Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Хроническая интраназальная терапия анти-Aβ30-42 scFv-антителом улучшает патологию амилоидов в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера

Chronic Intranasal Treatment with an Anti-Aβ30-42 scFv Antibody Ameliorates Amyloid Pathology in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3071717/

Задуманные и разработанные эксперименты: SC RMN. Выполнены эксперименты: SC MH LK. Проанализированы данные: SC MH. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: LK RMN. Написал газету: SC MH LK. Пересмотренная рукопись: MH LK RMN.

Амилоид-бета-пептид (Aβ) -правленные активные и пассивные терапевтические стратегии иммунизации уменьшают уровни Aβ в головном мозге, уменьшают тяжесть бета-амилоидной бляшки и обратные когнитивные дефициты в мышиных моделях болезни Альцгеймера (AD). В качестве альтернативного подхода к пассивной иммунизации с полными молекулами IgG одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) антитела могут модулировать или нейтрализовать связанную с Aβ нейротоксичность и ингибировать ее агрегацию in vitro. В этом исследовании мы охарактеризовали scFv, полученный из полного IgG-антитела, выращенного против С-конца Аβ, и изучили его переход в мозг трансгенных мышей APP, а также его потенциал для уменьшения связанной с Aβ патологии. Мы обнаружили, что scFv вошел в мозг после интраназального применения и что он связан с бета-амилоидными бляшками в коре и гиппокампе трансгенных мышей APP. Кроме того, scFv ингибировал образование фибрила Aβ и Aβ-опосредованную нейротоксичность in vitro. В профилактическом терапевтическом подходе хроническая интраназальная обработка scFv уменьшала конгофильные амилоидные ангиопатии (CAA) и бета-амилоидные числа бляшек в коре мышей APPswe / PS1dE9. Это снижение CAA и патологии бляшек было связано с перераспределением головного мозга Aβ из нерастворимой фракции в растворимый пул пептидов. Из-за их отсутствия эффекторного домена полного IgG scFv может представлять собой альтернативный инструмент для лечения связанной с Aβ патологии без запуска Fc-опосредованных эффекторных функций. Кроме того, наши наблюдения подтверждают возможность того, что Aβ-направленная иммунотерапия может уменьшить осаждение A в сосудах мозга у трансгенных мышей.

Болезнь Альцгеймера (AD) является наиболее распространенной формой деменции у пожилых людей, и число пациентов постоянно увеличивается из-за отсутствия эффективных методов лечения. Поэтому значительные усилия сосредоточены на разработке эффективных методов лечения [1]. AD характеризуется прогрессирующим дефицитом памяти и когнитивными нарушениями. Гистопатологические характеристики — внеклеточные амилоидные отложения и внутриклеточные нейрофибриллярные клубочки. Накопление этих белковых агрегатов сопровождается синаптической дисфункцией, воспалением и, в конечном счете, гибелью нейронов [2]. Широко считается, что генерация β-пептида амилоида (Aβ) из белка предшественника амилоида (APP) путем β- и γ-расщепления с последующей сеятельной агрегацией Aβ является инициирующим событием в патогенезе AD [3], что приводит к устойчивому отложение Aβ в паренхиме головного мозга и сосудах головного мозга [4]. Поскольку агрегаты Aβ являются нейротоксичными, в настоящее время изучаются многочисленные стратегии предотвращения агрегации и накопления Aβ в качестве потенциальных способов лечения или профилактики AD.

Aβ иммунотерапия была впервые введена Schenk et al. [5], который продемонстрировал, что вакцинация с Aβ1-42 и адъювантом Фрейнда не только предотвращала накопление Aβ у более молодых мышей PDAPP, но также очищала ранее существовавшие амилоидные бляшки у пожилых животных. За этим первым исследованием последовало несколько доклинических исследований в различных трансгенных моделях мышей AD, которые подтвердили терапевтический потенциал нацеливания на Aβ путем активной иммунизации или пассивного введения антител против Aβ [5], [6]. Ввиду этих многообещающих результатов вскоре после экспериментов с животными последовало клиническое испытание человека с агрегированным Aβ1-42 и адъювантом QS-21 (исследование Elan / Wyeth AN1792). Фаза I клинических испытаний продемонстрировала очевидную безопасность и переносимость AN1792, что вызвало значительный ответ на антитела к Aβ1-42 [7]. Последующее клиническое исследование II фазы было остановлено из-за асептического менингоэнцефалита у 6% пациентов, получавших лечение [8]. Долгосрочное последующее исследование когорты Цюриха выявило повышенные титры Aβ-специфических антител [9], [10] и замедление когнитивного спада у пациентов, которые ответили на активную вакцину по сравнению с неответчиками [11] , Случаи менингоэнцефалита не коррелировали с наличием или концентрацией антител к Aβ [8], [9], и сейчас считается, что менингоэнцефалит связан с ответом Т-клеток против Aβ [2], [12] , Гистопатологический анализ ткани головного мозга, полученный от отдельных пациентов, умерших от несвязанных причин, выявил бета-амилоидный бляшкообразный клиренс в сочетании с повышенным титром антител, причем некоторые области мозга практически не содержат бета-амилоидных бляшек [1].

Из-за неблагоприятных побочных эффектов активной вакцинации пассивная иммунизация гуманизированными моноклональными антителами против Aβ активно используется в качестве альтернативного подхода [13], [14]. В нескольких исследованиях было показано, что этот терапевтический подход был довольно успешным в улучшении патологии амилоидов, но он также не был свободным от побочных эффектов. Внутримозговое кровоизлияние, связанное с церебральной амилоидной ангиопатией (САА), было увеличено у трансгенных мышей APP, обработанных некоторыми антителами, особенно с связыванием с амилоидными бляшками [15], [16], [17]. Антитело-опосредованные микрогеморраги могут быть связаны с взаимодействием антител против Aβ с сосудистым амилоидом, вызывая структурную хрупкость вырожденных сосудов [17]. Другое возможное объяснение может быть связано с эффекторными функциями Fc, поскольку дегликозилированный IgG без эффекторной функции все еще эффективен при очистке амилоидных бляшек, но имеет значительно уменьшенную способность индуцировать микрогеморрагии у трансгенных мышей [18]. Кроме того, было показано, что терапия антитела может приводить к увеличению воспалительных реакций, опосредованных доменом Fc полных IgG-антител. Более того, Bacskai et al. сообщили, что фрагменты F (ab) 2 также способны удалять бляшки, свидетельствующие о том, что не-Fc-опосредованные механизмы могут участвовать в очистке бета-амилоида пассивной иммунотерапией [19].

Ввиду этих данных одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) IgG, лишенные Fc эффекторного домена, развились как новый и перспективный терапевтический инструмент для лечения AD. ScFvs имеют низкий молекулярный вес менее 30 кДа, что может облегчить их перенос через гематоэнцефалический барьер в мозг. ScFvs состоят из одной полипептидной цепи, содержащей вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH), связанный гибким полипептидным линкером с вариабельным доменом легкой цепи (VL) [20], [21], [22]. Эта конструкция может быть легко выражена в E. coli [23], что делает рендеринг scFv эффективным и экономичным. Предыдущие исследования in vitro показали, что scFv способны ингибировать агрегацию Aβ1-42 и предотвращать индуцированную Aβ нейротоксичность [24], [25], [26], [27], [28]. Кроме того, два исследования in vivo показали, что scFv может улучшать патологию амилоидов после стереотаксической инъекции в гиппокамп и кору головных у мышей Tg2576 [29] или после внутричерепной адено-ассоциированной опосредованной вирусом доставки scFv против пан-амилоида-бета у мышей TgCRND8 [30].

Основываясь на нашем предыдущем нахождении, что полный IgG 22C4, направленный против С-конца очищенного амилата головного мозга Aβ, мы проверили, сохранил ли этот фрагмент антитела из 22C4 IgG эту активность [31], [32]. Поэтому мы охарактеризовали scFv, сгенерированный путем прививки областей, определяющих комплементарность (CDR) доменов VH и VL 22C4 IgG в каркас scFv человека. Полученный 22S4 scFv экспрессировали в E. coli и характеризовали его характеристиками связывания и его потенциалом для ингибирования агрегации Aβ и предотвращения нейротоксичности, вызванной Aβ. Наконец, мы обработали 8-месячный APPswe / PS1dE9 в интраназально с 22C4 scFv, полный IgG 22C4 и контролер транспортного средства, чтобы оценить эффективность in vivo 22C4 scFv для улучшения бета-амилоидной патологии. Поскольку scFv имеет очень короткий период полувыведения после системного применения из-за клубочковой фильтрации, мы выбрали интраназальное применение в качестве маршрута доставки. Известно, что пептиды быстро проникают в мозг через носовой путь, таким образом, обходя гематоэнцефалический барьер и почечную экскрецию [33], [34], [35], хотя точные транспортные пути и механизмы этого способа доставки дата еще не полностью понята [36], [37], [38], [39], [40].

22C4 scFv представляет собой одноцепочечное антитело (scFv), исходящее из Aβ-специфического IgG1-антитела IgG1 мыши 22C4, которое было получено путем иммунизации мышей Aβ30-42. Поэтому и 22C4 IgG, и 22C4 scFv направлены против С-конца Aβ.

Домены VL и VH клонировали как опубликованные ранее [20], [21], [23]. Вкратце, мРНК была получена из клеток гибридомы, продуцирующих антитело 22C4. Для амплификации доменов VL и VH проводили RT-PCR с использованием праймеров, описанных Burmester и Plückthun. Эти два домена были собраны с помощью SOE-PCR (сращивание путем расширения перекрытия). Усиленный scFv-фрагмент расщепляли SfiI, клонировали в вектор экспрессии pTFT74 и секвенировали. Полученное антитело мышиного scFv сохраняло свою специфичность для Aβ1-42. Гуманизацию scFv осуществляли путем прививки CDR VL и VH-доменов в рамки scFv человека, что приводило к одноцепочечному антителу 22C4 scFv. Для контроля scFv Fw 2.3 случайные CDR были привиты в аналогичную структуру, которая в обоих случаях несет 5xHis-Tag и FLAG-Tag для очистки и обнаружения.

Плазмиды, кодирующие scFv 22C4 и контрольные scFv, вводили в BL21 (DE3) E. coli и экспрессировали в качестве включенных тел. Функциональные одноцепочечные антитела были получены путем рефолдинга из тел включения, диализа и последующей очистки с помощью гель-фильтрации над колонкой Superdex S75 16/60 (GE Healthcare), которая была подключена к системе Äkta Basic FPLC (GE Healthcare). Изготовление scFv 22C4 и контроль scFv проводили в ESBATech, Шлирен, Швейцария.

Точную массу 22C4 scFv определяли с помощью масс-спектрометрии с использованием электроплазма в сотрудничестве с Центром функциональной геномики (Цюрихский университет). 22C4 scFv очищали и измеряли в 50% ацетонитриле / 0,2% муравьиной кислоте (pH 2). Масс-спектры (нейтральная масса) деконволюлировались с использованием программного обеспечения MaxEnt1.

Средняя точка денатурации 22C4 scFv определялась в исследовании термической стабильности, измеряющем спектр преобразования Фурье-инфракрасный (FT-IR) с использованием Bio-ATR-ячейки на спектрометре Bruker Tensor 27. Проводили температурный скачок в диапазоне от 25 до 95 ° С с концентрацией scCv 22C4 5 мг / мл. 22C4 scFv оставляли для уравновешивания при каждой температуре в течение 1-2 минут до измерения спектра.

Хроматографию исключения по размеру (SEC) проводили для проверки специфического связывания 22C4 scFv с Aβ1-42, который должен элюироваться как один пик, что указывает на элюирование Aβ1-42 и 22C4 scFv, тогда как отсутствие связывания приведет к двум различным пикам в профиль элюции. Для этой цели FITC-Aβ1-42 (Bachem, Bubendorf, Switzerland) и 22C4 scFv или контрольный scFv предварительно инкубировали при эквимолярных концентрациях (1 мкМ) в разных условиях (температура и время), что привело к такому же результату. Гель-фильтрацию проводили на колонке Superdex 75 10/300 (GE Healthcare, Мюнхен, Германия), которая была подключена к Äkta Basic FPLC System (GE Healthcare). 150 мкл каждого анализа вводили в колонку и элюировали фильтрованым и дегазированным TBS (рН 7,4). Образцы были обнаружены с помощью УФ-поглощения (495 нм и 215 нм) при скорости потока 0,75 мл / мин.

BioLayer Interferometry (BLI) — технология без метки для измерения биомолекулярных взаимодействий. Это оптический аналитический метод, позволяющий анализировать интерференционную картину белого света, отраженного от двух поверхностей: слой иммобилизованного белка на наконечнике биосенсора и внутренний опорный слой. Изменение количества молекул, связанных с наконечником биосенсора, вызывает сдвиг интерференционной картины. Только молекулы, связывающиеся с кончиком биосенсора или диссоциирующие, могут смещать шаблон и, таким образом, генерировать профиль ответа в системе Octet Q (ForteBio Inc., Menlo Park, CA). Анализы измеряли в 96-луночном формате, где наконечник биосенсора перемещали из скважины в скважину для инкубации. Для предварительного равновесия наконечник биосенсора, покрытый стрептавидином, инкубировали в PBS (рН 7,4) в течение 300 с, затем кончик загружали биотинилированным Aβ1-42 (250 нМ в PBS, pH 7,4) в течение 400 с. После промывания кончика в течение 600 с в PBS (рН 7,4) проводили стадию ассоциации с 22C4 scFv (200 нМ, 125 нМ, 75 нМ, 50 нМ в PBS) или 22C4 IgG (50 нМ в PBS) в течение 2100 с с последующей стадией диссоциации в течение 2100 с в PBS. Анализы анализировали и дополняли Octet Software 4.0 (ForteBio Inc.).

Клетки человека эмбриональной почки 293 (HEK293T) (стандарты LGC — ATCC, Molsheim Cedex, Франция) культивировали в минимальной основной среде Дульбекко (DMEM), дополненной 10% FCS, 2 мМ L-глутамином, HEPES и пенициллином / стрептомицином в увлажненной атмосфере 5% СО2 при 37 ° С. Клетки высевали на четырехкамерные культуральные слайды (BD Biosciences, Bedford, MA), покрытые фибронектином (Sigma, St. Louis, MO) с плотностью 10000 клеток / лунку за 24 часа до трансфекции с помощью конструкции, содержащей APR-цитрин. Спустя 24 ч клетки инкубировали в течение 30 мин при 4 ° С с антителом 6Е10 (Covance Inc., Princeton, NJ), 22C4 scFv, 22C4 IgG и соответствующими контрольными средствами (Fw 2,3, 2H6C2, все 1:100). После анализа связывания клетки промывали TBS (рН 7,4) и фиксировали 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре. Для иммуноцитохимии клетки окрашивали o / n при 4 ° С кроличьим анти-His поликлональным антителом (1:500 Abcam, Cambridge, MA) в случае 22C4 scFv и контрольной scFv, после чего детектировали с помощью кролика Cy3 антитело (1:000). 6E10, 22C4 IgG и 2H6C2 были обнаружены непосредственно антителом против мышиного Cy3 (1:000). Слайды инкубировали со вторичным антителом в течение 2 ч при комнатной температуре. Все этапы промывки проводили с TBS / 0,05% Triton X-100.

Рекомбинантный пептид Aβ1-42 получали в виде ультрачистой пленки HFIP из rPeptide (Bogart, GA) и воссоздавали в HFIP, который выпаривали с постоянным потоком азота. Затем пептид снова ресуспендировали в HFIP и аликвотировали в Protein LoBind Tubes (Eppendorf). Снова HFIP выпаривали азотом, пробирки замораживали в жидком азоте, а аликвоты хранили при -80 ° С.

Для экспериментального использования HFIP-пленку пептида растворяли в 10 мМ NaOH (рН 12), который удерживает Aβ1-42 в его мономерной форме. После нейтрализации эквивалентным количеством 10 мМ HCl (pH 2) был начат процесс агрегации.

Характеристики связывания 22C4 scFv и соответствующего полного IgG 22C4 измеряли с помощью ELISA. Для анализа активности связывания пластину покрывали 1 мкг / мл рекомбинантного Aβ1-42 или синтетического Aβ1-42. Антитела добавляли в концентрациях от 0,001 нМ до 10000 нМ и инкубировали на планшете в течение 1 часа при комнатной температуре. ScFv был обнаружен с помощью мышиного анти-His-антитела (1:500, Qiagen, Hilden, Germany) и конъюгата антител против мышиного HRP (1:000, GE Healthcare), полный IgG был обнаружен непосредственно с помощью мыши HRP-антитело. Поглощение измеряли при 450 нм и 620 нм с помощью считывающего устройства Tecan Sunrise (Tecan, Männedorf, Switzerland).

Для анализа конкуренции планшет был покрыт Aβ1-42, как описано выше. 10 нМ 22C4 scFv предварительно инкубировали с возрастающими концентрациями Aβ1-42 или скремблировали Aβ1-42 (от 0 нМ до 1000 нМ) в течение 1 часа при 4 ° C. Предварительно инкубированные смеси добавляли на покрытую пластину ELISA в течение 15 мин при комнатной температуре, после инкубации эти смеси переносили на другую пластину с покрытием Aβ1-42 и обрабатывали одинаково, чтобы подтвердить, что равновесие связывания не нарушено. Обе пластины затем обрабатывали, как описано для ELISA антитела против Aβ.

Ингибирование образования фибрила Aβ с помощью scFv контролировалось флуоресценцией тиофлавина T (ThT). Рекомбинантный Aβ1-42 (в 10 мМ NaOH) инкубировали при концентрации 2,5 мкМ с 2,5 мкМ, 1,25 мкМ или 0,25 мкМ 22C4 scFv. Анализ проводили с помощью 50 мкМ ThT, 500 мМ NaCl, 0,1 мМ HCl и 10 мМ фосфата натрия при 25 ° C. Анализ перемешивали на протяжении всего измерения. Флуоресценцию четырех параллельных реакций измеряли на флуоресцентном спектрофотометре (Varian Inc.) при 456,2 нм (возбуждение) и 489,4 нм (эмиссия) каждые 2 мин в течение 180 мин. Анализ проводили 3 раза.

Для первичных клеток крысиного коркового нейрона эмбрионы (E18) были выделены, а мозг расселся на ледяной PBS (pH 7,4) / глюкоза (1 мг / мл) в соответствии со стандартными процедурами, но с незначительными изменениями в протоколе. Вкратце, мозг рассекали, коры удаляли и собирали в ледяной PBS / глюкозе. Затем кортики отделяли от мозговых оболочек, измельчали ​​и инкубировали в Dispase II (Roche, Indianapolis, IN, 2,4 ед. / Мл) при 37 ° C в течение 10 мин. Ткань промывали DMEM плюс 10% FCS, растирали и количество живых клеток определяли после окрашивания трипановым синим. После центрифугирования клеток в течение 5 мин при 1000 об / мин и удаления DMEM / FCS клетки ресуспендировали и разбавляли до нужной плотности в нейробазальной среде (Invitrogen, Carlsbad, CA), дополненной B27 (Invitrogen) и L-глутамином (Invitrogen ). Затем клетки покрывали поли-орнитином (Sigma, St. Louis, MO, 10 мкг / мл) 96-луночные белые стенки (Nunc, Rochester, NY) со скоростью 100000 клеток / лунку. Затем культуры инкубировали в течение 5 дней in vitro (DIV) при 37 ° С и 7% СО2 перед началом исследования нейротоксичности. Для анализа рекомбинант Aβ1-42 (препарат см. Выше) и 22C4 scFv добавляли непосредственно к культурам каждый с конечной концентрацией 5 мкМ и 0,5 мкМ или предварительно инкубировали вместе в течение 4 ч при 37 ° С и встр хивании со скоростью 500 об / мин перед тем, добавляется в ячейки. Контроль обрабатывали Ultra-Pure H2O для клеточной культуры (Invitrogen). Планшеты инкубировали в течение 48 ч перед оценкой нейротоксичности с помощью анализа цитотоксичности CytoTox-Glo ™ (Promega, Madison, WI). Анализ проводили в соответствии с протоколом изготовителя. Люминесценцию измеряли с помощью планшетного ридера SpectraMax GeminiXS (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Каждая группа лечения была измерена в 12 повторах, и каждый эксперимент повторяли 3 раза. Данные были рассчитаны как средства ± SD.

Пять микронных парафиновых отделов человеческой ткани головного мозга человека и мыши из APPswe / PS1dE9 [42], APPswe / PS1 [43] и ArcAβ [44] были установлены на стеклянных слайдах, и была проведена иммуногистохимия / иммунофлюоресценция; для окраски DAB использовались комплекты Vector Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingham, CA). Для невропатологических анализов использовались следующие антитела: 6E10 (1:000, Covance), анти-GFAP (1:400, Advanced Immunochemicals, Long Beach, CA), 22C4 scFv (1:100), 22C4 IgG (1:500) , анти-His (1:100, Abcam, Cambridge, UK), анти-мышиное биотинилированное антитело (1:500, Jackson, Suffolk, UK), антигуиновый свиньи Cy2 (1:100, Jackson), антимышиный Cy3 (1:000, Джексон) и против кроликов Cy3 (1:000, Джексон). Окрашивание тиофлавина S для фибриллярных Aβ и CAA проводили путем инкубации слайдов в 0,25% KMnO4 в течение 20 мин с последующей инкубацией в 2% K2S2O5 / 1% щавелевой кислоты в течение 2 мин, 0,25% уксусной кислоты в течение 10 с и, наконец, в 0,0125% тиофлавина S в 50% этаноле в течение 3-5 минут с последующим промыванием в 50% этаноле и, наконец, в дистиллированной воде. Прусский голубой метод Perl использовался для визуализации железа в гемосидерине в качестве меры для микрогеморрагирования и был выполнен, как было опубликовано ранее. Для количественной оценки иммунореактивности получение изображений выполнялось с использованием виртуальной слайдовой системы DotSlide (Olympus, Tokyo, Japan). Время приема было постоянным для всех изображений. Компьютерный анализ изображений выполнялся с использованием программного обеспечения Image J. Число налета и CAA рассчитывали для области коры в 5 равноудаленных сагитальных срезах всех обработанных животных.

Для иммуноцитохимии крысиные первичные кортикальные нейроны получали, культивировали и обрабатывали в соответствии с протоколом исследований токсичности клеточной культуры. После обработки клетки промывали PBS и фиксировали 4% PFA в PBS. Для иммунофлуоресценции применяли следующие антитела: анти-Map2 (1:000, Millipore, Billerica, MA), анти-Aβ1-42 (1-250, Calbiochem, San Diego, CA), анти-His (1:000, Abcam ) и анти-Cleaved Caspase 3 (1:100, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA). Окрашивание повторяли три раза.

Интраназальное лечение проводили у 7,5-месячных мужских и женских мышей APPswe / PS1dE9 [42] на фоне C57BL / 6, которые были первоначально получены из Jackson Labs (Bar Harbor, ME). Животных обрабатывали в течение 14 недель, начиная с 7,5 месяцев, причем каждая из 3 групп содержала 15 животных; все группы были сбалансированы по возрасту. Контрольные животные (обработанные PBS, стерильные, pH 7,4) и 22C4 IgG-обработанные животные получали еженедельные интраназальные применения (концентрация IgG: 1 мг / мл). Обработанную scFv группу 22C4 обрабатывали два раза в неделю (концентрация scFv: 1,5 мг / мл). При каждом применении животные получали капли 20 мкл PBS, 22C4 IgG или 22C4 scFv путем чередования между ноздрями. Применение выполняли на активных мышах, как описано Hanson et al. [45]. Вкратце, животных схватили кожей шеи и крепко держали в ладони, чтобы свести к минимуму движение. В течение всего времени нанесения 5 мин каждая мышь удерживалась в руке в положении лежа на спине. После лечения животных возвращали в свою домашнюю клетку. Все виды использования животных были одобрены Швейцарским институтом благосостояния животных и соответствовали всем федеральным и государственным нормам (ID утверждения 202-2005, Kantonales Veterinäramt Zürich).

После окончательной обработки животные получали летальную дозу кетамина / ксилазина и транскрипционно перфузировали ледяным PBS (рН 7,4). Мозги были изолированы и разделены сагитально; один геми-мозг замораживался в жидком азоте и хранили при -80 ° C до дальнейшей обработки, второе полушарие фиксировалось в 4% PFA в PBS, дегидратировалось и внедрялось в парафин для гистологических анализов.

Замороженные мозговые половины интраназально обработанных животных гомогенизировали в соответствии с протоколом, опубликованным Shankar et al [46]. Полученные экстракты TBS, TBS-Tx и GuHCl хранили при -80 ° C до дальнейшей обработки.

Уровни Aβ1-40 и Aβ1-42 в полученных экстрактах измеряли с помощью комплексов ELISA hAmyloid β40 и β42 (The Genetics Company, Schlieren, Switzerland). ELISA выполняли в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, стандарт и образцы (в соответствующих разведениях) инкубировали вместе с конъюгатом антитела o / n при 4 ° С на пластине, предварительно покрытой антителом. После промывки планшеты инкубировали с конъюгатом фермента в течение 30 мин при комнатной температуре. После инкубации с ферментным субстратом в течение 25-30 мин реакцию останавливали добавлением 1 М H2SO4 и планшеты измеряли при 450 нм и 620 нм на планшете Tecan Sunrise (Tecan).

Экстракты мозга анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Равные количества белка разделяли на 4-12% геля Bis-Tris (Invitrogen), переносили на нитроцеллюлозную мембрану и блокировали в TBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0,1% Tween 20. Первичные антитела против His, 1:500 ( Qiagen) и 6E10, 1:000 (Covance) инкубировали в течение ночи при 4 ° C и соответствующие вторичные антитела инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. SuperSignal West Dura (Pierce) использовался для обнаружения хемилюминесценции. Сигналы были обнаружены с использованием ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare), и денситометрический анализ проводили с использованием программного обеспечения GeneTools (Syngene, Frederick, MD) с использованием экстрактов головного мозга из когорты транспортных средств в качестве эталона для нормализации.

Данные были выражены как средства ± SEM. Статистический анализ выполнялся с помощью тестов PostApp от ANOVA и Bonferron или Fisheŕs PLSD с использованием GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) и программного обеспечения StatView (SAS Institute Inc., Cary, NC). Значение р <0,05 считалось статистически значимым.

Одноцепочечное вариабельное Фракция (scFv) антитела 22C4 scFv генерировалось путем трансплантации CDR мышиного моноклонального IgG 22C4 в каркас scFv человека. Полученный фрагмент антитела (трехмерная структура, см. Рисунок S1A) имел размер 26517 Да, как определено с помощью масс-спектроскопии с электрораспылением, был стабилен до температуры 62,8 ° C, как измерено FT-IR (фиг. S1B), и сохранял специфичность полный IgG для аминокислотных остатков 32-42 на С-конце мономерных видов амилоида-бета-пептида (фиг.1А). EC50 из 22C4 scFv рассчитывали как 280 нМ и 130 нМ для 22C4 IgG. Однако нет никакой разницы между синтетическим и рекомбинантным Aβ1-42 в качестве эпитопа на пластине (данные не показаны). В качестве более количественной оценки сродства антитело-Aβ-комплекса значения KD для 22C4 scFv и 22C4 IgG определяли с помощью интерферометрии BioLayer (октетная система), в которой измерялась интерференционная картина белого света. Из сдвига интерференционной картины значение KD для 22C4 scFv было рассчитано как 54 нМ и 12 нМ для 22C4 IgG (фиг.1C). Это различие в кажущейся поверхностной аффинности, скорее всего, связано с режимом бивалентного связывания IgG по сравнению с моновалентностью scFv.

A Связывающую активность 22C4 scFv определяли с помощью ELISA на пластине с покрытием Aβ1-42 и сравнивали с соответствующим полным IgG 22C4. EC50 из 22C4 scFv был рассчитан как 2,8 * 10-7 М и 1,3 * 10-7 М для 22C4 IgG. Не было различий между синтетическим и рекомбинантным Aβ1-42 в качестве эпитопа на пластинке. B Специфичность 22C4 scFv до Aβ1-42 определяли с помощью конкурирующего ELISA на пластине с покрытием Aβ1-42. 10 нМ 22C4 scFv конкурировали с увеличением количества рекомбинантного Aβ1-42. Конкуренция с скремблированным Aβ1-42 не показывала никакого неспецифического связывания с sc4v 22C4 (данные не показаны). C Определение значения KD с помощью интерферометрии BioLayer (октетная система). И scFv, и IgG измеряли при 50 нМ. 22C4 scFv дополнительно измеряли при 75 и 125 нМ (данные не показаны). Значение KD для 22C4 scFv было рассчитано как 2.7 * 10-8 M и 1.2 * 10-8 M для 22C4 IgG. Сдвиг кривых между 22C4 IgG и scFv не коррелирует с их аффинностью к Aβ1-42, но с размером молекулы. D и E SEC анализа FITC-Aβ1-42 (черный, 495 нм), предварительно инкубированных либо с 22C4 scFv (красный, 215 нм), либо с неспецифическим scFv Fw 2.3 (красный). 22C4 scFv и Aβ1-42 элюируются вместе в одном пике (D), тогда как Fw 2,3 и Aβ1-42 элюируются в двух разных пиках (E).

Чтобы дополнительно охарактеризовать специфичность связывания scFv 22C4 с Aβ1-42, были проведены конкурентные ELISA и аналитическая SEC. Для соревнований ELISA 10 нМ из 22C4 scFv конкурировали с увеличением количества рекомбинантного Aβ1-42. Соответственно, сигнал scFv, связанный с Aβ1-42 на пластине, показал дозозависимое снижение, указывающее специфичность 22C4 scFv для Aβ1-42 (фиг.1B). Это было дополнительно обосновано тем, что конкуренция с скремблированным Aβ1-42 не обнаруживала никакого неспецифического связывания с scFv 22C4 (данные не показаны). Во время соревнований равновесие связывания scFv с его целевым пептидом не нарушалось, поскольку контрольная пластинка показала 95% -ный сигнал по сравнению с аналитической пластиной. Для аналитической SEC, FITC-меченый Aβ1-42 и либо 22C4 scFv, либо неспецифический Fw2.3 предварительно инкубировали в эквимолярных концентрациях (1 мкМ). Гель-фильтрация показала, что 22C4 scFv и Aβ1-42 элюируются вместе (фиг.1D), тогда как неспецифические контрольные scFv Fw 2,3 и Aβ1-42 элюируются в разных объемах (фиг.1E). Предварительную инкубацию повторяли при разных условиях, изменяя время и температуру инкубации, которые оба не влияли на результат (данные не показаны). FITC-Aβ1-42 и 22C4 scFv элюировались вместе, даже когда оба были объединены непосредственно перед инъекцией в колонку, что указывает на то, что связывание Aβ1-42 на 22C4 scFv было быстрой и почти полной реакцией. Эти результаты показывают, что scFv 22C4 scFv представляет собой небольшой и высокоспецифический фрагмент антитела, который сохранил большую часть связывающих свойств полного IgG 22C4, из которого он был получен. Он показал хорошие характеристики связывания, которые сопоставимы с характеристиками 22C4 IgG.

Для проверки того, был ли 22C4 scFv связан с Aβ1-42 не только анализом ELISA, но и сохранил свою активность на образцах ткани ex vivo, мозги из разных моделей мышей AD и человеческих мозгов AD были инкубированы либо с 22C4 scFv (фиг.2A, C, E, G, I) или 22C4 IgG (фиг.2 B, D, F, H, J). И scFv, и полный IgG распознавали амилоидные бляшки и CAA со сравнимым качеством, но были некоторые различия между тестируемыми тканями в зависимости от происхождения ткани. Амилоидные отложения были лучше всего обнаружены в мозгах APPswe / PS1 и APPswe / PS1dE9 с наименьшим окрашиванием фона (рис. 2A и B, E и F). Депозиты в мозге человека AD были обнаружены с сопоставимой чувствительностью, но с несколько более сильным окрашиванием фона (рис. 2 G и H). Наконец, как 22C4 scFv, так и 22C4 IgG тестировали на срезах от мышей ArcAβ, что дало самое слабое окрашивание амилоидных отложений с наиболее сильным фоном окрашивания (фиг.2C и D). Поэтому мы решили провести все следующие эксперименты у мышей APPswe / PS1dE9.

От A до J Оба scFv и соответствующий полный IgG были протестированы на предмет их способности маркировать бляшки в мозгах различных моделей мыши AD и на человеческом мозге AD. Парафиновые участки окрашивали 22C4 scFv (A, C, E, G, I) и детектировали анти-His и антителом против Cybit Cy3 или окрашивали 22C4 IgG (B, D, F, H, J), который был обнаружен непосредственно с антителом против мышиного Cy3. APPswe / PS1 (A и B); ArcAbeta (C и D), APPswe / PS1dE9 (E an F), человеческий AD (G и H), WT (I и J). Оба scFv и полные IgG распознают бляшки во всех тестируемых тканях в сопоставимом качестве (шкала шкалы: 200 мкм). K до N После 12 недель интраназального применения 22C4 scFv (K) и 22C4 (M) у мышей APPswe / PS1dE9 только scFv обнаруживался у обработанных животных, указывая, что 22C4 IgG не доходил до мозга в обнаружимых количествах. Контрольные животные обрабатывали PBS и окрашивали для 22C4 scFv (L) и 22C4 IgG (N) соответственно (шкала шкалы: 200 мкм).

Для проверки того, были ли скрининг 22C4 IgG и 22C4 scFv также связан с амилоидными бляшками и CAA in vivo, участки мозга у животных, которые были обработаны интраназально в течение 14 недель либо с помощью scFv 22C4 (30 мкг два раза в неделю), 22C4 IgG (20 мкг один раз в неделю) или PBS (один раз в неделю) окрашивали антителом против 5xHis или антимышиным Cy3-антителом для определения 22C4 scFv и 22C4 IgG соответственно (фиг. 2 K-N). ScFv четко обозначенные бляшки (рис. 2 K), тогда как полный IgG не может быть обнаружен в мозге обработанных животных (рис. 2 М). Контрольные животные, обработанные PBS, которые были окрашены одинаково, показали слабое фоновое окрашивание для обеих групп обработки (фиг.2L и N), но окрашивание для sccv 22C4 было намного сильнее по сравнению с отрицательным контролем. Они предположили, что scFv 22C4 легко попал в мозг и маркировал амилоидные бляшки in vivo.

Антитела и фрагменты антител, направленные против амилоидного бета-пептида, могут иметь нежелательный побочный эффект, который также связывается с полноразмерным APP, что может мешать функции APP и обработке. Чтобы исключить эту возможность, мы провели анализ связывания in vitro, в котором клетки HEK293T, трансфицированные конструкцией, экспрессирующей APP-цитрин, инкубировали с любым антителом 6E10 в качестве положительного контроля (фиг.3А), 22C4 IgG (фиг.3B), 22C4 scFv (фиг.3С) или соответствующие неспецифические антитела в течение 30 мин на льду (данные не показаны). После фиксации флуоресцентное окрашивание показало, что ни 22C4 scFv, ни 22C4 IgG, ни неспецифические контрольные антитела не связывались с полноразмерным APP, тогда как 6E10 показал ожидаемую совместную локализацию (фиг.3A). Это открытие подтвердило, что ни scFv, ни полный IgG, специфичный для С-конца Aβ1-42, связанный с полноразмерным APP, предполагающий, что лечение с помощью 22F4 scFv или 22C4 IgG вряд ли будет связано с измененной обработкой или торговлей APP молекула в результате связывания антитела; кроме того, вывод исключил возможность того, что полноразмерный APP может действовать как приемник для применяемого антитела.

К клеткам A-C HEK293T трансфицировали конструкцию APP-цитрин (желтый). Затем клетки инкубировали с 6E10 (A), 22C4 scFv (B) или 22C4 IgG (C) (красный) в течение 30 мин на льду, фиксировали и флуоресценцию окрашивали. Окрашивание показало, что только 6E10 связывается с полноразмерной APP. Инкубация с контрольными антителами (Fw2.3, ​​2H6C2) показала сходное окрашивание по сравнению с (B) и (C). Окрашивание вторичным антителом не показало никакого окрашивания (данные не показаны) (Шкала шкалы: 10 мкм) D-H Первичные корковые нейроны из крысы (DIV5) инкубировали с 5 мкМ рекомбинантным Aβ1-42, 0,5 мкМ 22C4 scFv или оба для 48 час D Анализ нейротоксичности, определяемый люминесценцией, указывающий на гибель клеток. Улусы, обработанные Aβ1-42, показали значительно больше мертвых клеток по сравнению с контрольными лунками, которые были обработаны H2O. Добавление 22C4 scFv значительно уменьшало клеточную гибель, указывая на то, что оно ингибировало нейротоксичность Aβ1-42 (*** p <0,005). От E до H. После обработки клетки фиксировали PFA и окрашивали анти-Map2 (зеленым) и анти-расщепленным капсазой 3 (красные) антитела. Нейроны в контрольных лунках (контроль транспортных средств E и 22C4 scFv G) и лунки, которые были обработаны scFv (H) Aβ1-42 и 22C4, показали лучшую морфологию нейронов с более длительными процессами и меньшими апоптотическими нейронами, чем нейроны, которые обрабатывались 5 мкМ Aβ1-42 (F) (шкала шкалы: 50 мкм). I Мономерный рекомбинант Aβ1-42 (2,5 мкМ) инкубировали при 25 o C и 500 мМ NaCl либо отдельно, либо с 2,5 мкМ, 1,25 мкМ или 0,25 мкМ 22C4 scFv. Флуоресценцию тиофлавина T всех четырех реакций измеряли одновременно каждые 3 мин в течение 180 мин. Добавление 22C4 scFv к анализу агрегации показало дозозависимый эффект на агрегацию Aβ1-42. Агрегация откладывалась при использовании соотношений Aβ1-42-scFv 10:1 и почти полностью предотвращалась при использовании эквимолярных концентраций.

Затем мы проверили, может ли 22C4 scFv ингибировать опосредованную Aβ1-42 нейротоксичность. Первичные корковые нейроны эмбрионов крыс (E18) инкубировали с 5 мкМ рекомбинантным Aβ1-42, 0,5 мкМ 22C4 scFv или оба в течение 48 ч (фиг.3D), а нейроны, обработанные как Aβ1-42, так и 22C4 scFv, демонстрировали значительно меньшую клетку (*** p <0,005) по сравнению с клетками, обработанными только Aβ1-42, что указывает на то, что 22C4 scFv действительно ингибирует A-1-42-опосредованную нейротоксичность in vitro. Этот результат был дополнительно подтвержден иммуноокрашиванием культивируемых корковых нейронов крыс, которые обрабатывались 5 мкМ Aβ1-42, 0,5 мкМ 22C4 scFv или оба в течение 24 часов. Окрашивание показало, что нейроны в контрольных лунках и лунках, которые были обработаны scFv Aβ1-42 и 22C4, показали более интактную морфологию нейронов с более длительными процессами и меньшими апоптотическими нейронами, чем нейроны, которые обрабатывались только с помощью 5 мкМ Aβ1-42 (фиг.3 E к Н). Иммуноокрашивание антителом против Aβ1-42 показало, что нейроны были окружены агрегатами Aβ1-42. Агрегаты Aβ1-42 также могут быть обнаружены в тесной связи со значительно укороченными нейритическими процессами (рис. S2).

Способность 22C4 scFv ингибировать агрегацию Aβ1-42 оценивали в анализе ингибирования агрегации. Мономерный Aβ1-42 (2,5 мкМ) инкубировали либо отдельно, либо с добавлением 22C4 scFv при 2,5 мкМ, 1,25 мкМ или 0,25 мкМ (фиг.3 I). Флуоресценцию тиофлавина Т, которая показывает флуоресценцию при λ = 480 нм в присутствии β-листовых структур, измеряли в течение 180 мин. Флуоресценция не увеличивалась, когда Aβ1-42 была совместно инкубирована с эквимолярными концентрациями 22C4 scFv по сравнению с одним только пептидом, что указывает на то, что scFv ингибирует агрегацию Aβ1-42. Когда scFv добавляли к анализу при субстехиометрических концентрациях, он уменьшал образование фибрилл, а не полностью ингибировал агрегацию Aβ1-42. Примечательно, что 22C4 scFv полностью ингибирует агрегацию при добавлении к Aβ1-42 в начале анализа. При добавлении после начала агрегации 22C4 scFv не препятствует агрегации, а скорее замедляет прогрессию (рисунок S3A). Это наблюдение также подтвердило идею о том, что scCv 22C4 преимущественно связан с линейным (мономерным) состоянием Aβ1-42 и что он ингибирует его агрегацию через интерференцию с начальным образованием семян.

После определения характеристик связывания и свойств in vitro 22C4 scFv мы дополнительно проанализировали эффективность scFv in vivo. Мышей APPswe / PS1dE9 обрабатывали интраназально в течение 14 недель либо с помощью 22S4 scFv, 22C4 IgG, либо PBS до того, как произошло значительное осаждение амилоида. После окончательной заявки все мозги анализировали иммуногистохимически и биохимически. DAB-окрашивание участков мозга с помощью антитела 6E10 показало значительное различие в плотности бляшек между группами лечения (фиг.4А-С). Количественный анализ числа бляшек показал, что у животных, получавших саркоид 22C4, было значительно меньшее количество бляшек по сравнению с животными, обработанными PBS (рис. 4 D; * p <0,05). Однако не было различий в размерах бляшек между группами лечения (рисунок 4 E). Кроме того, окрашивание тиофлавином S проводили для определения количества CAA-положительных сосудов у обработанных мышей. Этот анализ показал значительно меньшее количество CAA-положительных сосудов в 22C4 scFv (*** p <0,005) и 22C4 IgG (* p <0,05), обработанных животными по сравнению с контролируемыми PBS контрольными средствами (фиг.4F).

Для определения эффективности in vivo 22C4 мышей scPv APPswe / PS1dE9 обрабатывали интраназально в течение 14 недель либо с помощью 22F4 scFv, 22C4 IgG, либо PBS. После окончательного применения животных подвергали эвтаназии, а участки мозга были DAB, окрашенными 6E10. От A до C Репрезентативные изображения животных PBS (A), 22C4 IgG (B) и 22C4 scFv (C) (Шкала шкалы: 1 мм). D и E. Оценка окрашивания 6E10 с помощью изображения J. Количество бляшек (D) было значительно уменьшено у животных с 22C4 scFv и 22C4 IgG по сравнению с животными, обработанными PBS, однако не было различий в размере бляшек (E) между обработкой групп (* p <0,05). F Определение CAA-положительных сосудов окрашиванием тиофлавином S. Количество сосудов с ВСА достоверно снижалось у мышей, получавших 22C4 IgG (* p <0,05) и 22C4 scFv (*** p <0,005) по сравнению с животными, которые получали PBS в качестве контроля. G до I Определение количества Aβ1-40 и J до L Aβ1-42 в гомогенатах головного мозга от мышей, обработанных интраназально APPswe / PS1dE9, с помощью ELISA. В фракции TBS (G и J) растворимый Aβ1-40 был значительно увеличен у 22C4 scFv обработанных животных по сравнению с животными, обработанными PBS, Aβ1-42 был слегка, но не значительно увеличен в группе, обработанной scFv 22C4. Ни Aβ1-40, ни Aβ1-42 не были значительно изменены между группами лечения в связанной с мембраной фракции TBS-Triton (H и K). Оба, нерастворимые Aβ1-40 и Aβ1-42 в фракции GuHCl (I и L) были уменьшены. Однако Aβ1-40 был только немного снижен, но Aβ1-42 был значительно снижен у животных, обработанных scFv 22C4, по сравнению с обработанной PBS группой (* p <0,05). В целом мы обнаружили большее количество Aβ1-42, чем Aβ1-40, что в отличие от пациентов с AD, но хорошо коррелирует с данными, опубликованными для мышиной модели APPswe / PS1dE9 [42].

Для дальнейшего анализа гем-мозг всех обработанных животных гомогенизировали и проводили экстракцию Aβ. Уровни Аβ1-40 (фиг.4 G-I) и Aβ1-42 (фиг.4J-L) в разных фракциях затем определяли с помощью ELISA. В фракции TBS растворимый Aβ1-40 был значительно увеличен у животных, обработанных scFv 22C4, по сравнению с животными, обработанными PBS, тогда как Aβ1-42 был слегка, хотя и не значительно, увеличен. Ни уровни Aβ1-40, ни Aβ1-42 существенно не отличались среди групп лечения в связанной с мембраной фракции TBS Triton; однако в «нерастворимой» фракции GuHCl уровни Aβ1-40 и Aβ1-42 значительно уменьшались. Однако Aβ1-40 был лишь слегка снижен, тогда как Aβ1-42 был значительно снижен у животных, обработанных scFv 22C4, по сравнению с обработанной PBS группой (* p <0,05). Анализ уровней сыворотки Aβ1-40 и Aβ1-42 не выявил статистически значимых различий между группами лечения (рис. S4). Более того, вестерн-блот-анализ растворимых экстрактов TBS показал сходные распределения олигомерных Aβ-видов среди различных групп лечения (рисунок S5). Последнее обнаружение показало, что увеличение Aβ1-40 в фракции TBS не связано с сопутствующим увеличением потенциально нейротоксичных Aβ-олигомеров.

Таким образом, при внутривенном введении 22C4 scFv уменьшало количество амилоидных бляшек и CAA-положительных сосудов у трансгенных мышей с амилоидозом головного мозга. Эти результаты были дополнительно подтверждены тем фактом, что уровни Aβ1-40 и Aβ1-42 были значительно уменьшены в нерастворимой фракции, но увеличились в растворимой фракции животных, обработанных scFv 22C4, что указывает на перераспределение головного мозга Aβ из нерастворимой фракции до растворимого пептидного пула, который не сопровождался увеличением уровней Aβ в сыворотке или увеличением количества олигомерных Aβ-видов. Интересно, что все эффекты лечения были более выраженными у животных, получавших scFv, по сравнению с теми, которые получали соответствующий полный IgG.

Иммунотерапевтические стратегии очистки Aβ от головного мозга [47] включают активную иммунизацию либо с помощью системной инъекции Aβ [5], [48], [49], либо путем назального введения всего Aβ-пептида [50], [51] или коротких Aβ-иммуногенов [52], а также стратегии пассивной иммунизации с моноклональными антителами [6], [15], [16], [53], [54], [55], [56], [57] или фрагменты антител [29] , [30]. Aβ-иммунотерапия может уменьшать как церебральную амилоидную нагрузку, так и уровни Аβ в головном мозге, ослаблять нейритовую дистрофию, астроглиоз и поведенческие дефициты, восстанавливать целостность гематоэнцефалического барьера [54] и предотвращать синаптическую дегенерацию [58].

В этом исследовании мы создали гуманизированный scFv против С-конца Аβ. Он был получен из полного IgG 22C4 [56], [32] путем прививки CDR в рамки scFv человека. Полученное scFv-антитело 22C4 scFv сохраняло большую часть связывающих свойств полного IgG 22C4, из которого он был получен. ScFv демонстрирует хорошие характеристики связывания с высокой аффинностью и специфичностью к Aβ. 22C4 scFv идентифицировали для связывания как с синтетическим, так и с рекомбинантным Aβ в анализах in vitro, а также с природным Aβ в трансгенных тканях мыши и человека. Более того, мы показали, что 22C4 scFv помечены Aβ-депозитами in vivo.

22C4 scFv сильно ингибирует агрегацию Aβ и опосредованную Aβ нейротоксичность in vitro, предположительно путем связывания с мономерами Aβ, тем самым блокируя их сборку на более крупные и потенциально нейротоксичные олигомерные агрегаты. Другая возможность может заключаться в том, что этот эффект может быть связан со стерическим препятствием Aβ для образования зерен агрегации. Агрегация может быть подавлена ​​или нарушена, когда концентрация мешающего агента достаточна для модуляции образования зерен агрегации, как это имеет место для человеческого сывороточного альбумина (HSA) [59]. Согласно этой теории, Rozga et al заявили, что относительное обилие HSA с низкой аффинностью в сыворотке отвечает за ингибирующее агрегацию действие на периферическое Aβ. Напротив, специфический Aβ-связывающий реагент должен иметь возможность ингибировать агрегацию при эквимолярных концентрациях из-за его более высокой аффинности к Aβ [24]. Действительно, мы могли бы показать, что 22C4 scFv уменьшал агрегацию Aβ даже в субстехиометрической концентрации, и это делалось в большей степени, чем неспецифическая BSA (фиг. S3B). Примечательно, что 22C4 scFv полностью ингибирует агрегацию при добавлении к Aβ1-42 в начале анализа. При добавлении после наступления агрегации 22C4 scFv не может препятствовать агрегации, а скорее замедляет прогрессирование агрегации. Это наблюдение также подтверждает идею о том, что 22C4 scFv преимущественно связывает мономерный Aβ1-42 и что он может ингибировать его агрегацию до тех пор, пока семена агрегации еще не сформировались. После начала образования семян агрегация может скорее задерживаться, чем ингибироваться. Это также может объяснить, как сдвиг 22C4 scFv уменьшает Aβ-опосредованную нейротоксичность. После связывания мономеров scFv с Aβ образование агрегационных семян и потенциально токсичных видов более высокого порядка, таких как олигомеры и фибриллы, ингибировалось [47].

В этом исследовании сообщается о новом обнаружении того факта, что хроническая интраназальная обработка мышей APPswe / PS1dE9 с помощью 22F4 scFv и 22C4 IgG приводила к уменьшению накопления Aβ в паренхиме и сосудах головного мозга и, соответственно, также уменьшала уровни Aβ в нерастворимой фракции, но увеличивала уровни в растворимой фракции мозговых экстрактов. Животные, обработанные scFv 22C4, проявляли значительно меньшее количество бляшек в паренхиме головного мозга, но статистической разницы в размерах бляшек среди групп лечения не было. Это может быть связано с тем, что трансгенные мыши APP, используемые в этом исследовании, обычно развивают только небольшие плотные бляшки, которые не значительно увеличиваются по размеру с прогрессированием заболевания [42]. В результате вариация размера бляшек в этой модели обычно низка, что может объяснить, почему наша обработка снизила количество бляшек, но существенно не повлияла на размер бляшек. Уменьшение накопления Aβ в паренхиме головного мозга и сосудистой сети мозга сопровождалось перераспределением Aβ из нерастворимого в растворимый пептидный пул. Однако это перераспределение не сопровождалось увеличением потенциально нейротоксичных Аβ-олигомеров, что было обнаружено в Вестерн-блоттинге 6E10 (рис. S5).

Вестерн-блот-анализ показал наличие scFv в головном мозге уже через 1 ч после интраназального применения (рис. S6), что указывает на быстрый перенос, который, возможно, совместим с идеей о том, что 22C4 scFv проникает в мозг через периневральные каналы в субарахноидальном пространстве носового полости и связывается с амилоидными бляшками. Считается, что поглощение молекулы вдоль носового пути от носа до ЦНС связано с двумя общими механизмами. Первая — это интернализация молекулы в первичные нейроны обонятельного эпителия и внутриклеточный перенос вдоль аксона на обонятельную луковицу и последующее распределение в ткани головного мозга. Транспортировка аксонов медленна, и молекулы достигают ЦНС через 24 часа после применения [36]. Сообщается, что второй путь — обонятельный эпителиальный путь — быстрее [36]. Он опирается на прямую анатомическую связь между подслизистой и субарахноидальными расширениями, периневральное пространство, окружающее обонятельные нервы, когда они проникают в крибискую пластинку [38]. У крыс было показано, что даже крупные молекулярно-массовые соединения, такие как фактор роста нервов [60], инсулиноподобный фактор роста [33] и интерферон-бета [35] могут быть быстро перенесены в ЦНС и распределены в ткани за раз — и зависящим от региона способом. Соответственно, наши результаты подтверждают идею о том, что 22C4 scFv переносится вдоль обонятельного эпителиального пути, затем распределяется в мозговой ткани и удаляется через кровь [36], [38], [41]. После его введения и распределения в ЦНС существует три возможных механизма, по которым 22C4 scFv мог бы оказывать влияние на патологию амилоидов: (i) путем связывания с мономерами он мог предотвратить образование зерен агрегации и, следовательно, накопление бляшек, (ii) он препятствует росту бляшек путем связывания с доступными С-концевыми частями бета-пептида амилоида или (iii) связывание мономеров может привести к уменьшению концентрации свободных мономеров, которые затем могли бы привести к распаду фибрилл, чтобы сохраняйте равновесие. Растворимые мономеры или scFv-связанные мономеры будут затем подвергнуты деградации или элиминации из мозга механизмами оттока вдоль гематоэнцефалического барьера [47]. Однако последний механизм «периферического стока», по-видимому, менее вероятно ответственен за наблюдаемое снижение патологии амилоидов в нашем исследовании, так как мы не наблюдали значительного увеличения уровней Aβ в сыворотке крови у животных с 22C4 IgG- и scFv-обработанными животными по сравнению с PBS-обработанных мышей (фиг. S4).

Большинство механизмов, предложенных для удаления Aβ из головного мозга (для обзора см. [47]), полагаются на присутствие терапевтически значимых концентраций антител в ЦНС. Таким образом, перенос антител через ВВВ в мозг является критическим вопросом. Имеющиеся данные из нескольких исследований показывают, что только 0,1% до 1% плазменных антител входят в ЦНС [10], [11], [61]. Тем не менее, иммуногистологический анализ ткани головного мозга у участников исследования AN1792 показал антитела, связанные с β-амилоидными бляшками [62]. В соответствии с этим исследованием мы также смогли обнаружить scFv 22C4 scFv, связанный с бляшками в мозге обработанных мышей APPswe / PS1dE9. В головном мозге антитела могут быть стабилизированы путем связывания с высокими локальными концентрациями целевых эпитопов в β-амилоидных бляшках, что, возможно, приводит к очень медленным явным отклонениям для взаимодействия антитело-Aβ. В результате антитела накапливаются вокруг отложений головного мозга Aβ, и даже небольшие количества антител могут, таким образом, быть терапевтически релевантными или вызывать терапевтически значимые концентрации антител в течение времени [1]. Чтобы увеличить концентрацию антител в головном мозге, мы выбрали интраназальный путь доставки, который обходит BBB и приводит к быстрому зависящему от времени и региону распределению молекул в мозге [36], [38]. Исследования с использованием декстрана [40] или NGF [63] у крыс показали сильную зависимость уровней и распределения применяемых биологических препаратов в паренхиме головного мозга от молекулярной массы. Эти результаты могут также объяснить наше наблюдение, почему все наши экспериментальные эффекты лечения оказались более выраженными у мышей, которым был обработан меньший scFv по сравнению с полным IgG. Возможно, что полный IgG либо попал в мозг в меньших количествах, либо его распределение сильно уменьшилось из-за его более крупного размера молекулы по сравнению с scFv. Большинство исследований, которые оценивали интраназальное применение в качестве пути доставки в мозг, были выполнены в модели крысы, которая, скорее всего, переоценивает степень транспорта из-за относительно большей поверхности обонятельного эпителия и относительно больших обонятельных луковиц крыс по сравнению с людьми [ 38], [39]. Однако некоторые исследования, выполненные у людей, подтвердили существование прямого пути от носа до мозга [38]. Born et al. [39] продемонстрировали, что интраназальная доставка меланокортина, вазопрессина и инсулина приводила к увеличению уровней этих пептидов в CSF в течение 30 минут без увеличения их уровня в кровотоке. В нескольких исследованиях также были измерены фармакологические эффекты интраназально доставленных молекул, что упрочило возможность прямого и эффективного переноса носа в мозг также у людей [38].

Исследования у трансгенных мышей показали, что лечение антителом приводит к микрогеморрагиям, связанным с ранее существовавшим САА [15], [16]. Это может быть связано с взаимодействием анти-Aβ-антител с сосудистым амилоидом, которое вызывает локальные нарушения BBB из-за вырожденных гладких мышц и эндотелиальных клеток [4], [17]. Антитело-опосредованные микрогеморрагии также могут быть связаны с эффекторными функциями Fc, поскольку дегликозилированный IgG без эффекторных функций демонстрирует значительно сниженный риск индуцирования микрогеморрагов [16], [54]. Это также может быть справедливо и для scFv, поскольку эти фрагменты антител пропускают домен Fc-эффектора, и в соответствии с этим мы не обнаружили значительно увеличенных микрогеморрагов у мышей, обработанных scFv 22C4, по сравнению с животными, обработанными PBS (рис. S7). Еще одна проблема заключается в том, что CAA может быть увеличена за счет опосредованного антителом клиренса Aβ из паренхимы головного мозга и последующего переноса Aβ в сосудистую сеть и накопления на стенках кровеносных сосудов [54], [62]. С другой стороны, было показано, что антитела против Аβ могут также уменьшить сосудистый амилоид без увеличения частоты микрогеморрагов [64], [65]. Возможно, что склонность антитела к увеличению САА зависит от эпитопа [17]. Степень связанных с лечением эффектов, таких как микрогеморрагии, может варьироваться в зависимости от тяжести исходной CAA-патологии [61]. Кроме того, было показано, что увеличение частоты микрогеморрагов в исследовании иммунизации может контролироваться снижением дозы антител [65]. Наши результаты также продемонстрировали, что 22C4 scFv уменьшает САА у трансгенных мышей без увеличения микрогеморрагии, что может быть связано с маршрутом доставки. Как обсуждалось ранее Thorne et al. В [33] говорится, что один механизм интраназальной доставки протеиновой терапии в мозг осуществляется через периваскулярные каналы, которые бы вставляли scFv в прямой контакт с цереброваскулярным Aβ. Это подтверждается тем фактом, что высокие уровни интерферона β-1b [66] и hypocretin-1 [67] были обнаружены в стенках кровеносных сосудов после интраназального введения.

В этом исследовании мы впервые сообщаем, что хроническая интраназальная обработка трансгенных мышей до наступления осаждения Aβ с помощью scFv 22C4 привела к уменьшению накопления Aβ в паренхиме и сосудах головного мозга и, соответственно, также показала снижение уровня Aβ в нерастворимой фракции, но повышенные уровни в растворимой фракции. Наши результаты свидетельствуют о том, что scFv 22C4 может быть полезной альтернативой полному IgG-молекулам для уменьшения Aβ головного мозга без активации Fc-опосредованных эффекторных функций и, возможно, микрогеморрагов. Кроме того, эти данные расширили терапевтический потенциал анти-Aβ-иммунотерапии до удаления бета-амилоида из поражения CAA. Наконец, это исследование также поддерживает интраназальную доставку протеиновой терапии для лечения расстройств ЦНС, которая ранее считалась эффективной у приматов нечеловека [68] и человека [69], [70].

3D-модель 22C4 scFv, созданная с использованием SWISS-MODEL Repository, которая представляет собой базу данных аннотированных трехмерных моделей сравнительной структуры белка, созданных полностью автоматизированным конвейером SWISS-MODEL для моделирования гомологии. Репозиторий был разработан в BioCenter Basel (Швейцарский институт биоинформатики). Синий: линкер; Красный: CDR; Зеленый: участок, где 22C4 scFv гидролизуется. B Измерения спектра FT-IR с повышением температуры от 25 ° C до 95 ° C для определения термической стабильности. Температура плавления 22C4 scFv (50% разворачивание белка) была определена равной 62,8 ° C.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Иммунокраины первичных нейронов коры головного мозга (DIV5), которые были инкубированы с 5 мкМ рекомбинантным Aβ42 до того, как они были закреплены параформальдегидом и окрашены анти-Map2 (зеленым) и анти-Aβ1-42 (красные) антитела. Нейроны показывают поврежденную морфологию нейронов, опухшие соматы и укороченные процессы в тесной связи с агрегатами Aβ42 (шкала шкалы: 50 мкм).

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Монокристаллический рекомбинант Aβ42 2,5 мкМ инкубировали в 500 мМ NaCl при 25 ° C отдельно или с эквимолярными концентрациями 22C4 scFv, который добавляли к перемешиваемому анализу либо при флуоресценции ThioT, достигающей полумаксимальной или максимальной интенсивности. Полное ингибирование агрегации Aβ42 с помощью 22C4 scFv было достигнуто только при добавлении 22S4 scFv к Aβ42 в начале анализа. При добавлении после начала агрегации 22C4 scFv не эффективно ингибирует агрегацию Aβ42, а скорее замедляет прогрессирование процесса агрегации. B Мономерный рекомбинант Aβ42 инкубировали в 500 мМ NaCl при 25 ° C отдельно или с эквимолярными или полуэквимолярными концентрациями BSA. Когда Aβ42 инкубировали с BSA, который неспецифически связывается с Aβ42, только небольшое снижение образования фибрилл обнаруживалось даже при эквимолярных концентрациях BSA.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Уровни сыворотки Aβ1-40 (A) и Aβ1-42 (B) у мышей, получавших интраназально APPswe / PS1dE9, как определено ELISA. Сыворотку принимали в начале периода лечения и после применения конечной дозы биологического препарата. Уровни Аβ в начале лечения вычитались из уровней в конце периода лечения. Никаких существенных различий в уровнях сыворотки Aβ1-40 и Aβ1-42 не было обнаружено среди различных групп лечения, хотя мыши, обработанные с помощью scFv 22C4 IgG и 22C4, имели тенденцию проявлять более низкие уровни Aβ1-40 в конце интраназального лечения.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Примерный Вестерн-блот из мозговых экстрактов TBS от мышей, получавших интраназально APPswe / PS1dE9. Группы, обнаруженные с антителом 6E10, имели кажущуюся молекулярную массу 4 кДа (соответствует мономеру Aβ), 14 кДа (тример), 22 кДа (гексамер) и 52 кДа (вероятно, соответствует додекамере). B Количественная оценка полос не выявила существенных различий в распределении олигомеров между группами лечения.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Вестерн-блот анализ мозговых экстрактов от интраназально обработанных животных, которые умерщвляли через 1 час после лечения 200 мкг 22C4 scFv. Для обнаружения scFv использовали анти-His первичное антитело (Cell Signaling, 1:000). Он распознает полосу 27 кДа, которая соответствует размеру scFv и которая может быть обнаружена в экстрактах коры (CX) и гиппокампа (HPC). Никаких значительных количеств scFv не было обнаружено в мозжечке (CBL) и обонятельной луковице (OB) через 1 час. Через 6 ч после лечения scFv не обнаруживался с помощью Вестерн-блоттинга в любом регионе (данные не показаны).

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Прусские голубые гистологические окраски Perl для микрогеморрагов (контрастированных с ядерным быстрым красным) парафиновых отделов от интраназально обработанных животных. По сравнению с контрольными животными микрохромные боли были незначительно, но не значительно увеличены у 22C4 scFv-животных. В обонятельной луковице наиболее распространены микрогеморраги. Репрезентативные снимки животных PBS (A), 22C4 IgG (B) и 22C4 scFv (C) после 14 недель лечения (шкала шкалы: 200 мкм). D Количественный анализ прусских голубых гистологических окрасок Perl показал, что микрогеморрагии были незначительно, но не значительно увеличены у 22C4 scFv обработанных животных по сравнению с контрольными животными.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы хотели бы поблагодарить ESBA Tech (Schlieren, Switzerland) за производство и очистку 22C4 scFv, а также Nadine Lucke (Neurimmune Therapeutics AG) за отличную техническую поддержку.

Конкурирующие интересы: Susann Cattepoel и Roger M. Nitsch являются соавторами патентной заявки «Гуманизированные антитела против бета-амилоидного пептида» (Международная заявка № PCT / CH2008 / 000382) Дата публикации: 03-19-2009. Для получения дополнительной информации см. Также: http://www.wipo.int/patentscope/search/en/detail.jsf?docId=WO2009033309. Susann Cattepoel теперь является сотрудником CSL Behring AG. Это не изменяет приверженность авторов ко всем политикам PLoS ONE по обмену данными и материалами. Майкл Ханенберг и Лука Кулич не заявили никаких конкурирующих интересов.

Финансирование: Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом Грант 3200B-112626/1, Швейцарской комиссией по технологиям и инновациям и Швейцарским национальным центром компетенции в области исследований (NCCR) на тему «Нейронная пластичность и ремонт». Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *