Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Таксол-стабилизированные микротрубочки способствуют образованию нитей из немодифицированного полноразмерного тау in vitro

Taxol-stabilized microtubules promote the formation of filaments from unmodified full-length Tau in vitro
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3521687/

Анализы просачивания и флуоресцентная микроскопия используются для того, чтобы показать, что микротрубочки (МТ) индуцируют образование нитей Тау в условиях обычного MT-связывания. Это образование нитей объясняет поразительные несоответствия в ранее сообщаемых аффинностях Тау-МТ и может служить новой моделью образования нитей тау при болезни Альцгеймера.

Тау — нейронный белок, который стабилизирует сеть микротрубочек (МТ), но также образует филаменты, связанные с болезнью Альцгеймера. Понимание взаимодействий Тау-МТ и Тау-Тау поможет установить функцию Тау в области здоровья и болезней. На протяжении многих лет литературные сообщения о тау-MT-связывании и аффинности оставались на удивление противоречивыми (например, 10-кратное изменение сродства к тау-МТ). Было также исследовано взаимодействие Тау-Тау, но неизвестно, могут ли МТ повлиять на образование нитей Тау. Мы рассмотрели эти проблемы посредством связывания анализов и микроскопии. Мы оценили взаимодействия Tau-MT через коселиментацию и обнаружили, что измеренная сродство Tau сильно варьирует в зависимости от экспериментальной конструкции и используемых концентраций белка. Чтобы исследовать эту зависимость, мы использовали флуоресцентную микроскопию для изучения связывания Тау-МТ. Поразительно, мы обнаружили, что стабилизированные таксолом МТ способствуют образованию нитей накаливания Тау без охарактеризованных индукторов тау-нити. Мы предлагаем, чтобы эти новые нити Тау учитывали несогласованность в измерениях аффинности Тау-МТ. Более того, электронная микроскопия показывает, что эти волокна похожи на индуцированную гепарином модель Альцгеймера. Эти наблюдения показывают, что индуцированные MT-индуцированные нити Тау представляют собой новую модель исследований Альцгеймера и что МТ могут играть определенную роль в формировании ассоциированных с Альцгеймером нейрофибриллярных клубок.

Тау-белок экспрессируется в нейронах и функционирует для стабилизации микротрубочек (MTs, Makrides et al., 2004; Choi et al., 2009). MTs являются динамическими полимерами, способными расти и сокращаться, и эта динамика регулируется группой MT-ассоциированных белков, включая Tau (Desai and Mitchison, 1997; Amos, 2000; Askham and Morrison, 2002; Howard and Hyman, 2003) , В нейронах МТ линейно и плотно упакованы по длине аксона, вызывая глобальную клеточную полярность, критическую для нейронной сигнализации (Tanaka and Kirschner, 1991; Slaughter et al., 1997; Witte et al., 2008). В нормальных клетках Tau обнаруживается распределенным по аксонам и локализуется в МТ. Взаимодействие Tau с MTs регулируется многими механизмами, включая альтернативное сплайсинг (имеется шесть известных изоформ человека Tau) и фосфорилирование (Alonso et al., 2010; Fauquant et al., 2011). Однако при болезни Альцгеймера Тау агрегируется для образования нейрофибриллярных клубок (NFT), и он больше не связан с сетью МТ (Goedert et al., 1999; Sun and Gamblin, 2009). Тау в этих путаницах сильно отличается от такового в нормальных клетках, поскольку он гиперфосфорилирован и имеет различное отношение выраженных изоформ. Он также структурно изменен: нормальный Tau растворим с очень небольшой вторичной структурой, но молекулы Тау в NFT связывают вместе, образуя прямые, лентообразные нити или парные спиральные нити с содержанием бета-листов (Mizushima et al., 2007; Jeganathan et al., 2008).

Пока еще неясно, является ли образование NFT причиной или следствием болезни Альцгеймера, но корреляция между богатыми Tau NFT и болезнью Альцгеймера сделала Тау объектом многих исследований. Один из них был посвящен изучению взаимодействий между МТ и Тау с целью установления нормальной физиологической функции белка. Эта работа показала, что Tau повышает стабильность MT и снижает динамику MT (Panda et al., 1995; Al-Bassam et al., 2002; Bunker et al., 2004). MT-связывание и MT-стабилизирующая активность Tau содержатся в C-концевом домене, который содержит четыре MT-связывающих повторяющихся мотива, зажатых богатыми пролином областями (рис. 1A). Считается, что N-конец Tau (также называемый доменом проецирования) разделяет МТ в переполненном аксоне путем соединения с N-концами Tau, выступающих из соседних МТ (Hirokawa et al., 1988; Kempf et al., 1996) , Несмотря на общее согласие в отношении этих аспектов взаимодействий Тау-МТ, литература содержит противоречивую информацию о других. Как ранее отмечалось Акманном и его коллегами, приведенные значения аффинности Tau-MT изменяются более чем на порядок, от менее 100 нМ до более 1 мкМ (Goode and Feinstein, 1994; Ackmann et al., 2000; Makrides et al., 2004). Исследования показали, что различные изоформы имеют разные сродства, но сообщалось о широком диапазоне аффинностей даже для той же изоформы (Goode and Feinstein, 1994; Sillen et al., 2007; Fauquant et al., 2011), а также происхождение эти несоответствия остаются нерешенными.

Очевидное сходство Tau-MT зависит от используемых методов и концентраций белков. (A) Принципиальная схема доменов полноразмерного Tau, использованного в этом исследовании (441 аминокислота, не оттянутая до масштабов). С-конец содержит четыре MT-связывающих повторяющихся мотива (R1-R4), окруженных богатыми пролином областями (P). (B) Tau-MT-связывание, определяемое в соответствии с подходом TcMv, при общем содержании МТ от 0 до 8 мкМ (см. Материалы и методы). Когда данные были установлены (сплошная линия) с использованием нелинейной регрессии в соответствии со стандартным уравнением связи (уравнение 1, см. Приложение), было получено KD 0,11 ± 0,02 мкМ. (C) Tau-MT-связывание, определяемое в соответствии с подходом TvMc, при общей концентрации Tau в диапазоне от 0 до 26 мкМ. Пунктирная линия показывает теоретическую кривую, построенную по формуле 2 с использованием значения KD, вычисленного в (B); данные явно не согласуются с этой кривой. Сплошная линия показывает подгонку данных к уравнению. 3, который включает дополнительный линейный термин, предназначенный для учета взаимодействий Тау-Тау на МТ (см. Приложение). Согласно этой подгонке KD = 2,02 ± 1,03 мкМ и ρ = 6,88 ± 0,37 мкМ. Красная стрелка указывает точку, в которой начинается пересыщение (более 1: 1 связывание), а красные точки данных показывают поведение седиментации умеренных (4 мкМ) и высоких (20 мкМ) концентраций Тау в отсутствие МТ , (D) Подход TcMv при 2 мкМ (оранжевый) и 4 мкМ (синий) Tau, при общем содержании МТ от 0 до 8 мкМ. Когда эти данные были установлены в стандартном уравнении связывания (уравнение 1), были получены значения KD 1,39 ± 0,35 мкМ и 0,67 ± 0,16 мкМ для 2 и 4 мкМ Tau соответственно. Серые данные и кривая воспроизводятся из (B) и приведены для сравнения. Изменчивость данных при более высоких [Тау] обсуждается в Приложении. (E) Подход TvMc при 0,5 мкМ (зеленый) и 0,1 мкМ (красный) МТ с общей концентрацией тау от 0 до 10 мкМ. Когда эти данные были приспособлены к уравнению 3 (см. Приложение) были получены следующие значения: для 0,5 мкМ МТ, КД = 0,84 ± 0,41 мкМ и р = 3,53 ± 0,21 мкМ, тогда как для 0,1 мкМ МТ КД = 0,10 ± 0,32 мкМ и р = 1,06 ± 0,04 мкМ , Серые данные и кривые воспроизводятся из (C) и приведены для сравнения. Данные во всех панелях — это среднее значение ≥3 испытаний ± SD.

Еще одним направлением исследований было понимание процесса формирования NFT. Поскольку Tau в NFT Alzheimer сильно фосфорилируется и не связывается с MTs (Paudel and Li, 1999; Alonso et al., 2010), in vitro исследования образования NFT обычно используют системы, лишенные МТ. В этих исследованиях сделан вывод о том, что немодифицированный тау может образовывать филаменты, подобные альфа-альдегидным NFT in vitro, но для этого процесса требуется много времени (дней) и присутствие промоторов, таких как гепарин, арахидоновая кислота или полиглутаматы (Friedhoff et al. 1998, Barghorn and Mandelkow, 2002; Hiraoka et al., 2004; Jeganathan et al., 2008). В некоторых предыдущих исследованиях показано, что олигомеризация Тау-Тау может происходить в присутствии МТ и даже, что олигомеризация Тау-Тау способствуется МТ (Ackmann et al., 2000; Makrides et al., 2003). На основе этих наблюдений исследователи пришли к выводу, что Тау может связываться с подмножеством молекул Тау, которые связаны с МТ (Ackmann et al., 2000; Makrides et al., 2003; Sillen et al., 2007). Однако, хотя есть очевидные доказательства того, что МТ способствуют олигомеризации тау на поверхности МТ, насколько нам известно, ни одно исследование не исследовало, может ли образование нитей Тау влиять на присутствие МТ.

В ходе других экспериментов мы были озадачены удивительным диапазоном значений аффинности Tau-MT. Мы решили исследовать возможность того, что различия в экспериментальном подходе могут объяснить (по крайней мере частично) расхождения в значениях сообщаемой константы диссоциации. Исследования MT-связывания обычно выполняются с использованием анализов конседиментации, в которых [Tau] поддерживается постоянным, и [полимеризованный тубулин] изменяется или, альтернативно, где [полимеризованный тубулин] поддерживается постоянным, а [Tau] варьируется. В любом случае, количество Tau, что заходы с MTs интерпретируется как Tau, связанное с MT. Проводя эксперименты, в которых мы использовали оба экспериментальных проекта параллельно, мы обнаружили, что кажущаяся сродство Tau для MTs зависит как от подхода, используемого для изучения взаимодействия, так и от концентрации каждого связывающего партнера. Мы обнаружили, что эта зависимость наблюдается, когда данные устанавливаются с использованием как стандартных моделей связывания, так и моделей привязки, предназначенных для учета олигомеризации Тау-Тау на поверхности МТ, что указывает на то, что в этих реакциях происходит взаимодействие, не учитываемое этими моделями.

Чтобы исследовать этот вопрос, мы использовали флуоресцентную микроскопию для изучения поведения меченого Тау в присутствии и отсутствии МТ. Удивительно, но мы обнаружили, что MTs индуцируют быстрое образование нитей Tau-only. Это наблюдение важно по двум причинам. Во-первых, существование этих нитей смешивает попытки измерения взаимодействий Тау-МТ любым методом, поскольку они исчерпывают пул свободного Tau, доступный для связывания с МТ, и они вращаются в анализах коэдиментации. Более важно, что эти нити формируются в обычных MT-связывающих буферах, индуцируются MTs и видны с помощью электронной микроскопии (EM), чтобы быть похожими на хорошо установленные Alzheimer’-подобные Tau-нити, индуцированные гепарином. Эти наблюдения показывают, что волокна, индуцированные MT, могут служить полезной новой моделью in vitro для образования нитей Тау при болезни Альцгеймера, и они повышают вероятность того, что МТ играют ранее недооцененную роль в образовании связанных с Альцгеймером NFT.

Наша статья разделена на два раздела. В первую очередь основное внимание уделяется измерению аффинности связывания Tau-MT, которая оценивается по различным экспериментальным подходам и моделям связывания, а также к отказу любой из широко используемых моделей привязки для соответствия диапазону данных. Общий обзор экспериментов и интерпретаций приведен в основном тексте, в то время как более подробное обсуждение можно найти в Приложении. Второй раздел посвящен наблюдению, что МТ индуцируют образование нитей Тау.

Чтобы выяснить происхождение несогласованностей в приведенных значениях аффинности Tau-MT (Goode and Feinstein, 1994; Ackmann et al., 2000; Makrides et al., 2004), мы вначале исследовали возможность того, что различные экспериментальные конструкции дают разную кажущуюся диссоциацию константы. При измерении констант диссоциации исследователь обычно содержит одну константу белка, изменяя концентрацию другой, а затем оценивает количество комплекса, образующегося при каждом условии. Как отмечено выше, связывание с МТ обычно оценивают путем смещения, в котором экспериментатор предполагает, что реакция достигла равновесия и что любой протеин, который осадок делает, связывается с МТ. В некоторых анализах связывания Tau-MT исследователи держат постоянную Тау при изменении концентрации полимеризованного тубулина (например, Goode and Feinstein, 1994). В других случаях полимеризованный тубулин поддерживается постоянным, а Tau варьируется (например, Ackmann et al., 2000). Мы ссылаемся на эти подходы, как «Tau константа MT изменена» (TcMv) и «Tau измененная константа MT» (TvMc) соответственно (см. Материалы и методы). Чтобы проверить, могут ли различия между TcMv и TvMc учитывать различия в опубликованных значениях аффинности Tau-MT, мы измерили взаимодействия Tau-MT, используя оба подхода в других идентичных условиях.

Как показано на рисунке 1 и более подробно описано в Приложении, кажущееся сродство Tau для стабилизированных таксолом MTs зависит от метода, используемого для оценки взаимодействия (рисунок 1, сравнение B и C). Измеренное сродство также зависит от концентрации Tau, используемой в анализе (рисунок 1D). Ожидается, что эта зависимость от [Tau] будет основана на предыдущих экспериментах, которые были интерпретированы как показывающие, что Tau связывается с MT-bound Tau (Ackmann et al., 2000; Makrides et al., 2003). Это также дает объяснение наблюдению, что кажущееся сродство зависит от подхода, используемого для оценки взаимодействия, поскольку [Tau] поддерживается постоянным в подходе TcMv и изменяется в подходе TvMc.

Акманн и его коллеги создали модель привязки, которая пытается объяснить как взаимодействие Tau-MT, так и связывание Tau с MT-bound Tau (Ackmann et al., 2000). В этой модели константа диссоциации Тау-МТ могла быть рассчитана из соответствия их уравнения данным привязки. Однако, вопреки предсказаниям этой модели, мы наблюдали, что кажущееся сродство Tau для МТ также зависит от концентрации МТ (рис. 1Е). Это наблюдение свидетельствует о том, что пока еще не учтено для реакции в анализах связывания Tau-MT, и это заставило нас рассмотреть возможность того, что Tau может формировать нити в наших тестах MT-связывания (для более углубленного обсуждения этих эксперименты и их интерпретации, см. Приложение).

Хорошо известно, что Тау образует филаменты в патологических состояниях (например, болезнь Альцгеймера) и что растворы очищенных тау образуют нити in vitro при воздействии раствора Тау индукторам, таким как гепарин (Jeganathan et al., 2008; Wegmann et al., 2011). Как обсуждалось выше, также принято, что Тау может участвовать в взаимодействиях Тау-Тау на поверхности МТ (Ackmann et al., 2000; Kar et al., 2003; Makrides et al., 2003). Мы задавались вопросом, может ли необычное поведение Tau в анализах MT-связывания быть вызвано, по меньшей мере, частично образованием нитей Тау во время анализов. Такое наблюдение было бы удивительным, потому что образование индуцированных гепарином нитей Тау очень медленно, принимая дни для накопления значительных концентраций нитей и обычно выполняется при гораздо более высоком [Тау], чем в наших экспериментах. Однако мы решили, что было бы целесообразно исследовать, поскольку, как обсуждалось выше, зависимость кажущегося Tau-MT KD от концентрации МТ была несовместима с математической моделью Экманна для взаимодействий Тау-МТ. Более того, Tau в наших TvMc-анализах, по-видимому, сочетается с МТ на уровнях, превышающих то, что можно объяснить исключительно ограниченной олигомеризацией Тау на поверхности МТ, как это было предсказано с использованием математических моделей MTBindingSim (Philip et al., 2012, неопубликованные данные) , Эти наблюдения показали, что мы должны исследовать возможность того, что МТ индуцируют образование нитей Тау.

Наша первая цель в проверке гипотезы о том, что филаменты могут формироваться в наших анализах, заключалась в том, чтобы воспроизвести результаты Makrides et al. (2003), которые показали, что МТ способствуют образованию сшиваемых комплексов Тау-Тау, которые интерпретируются как свидетельство того, что МТ способствуют образованию олигомеров Тау. Дополнительный рисунок S1 свидетельствует о том, что Tau делает перекрестную связь с Tau в наших анализах и, как и ожидалось, делает это только при наличии MT (рис. S1). Несмотря на обнадеживающие результаты, эти эксперименты не выявили, происходит ли взаимодействие Тау-Тау ограниченным образом на поверхности МТ, что согласуется с предыдущим пониманием или может возникнуть как часть ранее непризнанного процесса полимеризации.

Чтобы более непосредственно исследовать возможность того, что Tau в наших анализах формирует нити, мы обратились к флуоресцентной микроскопии. Более конкретно, мы провели эксперименты, в которых мы добавили различные количества меченого Alexa Fluor Tau (1-4 мкМ) к постоянному количеству меченых родамином МТ (4 мкМ), инкубировали смеси в течение 15 мин (аналогично анализу коседиментации ) и отображали образцы на соответствующих длинах волн. Первое, что мы заметили, это то, что Тау очень тонко декорировал МТ: некоторые МТ были хорошо украшены, у некоторых, казалось, не хватало Тау, а другие были спорадически украшены (рис. 2). Работа атомной силовой микроскопии, выполненная Schaap et al. (2007) также показали спорадическое украшение Тау на МТ.

Однако более ярким наблюдением является появление нитей, которые, по-видимому, состоят только из Тау: на правой панели на фиг. 2 можно видеть зеленые тау-меченные нити (голубые стрелки), которые не совсем соответствуют положению МТ на левых панелях (рис. 2). Важно отметить, что сборка этих нитей Tau требует наличия МТ: мы не видели таких нитей типа Тау, образующихся при других идентичных условиях в отсутствие МТ (рис. 2D). Количество этих тау-только нитей также, по-видимому, зависит от различных концентраций Тау (рис. 2). Кроме того, мы обнаружили, что нити Tau-only оставались нетронутыми после того, как мы позволили МТ деполимеризоваться путем длительных инкубаций в буфере без таксола (рис. 3). Это наблюдение указывает на то, что в то время как нити Tau требуют создания МТ (рис. 2), они не требуют поддержания МТ.

Флуоресцентно маркированные Tau и MTs обнаруживают спорадическое украшение Tau-MT и образование нитей Тау. Инкубации (A) 1 мкМ Tau: 4 мкМ МТС, (B) 2 мкМ Tau: 4 мкМ МТ и (C) 4 мкМ Tau: 4 мкМ МТС в течение 15 мин при 37 ° С. Индивидуальные МТ отличаются от того, что они редко украшены тау (красные наконечники стрел), чтобы быть умеренно и сильно украшены Тау (желтые стрелки). Фигуры Тау, которые не связаны с МТ, также очевидны (голубые стрелки). В правых панелях цветные изображения показывают тубулин как красный, а Tau — зеленый; наложение Тау и тубулина выглядит желтым. (D) Результаты контрольных экспериментов, выполненных только с белком Тау при низких (1 мкМ) и высоких (4 мкМ) концентрациях, в которых не наблюдается нитей Тау. Шкала шкалы: 8 мкм. Представленные изображения представляют собой типичные результаты более чем 10 независимых экспериментов, проведенных с Tau из многочисленных реакций очистки и мечения.

Фигуры тау образуются в присутствии МТ и остаются после диссоциации МТ. МТ (4 мкМ) инкубировали при 37 ° С в отсутствие или присутствии Тау (2 мкМ) и / или МТ-стабилизирующего препарата Таксол (10 мкМ). Образцы инкубаций брали с различными временными интервалами (от 15 мин до 4 ч, как указано) и отображались. Цветные изображения показывают тубулин как красный, а Tau — зеленый, а наложение — желтым. Шкала шкалы: 8 мкм. (А) МТ, инкубированные с Таксолом и Тау; правая пара панелей отображает полутоновые изображения для 4-часовой точки времени. (B) МТ, инкубированные с Tau в отсутствие таксола; правая пара панелей отображает полутоновые изображения для 4-часовой точки времени. (C) МТ, инкубированные в одиночку с таксолом. (D) МТ, инкубированные без таксола или тау. Обратите внимание, что МТ без таксола диссоциируют со временем (медленнее, когда присутствует Тау), но нити Тау остаются. Изображенные изображения представляют собой типичные результаты более шести разных полей собранных данных.

Образование MT-индуцированных нитей Tau могло бы помешать анализу MT-связывания двумя различными способами, которые будут отражены в данных связывания, представленных на рисунке 1. Во-первых, нити Tau могут расходоваться с MT, либо путем связывания с MT, либо посредством осаждение независимо. Если предполагается, что накопление нитей тау, образование нитей будет увеличивать как кажущееся сродство, так и кажущееся отношение Табубон: тубулин, увеличивая долю тау, которая осаждается при данной концентрации. Чтобы проверить гипотезу о том, что нити Tau проводят конседицию с МТ, мы инкубировали флуоресцентно меченые 2 мкМ Tau и 4 мкМ МТ в течение 15 мин при 37 ° С и проводили стандартный анализ коэдиментации. Однако на этот раз вместо загрузки фракций супернатанта и гранул на геле мы их визуализировали с использованием флуоресцентной микроскопии. Мы наблюдали, что как МТ, так и субстраты тау почти доходят до конца — немногие из них были найдены в супернатанте (рис. 4). Эти данные показывают, что центральное предположение о анализе коселиментации (идея о том, что Тау в грануле связана с МТ) нарушается при любых условиях, в которых формируются нити Тау. Таким образом, анализы конседиментации не могут быть использованы для обеспечения достоверного измерения взаимодействий Тау-МТ, если присутствуют нити.

Фигуры Тау вращаются в ультрацентрифугировании. Tau (2 мкМ) и МТ (4 мкМ) инкубировали при 37 ° С в течение 15 мин. Смесь подвергали ультрацентрифугированию и супернатант и осадок отделяли в соответствии с протоколом анализа MT-связывания для получения изображений. В то время как изображения «до спина» и гранулы являются репрезентативными, надсадочное изображение показывает одно очень небольшое количество МТ, оставшихся в супернатанте. Эти данные показывают, что анализы коседиментации, вероятно, приведут к недействительным измерениям аффинности Tau-MT, так как коседиментация предполагает, что все Tau в грануле связано с MTs. Цветные изображения показывают тубулин как красный, а Tau — зеленый, а наложение — желтым. Шкалы шкалы: 10 мкм. Изображенные изображения представляют собой типичные результаты трех независимых экспериментов.

Поскольку осаждение нитей накаливания Tau нарушает измерения сродства, наш первоначальный вывод заключался в том, что эта проблема, вероятно, объясняет неудачу привязки моделей к данным, и нам нужно было найти другой метод (тот, который не использовал седиментацию) для измерения Tau-MT взаимодействия. Однако мы поняли, что для обеспечения достоверного измерения не будет никакого подхода, поскольку образование нитей Тау также нарушает измерения аффинности, а также: сборка Tau в нити истощает пул свободного Tau, доступный для связывания с MTs, что уменьшит кажущуюся сродство, уменьшив эффективную концентрацию Tau, присутствующую в данной реакции. В то время как первая проблема (седиментация нитей Тау) специфична для анализов коселиментации, вторая проблема (истощение пула свободного тау) влияет на любой метод, который может быть использован для измерения взаимодействий Тау-МТ, независимо от того, участвует ли седиментация.

Поэтому мы решили посмотреть, была ли тау-концентрация, при которой образование нитей было минимальным в соответствующем диапазоне концентраций МТ. Наше ожидание заключалось в том, что определение такой концентрации позволило бы невозмущенное измерение взаимодействий Тау-МТ. Эксперименты, в которых мы варьировали концентрацию Tau, инкубированных с 4 мкМ МТ, показали, что 1 мкМ Tau образовывало относительно небольшое количество нитей (рис. 5). Это наблюдение указывает на то, что константа диссоциации, измеренная на рис. 1В, вероятно, дает разумную оценку фактической константы диссоциации Тау-МТ в соответствии с предыдущими измерениями, выполненными на низких [Тау], например, Гуд и Фейнштейн (1994). Более того, он предполагает, что другие измерения сродства Tau-MT должны выполняться при такой же низкой концентрации Тау, если не будут найдены условия, при которых образование нитей не происходит.

Эксперименты с использованием 1 мкМ Тау минимизируют образование нитей тау. Тау (1 или 2 мкМ) инкубировали в течение 15 мин при 37 ° С с 4 мкМ МТ и затем раствор визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Количество МТ и нитей Тау подсчитывалось из трех отдельных оптических полей, охватывающих общую площадь изображения 35,6 кв. Мм при каждом условии. Количество подсчитанных МТ превысило 300 в каждом поле. Поля, выбранные для подсчета, были типичными представлениями более чем 10 экспериментов.

Две оставшиеся проблемы — удивительная изменчивость во фракции Тау, осадки на рис. 1D, и несогласованная тенденция в кажущемся сродстве, когда Tau увеличивается от 1 до 2 и 4 мкМ. Мы предположили, что одной из причин изменчивости может быть то, что полимеризация Тау занимает больше 15 минут, чтобы достичь своей конечной точки, и что небольшие различия в процессе зарождения или времени инкубации будут варьировать количество полимеризованного Тау в течение этого короткого периода времени. Чтобы проверить эту гипотезу, мы инкубировали Tau с MTs в течение более длительного времени и собирали изображения в разные моменты времени. Работая с 2 мкМ Tau и 4 мкМ MTs, мы обнаружили, что Tau начинается как в форме MT-bound, так и в форме накачки Tau через 15 мин, но через 1 ч полностью переходит в форму нити накаливания (рис. 6). Через 60 мин Тау обнаруживается в основном в форме нитей тау, и МТ в значительной степени неэкранированы; только относительно немногие МП имеют Tau, которые были очень сильно украшены (рис. 6).

Образование нитей Тау является зависящим от времени процессом. Tau (2 мкМ) инкубировали с 4 мкМ МТ, периодически добавляли таксол при 37 ° С, и изображения собирали в 15-минутный, 1-часовой, 2-часовой и 3-часовой моменты времени. За 1 ч число нитей Тау достигло максимума. Данные гистограммы были сгенерированы, как описано на рисунке 5, отсчитываются от трех отдельных оптических полей, охватывающих общую площадь изображения 35,6 квадратных мм. Количество подсчитанных МТ превысило 300 в каждом поле. Поля, выбранные для подсчета, являются типичными представлениями более шести разных полей собранных данных.

Чтобы оценить влияние этой зависящей от времени полимеризации на анализы коэдиментации, мы повторили 2 мкМ Tau TcMv экспериментов на рис. 1D путем инкубации смеси Тау-МТ в течение 1 часа вместо 15 мин. В соответствии с наблюдениями на рисунках 4 и 6 мы увидели, что все Тау сдвинуты на гранулу до тех пор, пока присутствуют МТ (см. Рис. S2), что свидетельствует о том, что увеличенное время инкубации сдвинуло взаимодействие Tau-MT с низкого связывание с аффинностью с высоким связыванием. Однако это было бы неправильной интерпретацией: осаждение Tau происходит из комбинации быстрого связывания MT и медленной полимеризации Тау. Одним из последствий этого поведения седиментации является то, что кажущиеся сродства, полученные из экспериментов на рис. 1D, не являются законными измерениями связывания Tau-MT. Более того, поскольку кинетика процесса полимеризации Тау, вероятно, сложным образом изменяется с числом центров зародышеобразования, это зависящее от времени поведение полимеризации также дает объяснение изменчивости, наблюдаемой при определенных концентрациях МТ. Эти вопросы требуют дальнейшего изучения.

Наблюдение, что нити Тау не образуются в отсутствие МТ или других индукторов, указывает на то, что полимеризация Тау (также называемая фибриллизацией) является процессом с ограниченным нуклеацией. Один очевидный вопрос заключается в том, как МТ способствуют образованию ядер накачки нитей Тау. Сначала мы предположили, что этому процессу могут способствовать богатые глутаматом С-концевые хвосты тубулина, поскольку полиглутаматы могут индуцировать фибриллизацию Тау в in vitro (Friedhoff et al., 1998). Чтобы проверить эту идею, мы инкубировали Tau с МТ, из которых α- и β-хвосты димеров тубулина удаляли путем выщелачивания субтилизином (фиг. 7 и S3). Удивительно, но мы обнаружили, что, когда мы использовали МТ, лишенные их богатых глутаматом хвостов, не было очевидного эффекта на образование нитей Тау (рис. 7).

Обработанные субтилизином МТ могут способствовать образованию нитей Тау. (A) Tau (2 мкМ), инкубировали с 4 мкМ нормальных таксол-стабилизированных МТ в течение 15 мин. (B) Tau (2 мкМ), инкубировали в течение 15 мин с 4 мкМ субтилизированных МТ, которые расщепляли хвосты C-концевых тубулина (тестировали с помощью Вестерн-блот-анализа, см. Фиг. S3). Левые панели показывают МТ, средние панели показывают Tau, а правые панели показывают наложение; MT отображаются красным цветом, Tau — зеленым, а наложение — желтым. Шкала шкалы: 10 мкм. Изображенные изображения представляют собой типичные результаты более 30 различных полей собранных данных.

Это наблюдение указывает на то, что хвосты тубулина не участвуют в процессе зародышеобразования, но не предоставляют никакой информации о том, какой аспект структуры МТ задействован. Для решения этого вопроса потребуется дальнейшая работа. Тем не менее, одна из предположений заключается в том, что нити могут зарождаться с помощью MT-кончиков, как это предлагается с помощью изображений флуоресцентной микроскопии, показывающих нити Tau, простирающиеся от MT-кончиков (рис. S4). Мы использовали EM, чтобы лучше визуализировать нити Tau и, возможно, получить представление о механизме зарождения, как описано в следующем разделе.

До сих пор единственной экспериментальной моделью in vitro для образования Tau NFT, наблюдаемой при болезни Альцгеймера, была сборка нитей Тау индукторами, такими как гепарин, арахидоновая кислота и полиглутаматы (например, Friedhoff et al., 1998; Jeganathan et al., 2008). Гепарин фибриллирует полноразмерный человеческий тау в сочетании скрученных и плоских лентоподобных нитей. EM, флуоресценция тиофлавина-S, инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье и исследования кругового дихроизма доказали, что эти волокна можно использовать в качестве приемлемой модели NFT, которые образуются при болезни Альцгеймера (Ramachandran and Udgaonkar, 2011; Wegmann et al., 2011 ). Как отмечалось ранее, эта сборка нитей обычно происходит в течение нескольких дней или, по крайней мере, часов, часто использует очень высокие концентрации Тау, требует анионных индукторов и выполняется в системах, лишенных МТ. Чтобы исследовать связь между нашими новыми нитями Тау и нитями, индуцированными гепарином, используемыми в качестве моделей для NFT, мы обратились к просвечивающей электронной микроскопии (TEM).

Мы подготовили образцы, сделанные только с помощью МТ, только Тау, и смеси МТ и Тау в тех же условиях, которые использовались для экспериментов по смещению. Мы также подготовили контроль, состоящий только из тау в гепаринсодержащем буфере, который классически использовался для содействия образованию NFT-подобных нитей (Jeganathan et al., 2008; Ramachandran and Udgaonkar, 2011; Wegmann et al., 2011) , Как показано на рис. 8А, МТ в наших экспериментах можно признать прямыми нитями, которые имеют четкие прошивочные гребни. Когда полноразмерный Тау инкубируется с гепарином в буфере, способствующем NFT, он образует много прямых и несколько скрученных нитей, что согласуется с предыдущими отчетами (рис. 8B, Wille et al., 1992; Jeganathan et al., 2008; Wegmann et al., 2010, 2011; Ramachandran and Udgaonkar, 2011). Когда Tau инкубируется сам по себе в буфере MT (PEM), нити не видны (рис. 8B, вставка). Однако, когда Tau и MTs инкубируются вместе, появляются многочисленные нехелиальные нити без гребней (рис. 8C). Эти нити кажутся поверхностно подобными классическим нитратам, индуцированным гепарином (сравните рис. 8, C и B). Поразительно, что мы также смогли наблюдать ряд случаев, когда нить Тау, по-видимому, полимеризуется с концов МТ (рис. 8D), что согласуется с нашими предыдущими наблюдениями за флуоресценцией (рис. S4).

Новые тау-нити напоминают индуцированные гепарином нити Тау, которые являются моделями болезни Альцгеймера и, по-видимому, полимеризуются от концов MT. Все образцы использовали 2 мкМ Тау и 4 мкМ МТ, инкубировали в течение 15 мин при 37 ° С. Для образцов в (D) и (E) МТ инкубировали с Tau в течение 5 мин, чтобы поймать начальные стадии процесса фибриллизации. (A) ТЕМ-изображение только МТ. Могут быть видны прорезиненные гребни. (B) Индуцированные генами фибриллы Тау: полноразмерный тау образует комбинацию многих прямых и нескольких скрученных нитей при инкубации с гепарином. Вставка представляет собой репрезентативный образ контроля только с тау: ни одно образование нитей не было видно по нескольким полям и образцам. (C) TEM-изображение нитей Тау, образовавшихся при инкубации с МТ. Отметим, что лентоподобные, индуцированные MT-индуцированные нити Tau в (C) наиболее похожи на прямые, индуцированные гепарином нити Tau, замеченные в (B), и на другие, о которых сообщалось ранее (Barghorn and Mandelkow, 2002; Jeganathan et al., 2008). Хотя у MT-индуцированных нитей Tau нет периодического скручивания скрученных гепарин-индуцированных нитей Tau, MT-индуцированные нити Tau кажутся скрученными в виде кос. (D) Изображение, показывающее, что, по-видимому, является нитью Тау, полимеризующейся с конца MT. (E) Изображение, показывающее нормальный тупой конец MT, при котором полимеризация Tau не происходит. (F) Гистограмма ширины нитей. Измерения ширины проводились так, как описано в материалах и методах. (а) показывает более толстую ширину ТТ-индуцированных нитей Тау; (a ‘) показывает более тонкую ширину MT-индуцированных нитей Tau; (б) показывает более толстую ширину скрученных гепарин-индуцированных нитей Тау; (b ‘) показывает более тонкую ширину скрученных гепарин-индуцированных нитей Тау; (c) показывает ширину прямых нитей Tau, индуцированных гепарином; (d) показывает ширину МТ. Все изображенные изображения представляют собой репрезентативные изображения трех экспериментов и были получены ТЕМ. Шкала шкалы: 50 нм.

Чтобы провести более подробное сравнение индуцированных MT и индуцированных гепарином волокон, мы измерили ширину различных нитей, которые произошли в наших препаратах. МТ-индуцированные нити Tau были наиболее похожими по внешнему виду и ширине на прямые нити Tau, индуцированные гепарином (рис. 8, B, C и F). Значимость незначительных различий в ширине между этими двумя типами нитей неясна, но может быть обусловлена ​​условиями буфера. Действительно, многие исследования ЭМ, наблюдаемые в нитрообразованных нитритах Тау, показали, что морфология нитей может варьироваться в зависимости от используемой конструкции Туу, используемого анионного индуктора или буферных условий (Crowther, 1991; Goedert et al., 1992; Barghorn and Mandelkow, 2002; Jeganathan et al., 2008). Недавние исследования перешли к вопросу о различной морфологии нитей тау и обнаружили, что более толстые области фибрилл Туу колеблются между ~ 9 и 18 нм, а более тонкие области находятся в диапазоне от ~ 10 до 15 нм (Wegmann et al., 2010). Наблюдение, что ширина MT-индуцированных нитей Tau лежит в пределах этих значений, подтверждает идею о том, что индуцированные MT и индуцированные гепарином нити представляют собой аналогичные структуры. Учитывая, что волокна, индуцированные гепарином, распознаются как модели индуцированных Альцгеймером нитевидных волокон, сумма этих данных свидетельствует о том, что эти MT-индуцированные нити Tau обеспечивают новую модель in vitro для образования Tau NFT.

Мы обнаружили, что в условиях типичных анализов MT-связывания MTs индуцируют быстрое образование новых нитей Тау. Сборка этих нитей значительна по двум причинам. Во-первых, мы предлагаем, чтобы он учитывал как неспособность Tau-MT взаимодействий соответствовать стандартным моделям связывания, так и широким диапазонам зарегистрированных значений сродства, измеренных в разных условиях (Goode and Feinstein, 1994; Sillen et al., 2007; Fauquant et al., 2011). Возможно, остается, что Тау также связывается с МТ в кооперативной манере, о чем свидетельствует несогласованный характер декорирования МТ Тау (рис. 2). Тем не менее, будет сложно решить эту проблему количественно до тех пор, пока не будут найдены условия, которые устраняют индуцированное MT индуцированное образование нитей тау в диапазоне концентраций Тау. Такие важные вопросы, как важность метода очистки Тау для образования нитей (т. Е. Классического метода кипения по сравнению с другими подходами) и механизма зарождения нитей, остаются важными дополнительными направлениями для будущих исследований.

Вторая причина того, что образование MT-индуцированных нитей Tau является значительной, заключается в том, что она может иметь отношение к функции Tau как в отношении здоровья, так и в отношении болезней. Во-первых, наблюдение, что Тау быстро формирует нити в относительно мягких условиях, указывает на то, что взаимодействия Тау-Тау не требуют фосфорилирования или наличия химических индукторов. Кроме того, обнаружено, что нити Тау образуются из немеченого белка, как показано TEM (фиг. 8). Эти наблюдения показывают, что взаимодействия Тау-Тау могут играть роль в нормальной функции Тау. Более того, сходство MT-индуцированных нитей Tau с теми, которые образуются при болезни Альцгеймера, подразумевает, что MT-индукция узла накачки Tau может обеспечить более простой способ создания нитей Tau и, таким образом, открыть новые пути для изучения и, возможно, ингибирования образования нитей. Наконец, индукция сборки нитей Tau с помощью MTs in vitro обеспечивает дополнительную поддержку предложения (Friedhoff et al., 1998; Ackmann et al., 2000), что МТ могут играть роль в образовании связанных с Альцгеймером NFT in vivo.

Тубулин очищали из мозга свиней, используя два цикла полимеризации и разделение на колонке P-11 в соответствии с протоколом Mitchison (Mitchison and Kirschner, 1984). Аликвоты очищенного тубулина замораживали и хранили при -80 ° С.

Тубулин собирали в МТ со стабилизирующим препаратом Таксол в соответствии с установленным протоколом (Mitchison and Kirschner, 1984).

MT были переварены субтилизином для удаления обоих α- и β-тубулиновых хвостов в соответствии с ранее установленным протоколом (Zhu et al., 2009). Удаление обоих хвостов тубулина подтверждали вестерн-блот-анализом, зондированным с мышиным моноклональным антителом против α-тубулина 1A2 (подарок от лаборатории Томаса Крейса, Женевский университет), который нацелен на хвост α-тубулина, второй хвост (см. рисунок S3).

Полноразмерный человеческий Tau-белок рекомбинантно экспрессировали в клетках BL21 (DE3) Escherichia coli из вектора pRK-172, любезно предоставленного Халидом Икбалом (Alonso et al., 2010) и очищенным методом кипения, описанным Smith et al. (2000). Концентрацию Тау определяли с помощью аминокислотного анализа, а аликвоты хранили при -80 ° С.

Полноразмерный тау (50 мкМ) инкубировали с 12,5 мкМ гепарином (натриевая соль гепарина из слизистой оболочки кишечника свиньи [SKU: H3393, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO]) в буфере HEPES (pH 7,6, 10 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 0,125 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола) при 37 ° С в течение ~ 4,5 дней (Barghorn and Mandelkow, 2002; Jeganathan et al., 2008).

МТ (концентрация, измеренная как полимеризованные димеры тубулина) инкубировали при 37 ° С с белком Тау в течение 15 мин в буфере PEM (100 мМ ТРУБЫ, рН 6,8, 2 мМ MgCl2, 1 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты [EGTA]), дополненной 10 мкМ Таксол. МТ и связанный с ними тау (и любые другие осаждаемые комплексы) осаждали из раствора при 23000 × g в течение 20 мин при 37 ° С. Супернатанты, содержащие свободный Tau, отделяли от гранул и гранулы ресуспендировали в PEM. Образцы смешивали с SDS-буфером, кипятили и работали на 10% -ном геле SDS-PAGE. Контроль только с помощью Tau и MTs был включен в каждый анализ MT-связывания. Исчерпывающие фоновые значения связанных и свободных фракций полос белка туаса Кумасси, окрашенных синим, измерялись с использованием программного обеспечения Image J. GraphPad Prism (La Jolla, CA) использовался для всех подгоночных кривых, как описано ниже.

Анализ MT-связывания, в котором концентрация Тау поддерживается постоянной, а концентрация МТ изменяется по нескольким образцам, проходит параллельно. Расчеты для приведенных данных предполагают коэффициент связывания димера тау: 1 тубулина (N). Используемые общие концентрации МТ составляли 0, 1, 2, 4, 6 и 8 мкМ. Данные были установлены с использованием нелинейной регрессии согласно уравнению 1, то есть фракция Taubound = Bmax [MTfree] / ([MTfree] + KD), с Bmax = 1.0.

Анализ MT-связывания, в котором концентрация Tau изменяется, и концентрация MT поддерживается постоянным по нескольким образцам, проходит параллельно. Суммарная концентрация тау составляла от 0 до 26 мкМ. Данные были установлены с использованием нелинейной регрессии согласно уравнению 2 или 3, как указано в тексте.

MTs были полимеризованы с использованием отношения ~1: 3 карбокситетраметил-ходамин- (TAMRA-) или Alexa Fluor 561-меченого тубулина к немеченому тубулину; отношение молекул красителя к димерам тубулина в меченых исходных растворах тубулина составляло от 1: 5 до 1: 3. Тау был помечен Alexa Fluor 488 (A30052; Invitrogen, Carlsbad, CA), следуя протоколу Invitrogen для аминных реактивных зондов. Соотношение маркировки обычно было одной молекулой красителя до молекул ~ 10 Тау. Маркированный Tau, полученный из нескольких различных препарирующих тау, образовывал аналогичные нити Tau, а эксперименты по контролю за конседиментацией показали, что для всех препсов связывающая активность 2 мкМ с маркировкой Tau с мечеными МТ 2 мкМ была аналогична активности немаркированных белков (неопубликованные данные). Меченые МТ и меченый белок Тау инкубировали вместе в буфере BRB80 (80 мМ ТРУБЫ, рН 6,8, 1 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА) в присутствии 10 мкМ Таксола; образцы разбавляли 1:10 и дополняли кислород-очищающую систему (смесь, содержащую каталазу, глюкозооксидазу, β-меркаптоэтанол и глюкозу) непосредственно перед визуализацией. Изображения были получены на инвертированном микроскопе Nikon TE2000 с использованием объектива с числовой апертурой (NA) 60 × 1.4 и камерой Cascade 512B (Photometrics, Tucson, AZ). Только фиг.4 изображен на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert S100TV с использованием объектива 63 × / 1,4 NA и камеры Micromax Princeton Instruments (Trenton, NJ). Оба микроскопа были оснащены фильтром высокого качества Q от Chroma (Bellows Falls, VT). Все изображения были получены и обработаны с использованием программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) и обработаны с использованием Adobe Photoshop 7.0 (San Jose, CA).

Изображения были приобретены на FEI Titan 80-300 D3203 TEM (Hillsboro, OR) на 80 кВ и собраны камерой Gatan (Оксфорд, Великобритания). Образцы фиксировали глутаровым альдегидом класса EM и распределяли на сетчатые сетки типа B, 400 меш / с покрытием. Сетки были предварительно подвергнуты воздействию Ar / O2 в течение 12 с в плазменном очистителе модели 1020 фирмы «Фиджионе Инструменты», чтобы сделать поверхности гидрофильными. Образцы были отрицательно окрашены 2% уранилацетатом.

Ширина отдельной MT-индуцированной нити Tau изменяется с более толстыми (рис. 8Fa) и более тонкими (рис. 8Fa) областями. Три измерения более толстой ширины вдоль отдельных нитей Тау усреднялись вместе, чтобы представить толщину нити накала. Три измерения более тонкой ширины вдоль отдельной нити накала были усреднены вместе, чтобы представить тонкую ширину нити накала. Среднее по нескольким нитям (n) было взято и нанесено в виде гистограммы с более толстым показателем, показанным на рисунке (рис. 8Fa), и более тонким средним показателем (рис. 8Fa). Такой же подход был сделан для измерения более толстых (рис. 8Fb) и более тонких (рис. 8Fb) областей индуцированных гепарином, скрученных нитей Тау. Для индуцированных гепарином прямых нитей Тау (рис. 8Fc) и для МТ (рис. 8Fd) три измерения ширины отдельной нити были усреднены для учета как ширины отдельной нити. Среднее по нескольким нитям (n) было взято и нанесено на график; прямая ширина нитей накаливания, индуцированная гепарином, показана на рисунке 8Fc, а ширина MT показана на рисунке 8Fd.

Когда измеряется значение константы диссоциации для взаимодействия белок-белок, один белок обычно поддерживается постоянным, а другой изменяется, и данные устанавливаются в соответствующее уравнение для извлечения константы диссоциации (подробнее об этом позже в Приложение). Если связывание является простым, то тот же ответ следует получить, держа в эксперименте либо константу белка, либо не имеет значения, которая остается постоянной и которая изменяется. Аналогично, измеренное сродство не должно зависеть от концентрации используемых белков. Мы ссылаемся на подход, в котором концентрация Тау [Тау] поддерживается постоянной, а концентрация МТ [МТ] варьируется как TcMv, а наоборот — как TvMc. Обратите внимание, что в этой статье [MT] измеряется как концентрация полимеризованных димеров тубулина. Чтобы проверить, могут ли различия между кажущимся поведением Tau в подходах TcMv и TvMc объяснять расхождения в опубликованных значениях аффинности Tau-MT, мы измерили взаимодействия Tau-MT, используя оба подхода в других идентичных условиях. Чтобы далее характеризовать взаимодействие, мы затем проверили зависимость полученных значений от [MT] (в TvMc) и [Tau] (в TcMv). Как обсуждалось ниже, наши результаты не только не согласуются с идеей о том, что Tau связывается с МТ через простое взаимодействие, но также несовместимо с более сложной моделью привязки, разработанной Ackmann et al. (2000), который пытается включить привязку Тау к MT-связанному Tau. Эта несогласованность предполагает, что другое взаимодействие, не учитываемое моделью Ackmann, возникает, когда Tau и MTs смешиваются. Основной текст свидетельствует о том, что это «другое взаимодействие» представляет собой MT-индуцированное образование нитей Тау.

Используя подход TcMv, мы измерили долю постоянного количества Tau, что происходили с различными концентрациями стабилизированного таксолом МТ. Чтобы вычислить значение KD с использованием этого подхода, необходимо принять конкретный коэффициент связывания между Тау и тубулином и построить его в анализе. Это позволяет вычислить концентрацию свободных сайтов связывания на МТ ([MTfree]) и соответствовать полученным данным в соответствии со стандартным связующим уравнением. 1 для расчета кажущегося Tau-MT KD (KDapp), как показано:
(1)

Когда мы предполагаем коэффициент связывания (N) 1 димера тубулина 1 Tau: 1, наши данные для 1 мкМ Tau приводят к кажущейся константе диссоциации Тау-МТ 0,11 ± 0,02 мкМ (рис. 1B), что согласуется со многими сообщениями о том, что Tau связывается MTs очень плотно (Goode and Feinstein, 1994; Ackmann et al., 2000).

Параллельно с экспериментами TcMv, описанными выше, мы количественно определяли взаимодействия Tau-MT с использованием подхода TvMc. Более конкретно, мы провели эксперименты, в которых [MT] поддерживали постоянным в течение нескольких анализов, поскольку количество Tau менялось, и мы измерили количество Tau, которое было согласовано с MTs на каждом [Tau]. Вычитая Taubound из Tautotal в каждом анализе (или, наоборот, непосредственно измеряя количество Tau в супернатанте), мы установили количество Tau, которое оставалось свободным ([Tau] бесплатно). Затем мы использовали эти значения и стандартное уравнение связи для подхода TvMc, как показано в уравнении 2 для определения Tau-MT KD:
(2)
где N — отношение связанного Tau к диурулину тубулина (установлено, что он равен 1 Tau: 1 тубулиновый димер для всех наборов данных, в соответствии с N, используемым в подходе TvMc).

Сначала мы измерили Tau-MT KD на 1 мкМ MTs (рис. 1C), а затем сравнили данные с теоретической кривой (пунктирная линия), которая получается, когда уравнение 2 изображается с величиной KDapp, измеренной подходом TcMv (рисунок 1B). Два основных различия между пунктирной кривой и данными очевидны:
При низких [Тау] теоретическая кривая растет намного быстрее, чем фактические точки данных. Это наблюдение подразумевает, что Tau более слабо связывается с МТ в экспериментах TvMc, чем в экспериментах TcMv. Таким образом, оба подхода дают разные очевидные аффинности, даже когда все остальные переменные остаются постоянными.

Теоретическая кривая насыщается при 1 мкМ связанной Tau, в то время как экспериментальные данные продолжают расти примерно линейно, значительно выше ожидаемой точки насыщения (как показано красной стрелкой на рисунке 1C). Этот второй вопрос не позволяет получить разумное соответствие уравнения 2 к данным на рисунке 1C, независимо от допустимых значений KD и N (рисунок 1C и неопубликованные данные).

В предыдущей работе Акманн и его коллеги также наблюдали перенасыщение Тау и объясняли это поведение взаимодействием Тау-Тау, происходящим на поверхности МТ (Ackmann et al., 2000). Чтобы настроить это дополнительное взаимодействие, они изменили формулу. 2, добавив линейный член для соответствия пересыщению Tau, как показано в уравнении 3:
(3)
где N — отношение связанного Tau к диурулину тубулина (установлено, что он равен 1 Tau: 1 димер тубулина для всех наборов данных, в соответствии с N, используемым в подходе TcMv), а ρ является дополнительным параметром перегрузки, описанным Ackmann et al. (2000) как «формально напоминающее значение КД, описывающее слабое сродство Тау [для Тау]». Первая половина уравнения 3 идентична уравнению 2 и рассчитывает сродство между белком и лигандом. Вторая половина уравнения 3 — линейный член, введенный Акманном и его коллегами для учета количества Tau, что осадки за пределы насыщения.

Когда мы поместим наши данные, используя этот двухфазный экв. 3, получаем КД 2,02 ± 1,03 мкМ и ρ 6,88 ± 0,37 мкМ (рис. 1С). Это значение KD несовместимо с KD = 75 нМ, сообщенное Ackmann и его коллегами, и оно более чем на порядок меньше, чем значение, полученное при анализе данных TcMv (рис. 1B).

Как видно выше, различные экспериментальные схемы приводят к различным кажущимся значениям для аффинности Tau-MT (рис. 1, B и C). Однако различия в методе и / или модели сами по себе не могут объяснить расхождения в литературе: при сравнении результатов подхода TvMc, как сообщается различными исследовательскими группами, значения аффинности по-прежнему изменяются более чем на порядок от 75 нМ до> 1 мкМ (Ackmann et al., 2000; Sun and Gamblin, 2009; Fauquant et al., 2011). Одним из возможных объяснений вариации является то, что сила Tau-MT-взаимодействий зависит от [Tau]. Действительно, такую ​​зависимость от концентрации можно ожидать от свидетельств Акмана о том, что взаимодействия Тау-Тау могут происходить на поверхности МТ. Существование зависимости концентрации Tau также может объяснить, почему кажущее сродство зависит от метода, поскольку [Tau] поддерживается постоянным в подходе TcMv, но изменяется в подходе TvMc.

Чтобы проверить эту возможность, мы повторили эксперименты на рис. 1, B и C, используя те же два подхода, но с разной концентрацией белков в других идентичных условиях. Когда мы изменили [Tau], используемый в подходе TcMv, мы обнаружили, что кажущееся сходство Tau-MT также изменилось (рис. 1D): в то время как 1 мкМ Tau дало очевидное сродство 0,11 ± 0,02 мкМ (рис. 1B), 2 мкМ и 4 μM Tau дает значения KDapp 1,39 ± 0,35 мкМ и 0,67 ± 0,16 мкМ соответственно (рис. 1D). Предполагается, что изменение кажущейся близости связано с тем, что Тау связывается с Тау на поверхности МТ (Ackmann et al., 2000), но мы были озадачены непоследовательным характером изменения: значение КД, извлеченное из подгонки (т. Е. , кажущаяся сродство ослабевает) от 1 мкМ до 2 мкМ Тау, а затем упала с 2 до 4 мкМ Тау. Также примечательно, что данные для экспериментов 2 и 4 мкМ Тау более переменны, чем данные для 1 мкМ Тау. Хотя эта изменчивость затрудняла соответствие кривых, общие тенденции, наблюдаемые на рисунке 1D, были согласованы во многих экспериментах (рис. 1D и неопубликованные данные). Возможное происхождение этой изменчивости больше обсуждается в основном тексте.

Затем мы изучили, как взаимодействие Tau-MT, измеренное подходом TvMc, зависит от [MT]. Используя уравнение 3, чтобы соответствовать данным и устанавливая N = 1 для консистенции, мы обнаружили, что когда [MT] изменяется от 1 до 0,5 до 0,1 мкМ, измеренный KD изменяется от 2,02 ± 1,03 мкМ до 0,84 ± 0,41 мкМ до 0,10 ± 0,32 мкМ, соответственно (Рис. 1Е). Кроме того, параметр ρ (описанный как похожий на кажущийся KD для взаимодействия Тау-Тау, Ackmann et al., 2000) также изменяется в диапазоне от 6,8 ± 0,37 мкМ при 1 мкМ МТС до 1,06 ± 0,04 мкМ при 0,1 мкМ МТ , Разрешение N изменять не улучшало согласованность извлеченных значений KD или ρ (неопубликованные данные).

Для получения действительных констант диссоциации при использовании стандартных моделей связывания для согласования данных согласования необходимо выполнить несколько предположений. К ним относятся идеи, что: 1) события привязки Тау-МТ являются независимыми и обратимыми, 2) связывание Тау-МТ является единственным значительным взаимодействием, имеющим место в растворе, 3) взаимодействия достигли равновесия и 4) коселиментация Тау с МТ отражает привязку Тау к МТ. Наше наблюдение, что кажущееся сродство зависит от концентрации как Тау, так и МТ, демонстрирует, что по крайней мере одно из этих предположений нарушается, и, следовательно, ни одно из уравнений 1 или уравнение 2, могут быть справедливо применены к данным расчета расстояния Tau-MT. Этот вывод согласуется с выводами Ackmann et al. (2000), который на основании анализа TvMc определил, что взаимодействия Tau-Tau происходят на MT и Eq. 2 недостаточно для описания связывания Tau с MT. Чтобы решить эти проблемы, Акманн и его коллеги изменили формулу. 2 включить термин, который пытается объяснить взаимодействия Тау-Тау на поверхности МТ (уравнение 3). Однако мы обнаруживаем, что даже модифицированное уравнение связи Акмана (уравнение 3) недостаточно для описания поведения связывания Тау-М, поскольку наблюдаемые значения KD и ρ (подразумеваемые константами Ackmann) изменяются с [MT] (рисунок 1E). Одно из объяснений этих наблюдений заключается в том, что еще не учтенное для взаимодействия происходит в анализах связывания Tau-MT. Как обсуждалось в разделе статьи о исследованиях взаимодействий Тау-Тау, мы доказываем, что это дополнительное взаимодействие представляет собой МТ-индуцированное образование нитей типа Туу.

Эта статья была опубликована онлайн перед печатью в MBoC in Press (http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E12-05-0374) 19 октября 2012 года.

Эта работа была поддержана грантом MCB-0951264 Национального научного фонда. Мы благодарим Уильяма Арчера за техническую помощь TEM и сотрудников лаборатории Goodson за проницательные дискуссии.

электронная микроскопия

микротрубочек

числовая апертура

нейрофибриллярный клубок

Tau константа МТ изменялась

просвечивающая электронная микроскопия

Tau изменяет постоянную МП

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *