали с использованием биотинилированных вторичных антител, комплекта комплексов пероксидазы авидин-биотин-хрена и пероксидазы 3,3′-диаминобензидина в качестве субстрата (Vector Laboratories) для визуализации локализации антител в соответствии с инструкциями производителя. Ядра контрастировали с гематоксилином. После окрашивания двойных антител в некоторых средах для визуализации белков использовали флуоресцентные антитела против мышиного, -библя или -гоата. Совместная локализация была продемонстрирована с помощью модуля локализации локализации пакета обработки ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Все статистические анализы были сделаны с использованием Graph Pad Prism 4.0 (Graph Pad Software Inc., Сан-Диего). Для биохимических данных был применен односторонний анализ теста дисперсии. Тестовый тест Стьюдента вместе с коррекцией Уэлша использовался для сравнения данных экспрессии мРНК и уровней Clusterin.

В ME7-модели прионного заболевания протеиназа K-резистентная PrPSc легко обнаруживается на поздней стадии заболевания и широко распространена во всем гиппокампе. Эти особенности были продемонстрированы в когортах животных, созданных для этого исследования, и показаны в иммуноцитохимическом окрашивании PrPSc (фиг.1, A и B). Кроме того, у животных на продвинутой стадии заболевания образование гиппокампа явно уменьшается по объему, и есть потеря клеток гиппокампа, отмеченная прореживанием пирамидального слоя СА1, и снижение интенсивности и дезорганизация окрашивания нескольких синаптических маркеров , включая синаптофизин синаптического везикула (фиг.1, C и D). Дальнейшее вестерн-блоттинг из тканевых экстрактов выявило вызванное болезнью накопление PrPSc и устойчивое снижение синаптических белков (рис.1E). Животные, демонстрирующие эту дегенерацию нейронов, демонстрируют явные изменения в ряде аффективных, когнитивных и моторных поведений и проявляют пилоэрецию и сгорбленное поведение в домашней клетке (22).

Основная синаптическая архитектура в модели ME7. Представительное иммуногистологическое окрашивание с использованием моноклонального антитела 6H4 PrP на обработанных автоклавированной обработанной муравьиной кислотой коронарных срезах у контрольных животных NBH (A) сравнивают с животными ME7 (B, показывая накопленный неправильно закрепленный прион (PrPSc, коричневое пятно)). Сопоставление моноклональных антител синаптофизина (mAb SY38) нормальных слоев гиппокампа у животных NBH (C) сравнивается с животными ME7 (D, демонстрируя синаптическую дезорганизацию и нейродегенерацию в поздней стадии прионной гиппокампальной ткани). Маркировка слоев гиппокампа выглядит следующим образом: Или, oriens layer; Rad, stratum radiatum; LMol, молекулярный слой лакуносума; MoDG, молекулярный слой зубчатой ​​извилины; ГРДГ, зубчатая извилина из гранулированного слоя; PoDG, полиморфный слой зубчатой ​​извилины. Шкала шкалы, 200 мкм. E показывает репрезентативную вестерн-блот из общего гомогената головного мозга от нормальных (NBH) или мышей, зараженных ME7, которые указывают на связанное с болезнью увеличение PrP (mAb 6H4) и снижение синаптофизина синаптического маркера (mAb SY38) в ME7 по сравнению с животными NBH.

Мы объединили гиппокампы из пяти 21-недельных животных ME7 и сравнили их с животными NBH, сопоставимыми с возрастом. Мы выделили общий белок из мембранных гомогенатов путем солюбилизации в SDS-содержащих буферах, совместимых с аффинной маркировкой с iTRAQ (Applied Biosystems). Это включало верхнюю концентрацию SDS 0,1%. Мы профилировали и количественно определяли различия с использованием масс-спектрометрии. Подход MS / MS вызывает фрагментацию изобарических тегов из исходного пептида, и сигналы от них захватываются на конце с низкой молекулярной массой спектра. Это относительное обилие сигнала из изобарических меток дает количественную оценку отдельных белков из образцов из животных ME7 и NBH, соответственно. В высокомолекулярном конце спектра фрагментация исходного иона дает сигнал, который используется для идентификации белка. В текущем анализе контрольные образцы животных NBH были помечены 115 изобарической меткой, а образцы животных ME7 были помечены тегом 117. Многие пептиды фрагментированы, не обнаруживая изменений в относительном обилии, и это проиллюстрировано на фиг.2, средняя панель. Другие пептиды, которые были фрагментированы, показывают явные различия в их относительном выражении. Среди более ярких изменений были те, которые связаны с несколькими пептидами, полученными из GFAP; также показан необработанный сигнал от одного из пептидов для этого белка (фиг.2, верхняя панель).

Показаны репрезентативные спектры MS / MS для двух пептидов, идентифицированных в этом анализе.
Верхняя и средняя панели, 100 мкг гомогената были денатурированы, уменьшены / алкилированы, обработаны трипсином и мечеными реагентами iTRAQ 115.1 и 117.1 параллельно. Оба реагента имеют группу репортеров для маркировки первичных аминов, а также баланса. Полученную меченую комплексную пептидную смесь смешивали и разделяли путем катионообменной хроматографии. После столкновения с индуцированной диссоциацией MS / MS-анализа предшественника ионные группы репортеров проявляются в виде отдельных ионов (m / z 115-117), а относительная концентрация пептидов определяется относительной интенсивностью репортерных ионов. Показаны спектры MS / MS для Syntaxin-связывающего белка и GFAP с фрагментацией пептидов и фрагментацией изобарической метки, которые используются для идентификации (левая панель) и количественной (белой) белковой экспрессии соответственно. Все сигналы с интенсивностью репортерного иона <20 были проигнорированы. Этот анализ позволил получить надежные сигналы, охватывающие 2-9 пептидов от 200 индивидуальных белков гиппокампа. Коррелограмма показывает относительную экспрессию более 200 белков гиппокампа в экстрактах гиппокампа NBH и ME7. Нижняя панель, более 200 белков была предсказана с использованием инструментов биоинформатики. Мы использовали 2-кратное изменение в качестве среза для оценки изменений экспрессии белка; восемь белков были идентифицированы как отрегулированные и три белка как пониженные в ME7 по сравнению с животными NBH. Четыре из вышеперечисленных белков (GFAP, Clusterin, EAAT-2 и Prdx6) являются компонентами астроцита.

Полные собранные MS / MS-спектры сначала подвергались ручному анализу для устранения спектров, в которых сигнал, связанный с NBH- или ME7, составлял менее 20 отсчетов. Оставшиеся спектры были запрошены относительно базы данных мыши, и большинство пептидов соответствовало высоким значениям ионов MASCOT (p <0,05). Наш анализ MS / MS основан на количественных данных пептида от> 200 отдельных белков гиппокампа, экспрессия которых изменяется или остается неизменной (рис.2, нижний график). Используя 2-кратное изменение в качестве среза для оценки изменений экспрессии белка, мы обнаружили, что три белка были отрегулированы и восемь белков были отрегулированы у животных ME7 относительно животных NBH (таблица 1). Строгое отсечение было установлено, потому что ряд белков, которые удовлетворяют критериям для включения, были достигнуты на основе одиночных пептидов. Представленные белки не включали синаптофизин, который, как мы показали ранее, уменьшал экспрессию путем количественного иммуноблоттинга (фиг.1Е). Это подтверждает мнение о том, что текущий анализ благоприятствует обнаружению белков, которые были относительно обильно экспрессированы в экстракте протеома гиппокампа. Краткие описания функции дифференцированных регулируемых белков представлены в таблице 2. Дополнительная информация об идентифицированных белках, которые не изменялись или не показывали потенциальную дифференциальную регуляцию ниже наших критериев, перечислены в книге Gray (33).

Белки, экспрессируемые в экстрактах гиппокампа NBH и ME7

Выбранные выше регулируемые белки в ME7 сравниваются с образцами NBH. Рассмотрены только белки с коэффициентами, по крайней мере в 2 раза выше или ниже среднего значения (0,9). Сообщается о белках-кандидатах с их ассоциированным номером присоединения (курсивом ниже). Восемь пептидов были отрегулированы в ME7 по сравнению с NBH. Выбранные вниз-регулируемые белки в ME7 сравниваются с образцами NBH. Перечислены три пептида, пониженные в ME7 по сравнению с животными NBH.

Функция белков, экспрессируемых в экспрессиях гиппокампа NBH и ME7

Белки сообщаются с их ассоциированным номером присоединения (курсивом ниже).

GFAP был одним из наиболее устойчиво регулируемых белков, основанных на относительной интенсивности нескольких идентифицированных пептидов. Кроме того, интенсивность сигнала МС в образцах НБН также указывала на то, что белок является одним из наиболее распространенных белков, профилированных даже в контрольных образцах. Иммуноцитохимическое окрашивание для GFAP в срезах гиппокампа из животных NBH и ME7 показывает обилие астроцитов в обеих когортах и ​​заметно повышенное окрашивание в образцах ME7 (фиг.3, A-D, по сравнению с E-H). Три из других белков-кандидатов, которые, как мы наблюдали, были отрегулированы у животных ME7, включали Clusterin, EAAT-2 и Prdx6, которые, как известно, преимущественно экспрессируются в астроцитах (фиг.3, I-N) (34-36 ). Иммунореактивность для этих молекул также наблюдается у астроцитов вне гиппокампа (данные не показаны). Мы использовали двойную иммуноцитохимию Prdx6 и GFAP, чтобы подтвердить, что этот белок экспрессируется и индуцируется в астроцитах или других клетках у животных ME7. Наши данные показали совместную локализацию Prdx6 и GFAP, хотя и с более слабой иммунореактивностью Prdx6, чем GFAP; Prdx6 был экспрессирован в ткани NBH (фиг.4, A-D), но был заметно увеличен у животных ME7 (фиг.4, E-J). Кажется, что клетки, отличные от астроцитов, не выражают Prdx6. Совместная локализация ImageJ показана белым в крайнем правом углу, иллюстрируя пиксели, имеющие как значительные красные, так и зеленые сигналы (рис.4, I-J).

Реактивные астроциты в гиппокампе животных ME7. Микрофотографии иллюстрируют экспрессию GFAP у животных NBH и ME7 через 21 неделю. Ядра контрастировали с гематоксилином. Показана иммунореактивность GFAP в астроцитах в слоях гиппокампа животных NBH (см. Стрелки в размерах A-D, × 5, × 10, × 20 и × 40 соответственно). На этом этапе в корковых областях животных NBH наблюдается минимальное окрашивание GFAP (данные не показаны). Животные ME7 были сильно положительны для GFAP, особенно в разбухших астроцитических процессах (см. Стрелки в размерах E-H, × 5, × 10, × 20 и × 40 соответственно), и на этой стадии заболевания GFAP-окрашивание в коре (данные не показаны). Маркировка областей гиппокампа: образование гиппокампа (HPF); зубчатая извилина (DG); заднее таламическое ядро ​​(Po); область cornu ammonis 1 (CA1); stratum radiatum (SRad). Секции головного мозга окрашивались антителами против других ассоциированных с астроцитом белков, выделенных в протеомическом анализе, и представлены репрезентативные изображения стратиграфического радиуса в животных NBH и ME7, иммунизированных для Clusterin (I и J), EAAT-2 (K и L) , и Prdx6 (M и N) (стрелки направляются на примеры иммунореактивных астроцитов). Шкала шкалы, 20 мкм.

Prdx6 окрашивание гиппокампа у животных NBH и ME7. Репрезентативные флуоресцентные изображения для иллюстрации экспрессии Prdx6 в астроцитах в области гиппокампа CA1 животных NBH и ME7. A-D, совместное окрашивание Prdx6 с GFAP у животных NBH. A, GFAP, Texas red; B, ядра, DAPI синий; C, Prdx6, FITC зеленый; и D, объединенное изображение. Шкала шкалы, 100 мкм. E-H, ME7 животных. E, Prdx6, FITC зеленый; F, ядра, DAPI синий; G, GFAP, Техас красный; и H, слитое изображение. Шкала шкалы, 75 мкм. I, представительное изображение, показывающее область гиппокампа CA1 с высоким выражением, совпадение Prdx6 и GFAP (наконечники стрел) у животных ME7 показано с более высоким увеличением. Совместная локализация ImageJ показана белым в крайнем правом углу, иллюстрируя пиксели, имеющие как значительный красный, так и зеленый сигнал (J). Шкала шкалы, 50 мкм.

Повышенная экспрессия отдельных белков может просто отражать увеличение числа астроцитов в результате заболевания. Имеются данные, свидетельствующие о том, что содержание GFAP увеличивается в астроцитах во время реактивного глиоза (37, 38), а также свидетельства того, что астроциты могут размножаться в некоторых болезненных состояниях (39). Чтобы решить эту проблему, мы использовали Ki67 в качестве маркера клеточной пролиферации и двойной маркировки GFAP, чтобы исследовать, было ли распространение астроцитов во время болезни ME7. Используя этот подход, мы обнаружили, что у животных NBH иммунореактивность Ki67 низкая (данные не показаны) относительно животных ME7 (рис.5). Хотя в животных ME7 было увеличено Ki67, мы не наблюдали значительную ко-локализацию Ki67 и GFAP (фиг.5, наконечники стрел). В случаях применения Ki67 и GFAP это окрашивание появилось в связанных клетках (рис.5, стрелки). Это согласуется с нашим недавним докладом, в котором мы демонстрируем, что популяция микрогенных была основным клеточным типом, распространенным во время прионной болезни (21). Это говорит о том, что повышенный уровень астроцитарного белка в гиппокампе животных ME7 не определяется их пролиферацией (рис.5).

Экспрессия маркера пролиферации Ki67 в гиппокампе животных ME7 и его совместная локализация с маркером астроцитов GFAP. Репрезентативные изображения из корональных разрезов, показывающих гиппокампальную стратиграфическую оболочку (SRad) (A) и зубчатую извилину (DG) животных ME7, окрашенных для клеток Ki67 +, FITC green и GFAP, Texas red (B). Большинство окрашиваний Ki67 (FITC green) было ограничено ядром (наконечники стрел) и в значительной степени отличалось от GFAP (красный техасский). Несколько клеток Ki67 + были добавлены к GFAP (стрелки), но это было связано скорее, чем с GFAP-позитивными клетками. Шкала шкалы, 100 мкм.

Мы исследовали прогрессивные изменения в идентифицированных глиальных генах и их экспрессированных белках по заболеванию. Пять гиппокампий из животных ME7 и NBH в течение 8, 13 и 21 недели гомогенизировали в виде отдельных образцов и делили на 2 аликвоты, из которых извлекали либо белок, либо общую РНК. Для количественного анализа вестерн-блоттинга мы использовали пул SDS-буферных экстрагированных 8-, 13- и 21-недельных гомогенатов гиппокампа NBH в качестве контроля (контроль NBH), который сравнивали с 13 и 21 неделями животных ME7 и исследовали с помощью антитела против PrP, GFAP, Clusterin, EAAT-2 и Prdx6 (фиг.6, A-J). Присутствие возрастающего уровня PrPc / PrPSc в каждом образце было показано увеличением иммунореактивности антител против PrP и появлением олигомеров высокого порядка, которые сопротивляются диссоциации SDS как на средней, так и на поздней стадиях заболевания (фиг.6, A и F, p <0,01) (32). Иммунореактивность GFAP увеличивалась с заболеванием (фиг.6В), а количественная оценка показала значительное увеличение по сравнению с контролем НБН в 13-недельный момент времени (фиг.6В, р <0,01), что еще больше увеличилось на 21 неделю (фиг.6В, р <0,01).

Вестерн-блот-анализ для проверки изменений белка, наблюдаемых при анализе МС. Количественное вестерн-блоттинг астроцитарных белков в гомогенатах гиппокампа (мозговой эквивалент, 20 мкг) у нормальных животных (объединенные контрольные НБГ) по сравнению с животными ME7 (13 и 21 неделя). Образцы были исследованы на присутствие PrP (mAb 6H4) (GFAP, EAAT-2, Clusterin и Prdx6). A-E показывает репрезентативные экспериментальные пятна. 1-я полоса, контроль НБН; 2-я полоса, 13-недельный ME7; и 3-я полоса, 21-недельный ME7. F-J, денситометрические данные в каждом баре представляют собой средства ± S.E. от n = 5 животных. Шкала ошибок представляет собой прямое сравнение экспрессии белка в контрольных образцах NBH и животных ME7. * означает p <0,05; ** означает p <0,01; *** означает p <0,001.

Иммунореактивность Clusterin (фиг.6C) размыта в соответствии с предыдущими данными для этого высокогликозилированного белка (40). Тем не менее, мы наблюдали прогрессирующее увеличение иммунореактивности для Clusterin, которое разрешается как кажущаяся негликозилированная полоса (стрелка на фиг.6C) и различные гликозилированные состояния (мазка на фиг.6C), которые постепенно увеличиваются на 13 и 21 неделю. Мы подсчитали интенсивность полосы негликозилированного / гликозилированного белка при 45 кДа и показали, что это увеличение было значительным относительно контроля НБН как на 13, так и на 21 неделе (p <0,01). Аналогично, EAAT-2 продемонстрировал повышенную экспрессию через 13 недель, которая прогрессировала еще через 21 неделю (фиг.6D), и количественное определение этих блоттингов показало, что экспрессия EAAT-2 значительно возрастает через 13 недель и прогрессирует до повышенного уровня через 21 неделю ( Фиг.6I, p <0,05 и p <0,001 соответственно). Экспрессия Prdx6 также значительно повышалась на поздней стадии заболевания (рис.6, E и J, p <0,01), что согласуется с независимой идентификацией ее индукции в анализе iTRAQ и иммуногистохимией (фиг.3, L и N) , Напротив, этот белок не кажется значительно повышенным в более ранний момент времени; таким образом, в отличие от GFAP и EAAT-2, Prdx6 только значительно индуцируется позже при болезни ME7.

Предыдущие исследования показывают, что увеличение экспрессии GFAP напрямую связано с транскрипционным ответом. Однако дифференцированное увеличение экспрессии в PrP, Clusterin и Prdx6, идентифицированное в этом исследовании, указывает на то, что между транскрипцией и экспрессией белка может быть непростая взаимосвязь. TaqMan RT-PCR проводили для количественной оценки экспрессии мРНК. Ожидаемый размер ПЦР-продукта для каждого продукта гена был первоначально подтвержден электрофорезом в агарозном геле, и, кроме того, контроль без шаблона не показал амплификации (данные не показаны). Анализ RT-PCR сравнивал изменения в PrP, GFAP, Clusterin, EAAT-2 и Prdx6 мРНК животных ME7 и NBH (рис.7, A-E). Следует отметить, что эти мРНК взяты из той же ткани, которая используется для измерения уровней экспрессии белка. Несмотря на значительное увеличение белка PrP, нет никаких дифференциальных изменений в мРНК PrP между животными NBH и ME7 (рис.7A). Мы наблюдали, что у животных ME7 на поздней стадии заболевания транскрипция GFAP и Clusterin была увеличена в 5 раз (фиг.7, B и C, p <0,001 и p <0,05 соответственно) по сравнению с NBH. Не было различий в уровнях транскрипта EAAT-2 на поздней стадии заболевания между животными ME7 и NBH, хотя было значительное увеличение мРНК EAAT-2 на средней стадии заболевания по сравнению с NBH (фиг.7D ). Данные свидетельствуют о том, что это связано с низким уровнем экспрессии в группе NBH в этот момент времени. Значения экспрессии мРНК Prdx6 были значительно ниже, чем у других генов (рис.7Е) и не увеличивались с прогрессированием заболевания. Повышенная экспрессия белка Prdx6 не поддерживается транскрипционной повышающей регуляцией мРНК Prdx6.

TaqMan RT-PCR. Анализ TaqMan RT-PCR мРНК EAAT-2, Prdx6, PrP, GFAP и Clusterin в NBH сравнивается с животными ME7. A, PrP мРНК остается неизменной, хотя уровни были выше в середине стадии заболевания. B и C, транскрипция Clusterin и GFAP были увеличены в 5 раз (*, p <0,05; ***, p <0,001 соответственно) по сравнению с NBH на поздней стадии заболевания. D, на поздней стадии заболевания не было различий в уровнях транскрипта EAAT-2, хотя было значительное увеличение мРНК EAAT-2 на средней стадии заболевания по сравнению с NBH. E, не было транскрипционной регуляции Prdx6, связанной с распространением болезни.

Ранее мы показали, что в мозге животных с прионным заболеванием индуцируется ряд типичных белков сыворотки сыворотки сыворотки сыворотки сыворотки А, комплемента С3, пентаксина 3 и α2-антиплазмина, но в печени нет индукции, несмотря на присутствие системного осаждения PrPSc (19). Индукция белка острой фазы Clusterin в астроцитах представляет особый интерес, поскольку было высказано предположение, что этот белок может быть полезным сывороточным биомаркером у пациентов с AD (41). Таким образом, используя коммерчески доступный сэндвич-иммуноанализ, мы изучили полезность Clusterin как кандидата биомаркера сыворотки при прионном заболевании. Мы измерили его концентрацию в образцах от животных NBH и ME7, и мы показали, что уровни Clusterin в сыворотке не изменялись (фиг.8A, 72.02 ± 9.5 и 83.17 ± 4.5 мкг / мл). Несмотря на значительное увеличение этого белка в областях гиппокампа, коры головного мозга и таламических головных мозга животных с прионным заболеванием, белок не оставляет мозг в достаточном количестве, чтобы его можно было обнаружить в сыворотке. Мы также рассмотрели, повлияет ли системная инфекция Salmonella typhimurium на уровни Clusterin (42). Общая инфекция сальмонеллами повышала уровни циркулирующего Clusterin у животных NBH и ME7 на 40% (p <0,05) и 35% (p = 0,215) соответственно, по сравнению с неинфицированными животными, но не было никакой разницы между NBH Salmonella и ME7 Salmonella (фиг.8А, 112,1 ± 14,3 и 112,4 ± 21,6 мкг / мл).

Измерение кластерина в сыворотке. Уровни Clusterin измеряли количественным сэндвич-ELISA в сыворотке животных NBH и ME7 с или без системной инфекции S. typhimurium. Фондовая биржа показаны значения, и не было статистических (ns) различий между животными NBH и ME7 в обеих группах.

Модель прионной болезни ME7 вызвала все более детальное понимание эволюции патологии этого нейродегенеративного заболевания и основных механизмов (21, 22, 43-45). В этом исследовании мы исследовали протеом гиппокампа при позднем прионном заболевании. В этом исследовании используется метод iTRAQ для одновременной идентификации и количественной оценки протеома гиппокампа у животных с вызванным ME7 прионным заболеванием (25, 26, 46). Этот анализ позволил получить надежные сигналы, охватывающие 2-9 пептидов от 200 индивидуальных белков гиппокампа. Используя 2-кратное изменение в качестве отсечки для оценки изменений в экспрессии белка, мы идентифицировали восемь белков как регулируемые по регулированию и три белки, как отрегулированные у животных ME7.

Мы специально сосредоточились на четырех из вышеперечисленных белков (GFAP, Clusterin, EAAT-2 и Prdx6), которые, как известно, выражаются астроцитами (47, 48). Повышающая регуляция GFAP является доминирующей чертой протеома пораженной прионами ткани головного мозга (32, 49, 50), а три других белка независимо друг от друга ассоциируются с астроцитами и проявляют дифференциальное увеличение экспрессии при прогрессировании прионного заболевания до конечной стадии. Наблюдается устойчивое увеличение GFAP, Clusterin и EAAT-2 на протяжении всего периода времени заболевания с более ограниченным началом повышенной экспрессии, проявляемой Prdx6. Регуляция глиальных экспрессируемых молекул также различна при рассмотрении сравнения экспрессии белка и мРНК. Эти анализы проводили с помощью вестерн-блоттинга и транскрипционно измеряемой экспрессии генов в белке и мРНК, экстрагированных из одной и той же ткани. Это показывает, что увеличение некоторых глиальных белков сопровождается регуляцией транскрипции, тогда как в случае Prdx6 увеличение белка кажется независимым от транскрипционного ответа. Некоторые из этих изменений, описанных выше, подтверждаются наблюдениями в исследованиях времени микрочипов от других прионных штаммов (50, 51).

Наблюдение, что окрашивание Ki67 не совпадает с прогрессированием заболевания, показывает, что изменения в экспрессии белка, которые мы исследовали, происходят в численно постоянной популяции астроцитов. Мы заметили, что маркировка астроцитов Ki67 незначительна, что контрастирует с микроглиями с выраженным пролиферативным ответом (21). Предыдущие исследования микроглиального ответа показали, что они способствуют патогенезу прионного заболевания (24, 52). Селективное ингибирование пролиферации микроглии замедляло прогрессирование заболевания (21). Однако меньше известно о роли, которую играет астроглия.

Исследования in vitro показали, что и нейроны, и астроциты способны поддерживать эффективное распространение прионов независимо, что приводит к получению PrPSc (53), но кинетика их производства в покоящихся и активированных глиях не изучалась. Было показано, что нейронный синтез PrPc важен, поскольку реверсия прионного заболевания возможна за счет селективного восстановления нейронального PrPc у мышей с установленной прионной инфекцией (54). Однако имеются многочисленные свидетельства того, что внеклеточные автономные воздействия тесно связаны с патогенезом болезни. Экспрессия PrPc в астроцитах имеет решающее значение для поддержания взаимодействия между клетками, дифференциации нейронов и выживаемости (55), но астроциты накапливают прионные агрегаты, приводящие к реактивному астроцитозу (56), который окружает астроциты с побочным эффектом на PrPc-нулевые нейроны (57) ,

Специфическая для астроцитов экспрессия белка приона хомяка дает PrP нокаутные мыши, восприимчивые к прионному заболеванию, несмотря на отсутствие нейрональных PrPc (15). Другие подтвердили, что экспрессия PrP на нейронах или астроцитах была достаточной для нейродегенерации прион (58), но экспрессия PrPc на фолликулярных дендритных клетках также важна для репликации прионов (59, 60). Не менее важным в патогенезе болезни является роль перекрестных помех нейронной глии, которая, по-видимому, инициируется взаимодействием между микроциклическими секретируемыми молекулами и астроцитами, которые затем воздействуют на нейроны (61, 62). Это подчеркивает глиальные клетки, играющие решающую роль в болезни, как это наблюдалось в нескольких других нейродегенеративных условиях (16, 64).

Белки, идентифицированные на протеомическом экране, демонстрируют функции, которые поддерживают потенциальную роль модуляторных детерминант прогрессирования заболевания. Хотя GFAP по существу является структурным белком, его индукция в астроцитах лежит в основе важных морфологических изменений, которые астроциты используют, чтобы расширить сферу их влияния и облегчить клеточные структуры и функционировать, определяя форму и контролируя движение этих клеток (65). В случае Clusterin несколько связанных действий предполагают, что он регулирует нейродегенерацию (66, 67). Функции Clusterin включают внеклеточное шаперонирование белка, липидную каретку и участие в стресс-ответах, все из которых являются нейрозащитными. В контексте прионного заболевания Clusterin демонстрирует способность связывать несогласованный белок с высокой авидностью (68), и было показано, что он уменьшает цитотоксичность амилоида-β в AD (69). Тем не менее, Clusterin также, как известно, сотрудничает с каскадом комплемента как в ЦНС, так и на периферии, взаимодействии, которое может помочь с рассогласованным протеином (70, 71). Роль этих путей и их потенциальная конвергенция друг с другом получили новый интерес после наблюдения, что Clusterin и C1q-рецептор, ранний компонент каскада комплемента, являются значимыми генетическими детерминантами позднего начала AD (72, 73).

Было установлено, что кластерин был увеличен в плазме пациентов с АД, и сообщалось, что уровни связаны с выраженностью и прогрессированием заболевания (41, 74, 75), но другие не согласны (76-78). Мы исследовали, были ли изменения в мозговых концентрациях Clusterin у животных ME7 отражены в сыворотке. Мы тестировали сыворотки у 21-недельных животных NBH и ME7 в момент времени, когда была устойчивая нейродегенерация и периферическое осаждение PrPSc. Реально мы можем быть уверены, что животные еще не достигли конечной болезни, когда недержание мочи может вызвать системное воспаление, достаточное для того, чтобы вызвать острую фазовую реакцию печени, независимо от последующей нейродегенерации. Наши результаты не показали разницы в уровне сывороточного уровня Clusterin между животными NBH и ME7. Эти данные, в которых периферические нарушения были хорошо контролируемы, предостерегают от идеи о том, что повышенные уровни мозга белков острой фазы или центрально вырабатываемых компонентов врожденных иммунных клеток могут быть обнаружены в сыворотке.

Существовала значительная разница в уровнях кластерина сыворотки между контролем и животными, инфицированными S. typhimurium, но не было различий между когортами инфицированных S. typhimurium NBH и животных ME7 (42). Это показывает, что оценки Clusterin в сыворотке непригодны как биомаркер прионной болезни. Протеиновые и мРНК уровни провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и TNF-α, повышаются в головном мозге, периферической лимфоидной ткани и сыворотке терминальных прионных животных (19, 79, 80). Макрофаги, моноциты и астроциты, ответственные за эти сигналы, могут индуцировать экспрессию белков острой фазы, таких как Clusterin (81, 82). Уровни кластерина повышаются в синовиальной жидкости ревматоидного артрита и пациентов с остеоартритом (83, 84) и в спинномозговой жидкости пациентов с АД, болезнью Паркинсона и рассеянным склерозом (85-87), а также в моче пациентов с почками раны или рак мочевого пузыря (88, 89). Не исключено, что повышенный уровень Clusterin в плазме пациентов с АД отражает системное заболевание (90). Консенсус в том, что хотя белки острой фазы являются высокочувствительными индикаторами воспаления и повреждения тканей, им не хватает специфичности (91, 92).

Индукция EAAT-2 и Prdx6 представляет собой скоординированное увеличение молекул, которые обеспечивают нейропротективную роль. EAAT-2 отвечает за большинство поглощений глутамата в установившемся состоянии в головном мозге (93), и повышенная экспрессия этой молекулы будет задерживаться против нейротоксического эффекта повышенных внеклеточных уровней этого передатчика (94). В других заболеваниях, связанных с белками, существует явный прецедент для целенаправленного нарушения функции EAAT-2 (95); однако значение токсичности глутамата при прионном заболевании может быть более ограниченным, но менее понятным. Данные недавнего транскрипционного анализа животных прионной болезни также свидетельствуют о том, что экситотоксическая сигнализация может способствовать продолжающемуся заболеванию (96). Это означало бы, что выражение EAAT-2 отражает важный вторичный эффект для буферного глутамата, который возникает из прогрессирующей первичной нейродегенерации. Аналогично, Prdx6 относится к семейству 25-кДа пероксидаз с одним окислительно-восстановительным цистеином, который, как полагают, функционирует как антиоксиданты (97, 98). Хотя Prdx6 имеет зарегистрированную активность фосфолипазы A2, его роль в глиальном ответе, вероятно, будет как антиоксидант (99). Наш анализ этого белка и его мРНК, поддерживая его появление в глиальной экспрессии болезни, предполагает, что он регулируется на уровне белка.

Мы специально сосредоточились на белках, связанных с астроцитом, в этом отчете, но остальные повышенные уровни белка также представляют интерес и были кратко описаны в таблице 2. В частности, их потенциальная роль в опосредующих изменениях врожденной иммунной регуляции и структурном ремоделировании нейронов также предполагает наличие возможных новых целей для терапевтического вмешательства. Другие штаммы прионов (22L и 79a) демонстрируют некоторые перекрывающиеся поведенческие дефициты и невропатологию с ME7 (100, 101), но мы имеем ограниченные доказательства того, что наши биохимические наблюдения в прионном заболевании ME7 такие же, как и в других штаммах. Более подробное обсуждение различий потенциальных деформаций, которые не были исследованы, выходит за рамки настоящего доклада. Однако есть свидетельства того, что исследованные нами белки также дифференциально регулируются при других прионных заболеваниях (32, 49-51, 102-105). Нынешний анализ, хотя и ограниченный идентификацией и характеристикой наиболее распространенных компонентов вырождающегося протеома гиппокампа, предполагает сложный многогранный глиальный ответ, способный гомеостатический ответ, который поддерживает морфологические, метаболические, протеостатические и нейрохимические изменения в хроническом дегенерирующем мозге.

Эта работа была поддержана Советом медицинских исследований Grant G0501636.

Используемые сокращения:
болезнь Альцгеймера

нормальный сотовый PrP

протеиназа K устойчивая форма PrP

глиальный фибриллярный кислый белок

нормальный гомогенат мозга

флуорофор 6-карбоксифлуоресцеин

тетраметилродамин.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *