Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

FLZ устраняет недостатки памяти в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера путем снижения производства бета-амилоидов и гиперфосфорилирования тау

FLZ Alleviates the Memory Deficits in Transgenic Mouse Model of Alzheimer’s Disease via Decreasing Beta-Amyloid Production and Tau Hyperphosphorylation
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3817172/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: DZ. Выполнены эксперименты: NL XQB TW XCK WJT HS. Проанализированы данные: XQB. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: XQB NL. Написал документ: XQB DZ.

Болезнь Альцгеймера (AD) является наиболее распространенной причиной деменции во всем мире и в основном характеризуется агрегированным β-амилоидом (Aβ) и гиперфосфорилированным тау. FLZ является новым синтетическим производным натурального кальмозамида и доказано, что он улучшает дефицит памяти в моделях слабоумия. В этом исследовании мы стремились исследовать механизмы нейропротекторного эффекта ФЛЗ у двойных трансгенных мышей APP / PS1 и клеток SH-SY5Y (APPwt / swe). Результаты показали, что лечение FLZ значительно улучшает дефицит памяти трансгенных мышей APP / PS1 и уменьшает апоптоз клеток SH-SY5Y (APPwt / swe). FLZ заметно ослабляет накопление Aβ и фосфорилирование тау как in vivo, так и in vitro. Механическое исследование показало, что FLZ интерферировал обработку APP, то есть FLZ уменьшало фосфорилирование белка-предшественника β-амилоида (APP), продуцирование APP-карбокси-концевого фрагмента (APP-CTF) и экспрессию фермента 1-го белка белка-предшественника β-амилоида. Эти результаты показали, что FLZ снижает продукцию Aβ за счет ингибирования амилоидогенного пути. Механическое исследование ингибирующего влияния ФЛЗ на фосфорилирование тау выявило участие пути Akt / glycogen synthase kinase 3β (GSK3β). FLZ повышала активность Akt и ингибировала активность GSK3β как in vivo, так и in vitro. Ингибирующее действие FLZ на активность GSK3β и tau-фосфорилирование было подавлено ингибированием активности Akt, что указывает на то, что путь Akt / GSK3β может быть возможным механизмом, участвующим в ингибирующем эффекте FLZ на гиперфосфорилирование тау. Эти результаты предполагают, что FLZ может быть потенциальным анти-AD-препаратом, поскольку он не только уменьшает продукцию Aβ посредством ингибирования амилоидогенного пути обработки APP, но также ослабляет тау-гиперфосфолирование, опосредованное Akt / GSK3β.

Болезнь Альцгеймера (AD) является наиболее распространенной причиной деменции во всем мире. Отличительными признаками AD в основном являются старческие бляшки (SP) и нейрофибриллярные клубочки (NFT), которые состоят из агрегированного β-амилоидного белка (Aβ) и гиперфосфорилированного тау-белка (p-tau). Aβ-пептиды образуются путем последовательного протеолиза белка-предшественника β-амилоида (APP), большого трансмембранного гликопротеина, который первоначально расщепляется ферментом расщепления белка-предшественника β-амилоида 1 (BACE1), а затем γ-секретазой в трансмембранном домене [ 1]. Агрегированный Aβ играет ключевую роль в патогенезе AD [2]. После проникновения нейронной мембраны Aβ агрегатирует и разрушает клеточную мембрану [3], что приводит к потере нейронов и дефициту памяти [4], [5]. Кроме того, Aβ изменяет клеточный метаболизм и вызывает нисходящее затем гиперфосфорилирование / образование клубок, которое играет важную роль в начале когнитивного спада и тау-патологии. Сообщается, что гиперберфосфорилированный тауберберган, который теряет способность связывать и стабилизировать микротрубочки, приводит к дестабилизации цитоскелета и нарушению переноса аксонов [6].

Текущие препараты для лечения АД, такие как ингибитор ацетилхолинэстеразы и антагонист NMDA, демонстрируют ограниченную пользу большинству пациентов с АД [7]. Поэтому существует настоятельная необходимость в новых терапевтических стратегиях, которые могут остановить процесс болезни и подходят для долгосрочного клинического лечения. Появилась новая точка зрения о том, что лечение AD может быть более эффективным для конкретных целей, таких как олигомерное гиперфосфорилирование Aβ и тау [7]. Поэтому изучение соединений, которые предотвращают накопление Aβ или гиперфосфорилирование тау, было основным направлением развития лекарственного средства в последние годы. Ранее сообщалось, что FLZ (рис.1), новый синтетический циклический аналог натурального кальмозамида из листьев Anona squamosa, оказывает нейропротекторное действие на модели in vivo и in vitro AD. FLZ улучшил дефицит памяти у мышей с естественным старением [8], мышей с деменцией, индуцированных Aβ25-35 (Fang & Liu, 2006) и D-галактозы плюс NaNO2
[9]. FLZ также заметно предотвратил апоптоз нейронов, вызванный Aβ25 ~ 35
[10]. Фармакокинетическое исследование показало, что FLZ может пересечь гематоэнцефалический барьер и достичь коры и гиппокампа [11]. Эти предыдущие исследования предполагали, что FLZ обладает потенциальным терапевтическим эффектом для AD-ассоциированных патологий. Однако механизм недостижения терапевтического эффекта FLZ на моделях AD еще не установлен.

Настоящее исследование было разработано для исследования положительных эффектов FLZ на изучение и дефицит памяти мышей модели AD и возможных механизмов. В соответствии с предыдущими исследованиями [12], [13], трансгенные мыши APP / PS1 продемонстрировали ухудшение памяти, перепроизводство Aβ и гиперфосфорилирование тау. Используя трансгенные мыши APP / PS1 и клетки SH-SY5Y (APP wt / swe), мы обнаружили, что FLZ значительно улучшает способность к обучению и памяти мышей, снижение продукции Aβ и фосфорилирование тау. Механическое исследование показало, что FLZ ослабляет продукцию Aβ путем ингибирования фосфорилирования APP и экспрессии BACE1, ингибирует гиперфосфорилирование тау путем регулирования пути Akt / glycogen synthase kinase 3β (GSK3β).

FLZ, белый порошок с чистотой 99%, был синтезирован Отделом фармацевтической химии, Институтом Materia Medica, Китайской медицинской академии. Его суспендировали в 0,5% (мас. / Об.) Карбоксиметилцеллюлозе натрия (CMC-Na) для перорального введения и растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) для использования in vitro. Dulbecco, модифицированная среда Eagle, питательная смесь F-12 (DMEM / F-12), эмбриональная бычья сыворотка и G418 были приобретены у Гибико (Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк, США). β-амилоидный набор ELISA был продуктом Invitrogen. Фосфорилированные тау на Ser396, Ser404 и Thr231, фосфорилированные Akt, Akt и инсулин-деградирующие ферменты (IDE) были приобретены у Signalway. Фосфорилированное тау на антитело Ser202 / Thr205 (клон AT8) было приобретено у Pierce Biotechnology. APP, AP-C-концевой фрагмент (APP-CTF) и Aβ (клон 6E10) были получены от Abcam. BACE1 антитело получали из Millipore. Фосфорилированное антитело APP (Thr668) и Ly294002 было приобретено у Cell Signaling. Фосфорилированные GSK3β, GSK3β антитела были получены от Santa Cruz Biotechnology. Комплект для анализа Caspase-3 был приобретен у Sigma.

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованием в Медицинском колледже Пекинского союза и выполнены в соответствии с руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Все усилия были направлены на минимизацию страданий животных.

Мужские мыши B6C3, экспрессирующие шведский мутант AβPP695 и мутант удаления экзона-9 PS1 (APPswe / PS1Δ9), были предоставлены Центром животных Китайской академии медицинских наук. Мышей выдерживали в 12-часовом световом / темном цикле при 24 ° С при относительной влажности 60% -ной комнаты и получали пищу и воду ad libitum. FLZ 150 мг / кг вводили перорально двойным трансгенным мышам APP / PS1, а мыши WT получали перорально 0,5% CMC-Na в возрасте 5 месяцев в течение продолжавшихся 20 недель.

SH-SY5Y, стабильно выраженные APP дикого типа и шведские мутантные APP (APPwt / swe), были подарками профессора Бао-Лу Чжао из Института биофизики Китайской академии наук. В качестве отрицательного контроля использовали клетки SH-SY5Y, трансфицированные пустым вектором pcDNA3.1neo. Клетки поддерживали в среде DMEM / F-12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 200 мкг / мл G418 при 37 ° С в увлажненном 5% CO2 / 95% воздухе инкубатор. Когда слияние достигало 80%, клетки переключились на «стимулирующую среду», содержащую 50% DMEM, 50% Opti-MEM, 0,5% FBS, 200 мкг / мл G418 и 10 мМ натриевую соль натрийной кислоты в течение 12 ч, чтобы вызвать трансгенной экспрессии. FLZ (0,1, 1 и 10 мкМ), Ly294002 10 мкМ в сочетании с FLZ 10 мкМ или отдельно, инкубировали с клетками в течение 24 ч, а затем клетки собирали для проверки соответствующих биомаркеров.

Пространственное обучение и память мышей оценивали в водном лабиринте Морриса (Институт Матери Медики, Китайская академия медицинских наук и Медицинский колледж Пекинского союза, Пекин, Китай) после того, как мыши получили ФЛЗ в течение 20 недель (n = 10 в каждой группе ). Водный лабиринт Морриса состоял из круглого бассейна (120 см в диаметре и 40 см в глубину), заполненного нетоксичной непрозрачной водой с скрытой под водой водой (2 см) платформой для побега (диаметром 10 см). Температура воды поддерживалась на уровне 23 ± 1 ° C. В начале каждого испытания мышь была помещена в воду, обращенную к стене бассейна в одном из четырех квадрантов. Хотя отправная точка была выбрана случайным образом, протокол был установлен в начале каждого испытания и поддерживался на всех четырех испытаниях на приобретение. Каждой мыши было разрешено 120 секунд, чтобы найти и установить платформу. Когда мышь нашла платформу, ее держали на платформе в течение 30 с. Если мышь не смогла найти платформу в течение 120 секунд, она была помещена на платформу, где она оставалась на 30 секунд. Каждой мыши давали 4 испытания в день с интервалом 1 час. Время, необходимое для поиска платформы (латентность ожидания), пройденного расстояния и скорости плавания животных, было записано с помощью программного обеспечения для отслеживания видео. Мышей затем высушивали полотенцем и помещали в клетку с нагревательной подушкой под ней до высыхания и возвращали в свою домашнюю клетку. Учебная сессия проводилась в течение 5 дней подряд, когда платформа никогда не перемещалась. Задержка для выхода была рассчитана как среднее время, чтобы найти платформу из 4 испытаний в течение одного дня.

Удержание памяти оценивалось на 6-й день с пробной пробной версией, в которой платформа была удалена. Мышей помещали в бассейн и позволяли свободно плавать в бассейне в течение 120 с. было записано количество пересечений платформы и время, проведенное в целевом квадранте.

Пять мышей из каждой группы анестезировали пентобарбиталом и перфузировали транскрипционно с помощью физиологического раствора, а затем с холодным 4% параформальдегидом в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4. Затем мозги удаляли и фиксировали в течение 4 ч в одном фиксаторе. Фиксированные мозги промывали и подвергали криозащите в том же буфере, содержащем 20% сахарозы, и, наконец, разделяли на секции размером 40 мкм на замораживающем микротоме. Каждый шестой серийный раздел был выбран и обработан для иммунодефицита TH. Корональные срезы через гиппокамп обрабатывали для иммуногистохимии Aβ. Вкратце, после инкубации в течение 1 часа в 10% нормальной сыворотке свиней с 0,25% TritonX100 в 0,02 М забуференном калия фосфатом физиологическом растворе, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (KPBS-BSA), срезы инкубировали с первичным антителом (мышиная моноклональная антисыворотка до Aβ, 1:500 в KPBS-BSA, содержащей 2% нормальной сыворотки свиней и 0,25% Triton X100), а затем инкубировали сначала с соответствующим биотинилированным вторичным антителом, а затем в течение 90 мин с авидин-пероксидазой. Наконец, этикетирование визуализировали с помощью 0,04% пероксидазы водорода и 0,05% 3,3′-диаминобензидина (DAB). Секции наблюдались с помощью световой микроскопии (NIKON E600, Япония), а интенсивность окрашенной области в каждой группе была проанализирована системой Image-Pro plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Все оценки были сделаны исследователем, слепым к экспериментальному проекту.

Супернатанты клеток собирали, центрифугировали и 10 × концентрировали в присутствии коктейля ингибиторов протеазы (2,5 мМ ЭДТА, 10 мкМ лейпептина, 1 мкМ пептастина, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида), используя Centricon (Amicon) с нормой среза 3 кДа , Для измерения внутриклеточного Аβ приблизительно 107 клеток очищали в ледяной PBS. Клеточные гранулы солюбилизировали в 300 мл 70% муравьиной кислоты. Растворимые муравьиной кислотой клеточные гранулы очищали центрифугированием при 16000 г в течение 5 мин при 4 ° С и супернатанты центрифугировали при 21000 г в течение 20 мин при 4 ° С. Супернатанты высушивали в вакууме и полученный осадок ресуспендировали в 1 мл щелочно-карбонатного буфера (2% Na2CO3, 0,1 н. NaOH) и центрифугировали при 16000 g в течение 3 мин при 4 ° C. Аβ-продуцирование измеряли с помощью анализа ELISA на основе сэндвича на основе флуоресцентной флуоресценции с использованием набора (Human-Amyloid 1-40 Colorimetric Immunoassay Kit) в соответствии с инструкциями производителя.

Мышиный гиппокамп (четыре мыши из каждой группы) и клетки лизировали в неденатурирующем лизисном буфере. Затем лизы центрифугировали при 12000 г в течение 15 мин при 4 ° С, супернатанты смешивали с загрузочным буфером и кипятили в течение 5 мин. Концентрацию белка измеряли с помощью анализа белка Брэдфорда. Образцы, содержащие 30 мкг белка на полосу, разделяли 10% -ным электрофорезом на додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и переносили в мембраны PVDF (для анализа Aβ использовали 16% трис-трициновый гель). Мембраны блокировали в 5% обезжиренного молока TBST (20 мМ Tris-HCL, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 0,1% Твин 20) в течение 1 часа, затем в одно молоко добавляли соответствующие первичные антитела и инкубировали в течение ночи при 4 ° C, а затем инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, в TBST в течение 2 ч при комнатной температуре. Блот был разработан с использованием хемилюминесцентной системы LAS3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan), а плотность полос определялась с использованием программного обеспечения Gel-Pro Analyzer 4.0.

Скорость апоптоза клеток анализировали с помощью проточной цитометрии в соответствии с инструкцией по изготовлению. Вкратце, клетки собирали и дважды промывали PBS, затем ресуспендировали в 500 мкл связывающего буфера, а затем инкубировали с 5 мкл аппендином V и 5 мкл пропидиум-иодидом (PI) в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Затем 1 × 104 клетки измеряли проточным цитометром с использованием программного обеспечения Cell Quest.

Активность Caspase-3 определяли в соответствии с протоколом изготовителя. Короче говоря, клеточные лизаты были приготовлены буфером для лизиса. Активность каспазы-3 определяли путем мониторинга протеолиза колориметрических субстратов. Ac-DEVD-p-нитроанилин использовали в качестве колориметрического субстрата, связанного с p-нитроанилином. Целебный лизат добавляли в буфер, содержащий 200 мкМ субстрата. После 1,5 ч инкубации расщепление пептида каспазой определяли количественно спектрофотометрически при 405 нм в 96-луночном планшете. Единицу оптической плотности превращали в нмоль п-нитроанилина с использованием стандартной кривой, полученной с помощью свободного п-нитроанилина.

Данные были выражены как средства ± SD. MANOVA использовался для повторного измерения данных задержки при спуске с использованием общей линейной модели (GLM) в SPSS 13.0. Другие данные анализировали односторонним ANOVA с последующим постневым тестом Dunnett. P <0,05 считалось статистически значимым.

Обработка FLZ начиналась, когда двум трансгенным мышам APP / PS1 было 5 месяцев, и они проявляли дефицит памяти (рис. S1 в файле S1). После того, как FLZ ежедневно вводили в течение 20 недель, мышей подвергали тестированию на водный лабиринт Морриса. Как показано на фиг.2, мыши APP / PS1 показали значительно более длительные задержки лапароскопии, чем мыши с широким типом (Р <0,01), что подтвердило нарушение пространственного обучения у мышей APP / PS1. Обработка FLZ значительно снизила латентность побега на 3-м, 4-м и 5-м днях теста (P <0,05) (рис. 2). В тесте зонда количество мышей APP / PS1, пересекающих платформу, и время, проведенное в целевом квадранте, заметно уменьшилось по сравнению с мышами WT, а расстояния на пути были намного длиннее, чем у мышей WT. Обработка FLZ значительно увеличила количество пересечений платформы (увеличение в 1,16 раза, P <0,01) и время, проведенное в целевом квадранте (1,8-кратное увеличение, P <0,01), а расстояние перемещения уменьшилось с помощью FLZ-обработки (62,18% уменьшение, P <0,01). Не было различий в скорости плавания среди трех групп мышей. Кроме того, массы тела мышей во всех группах были на одном уровне во время теста (рис. S2 в файле S1). Эти данные указывают на то, что FLZ оказывает благотворное влияние на образование и повреждение памяти трансгенных мышей APP / PS1.

Двукратным трансгенным мышам APP / PS1 перорально обрабатывали FLZ 150 мг / кг в течение 20 недель, а способность к обучению и памяти была доступна при испытании лабиринта проточной воды. (A) Задержки мышей, чтобы найти пункт назначения. (B) Количество пересечений платформы. (C) Время в целевом квадранте. (D) Расстояние перемещения. Результаты были выражены как среднее ± SD. * P <0,05, ** P <0,01 vs, мыши WT, #P <0,05 по сравнению с трансгенными мышами APP / PS1. n = 10 в каждой группе.

Нейропротекторные эффекты FLZ наблюдались также в клетках SH-SY5Y (APPwt / swe). Как показано на фиг.3, FLZ заметно повышает жизнеспособность клеток (FLZ 1 мкМ: увеличение на 14,25%, P <0,05, FLZ 10 мкМ: увеличение на 26,71%, P <0,01) клеток SH-SY5Y (APPwt / swe). Апоптоз анализировали с помощью проточной цитометрии с окрашиванием Приекном-V / PI для определения процента раннего апоптоза (AnnexinV + / PI-) и позднего апоптоза (AnnexinV + / PI +). Результаты показали, что FLZ уменьшает как ранний, так и поздний апоптоз клеток дозозависимым образом (FLZ 1 мкМ: 22,66%, Р <0,05, FLZ 10 мкМ: 50,81%, Р <0,01). Результаты проточной цитометрии были подтверждены измерением активности каспазы-3, которая показала, что FLZ заметно снижает активность каспазы-3 (FLZ 1 мкМ: уменьшение на 22,62%, P <0,05, FLZ 10 мкМ: 52,18%, P <0,01 ) клеток SH-SY5Y (APPwt / swe), что указывает на то, что FLZ защищенные нейроны от апоптоза стимулируются Aβ (фиг.3).

SH-SY5Y (APPwt / swe) клетки выращивали в «стимулирующей среде», содержащей 50% DMEM, 50% Opti-MEM, 0,5% FBS, 200 мкг / мл G418 и 10 мМ натриевой соли масляной кислоты в течение 12 ч для индукции трансгена выражение. FLZ (0,1, 1 и 10 мкМ) инкубировали с клетками в течение 24 часов. (A) Жизнеспособность клеток SH-SY5Y (APPwt / swe). (B) Апоптоз клеток SH-SY5Y (APPwt / swe), измеренных с помощью проточной цитометрии с окрашиванием Appin-V / PI. Гистограмма представляет собой статистическую сумму суммы раннего и позднего клеточного апоптоза. (C) Caspase-3 активности клеток SH-SY5Y (APPwt / swe). Результаты были выражены как среднее ± SD из 6 независимых экспериментов. ** P <0,01 по сравнению с клетками Neo SH-SY5Y, #P <0,05, ## P <0,01 против клеток SH-SY5Y (APPwt / swe), обработанных растворителем.

Был испытан эффект системного введения FLZ на продуцирование Aβ у двух трансгенных мышей APP / PS1. В соответствии с предыдущими исследованиями [12], [13] иммуногистохимический анализ показал, что в гиппокампе мышей APP / PS1 были большие площади отложений Aβ. FLZ значительно уменьшило площади отложений Aβ в гиппокампе (снижение на 62,17%, P <0,01) (фиг.4A). Мы также обнаружили, что FLZ уменьшает Aβ-отложения в коре мышей APP / PS1 (рис. S3 в файле S1). Аналогичные данные были получены в Вестерн-блот-анализе, который показал увеличение количества Aβ в гиппокампе мышей APP / PS1 и терапевтический эффект FLZ (снижение на 71,62%, P <0,01) (фиг.4B).

Двукратные трансгенные мыши APP / PS1 перорально обрабатывали FLZ 150 мг / кг в течение 20 недель. SH-SY5Y (APPwt / swe) клетки выращивали в «стимулирующей среде», содержащей 50% DMEM, 50% Opti-MEM, 0,5% FBS, 200 мкг / мл G418 и 10 мМ натриевой соли масляной кислоты в течение 12 ч для индукции трансгена выражение. FLZ (0,1, 1 и 10 мкМ) инкубировали с клетками в течение 24 часов. (A) Иммуногистохимия отложений Aβ в гиппокампе. Показаны репрезентативные участки гиппокампа из 5 мышей. Шкала шкалы: 500 мкм. (B) Вестерн-блот-анализ экспрессии Aβ в гиппокампе. Показан репрезентативный иммуноблот из 4 мышей. Результаты были выражены как среднее ± SD. ** P <0,01 против мышей WT; #P <0,05, ## P <0,01 против мышей APP / PS1. (C) Вестерн-блот-анализ и (D) ELISA-анализ Aβ1-40 в клетках SH-SY5Y (APPwt / swe). Результаты были получены из 4-6 независимых экспериментов. Результаты были выражены как среднее ± SD. ** P <0,01 по сравнению с клетками Neo SH-SY5Y, #P <0,05, ## P <0,01 против клеток SH-SY5Y (APPwt / swe), обработанных растворителем.

Вышеуказанные данные in vivo были подтверждены в следующем эксперименте in vitro, в котором использовались клетки SH-SY5Y (APPwt / swe). Эта клеточная линия стабильно экспрессирует шведскую мутантную форму человеческого APP и перепроизводит Aβ. Вестерн-блот-анализ и анализ ELISA применяли для измерения внутриклеточного и внеклеточного уровней Aβ соответственно. Результаты показали, что как внутриклеточный, так и внеклеточный уровни Aβ значительно увеличиваются в клетках SH-SY5Y (APPwt / swe). FLZ 10 мкМ значительно уменьшало внутриклеточное продуцирование Aβ (снижение на 73,33%, P <0,05), FLZ 1 мкМ и 10 мкМ заметно уменьшали уровни внеклеточного Aβ (FLZ 1 мкМ: 44,56% снижение, Р <0,05, FLZ 10 мкМ: 63,93% уменьшение , P <0,01) (фиг.4С, D). Вышеприведенные данные указывают на то, что FLZ потенциально ингибирует продукцию Aβ.

Aβ является протеолитическим продуктом APP, а фосфорилирование в Thr668 APP облегчает его обработку в направлении Aβ. Таким образом, мы измерили уровни общего APP и фосфо-APP (Thr668) в гиппокампе мышей APP / PS1 и SH-SY5Y (APPwt / swe). Результаты показали, что уровни APP и фосфо-APP (Thr668) заметно увеличиваются в гиппокампе мышей APP / PS1 и SH-SY5Y (APPwt / swe). FLZ не влияло на уровень общего APP, но значительно уменьшало фосфорилирование APP на Thr668 как in vivo (снижение 44,44%, P <0,05), так и in vitro (FLZ 1 мкМ: 52,94% снижение, P <0,05, FLZ 10 мкМ: 73,53%, P <0,01) (рис.5), что указывает на интерференцию FLZ при обработке APP.

Двукратные трансгенные мыши APP / PS1 перорально обрабатывали FLZ 150 мг / кг в течение 20 недель. SH-SY5Y (APPwt / swe) клетки выращивали в «стимулирующей среде», содержащей 50% DMEM, 50% Opti-MEM, 0,5% FBS, 200 мкг / мл G418 и 10 мМ натриевой соли масляной кислоты в течение 12 ч для индукции трансгена выражение. FLZ (0,1, 1 и 10 мкМ) инкубировали с клетками в течение 24 часов. Антитела против p-APP, APP-CTF и APP подвергали Вестерн-блоттингу. Показан репрезентативный иммуноблот из 4 мышей. Результаты были выражены как среднее ± SD. (А) Вестерн-блот-анализ APP, фосфо-APP и APP-CTF в гиппокампе мышей APP / PS1. * P <0,05, ** P <0,01 против мышей WT; #P <0,05 против мышей APP / PS1. (B) Вестерн-блот-анализ APP, фосфо-APP и APP-CTF в клетках SH-SY5Y (APPwt / swe). ** P <0,01 по сравнению с клетками Neo SH-SY5Y, #P <0,05, ## P <0,01 против клеток SH-SY5Y (APPwt / swe), обработанных растворителем.

Фосфо-APP расщепляется BACE1 и продуцирует связанный с мембраной C-концевой фрагмент (CTF). Затем APP-CTF расщепляют γ-секретазой в трансмембранной области, которая генерирует небольшие секретируемые пептиды, включая патогенный Aβ. Таким образом, повышенный уровень APP-CTF приведет к увеличению производства Aβ. Чтобы проверить, ингибирует ли FLZ продукцию APP-CTF, мышиный гиппокамп APP / PS1 подвергают Вестерн-блот-анализу. Как показано на фиг.5А, значительное снижение экспрессии APP-CTF наблюдалось у обработанных FLZ мышей APP / PS1 (снижение на 61,97%, P <0,01). Экспрессия APP-CTF также снижалась при помощи FLZ в клетках SH-SY5Y (APPwt / swe) (FLZ 1 мкМ: уменьшение на 40,48%, P <0,05, FLZ 10 мкМ: уменьшение на 69,05%, Р <0,01) (фиг.5В) , Вышеуказанные результаты показали, что ингибирующее действие FLZ на продукцию Aβ может быть связано с ослаблением фосфорилирования APP и продуцированием APP-CTF.

Мы также изучили влияние FLZ на ферменты, которые способствуют выработке Aβ. BACE1 является ключевым ферментом, который отвечает за обработку APP и производство Aβ. В настоящем исследовании было отмечено, что обработка FLZ заметно уменьшала экспрессию BACE1 в гиппокампе мыши APP / PS1 (снижение 53,33%, P <0,01) и SH-SY5Y (APPwt / swe) клетки (FLZ 1 мкМ: 49,62% снижение , P <0,05, FLZ 10 мкМ: 56,39%, Р <0,05) (фиг.6).

Двукратные трансгенные мыши APP / PS1 перорально обрабатывали FLZ 150 мг / кг в течение 20 недель. SH-SY5Y (APPwt / swe) клетки выращивали в «стимулирующей среде», содержащей 50% DMEM, 50% Opti-MEM, 0,5% FBS, 200 мкг / мл G418 и 10 мМ натриевой соли масляной кислоты в течение 12 ч для индукции трансгена выражение. FLZ (0,1, 1 и 10 мкМ) инкубировали с клетками в течение 24 часов. (А) Вестерн-блот-анализ BACE1 и IDE в гиппокампе мышей APP / PS1, обработанных FLZ. Показан репрезентативный иммуноблот из 4 мышей. Результаты выражаются как среднее ± SD. * P <0,05 против мышей WT; #P <0,05 против мышей APP / PS1. (B) Вестерн-блот-анализ BACE1 и IDE в клетках SH-SY5Y (APPwt / swe), обработанных FLZ. Показан репрезентативный иммуноблот из четырех независимых экспериментов. Результаты были выражены как среднее ± SD. ** P <0,01 по сравнению с клетками Neo SH-SY5Y, #P <0,05, ## P <0,01 против клеток SH-SY5Y (APPwt / swe), обработанных растворителем.

Внеклеточная деградация Aβ проводится главным образом главным образом ферментом, разрушающим инсулин (IDE). Затем мы протестировали эффект FLZ на выражение IDE. Настоящие результаты показали, что FLZ не влияет на выражение IDE. Эти данные свидетельствуют о том, что FLZ снижает уровень Aβ за счет ингибирования продуцирования Aβ, не влияя на его деградацию (фиг.6).

Помимо отложения Aβ аномально фосфорилированный тау является еще одним крупным невропатологическим характером AD. В этом исследовании влияние FLZ на гиперфосфорилирование тау оценивали с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием антител против различных сайтов фосфорилирования тау, включая Ser396, Thr231, Ser202 / Thr205 и Ser404. Результаты показали, что ФЛЗ значительно уменьшал тау-фосфорилирование при этих фосфорилирующих эпитопах в гиппокампе APP / PS1 (снижение Ser396:52.70%, P <0,05, снижение Ser202 / Thr205:60.00%, P <0,05, Thr231:51.43% снижение, P < 0,0, Ser404:43.81%, P <0,05) и SH-SY5Y (APPwt / swe) клетки (Ser396: FLZ 1 мкМ: 35,44% снижение, FLZ 10 мкМ: 46,83% снижение, P <0,05, Ser202 / Thr205: FLZ 1 мкМ: уменьшение на 48,15%, Р <0,05, FLZ 10 мкМ: уменьшение на 51,76%, P <0,01, Thr231: FLZ 10 мкМ: уменьшение на 37,10%, P <0,05, Ser404: FLZ 10 мкМ: 48,84%, P <0,01 ) (Фиг.7). Затухание tau-фосфорилирования, индуцированное FLZ, подразумевает еще один потенциальный защитный эффект FLZ на патологию AD.

Двукратные трансгенные мыши APP / PS1 перорально обрабатывали FLZ 150 мг / кг в течение 20 недель. SH-SY5Y (APPwt / swe) клетки выращивали в «стимулирующей среде», содержащей 50% DMEM, 50% Opti-MEM, 0,5% FBS, 200 мкг / мл G418 и 10 мМ натриевой соли масляной кислоты в течение 12 ч для индукции трансгена выражение. FLZ (0,1, 1 и 10 мкМ) инкубировали с клетками в течение 24 часов. Антитела против p-tau (Ser396), p-tau (Ser202 / Thr205), p-tau (Thr231) и p-tau (Ser404) подвергали Вестерн-блоттингу. Показан репрезентативный иммуноблот из 4 мышей. Результаты были выражены как среднее ± SD. (А) Вестерн-блот приводит к гиппокампу мышей APP / PS1. * P <0,05, ** P <0,01 против мышей WT; #P <0,05, ## P <0,01 против мышей APP / PS1. (B) Вестерн-блот-результат клеток SH-SY5Y (APPwt / swe). ** P <0,01 по сравнению с клетками Neo SH-SY5Y, #P <0,05, ## P <0,01 против клеток SH-SY5Y (APPwt / swe), обработанных растворителем.

Сообщается, что GSK3β фосфорилирует тау-протеин на нескольких участках in vitro и in vivo
[14]. Akt является одним из критических регуляторов GSK3β, а фосфорилирование Akt на остатке Ser9 GSK3β приводит к снижению ферментативной активности GSK3β [15], а затем в конечном итоге влияет на фосфорилирование тау. Изучение механизма лежит в основе тормозного эффекта ФЛЗ на фосфорилирование тау, затем исследовали влияние FLZ на сигнальный путь Akt / GSK3β. Результаты показали, что обработка FLZ значительно увеличила фосфорилирование Akt на Ser473, что свидетельствует о его активации (мышь: P <0,01, ячейка: FLZ 10 мкМ: P <0,01). Активация АКТ, вызванная FLZ-обработкой, сопровождалась деактивацией GSK3β, выявленной увеличением фосфорилирования GSK3β у Ser9 у мышей APP / PS1 (P <0,01) и SH-SY5Y (APPswe / wt) клеток (FLZ 1 мкМ : P <0,05, FLZ 10 мкМ: P <0,01) (фиг.8А, В). Мы также обнаружили, что с использованием Ly294002, ингибитора пути фосфоинозитид-3-киназ (PI3K) / Akt, было значительно снижено фосфорилирование GSK3β на Ser9 (P <0,01), так же как и понижающий регуляторный эффект FLZ на тау-фосфорилирование (Ser396 : P <0,05; Ser / Thr202 / 205: P <0,01; Thr231: P <0,05, Ser404: P <0,05) (фиг.8C, D). Эти результаты свидетельствуют о том, что FLZ может ослабить tau-фосфорилирование посредством регулирования сигнального пути Akt / GSK3β. Помимо AKT, существует множество других ферментов, которые, как сообщается, регулируют GSK3β. Изучение влияния ФЛЗ на другие вовлеченные ферменты все еще продолжается.

Двукратные трансгенные мыши APP / PS1 перорально обрабатывали FLZ 150 мг / кг в течение 20 недель. SH-SY5Y (APPwt / swe) клетки выращивали в «стимулирующей среде», содержащей 50% DMEM, 50% Opti-MEM, 0,5% FBS, 200 мкг / мл G418 и 10 мМ натриевой соли масляной кислоты в течение 12 ч для индукции трансгена выражение. FLZ (0,1, 1 и 10 мкМ), Ly294002 10 мкМ в сочетании с FLZ 10 мкМ или отдельно, инкубировали с клетками в течение 24 часов. (А) Вестерн-блот-анализ p-Akt (Ser473), Akt, GSK3β и p-GSK3β (Ser9) в гиппокампе мышей APP / PS1. Показан репрезентативный иммуноблот из 4 мышей. Результаты были выражены как среднее ± SD. * P <0,05 против мышей WT; #P <0,05, ## P <0,01 против мышей APP / PS1. (B) Вестерн-блот-анализ p-Akt (Ser473), Akt, GSK3β и p-GSK3β (Ser9) в клетках SH-SY5Y (APPwt / swe). Показан репрезентативный иммуноблот из четырех независимых экспериментов. Результаты были выражены как среднее ± SD. ** P <0,01 по сравнению с клетками Neo SH-SY5Y, #P <0,05, ## P <0,01 против клеток SH-SY5Y (APPwt / swe), обработанных растворителем. (C, D) Ly294002 добавляли для проверки влияния Akt на активность GSK3β и фосфорилирования тау в клетках SH-SY5Y (APPwt / swe), обработанных FLZ. Показан репрезентативный результат трех независимых экспериментов. Результаты были выражены как среднее ± SD. ** P <0,01 по сравнению с клетками Neo SH-SY5Y, #P <0,05, ## P <0,01 против клеток SH-SY5Y (APPwt / swe), обработанных растворителем; ΔP <0,05, ΔΔP <0,01 по сравнению с FLZ-обработанными клетками SH-SY5Y (APPwt / swe).

Наш сегодняшний вывод показал, что обработка FLZ значительно улучшает дефицит памяти трансгенных мышей APP / PS1 и уменьшает апоптоз клеток SH-SY5Y (APPwt / swe). Благотворное влияние FLZ может быть связано с его ингибированием продуцирования Aβ, обусловленным уменьшением обработки APP, а также затуханием гиперфосфорилирования тау путем регулирования сигнального пути Akt / GSK3β. Чтобы найти время, когда трансгенные мыши начинают проявлять поведенческий ущерб, мы обнаружили дефицит памяти с помощью теста на водную лабиринт Морриса в начале (0 недель), 5 недель, 10 недель, 15 недель и 20 недель во время лечения FLZ. Результаты показали, что FLZ начал оказывать благотворное влияние на дефицит памяти мышей APP / PS1 с 15-й недели (данные не показаны). После нескольких испытаний мы предполагаем, что мыши построили память о лабиринте воды, и это возможная причина того, что латентность выживания мышей группы WT была так явно отличной от таковой у трансгенных мышей в первый день тренировки в лабиринте воды и при 20-й неделе лечения FLZ, которые показаны на рисунке 2.

«Амилоидная каскадная гипотеза» предполагает, что увеличение производства амилоидогенного Aβ-пептида является основной причиной нейрональной и синаптической потери в AD [16]. Было доказано, что препараты, нацеленные на производство Aβ, оказывают благотворное влияние на нейронную систему. Хотя активная иммунотерапия Aβ была остановлена, потому что у некоторых пациентов развилось воспаление головного мозга, недавние альтернативные подходы исследуются как пассивная иммунотерапия на основе более коротких Aβ-иммуногенов, которые нацелены на N-конец, не влияя на середину и C-конец Aβ [17]. Пассивная иммунотерапия и продвинутое антитело, нацеленное на Аβ, показало потенциальную терапевтическую ценность для пациентов с АД в клинических испытаниях [18]. Кроме иммунотерапии, также сообщалось, что некоторые химические синтетические соединения уменьшают осаждение Aβ и изменяют прогрессию AD [19]. FLZ — новый кандидат на лечение AD, разработанный нашим институтом. Предыдущие исследования подтвердили, что FLZ улучшает способность к обучению и памяти мышей модели AD [8], [9], [20]. Заявка на использование FLZ в клинических испытаниях сейчас оценивается FDA Китая. Чтобы лучше понять механизм нейропротекторного эффекта FLZ, мы применили FLZ на трансгенных мышах APP / PS1 и трансгенных клетках APP в настоящем исследовании. Администрация FLZ продолжалась в течение 20 недель и не вызывала никаких изменений веса и поведения тела мыши. В нашем доклиническом анализе токсичности последовательное введение FLZ крысам в течение 30 дней не проявляло никакой токсичности. Наши данные показали, что FLZ снижает активность Aβ как in vitro, так и in vivo. APP обрабатывается, по меньшей мере, двумя различными протеолитическими путями, амилоидогенным и неамилоидогенным способом обработки APP. Амилоидогенный путь включает расщепление BACE1, связанной с мембраной аспартил-протеазой, которая генерирует N-конец пептида Aβ. Было показано, что фосфорилирование APP на Thr668 облегчает расщепление BACE1 и увеличивает продукцию Aβ [21]. Таким образом, BACE1 представляет собой ключевой целевой белок в разработке новых потенциальных лекарств для лечения АД. CTS-21166 является первым ингибитором BACE1, испытанным в клинических испытаниях, который показывает снижение дозы в Aβ40
[22]. В настоящем исследовании было показано, что FLZ заметно уменьшает фосфорилирование APP при экспрессии Thr668 и BACE1 in vitro и in vivo, и это может быть одним из механизмов, которые приводят к ослаблению продуцирования Aβ с помощью FLZ. Неамилоидогенный путь включает α-секретазу, которая расщепляет APP для получения растворимого фрагмента APP (sAPP), который предотвращает образование и накопление Aβ. Предыдущие данные из нашей лаборатории показали, что FLZ снижает продукцию Aβ, стимулируя производство нонамилоидоза SAPP, которое опосредовано увеличением способности α-секретазы [23]. Объединив эти результаты, мы предположили, что FLZ снижает производство Aβ путем регулирования обработки APP, то есть FLZ способствует неамилоидогенному пути путем увеличения активности α-секретазы и ингибирует амилоидогенный путь, уменьшая активность BACE1. Другим подходом к уменьшению осаждения Aβ является повышение его деградации. FLZ не влияет на деградацию Aβ, поскольку мы обнаружили, что FLZ не влияет на IDE, основная эндопептидаза включает ферментативную деградацию Aβ. Вышеприведенные результаты показали, что регулирование продукции Aβ может быть одним из механизмов FLZ для лечения AD.

Тау-олигомер используется в качестве потенциальной мишени для иммунотерапии AD и других тауопатий [24]. Соединения, которые ингибируют гиперфосфорилирование тау, показали положительное влияние на когнитивную функцию в клинических испытаниях, таких как AL108 [25]. Исследования показали, что развитие амилоидных отложений и развитие нейрофибриллярных клубок могут быть связаны [26]. Отношение Aβ-tau подтверждается фактами, что наблюдается увеличение tau-фосфорилирования у мутантных APP-трансгенных мышей, кроме избыточной экспрессии Aβ-пептидов [27]. Кроме того, сообщалось, что интрацеребральная инъекция Aβ мутантным тау-трансгенным мышам вызывает повышенное тау-фосфорилирование [28]. Последовательно ингибирование накопления Aβ заметно уменьшает начало тау-патологии [29]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что после коррекции ФЛЗ тау-фосфорилирование заметно уменьшилось, что, по крайней мере, частично можно объяснить ингибирующим действием ФЛЗ на Аβ. Образование нейрофибриллярных клубок регулируется несколькими протеинкиназами, которые вызывают фосфорилирование на более чем 79 серин / треониновых остатках на тау [30]. В этом исследовании данные показали, что FLZ ослабляет гиперфосфорилирование тау на нескольких участках. Мы дополнительно исследовали ферменты, которые индуцировали tau -фосфорилирование, и были сфокусированы на GSK3β, который является важной киназой, ответственной за фосфорилирование APP в нейронных клетках [14], [31]. Известно, что фосфорилируют Ser9 GSK3β у многих киназ, расположенных выше по течению, таких как протеинкиназа A (PKA), Akt, протеинкиназа C (PKC) и рибосомальная S6 киназа p6 (p70S6K). Среди этих киназ активность GSK3β отрицательно регулируется Akt через фосфорилирование при Ser9 эпитопе в нейронах [15]. Наши нынешние результаты показали, что FLZ ослабляет гиперфосфорилирование тау в основном за счет ингибирования пути Akt / GSK3β. Существует несколько свидетельств, подтверждающих эту гипотезу. Во-первых, обработка FLZ увеличивала активность Akt и ингибировала активность GSK3β как in vivo, так и in vitro. Кроме того, ингибирующее действие FLZ на GSK3β было подавлено ингибированием активности Akt. Кроме того, ингибирование активности Akt подавляемого FLZ-индуцированного снижения тау-фосфорилирования. Эти данные свидетельствуют о том, что помимо косвенного эффекта, обусловленного ингибированием накопления Aβ, путь Akt / GSK3β может быть другим возможным механизмом, участвующим в ингибирующем эффекте FLZ на гиперфосфорилирование тау. Однако, как путь Akt / GSK3β регулируется FLZ, все еще нуждается в дальнейшем исследовании.

Основное внимание в настоящей работе уделяется механизму нейропротективного воздействия FLZ на патологию AD. Наше исследование дает первые доказательства того, что FLZ-лечение снижает APP-обработку BACE1 и ингибирует гиперфосфорилирование тау, опосредованное путем Akt / GSK3β, подчеркивая потенциал FLZ в качестве терапевтического агента против AD.

Файл содержит изображение S1-S3. Рисунок S1. Моррис-лабиринт теста обучения и дефицита памяти мышей APP / PS1. (A) Задержки мышей, чтобы найти пункт назначения. (B) Число пересечений платформы у мышей. Результаты были выражены как среднее ± SD. ** P <0,01 vs, мыши WT, n = 10 в группе WT, n = 20 в группе APP / PS1. Рисунок S2. Вес тела мышей APP / PS1 во время теста лабиринта воды. Рисунок S3. Aβ в коре мышей APP / PS1. Иммуногистохимия отложений Aβ в коре. Показаны репрезентативные участки коры от 5 мышей. Результаты были выражены как среднее ± SD. ** P <0,01 против мышей WT; ## P <0,01 против мышей APP / PS1.

(DOC)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим профессора Лиан-Фенга Чанга из Центра животных Китайской академии медицинских наук для снабжения (APPswe / PS1:9) мышей. Мы также благодарим профессора Бао-Лу Чжао из Института биофизики Китайской академии наук за предоставление клеток SH-SY5Y (APPwt / swe).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *