Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

3R и 4R тау-изоформы в парных спиральных нитях при болезни Альцгеймера

3R and 4R tau isoforms in paired helical filaments in Alzheimer’s disease
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3895182/

Isoform-специфические тау-антитела RD3 и RD4 являются полезными инструментами для исследования экспрессии и локализации трех повторных (3R) и четырех-повторных (4R) тау-изоформ. Недавно переход от 3R к 4R тау при болезни Альцгеймера (AD) был предложен на основе иммуногистохимических исследований с RD3 и RD4 [3]. Здесь мы показываем, что на иммунореактивность к этим антителам влияют два фактора. Во-первых, дезамидирование на эпитопе RD4 отменяет иммунореактивность к RD4, а во-вторых, представление эпитопов RD3 и RD4 накладывается взаимным влиянием на протеазу. Аспарагин в положении 279 в эпитопе RD4 преимущественно дезамидируют до аспарагиновой кислоты в патологическом тау в мозгу AD [2, 4]. Следовательно, наличие 4R tau в AD-патологиях может быть недооценено при использовании RD4. Однако анти-4R (доступный от Cosmo Bio Co., Ltd.), выращенный против пептида RD4 с замещением N279D, окрашенным как дикого типа, так и дезамидированного 4R тау, и сильно окрашенных RD3 + / RD4-клубок и размазываний тау-фрагментов в нерастворимой Саркозиле фракции мозга AD [2].

Сообщалось, что RD3 окрашивал обильные призрачные клубочки в энторинальной коре и запутывает в CA1, но не смог окрасить тонкие процессы клубок и нитей [3], в то время как RD4 не обнаруживал пучки призраков в энторинальной коре [3]. Чтобы понять эти результаты, мы исследовали влияние протеазы на иммунореактивность. Парафиновые отделы головного мозга AD обрабатывали 10 мкг / мл протеиназы K (Pro-K) в течение 30 минут после обработки автоклавированием (Ac) и муравьиной кислоты (FA). Окрашивание RD3 сильно усиливалось (рис.1a, b). И наоборот, иммунореактивность RD4 почти полностью исчезла после лечения Pro-K (рис.1c, d). Не только путаницы-спутники, но и пучки RD3- / RD4 + и их процессы становились RD3-положительными после обработки Pro-K (рис.1a, b), что сильно указывало на то, что эпитоп RD3 был похоронен в тау-нитях внутриклеточных клубок и нитей и был подвергается обработке Pro-K. Вопреки ожиданиям, анти-4R-окрашивание также усиливалось обработкой Pro-K (рис.1e, f). Возможно, что сайт распознавания анти-4R отличается от сайта распознавания RD4 и подвергается обработке Pro-K секциями. Анти-4R-антитело может распознавать карбоксильную половину антигенного пептида, тогда как RD4 распознает аминоконцевую половину вокруг N279. Обработка Pro-K также эффективна при иммуноокрашивании свободно плавающих сегментов AD с более низкой концентрацией. 1
a-f Иммуноокрашивание AD-секций после лечения Ac и FA до (a, c, e) и после (b, d, f) лечения Pro-K с использованием RD3 (a, b), RD4 (c, d) и анти- -4R (e, f). Бар 100 мкм. g-j Иммуноблоты Саркозил-нерастворимого тау из двух головного мозга AD до (Con) и после лечения трипсином или Pro-K с использованием RD3 (g), RD4 (h), анти-4R (i) и pS396 (j) , k-l Вычисленное поперечное сечение через парную спиральную нить (k) [воспроизведено из работы [ [1], с разрешения издателя], предсказанная складная модель 3R и 4R tau в PHF (l). RD3 и RD4-эпитопы обозначены синим и красным соответственно. 4R tau специфическая вставка обозначена подчеркиванием. Сайт дезамидирования N279 обозначен звездочками. Указывается фосфорилирование Ser396. Возможные участки расщепления трипсином, проназой и Pro-K указаны в зеленых, пурпурных и синих стрелках соответственно. Протеазоустойчивый домен PHF обозначен как PHF-ядро

Чтобы подтвердить эти результаты биохимически, Саркозил-нерастворимые фракции из двух головного мозга AD обрабатывали трипсином или Pro-K, затем иммуноблоттировали RD3, RD4, анти-4R и анти-pS396 (фиг.1g-j). RD3 сильно окрашивал много полос и мазков, как видно из pS396 (фиг.1g, j), тогда как RD4 только маркировал дублет 64/68 кДа и некоторые фрагменты при ~ 25 кДа (фиг.1h). Анти-4R сильно окрашивал мазки и фрагменты (рис.1i), предполагая, что tau в этих RD4-отрицательных анти-4R-позитивных полосках и мазках дезамидируют при N279. Слабая RD4 и сильная анти-4R-иммунореактивность были полностью отменены после лечения трипсином или Pro-K (фиг.1h, i). Этот результат несовместим с иммуногистохимией, но чувствительность к протеазе, вероятно, отличается в фиксированных тканях. Напротив, эпитоп RD3 был сохранен во фрагментах, а RD3 сильно реагирует с протеазо-резистентными полосами 10-25 кДа после обработки трипсином или Pro-K (фиг.1g). pS396 эпитоп был удален Pro-K, но не трипсином, что указывает на местоположение вне ядра PHF. Трипсин не может расщеплять сайт КСП из-за фосфорилирования Ser396. Эти результаты демонстрируют взаимные эффекты обработки протеазой на эпитопах RD3 и RD4, что указывает на то, что эпитоп RD4 в тау в AD восприимчив к протеазам, тогда как эпитоп RD3 обладает высокой устойчивостью.

Эти результаты согласуются с предыдущими результатами. Wischik et al. идентифицировали два типа аминокислотных последовательностей, QPGGGKVQIVYK … (3R tau) и IKXVPGG … (4R tau), в 12-кДа-тау-фрагменте, содержащем проназ-устойчивое ядро ​​PHF [6] (см. фиг.1k). Мы идентифицировали HQPGGG … (3R tau) и HVPGGG … (4R tau) в 7-15 кДа трипсин-резистентных фрагментах PHF-tau в мозгу AD [5]. В обоих случаях были обнаружены изоформы 3R и 4R tau, но на 4R tau N-конце отсутствовал эпитоп RD4. Основываясь на этих наблюдениях и вычисленном поперечном сечении PHF (рис.1k) [1], мы предлагаем схематическую модель tau folding в PHF (рис.1l). Анализ плотности поперечного сечения в ядре PHF на электронных микрофотографиях указывает на наличие двух C-образных морфологических единиц, которые соответствуют двум нитям PHF, каждая из которых имеет три домена (рис.1k) [1]. Эпитоп RD3 заглублен в ядро ​​PHF и обычно маскируется N- или C-терминальной областью tau, но подвергается воздействию в путаницах-призраках и / или в PHF, атакуемых протеазами. Эпитоп RD4, который в основном деамидирован в PHF, расположен немного вне ядра, где он может быть переварен протеазами (фиг.1l). Эта модель может объяснить маскирование эпитопов RD3 и RD4 и обратные эффекты деградации или протеазы на иммунореактивность.

Это исследование показывает, что дифференциальное представление эпитопов может возникать в результате сгибания и обработки, даже когда эпитопы расположены в непосредственной близости. Тау в PHF, по-видимому, постепенно обрабатывается внутриклеточными протеазами и более широко во внеклеточном пространстве во время прогрессирования AD. Мы полагаем, что изменения в иммунореактивности к антителам отражают старение тау в клубочках или PHF, которые состоят из изоформ 3R и 4R tau. Мы также показываем, что Pro-K лечение секций после лечения Ac и FA полезно для разоблачения захороненных эпитопов.

Мы признаем поддержку исследования Альцгеймера в Великобритании и общества Альцгеймера за счет финансирования Манчестерского мозгового банка под инициативой «Исследования мозгов за слабоумие» (BDR). Эта работа была поддержана грантами для научных исследований (S) (JSPS KAKENHI 23228004), (A) (JSPS KAKENHI 23240050) и MHLW Grant 12946221 (до M.H.).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *