Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Пассивная иммунизация против пироглутамата-3 амилоида-β снижает нагрузку на бляшку у трансгенных мышей, подобных Альцгеймеру: экспериментальное исследование

Passive Immunization against Pyroglutamate-3 Amyloid-β Reduces Plaque Burden in Alzheimer-Like Transgenic Mice: A Pilot Study
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3702016/

J.L.Frost и B. Liu внесли одинаковый вклад в эту статью.

N-терминально усеченный и модифицированный белок-пироглутамат-3-амилоид-β (pE3-Aβ) присутствует в большинстве, если не во всех, церебральных бляшках и сосудистых амилоидных отложениях при болезни Альцгеймера (AD). pE3-Aβ также обнаружено в AD-подобном трансгенном (tg) мозге мыши, хотя и в меньших количествах, чем общий Aβ. pE3-Aβ противостоит деградации, является нейротоксичным и может выступать в качестве затравки на агрегацию Aβ. Цель: мы стремились определить, удаляет ли pE3-Aβ путем пассивной иммунизации высокоспецифическое моноклональное антитело (mAb), которое влияет на патогенез в мышиной модели амилоидоза Альцгеймера.

Мышам APPswe / PS1ΔE9 tg давали еженедельные внутрибрюшинные инъекции нового mAb против pE3-Aβ (mAb07 / 1) или PBS с 5,8 до 13,8 месяцев (профилактика) или от 23 до 24,7 месяцев (терапевтический). Множественные формы церебрального Aβ были количественно определены патологически и биохимически. Были исследованы глиоз и микрохромное кровотечение.

Хроническая пассивная иммунизация с mAb против pE3-Aβ значительно уменьшала общее осаждение бляшек и, как оказалось, уменьшала глиоз в гиппокампе и мозжечке как в профилактических, так и в терапевтических исследованиях. Нерастворимые уровни Аβ в гомогенатах полупрозрачных тканей не были существенно различны у иммунизированных и контрольных мышей. Микрогемораза не наблюдалась при иммунотерапии против pE3-A.

Селективное удаление pE3-Aβ пониженного общего осаждения бляшек Aβ, предполагающее роль проагрегации или посева для pE3-Aβ.

Болезнь Альцгеймера (AD), наиболее распространенная форма деменции, поражает более 30 миллионов человек во всем мире. Амилоид-β-белок (Aβ) участвует в патогенезе AD [1]. N-концевой усеченный пептид Aβ с пептидом и пироглутаматом, начинающийся с остатка 3 (pE3-Aβ), обилен в порошковых и диффузных отложениях Aβ, а также в сосудистом амилоиде в AD, пресенилин-ассоциированном семейном AD и головном мозге Дауна [2,3, 4,5,6]. pE3-Aβ образуется при удалении первых 2 N-концевых остатков Aβ с последующим циклизацией глутаминилциклазой (QC; isoQC) для превращения третьего остатка глутаминовой кислоты в пироглутамат [7]. Образование пироглутамата делает пептид Aβ более гидрофобным, ускоряя его агрегацию; pE3-Aβ устойчив к деградации, способствуя образованию стабильных нейротоксических агрегатов [8,9,10,11]. Неясно, присутствует ли пептид pE3-Aβ в раннем осаждении налета или если он накапливается позже. Однако сообщалось о корреляции между формами Aβ, подвергнутыми пироглутамату, и тяжести заболевания [12,13,14]. В совокупности эти результаты показывают, что пептид pE3-Aβ играет важную роль в патогенезе AD. Таким образом, N-концевое усечение и модификация делают этот вид пептида превосходной мишенью для иммунизации. Основным преимуществом такой стратегии может быть захват и детоксикация определенной молекулы Aβ без влияния на потенциальную физиологическую функцию полноразмерного Aβ. Здесь мы использовали пассивную иммунизацию, нацеленную на pE3-Aβ у AD-подобных трансгенных (tg) мышей, чтобы определить, влияет ли селективное удаление этого токсического пептида на патогенез AD.

Вестерн-блот-анализ проводили, как описано ранее [15]. Перекрестная реактивность определялась поверхностным плазмонным резонансом с использованием Biacore 3000. Различные пептиды, модифицированные пироглутаматом, ковалентно иммобилизовались на чипах CM5. Связывание с этими пептидами характеризовалось мониторингом ассоциации (540 с) и диссоциацией (540 с) моноклонального антитела mAb07 / 1.

Мыши APPswe / PS1ΔE9 [16], укрывающие человеческие APPswe (K595N / M596L) и PS1ΔE9 (удаление экзона 9), были получены из Jackson Lab (Bar Harbor, Me., USA) и разведены в нашей колонии с мышами C57BL / 6 , Все виды использования животных были одобрены Постоянным комитетом Гарварда по использованию животных и соответствовали всем государственным и федеральным нормам. В этой модели началось осаждение бляшек мозгового вещества и церебральная амилоидная ангиопатия в течение 5-6 месяцев [17].

Было проведено два исследования для мышей APPswe / PS1ΔE9, ориентированных на пол и возраст. Испытание «профилактики» было начато у 5,8-месячных мышей (± 0,38 SEM, анти-pE3-Aβ mAb, n = 6, PBS-контроль, n = 3), на ранней стадии осаждения бляшек и продолжалось 32 недель. «Терапевтическое» исследование было проведено у 23-месячных мышей (± 0,25 SEM, анти-pE3-Aβ, n = 4, PBS-контроль, n = 4) с надежным выделением бляшек Aβ и pE3-Aβ и церебральной амилоидной ангиопатией , и продолжали в течение 7 недель. Мышей вакцинировали еженедельно путем внутрибрюшинной инъекции 200 мкг нового мышиного IgG1 mAb, специфичного для pE3-Aβ [mAb07 / 1; Probiodrug AG, Halle (Saale), Германия] или 100 мкл PBS (в качестве контроля).

Мышей умерщвляли путем ингаляции СО2 через 1 неделю после окончательной иммунизации. Кровь собирали с помощью сердечной пункции с последующей перфузией с 20 мл PBS. Мозг удаляли и разделяли сагитально. Один hemibrain фиксировали в течение 2 часов в 10% нейтральном буферном формалине и обрабатывали для вставки парафина, в то время как другой был заморожен и хранился при -80 ° C для биохимического анализа.

Десятимикрометровые парафиновые секции иммуноблокалировали с использованием метода ABC ELITE (Vector Laboratories, Burlingame, CA, США), как описано ранее [18]. Для иммуногистохимического анализа использовались следующие антитела: анти-CD45 (1: 5000, Serotec, Raleigh, NC, США), анти-Iba-1 (1: 500, Wako Chemicals, Richmond, Va., USA), анти-GFAP (1: 1000, DakoCytomation, Carpinteria, CA, США), кролик поликлональный анти-Aβ R1282 (1: 1000, подарок от D. Selkoe, Boston, Mass., USA) и анти-pE3-Aβ mAb07 / 1 [1 : 1000, подарок от Probiodrug AG, Галле (Заале), Германия]. Однофазный водный тиофлавин S (Sigma Aldrich, St. Louis, Mo., USA) использовали для визуализации фибриллярного амилоида в бляшках и кровеносных сосудах. Окрашивание гемосидерина с использованием 2% ферроцианида (Sigma) в 2% -ной соляной кислоте использовали для обнаружения микрогеморрагов. Количественную оценку общей иммунореактивности (IR) R1282, окрашивание pE3-Aβ IR и тиофлавина S проводили с использованием анализа изображения BIOQUANT (Nashville, Tenn., USA). Порог обнаружения был постоянным во время анализа. Процентная площадь, занимаемая R1282 IR, pE3-Aβ IR или тиофлавиновым S-мечением во всем гиппокампе и мозжечке, была рассчитана для 3 эквидистантных сагиттальных разрезов на расстоянии 300 мкм на мышь. Сосудистый амилоид оценивали полуколичественно 2 исследователями (слепыми к группе лечения), используя следующие критерии: «0» = нет положительных кровеносных сосудов; ‘1’ = 1-5 положительных кровеносных сосудов; «2» = 6-10 положительных кровеносных сосудов, а «3» = 11 или более положительных кровеносных сосудов.

Замороженные целые полусферы гомогенизировали в 5 объемах забуференного Трисом соляного раствора, содержащего коктейль ингибитора протеазы (Roche, Indianapolis, Ind., USA). Гомогенаты центрифугировали при 175000 г в течение 30 мин при 4 ° С. Трис-буферный солевой раствор ресуспендировали в 10 объемах гуанидинового буфера (5 М гуанидина HCl, 50 мМ Трис, рН 8,0). Образцы смешивали в течение 4 ч при комнатной температуре и хранили при -20 ° С. Aβ (x-42) и pE-Aβ (3-42) количественно определяли, как описано ранее [19], с использованием коммерческих наборов ELISA (IBL, Гамбург, Германия).

Тест Mann-Whitney U (программное обеспечение Prism 4.0, GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США) использовался для сравнения результатов иммунизированных и контрольных мышей PBS. Значительные различия были определены как p <0,05.

Специфичность антитела mAb07 / 1 оценивали комбинацией анализа вестерн-блоттинга и поверхностного плазмонного резонанса (рис.1). Антитело не проявляло перекрестной реактивности с полноразмерным Aβ (1-x) или усеченным, нециклизированным Aβ (3-x) в Вестерн-блот-анализе. Более того, нейропептиды или гормоны, модифицированные пироглутаматом, не были распознаны mAb07 / 1, что указывает на очень высокую специфичность молекулы без потенциала побочных эффектов. Для иммунизации антитело очищали из культур клеток гибридомы мыши и затем стерильно фильтровали в PBS. Диапазон концентрации для инъекций составлял 2-2,5 мг / мл.

Отложение Aβ начинается в гиппокампе, неокортексе и мозжечке через 5-6 месяцев у мышей APPswe / PS1ΔE9 и увеличивается с возрастом [17]. К 6 месяцам небольшое подмножество преимущественно уплотненных бляшек содержит pE3-Aβ; это подмножество увеличивается с возрастом пропорционально общему отложению Aβ (данные не показаны). В этом исследовании мышей иммунизировали еженедельно высокоспецифичным анти-pE3-Aβ mAb07 / 1, начиная с 5,8 месяцев, на ранних стадиях отложения Aβ. После 32 недель вакцинации общее отложение Aβ (включая бляшки и церебральную амилоидную ангиопатию) было снижено в гиппокампе и мозжечке у приблизительно 14-месячных обработанных мышей по сравнению с контрольными PBS с учетом возраста и пола (таблица 1, рис.2 ). В гиппокампе pE3-Aβ и общий Aβ (R1282) IR были снижены на 35% (p = 0,04) и 18% (p = 0,01) соответственно, тогда как фиолетовый амилоид с тиофлавином-S был снижен на 50% (p = 0,02) у иммунизированных мышей при нормировании на контроль PBS. В мозжечке pE3-Aβ и общий Aβ IR были снижены на 76% (p = 0,0004) и 52% (p = 0,005) соответственно, в то время как тиофлавин-S-позитивный фибриллярный амилоид был на 43% меньше (p = 0,13, ns ) у иммунизированных мышей при нормализации к контрольным мышам PBS. Абсолютные значения, перечисленные в таблице 1, сильно свидетельствуют о том, что пассивная иммунизация против pE3-Aβ уменьшилась больше, чем pE3-Aβ. Например, абсолютное снижение 2,4% в общем случае Aβ (R1282) IR наблюдалось в гиппокампе, тогда как абсолютное количество pE3-Aβ в контрольной группе PBS было намного ниже (0,61%, таблица 1). Аналогичные сокращения наблюдались в коре, но не были количественно определены (данные не показаны). Полуколичественный анализ сосудистого амилоида (набрал 0-3) был сходным в гиппокампе между контролем PBS и вакцинированными pE3-Aβ мышами (R1282: 0,89 ± 0,11 SEM против 0,59 ± 0,12, p = 0,11, pE3-Aβ: 0 против 0 , p = ns). В мозжечке сосудистый амилоид был снижен путем вакцинации (R1282: 2,11 ± 0,26 против 1,47 ± 0,15, p = 0,03, pE3-Aβ: 0,33 ± 0,17 против 0,17 ± 0,09, p = 0,24). Микрогеморрагии отсутствовали в обеих группах приблизительно 14-месячных мышей.

Никаких существенных различий между иммунизированными и контрольными мышами не наблюдалось в уровнях pE-Aβ (3-42) и Aβ (x-42) в гуанидиновых HCl-экстрагированных гомогенатах полубокса; pE-Aβ (3-42) составляла приблизительно 0,2% от Aβ (x-42). Микролиоз (Iba-1 и CD45 IR) и астроцитоз (GFAP IR), по-видимому, ослабляются у иммунизированных мышей по сравнению с контрольными PBS.

Двадцати трехмесячные мыши, несущие табличку APPswe / PS1ΔE9, пассивно иммунизировали еженедельно в течение 7 недель. Процентные области, занятые общим Aβ IR и pE3-Aβ IR, соответственно, были выше у 24,7-месячных против 14-месячных контрольных мышей PBS в конце каждого исследования, особенно в мозжечке (данные не показаны) , В целом, терапевтическая пассивная анти-pE3-Aβ-иммунизация уменьшала как общий Aβ, так и pE3-Aβ IR (таблица 1, рис.3), аналогичные сокращениям, наблюдаемым в профилактическом исследовании. В гиппокампе pE3-Aβ и общий Aβ (R1282) IR были снижены на 34% (ns) и 25% (p = 0,03) соответственно, в то время как тиофлавин-S-позитивный фибриллярный амилоид был снижен на 49% (p = 0,04 ) у иммунизированных мышей при нормализации к контрольным мышам PBS. В мозжечке pE3-Aβ и общий Aβ IR были снижены на 41% (p = 0,03) и 62% (p = 0,0005) соответственно, тогда как тиофлавин S-амилоид был снижен на 38% (p = 0,06, тренд) при иммунизации мышей при нормировании на контрольные мыши PBS. Хотя мы измеряли общее осаждение, снижение нагрузки на бляшку объясняло большинство различий в иммунизации по сравнению с контрольными мышами; сосудистые амилоидные отложения не изменялись относительно контрольных мышей, прошедших возраст. Полуколичественный анализ сосудистого амилоида (набрал 0-3) был сходным в гиппокампе между контролем PBS и вакцинированными pE3-Aβ мышами (R1282: 0,83 ± 0,11 SEM против 0,75 ± 0,13, p = 0,37, pE3-Aβ: 0,83 ± 0,17 против 0,75 ± 0,13, p = 0,41). В мозжечке сосудистый амилоид был снижен путем вакцинации (R1282: 2,5 ± 0,19 против 2,5 ± 0,15, p = 0,44, pE3-Aβ: 1,83 ± 0,21 против 1,83 ± 0,17, p = 0,49). Микрогеморрагии не наблюдались ни у иммунизированных, ни у контрольных мышей в возрасте 24,7 месяцев.

Биохимические уровни Aβ (x-42) и pE-Aβ (3-42) были слегка уменьшены при иммунизации, но не достигли значимости (данные не показаны). Как и в профилактическом исследовании, микролиоз и астроцитоз оказались ниже у иммунизированных мышей по сравнению с контрольными мышами PBS, возможно, отражая снижение бляшки.

У мышей APPswe / PS1ΔE9 наблюдалось увеличение осаждения общего Aβ, pE3-Aβ и фибриллярного амилоида в коре, гиппокампе и мозжечке со старением (т.е. примерно от 14 до 24,7 месяцев), хотя pE3-Aβ был обнаружен в значительно более низких количествах в обоих возрастных группах по сравнению с общим Aβ. В этом пилотном исследовании, используя небольшое количество мышей на группу, пассивная иммунизация с высокоспецифическим mAb против pE3-Aβ уменьшала все 3 типа отложений в гиппокампе и мозжечке как в профилактическом исследовании, начатом на ранней стадии осаждения бляшек и в терапевтическом исследовании, начатом у старых мышей с устойчивым отложением Aβ и глиозом. Процент снижения количества бляшек был аналогичен профилактике и терапевтическому испытанию, хотя абсолютный уровень осаждения бляшек был выше у старых мышей. Однако даже в терапевтическом исследовании абсолютное количество общих Aβ и фибриллярных амилоидных отложений было уменьшено за пределы ожидаемого от клиренса отложений pE3-Aβ, как показано в таблице 1, что указывает на то, что удаление pE3-Aβ может предотвратить образование новых бляшек. В обоих исследованиях снижение содержания Aβ в mAb pE3-Aβ было больше в мозжечке, чем гиппокамп (и коры, данные не показаны). Это может быть обусловлено, в частности, более низким содержанием Aβ-осаждения в мозжечке по сравнению с гиппокампом и корой. Возможно, осаждение бляшек в мозжечке появляется позже или антитела имеют больший доступ к мозжечку, чем другие области мозга. Однако до сих пор неясно, почему биохимические измерения уровней нерастворимого Aβ (x-42) и pE-Aβ (3-42) не отражают количественных иммуногистохимических результатов. Потенциальные причины состоят в том, что гомогенаты были получены из целых гемибринов, но патологический анализ проводился на небольших участках мозга в тонких срезах, то есть с использованием в общей сложности 3 эквидистантных разделов мозга на мышь. Кроме того, в иммуногистохимических и ELISA-анализах использовались различные антитела, которые, возможно, способствовали обнаруженному расхождению. Например, используемые ELISA количественно определяют Aβ (x-42) и pE-Aβ (3-42), включая низкие уровни фрагментов P3, но не Aβ, заканчивающиеся на остаток 40. Иммуногистохимия была выполнена с использованием R1282 pAb, которая обнаруживает общие Aβ и mAb07 / 1 (специфичный для Aβ, начинающийся с пироглутамата у остатка 3), оба из которых обнаруживают Aβ, заканчивающийся на остатках 40 и 42. Наконец, многоанимальная изменчивость и небольшое количество животных, используемых в этих предварительных исследованиях, возможно, сыграли свою роль.

В целом, наши результаты подтверждают и распространяют опубликованные недавно Виртс и др. [20], в котором 6 недель пассивной иммунизации с их IgG2b pE3-Aβ-олигомер-специфическим mAb, 9D5, приводили к уменьшению уровней Aβ и бляшки мозга и улучшали эффективность теста повышенного плюс лабиринта для беспокойства в четырех 4,5- старых 5XFAD tg мышей по сравнению с 4 контрольными мышами. В настоящее время разрабатываются планы изучения эффектов пассивной иммунизации с использованием анти-pE3-Aβ mAb07 / 1, используемого в нашем исследовании (который распознает мономерный, олигомерный и фибриллярный pE3-Aβ) при познании, а также патогенез AD в большой когорте AD-подобные tg-мыши.

Каковы последствия этих исследований? Селективное удаление пептидов pE3-Aβ, особенно в начале патогенеза AD, может снизить осаждение pE3-Aβ, общего Aβ и фибриллярного амилоида, поскольку pE3-Aβ может играть роль в агрегации и / или осаждении нескольких видов Aβ в головном мозге , Таким образом, избирательное нацеливание этого особо токсичного вида Aβ путем иммунотерапии может быть эффективным способом профилактики или лечения АД у людей, у которых pE3-Aβ IR присутствует в большинстве, если не во всех, церебральных Aβ-отложениях.

Характеристика pE3-Aβ mAb07 / 1. вестерн-блоттинг Aβ (1-40), Aβ (3-40) и pE3-Aβ (3-40), обнаруженный с mAb07 / 1 или mAb6E10. Пептиды (по 20 нг каждый) отделяли в гелях, содержащих 8 М мочевины. MAb против pE3-Aβ не обнаруживает усеченного предшественника или полной длины Aβ. b Анализ связывания антитела с использованием поверхностного плазмонного резонанса. Пептиды ковалентно связаны и антитело применяют в буферном растворе. Значительное связывание mAb07 / 1 наблюдалось только при иммобилизации pE3-Aβ (3-40) на поверхности. Другие анализируемые пептиды: MCP-1 и 2; гастрин; ГнРГ; нейротензин; орексин; ТРГ; N-конец коллагена и фибронектин.

В профилактическом исследовании, начатом на ранней стадии осаждения бляшек, еженедельная пассивная иммунизация мышей APPswe / PS1ΔlE9 с mAb07 / 1 против pE3-Aβ с 5,8 до 13,8 месяцев значительно снижала pE3-Aβ, а также общую Aβ (R1282 IR ) и фибриллярного амилоида (тиофлавин S) в гиппокампе (a, b) и мозжечке (c, d) по сравнению с таковым у контрольных мышей PBS. Иммуногистохимические результаты (a, c) и маркирование тиофлавина S определяли количественно с помощью анализа изображения (b, d). Абсолютные значения приведены в таблице 1. Шкала шкалы, 200 мкм. p: * p> 0,05; ** p> 0,01; *** p> 0,001; не уточнено = неважно (р = 0,089).

В терапевтическом исследовании, начатом после начала осаждения и глиоза головного мозга A, недельная пассивная иммунизация с mAb07 / 1 против pE3-Aβ mAb07 / 1 у 23-месячных мышей APPswe / PS1ΔE9 в течение 7 недель приводила к ослаблению pE3-Aβ и общего Aβ (R1282 IR), а также фибриллярный амилоид (тиофлавин S) в гиппокампе (a, b) и мозжечке (c, d) по сравнению с контрольными мышами PBS. Иммуногистохимические результаты (a, c) и маркирование тиофлавина S определяли количественно с помощью анализа изображения (b, d). Абсолютные значения приведены в таблице 1. Шкала шкалы, 200 мкм. p: * p> 0,05; *** p> 0,001; не уточнено = несущественный (p = 0,11); p = 0,06 (сильный тренд).

Абсолютные значения процентной маркировки в интересующей области

Процентное сокращение, нормированное на среднее значение PBS.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *