Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Клеточная фабрика Bacillus subtilis спроектирована для простой биоконверсии мио-инозита в scyllo-inositol, потенциальном терапевтическом агенте для болезни Альцгеймера

A cell factory of Bacillus subtilis engineered for the simple bioconversion of myo-inositol to scyllo-inositol, a potential therapeutic agent for Alzheimer's disease
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3176187/

Стереоизомер инозита, scyllo-inositol, известен как перспективный терапевтический агент для болезни Альцгеймера, поскольку он предотвращает накопление бета-амилоидных отложений, отличительной чертой болезни. Однако это соединение относительно редка в природе, тогда как другой стереоизомер инозита, мио-инозита, доступен в изобилии.

Bacillus subtilis обладает уникальным метаболизмом инозита, включающим оба стереоизомера. Мы манипулировали метаболизмом инозита в B. subtilis, чтобы позволить возможную биоконверсию из мио-инозита в scyllo-inositol. В течение 48 ч культивирования сконструированный штамм способен превращать почти половину 10 г / л мио-инозита в scyllo-inositol, который накапливается в культуральной среде.

Разработанный B. subtilis служит прототипом клеточной фабрики, позволяющей создать новую и недорогую поставку scyllo-inositol.

Болезнь Альцгеймера является одной из наиболее распространенных и проблемных форм деменции [1]. В 2006 году 26,6 миллиона человек страдали от болезни Альцгеймера во всем мире, и к 2050 году болезнь, как прогнозируется, увеличится, что затронет 1 из каждых 85 человек [2]. Сотни клинических исследований были проведены для выявления возможных стратегий лечения этого заболевания, но, несмотря на эти усилия, не было найдено многообещающей стратегии. В настоящее время большинство используемых в настоящее время стратегий лечения предлагают лишь небольшую симптоматическую выгоду, и на самом деле никакого лечения не существует, чтобы остановить прогрессирование заболевания.

Инозитол (1,2,3,4,5,6-циклогексангексол) имеет девять возможных стереоизомеров из-за эпимеризации шести гидроксильных групп. Наиболее распространенным стереоизомером является мио-инозитол (соединение 1, рис. 1), который является структурной основой для ряда вторичных мессенджеров в эукариотических клетках [3]. В растениях мио-инозитол гексакисфосфат или фитиновая кислота часто встречается в злаках с высоким содержанием бран, которые служат основной формой фосфата. Это основной промышленный источник мио-инозита [4]. Другие стереоизомеры инозитола относительно редки в природе, но некоторые из них оказывают специфическую деятельность, способствующую укреплению здоровья. D-chiro-inositol (соединение 2) полезен для пациентов с гипергликемией и синдромом поликистозных яичников, поскольку он восстанавливает чувствительность к инсулину [5] и восстанавливает нормальную овуляцию [6] соответственно. Накопленные данные показывают, что другой изомер, scyllo-inositol (соединение 3), обладает исключительным потенциалом в качестве терапевтического агента для болезни Альцгеймера [7].

Инозитольный обмен в B. subtilis. Показаны гены B. subtilis iol, кодирующие ферменты для реакций в катаболическом пути инозита и соответствующие промежуточные соединения. Промежуточные соединения представляют собой мио-инозитол (соединение 1), D-хиро-инозитол (соединение 2), scyllo-инозитол I (соединение 3), scyllo-inosose (соединение 4), 1-кето-D-хиро-инозит (соединение 5), 3D- (3,5 / 4) -тригидроксициклогексан-1,2-дион (соединение 6), 5-дезокси-D-глюкуронова кислота (соединение 7), 2-дезокси-5-кето-D-глюконова кислота (соединение 8), 6-фосфат 2-дезокси-5-кето-D-глюконовой кислоты (соединение 9), дигидроксиацетонфосфат (соединение 10), малоновый полуальдегид (соединение 11) и ацетил-СоА (соединение 12).

scyllo-Inositol иногда встречается в растениях и также естественным образом встречается в человеческом мозге как незначительное вещество, которое легко пересекает гематоэнцефалический барьер [8]. Агрегация бета-амилоидного пептида в клетках головного мозга является ключевым патологическим признаком болезни Альцгеймера [9]. scyllo-Inositol непосредственно взаимодействует с бета-амилоидным пептидом и блокирует развитие волокон, уменьшает дефицит памяти и другие симптомы, связанные с накоплением бета-амилоидов [10,11]. Кроме того, было показано, что мышам, которым кормили scyllo-inositol, были уменьшены симптомы заболевания с лучшей когнитивной функцией и большей долговечностью, поскольку амилоидные бляшки исчезли, а воспаление уменьшилось. scyllo-Inositol дает эти преимущества не только у очень молодых безболезненных мышей, но также у больных мышей [7]. Таким образом, scyllo-inositol получил ускоренное обозначение от Управления по контролю за продуктами и лекарствами США для лечения болезни Альцгеймера от легкой до умеренной степени и получил патент США в 2009 году [12]. Были опубликованы клинические испытания фазы 2 для лечения сквайло-инозитолом с положительными результатами, и были объявлены планы испытаний фазы 3 [13].

Bacillus subtilis является одним из наиболее изученных грамположительных бактерий, а его уникальный метаболизм инозита включает в себя по меньшей мере три стереоизомера, мио-инозита, scyllo-инозита и D-чиро-инозита (рис. 1) [14]. Оперон B. subtilis iolABCDEFGHIJ кодирует ферменты, участвующие в множественных стадиях метаболизма инозита [15]. На первой стадии мио-инозитол превращают в scyllo-inosose (соединение 4, рис. 1) с помощью мио-инозитолдегидрогеназы, IolG, с уменьшением NAD +. IOLG также дегидрирует D-хиро-инозитол в 1-кето-D-хиро-инозитол (соединение 5), который затем изомеризуется IolI в scyllo-inosose [16]. На второй стадии scyllo-inosose обезвоживается IOLE до 3D- (3,5 / 4) -тригидроксициклогексан-1,2-диона (соединение 6) [17]. На третьей стадии IolD катализирует гидролиз 3D- (3,5 / 4) -тригидроксициклогексан-1,2-диона с получением 5-дезокси-D-глюкуроновой кислоты (соединение 7). На следующей стадии IolB катализирует изомеризацию 5-дезокси-D-глюкуроновой кислоты в 2-дезокси-5-кето-D-глюконовую кислоту (соединение 8), которая затем фосфорилируется с помощью IolC-киназы до 2-дезокси-5- кето-D-глюконовой кислоты 6-фосфат (соединение 9) [18]. 6-фосфат 2-дезокси-5-кето-D-глюконовой кислоты является промежуточным продуктом, который действует как индуктор путем антагонистического связывания ДНК IoIR, репрессора, контролирующего транскрипцию ионового оперона [19]. Наконец, IOLJ альдолаза катализирует превращение 6-фосфата 2-дезокси-5-кето-D-глюконовой кислоты в дигидроксиацетонфосфат (соединение 10) и малоновый полуальдегид (соединение 11). Первый представляет собой гликолитическое промежуточное соединение, и последний превращается в ацетил-СоА (соединение 12), который входит в цикл трикарбоновой кислоты и СО2 с помощью реакции Иола.

B. subtilis обладает двумя дополнительными и отчетливыми инозитолдегидрогеназами, IolX и IOLW, которые специфически действуют на scyllo-inositol с уменьшением NAD + и NADP + соответственно [14]. Каждый из этих ферментов преобразует ссилолозитол в scyllo-inosose, который является тем же самым соединением, полученным из мио-инозита IOLG, и далее легко деградирует через описанный выше метаболический путь [18]. Транскрипция iolX индуцируется после добавления scyllo-inositol в среду для роста клеток, и его инактивация ингибирует рост клеток в присутствии scyllo-inositol в качестве источника углерода, что указывает на то, что IolX может функционировать физиологически как катаболический фермент [14]. Напротив, транскрипция yolW является конститутивной и ее инактивация не изменяет рост клеток в присутствии scyllo-inositol. В нашем предыдущем исследовании было показано, что IOLW может генерировать scyllo-inositol из scyllo-inosose с окислением NADPH, хотя его физиологическая роль остается неопределенной [14].

В этом исследовании мы манипулировали метаболизмом инозита у B. subtilis для контроля взаимопревращения среди стереоизомеров инозитола, секретируемых в культуральную среду, что позволяло простой и недорогой биоконверсии мио-инозита в scyllo-inositol. Разработанный B. subtilis олицетворял концепцию нашей клеточной фабрики для производства scyllo-inositol.

Ранее мы продемонстрировали, что штамм B. subtilis YF256 (таблица 1) способен к биоконверсии мио-инозита в D-чиро-инозитол [16]. Из-за инактивации iolR [19] штамм YF256 конститутивно экспрессирует iolG, iolE41 и iolI. Пропущенный мутантный аллель iolE41 отменяет активность дегидратазы IolE, что приводит к внутриклеточному накоплению scyllo-inosose из мио-инозита из-за реакции IolG [16]. scyllo-Inosose изомеризуется IolI в 1-кето-D-хиро-инозитол и затем восстанавливается IOLG до D-чиро-инозита; Таким образом, мио-инозитол превращается в D-хиро-инозитол, который затем появляется в среде биоконверсии инозита [16].

Бактериальные штаммы, используемые в этом исследовании.

Вектор интеграции pMutin2 изначально обладает erm-маркером [26], который был заменен маркером tet в TM043, как описано ранее [23].

В этом исследовании мы повторно исследовали среду, в которой штамм YF256 культивировали в течение 24 ч с помощью улучшенной системы GC-TOFMS [20]. Мы были удивлены, обнаружив не только D-чиро-инозитол, но и scyllo-инозитол (рис. 2A), что свидетельствует о том, что наш предыдущий высокоэффективный жидкостной хроматографический анализ не обнаружил сканлоинозитол [16]. Кроме того, этот результат предположил, что часть накопленной scyllo-inosose может быть преобразована в scyllo-inositol, вероятно, с участием IolX и / или IOLW.

Изозитольные стереоизомеры, присутствующие в среде. Штаммы B. subtilis, включая YF256 (A), TM038 (B), TM039 (C), TM040 (D) или TM041 (E), выращивали в биоконверсионной среде инозита, содержащей 2% Bacto soytone. В указанные моменты времени аликвоты культуральной среды подвергали анализу GC-TOFMS, как описано ранее [20], параллельно исходной среде (F) и аутентичным стандартам, как указано (G). Эксперименты повторялись независимо, по крайней мере, три раза с аналогичными результатами, и показывались репрезентативные данные.

Когда iolI был инактивирован (штамм TM038, рисунок 2B), превращение scyllo-inosose в D-chiro-inositol уменьшилось до незначительного уровня, тогда как увеличение scyllo-inositol увеличилось; но лишь незначительно. Эти результаты показали, что мы могли бы устранить метаболический путь для D-чиро-инозита путем инактивации iolI, хотя этого было недостаточно для увеличения превращения в scyllo-inositol. Таким образом, iolX и / или IOLW были инактивированы для изучения их участия в производстве сквилло-инозитола. Когда iolW был функциональным, инактивация iolX сама по себе резко повышала концентрацию scyllo-inositol, присутствующего в среде (штамм TM039, рисунок 2C), что указывает на то, что IolX может деградировать scyllo-inositol. В отличие от этого, IolW был необходим для эффективного производства супралонитола (штаммы TM040 и TM041, рисунок 2D и 2E соответственно). Эти результаты ясно показывают, что IOLW имеет решающее значение для превращения scyllo-inosose в scyllo-inositol.

После 48-часовой культуры штамма TM039 в биоконверсионной среде инозита (рис. 3А) почти половина мио-инозита превращалась в скйло-инозитол. Эта простая биоконверсия была настолько успешной, что она реализовала нашу концепцию клеточной фабрики по производству ссилолозитола с более высоким поступательным потенциалом в отношении выхода и чистоты продукта, чем другие ранее описанные методы [21,22]. Дальнейшая культура привела к потреблению не только мио-инозитола, но и некоторых из scyllo-inositol, и особенно мио-инозитол почти полностью потреблялся через 96 часов культивирования, тогда как scyllo-inositol оставался относительно нетронутым. Результаты предполагали, что мутированный фермент IolE41, который не поддерживает рост клеток с использованием мио-инозита в качестве источника углерода [17], возможно, сохранит некоторый более низкий уровень разрушающей способности скейло-инозус, что привело к уменьшению количества инозитола изомеры; потому что мио-инозитол предпочтительно превращается в scyllo-inosose по реакции IolG, он более явно уменьшался. Хотя у нас нет экспериментальных доказательств для доказательства упомянутой выше возможности, тем не менее, выборочное потребление мио-инозита может быть даже практичным для клеточного завода, делающего продукт scyllo-inositol свободным от значительного заражения мио-инозитолом. Однако, чтобы избежать потерь как материала, так и продукта, будут рассмотрены возможные стратегии прекращения деградации инозитола, в том числе удаление внутри iO в рамке.

Временной ход производства сосново-инозитола и потребления мио-инозита во время биоконверсии инозита наряду с ростом клеток. Биоконверсию из мио-инозита в scyllo-inositol проводили в средах, содержащих 2% (A) или 1% (B) сомонотон Bacto. Представлены данные о оптической плотности клеток (черные бриллианты) и концентрации мио-инозита (черные квадраты) и скуло-инозитола (белые треугольники). Эксперименты повторялись независимо, по крайней мере, три раза с аналогичными результатами, и показаны типичные наборы данных.

В принципе, можно предположить, что реакция IolG обусловлена ​​снижением внутриклеточного отношения NAD + / NADH, тогда как реакция IolW повышает отношение NADP + / NADPH (рисунок 1). Если это действительно так, неизбежная проблема дисбаланса кофактора должна быть вызвана в клетках. Хотя значительно эффективная биоконверсия уже достигнута (рис. 3А), ее можно улучшить, исправив возможный дисбаланс кофактора в данных условиях. Интересно отметить, что когда основное питательное вещество (Bacto soytone), содержащееся в конверсионной среде, было уменьшено наполовину, никакого серьезного влияния на рост клеток не наблюдалось, тем не менее было значительно снижено производство только соллинозитола, в то время как мио-инозитол потреблялся почти полностью (рисунок 3B ). Результаты предполагают, что могут быть некоторые пищевые и / или метаболические факторы, ограничивающие биоконверсию, которые должны быть идентифицированы, а затем контролироваться в следующем поколении реалистичных клеточных фабрик с оптимизированной эффективностью в производстве scyllo-inositol.

Было продемонстрировано, что B. subtilis обладает двумя различными переносчиками инозитола, IolT и IolF, которые отличаются субстратной специфичностью к мио-инозитолу и D-чиро-инозитолу [23]. Наши предварительные наблюдения предполагали, что перенос scyllo-inositol в клетки может в основном зависеть от IolT, который аналогичен мио-инозитолу (данные не показаны), и избыточная экспрессия iolT может быть неэффективной для улучшения эффективности преобразования. Однако еще не объяснено, как стереоизомеры инозитола секретируются в среду после конверсии; поэтому мы предполагаем участие неизвестного эффлюкционного насоса, который также в настоящее время исследуется как одна из возможных целей, которые должны быть спроектированы.

B. subtilis — одна из лучших изученных грамположительных бактерий. Его уникальный метаболизм инозита был полностью выяснен, чтобы включать в себя по меньшей мере три стереоизомера инозита, включая ссилолозитол и мио-инозит. Наши предыдущие знания и результаты предполагали возможное взаимопревращение между стереоизомерами. Таким образом, мы манипулировали метаболическим путем, чтобы реализовать концепцию клеточной фабрики, позволяющую простой и недорогой биоконверсии мио-инозита к scyllo-inositol, который является перспективным терапевтическим средством для болезни Альцгеймера.

Бактериальные штаммы, используемые в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Ген iolI штамма YF256 инактивируется путем вставки кассеты с резистентностью к спектиномицину (spc) следующим образом. Фрагмент ДНК, несущий кассету spc, амплифицировали из ДНК штамма FU341 [24] с помощью ПЦР с использованием пары праймеров IolI3F и IolI4R (таблица 2). Кроме того, два фрагмента ДНК, соответствующие верхним и нижестоящим областям iolI, амплифицировали из ДНК штамма 60015 с помощью ПЦР с использованием пар праймеров IolI1F / IolI2R и IolI5F / Iol6R соответственно (таблица 2). 5′-концевые последовательности IolI3F и Iol4R были комплементарны IolI2R и IolI5F соответственно. Три фрагмента ПЦР смешивали и лигировали с использованием ПЦР, выполненной с наружной праймерной парой IolIF1 / Iol6R. Полученный ПЦР-фрагмент использовали для трансформации штамма YF256 для получения штамма TM038 со стойкостью к спектиномицину (iolI :: spc; таблица 1).

Олигонуклеотидные праймеры, используемые в этом исследовании

Штамм TM038 трансформировали ДНК штамма BFS3018 [14], чтобы получить штамм TM039 с резистентностью к эритромицину (iolX :: pMutin4 (erm), таблица 1) и ДНК штамма TM043 [14], чтобы получить штамм TM040 с устойчивостью к тетрациклину (iolW :: pMutin2 (erm :: tet), таблица 1). Штамм TM040 дополнительно трансформировали ДНК штамма BFS3018 для получения штамма TM041 с резистентностью к эритромицину (iolW :: pMutin2 (erm :: tet) iolX :: pMutin4 (erm), таблица 1).

Бактериальные штаммы поддерживались в среде Лурия-Бертани [25]. Для биоконверсии инозита использовали 500-мл колбу Сакагути с дышащей пробкой для пены, содержащую 30 мл среды для биоконверсии инозита, содержащую 2% или 1% (мас. / Об.) Сомонотон Bacto (Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD), 0,5% экстракт дрожжей Bacto (Becton, Dickinson and Co.), 0,5% NaCl и 1% мио-инозита инокулировали одним из штаммов B. subtilis с оптической плотностью 0,05 при 600 нм и инкубировали при 37 ° C со встряхиванием при 150 об / мин.

После биоконверсии аликвоты культуральной среды подвергали анализу газовой хроматографии — времяпролетной масс-спектрометрии (GC-TOFMS), как описано [20], но с некоторыми изменениями следующим образом. После удаления бактериальных клеток путем центрифугирования аликвоту культуральной среды выпаривали в пробирке под вакуумом. Высушенный осадок растворяли в экстракционной смеси воды, хлороформа и метанола (2: 2: 5) и инкубировали при 150 ° С в течение 30 мин при интенсивном встряхивании. После центрифугирования при 40 ° С в течение 3 мин при 16000 г супернатант переносили в другую пробирку и разбавляли соответствующим образом чистой водой. После другого центрифугирования часть надосадочной жидкости полностью высушивали в другой пробирке. Высушенный осадок растворяли и присутствующие в нем вещества дериватизировали с помощью метоксиамина гидрохлорида в пиридине при 30 ° С в течение 90 мин при энергичном встряхивании. После добавления N-метил-N- (триметилсилил) трифторацетамида (GL Science, Токио, Япония) дериватизированные вещества дополнительно инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин и затем инжектировали через автосамплер Agilent 7683B в Agilent 7890A GC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) в сочетании с Pegasus HT TOFMS (Leco Corp., St Joseph, MI) с настройками, описанными в [20]. Идентификацию и количественную оценку пик-деконволюции выполняли с использованием программного пакета Pegasus ChromaTOF ver. 4.21 (Leco Corp.). Коммерчески доступные аутентичные инозитолы были дериватизированы и проанализированы параллельно с экспериментальными образцами. Полученные масс-спектры и время удерживания использовали для идентификации стереоизомеров, а для расчета концентрации стереоизомеров использовались интенсивности ионов.

Содержание этой рукописи имеет отношение к патентной заявке, сделанной Университетом Кобе (PCT / JP2009 / 005782), но все авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Все авторы прочитали и одобрили рукопись. MY, SO и TM в равной степени способствовали экспериментам. ST участвовал в анализе и интерпретации данных. KY разработал и провел этот исследовательский проект в качестве главного исследователя, также отвечающий за подготовку рукописи.

Мы благодарим доктора Томохису Хасунуму, г-на Кадзую Йошимуру и профессора Акихико Кондо за их непременный совет по анализу GC-TOFMS, а также за их постоянную поддержку. Strain BFS3018 был предоставлен Национальным институтом генетики, Япония, в рамках Национального проекта BioResource: E. coli и B. subtilis. Эта работа была частично поддержана KAKENHI (22310130), специальными координационными фондами для содействия развитию науки и техники, созданием инновационных центров для передовых междисциплинарных исследовательских областей и передовой программой исследований и разработок в области низкоуглеродных технологий, MEXT, Япония.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *