Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Белковый белок-предшественник амилоида (APP) и Fe65, APP-связывающий белок, регулируют движение клеток

The Alzheimer Amyloid Precursor Protein (APP) and Fe65, an APP-Binding Protein, Regulate Cell Movement
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2150733/

FE65 связывается с белком предшественника амилоида Альцгеймера (APP), но функция этого взаимодействия не идентифицирована. Здесь мы сообщаем, что APP и FE65 участвуют в регуляции движения клеток. APP и FE65 colocalize с актином и Mena, ассоциированным с Abl сигнальным белком, который, как полагают, регулирует динамику актина, в lamellipodia. APP и FE65 специфически концентрируются с β1-интегрином в участках динамической адгезии, известных как фокальные комплексы, но не в более статических сайтах адгезии, известных как фокальные спайки. Сверхэкспрессия APP ускоряет миграцию клеток в анализе раневого исцеления клеток MDCK. Коэкспрессия APP и FE65 резко усиливает действие APP на движение клеток, возможно, путем регулирования количества APP на поверхности клетки. Эти данные согласуются с ролью FE65 и APP, возможно, в Mena-содержащем макромолекулярном комплексе, в регуляции подвижности актина.

Считается, что измененная протеолитическая обработка белка предшественника амилоида Альцгеймера (APP) является по меньшей мере одной причиной болезни Альцгеймера. Несмотря на многочисленные усилия по определению нормальной функции APP, ее функция в ячейке остается неуловимой. Роль в клеточной адгезии (Schubert et al., 1989), пролиферация клеток (Saitoh et al., 1989), нейропротекция (Mattson et al., 1993) и рост нейритов (Milward et al., 1992; Jin et al., 1994; Small et al. 1994; Perez et al., 1997). Также было высказано предположение, что APP может играть роль в сигнальной трансдукции, поскольку APP структурно напоминает рецептор (Kang et al., 1987) и нацелен на поверхность клетки.

FE65 взаимодействует с мотивом YENPTY в цитоплазматическом домене APP (Fiore et al., 1995; Borg et al., 1996; Bressler et al., 1996; Guenette et al., 1996; Zambrano et al., 1997; Duilio et al., 1998; Tanahashi и Tabira, 1999). Помимо его взаимодействия с APP, очень мало известно о FE65. Он не обладает известной ферментативной активностью и содержит три домена белка-белка, с доменом WW в его доменах NH2 и тандемфосфотирозин / белковых взаимодействий (PID) на его конце COOH. FE65 связывается с APP через его более COOH-терминальный PID. Сверхэкспрессия FE65 увеличивает протеолитическую обработку APP (Guenette et al., 1999; Sabo et al., 1999). Это также вызывает транслокацию APP на клеточную поверхность (Sabo et al., 1999), предполагая, что связывание FE65 с мотивом YENPTY может регулировать функцию APP, регулируя количество APP на поверхности клетки.

Мы еще не знаем, взаимодействуют ли другие белки с FE65, если FE65 взаимодействует с APP. Ранее было показано, что Мена соосаждается с доменом WW FE65 (Ermekova et al., 1997). Мена генетически связана с каскадом сигнализации фосфорилирования Abl-тирозина и необходима для нормального развития нервной системы (Gertler et al., 1990, Gertler et al., 1995; Lanier et al., 1999). Он локализуется на сайтах адгезии клеточных субстратов и местах сборки и разборки динамического актина. Интересно, что Мена также связывается с профилином, ставя его в положение, чтобы регулировать динамику актина. Было высказано предположение, что Mena, FE65 и APP могут быть компонентами трехстороннего комплекса (Ermekova et al., 1997). Однако не было показано, что этот трехсторонний комплекс существует.

На поверхности нейронных клеток APP колокализуется пятнами интегринов (Yamazaki et al., 1997). Интегрины представляют собой семейство гетеродимерных клеточных адгезионных рецепторов, которые опосредуют клеточно-матричные взаимодействия, необходимые для клеточной пролиферации, дифференцировки и миграции (Howland et al., 1995). Это ставит вопрос о том, может ли комплекс APP-FE65 играть определенную роль в адгезии или сигнализации на основе интегрина.

Интегрины и Мена обнаруживаются в двух типах адгезионных сайтов клеточных субстратов, известных как фокальные спайки и фокальные комплексы (Hotchin and Hall 1995, Gertler et al., 1996; Rottner et al., 1999a, Lanier and Gertler, 2000). Фокальные спайки являются широко изученными сайтами адгезии, обнаруженными на кончиках волокон напряжения актина. Они, как правило, очень стабильны и сильны и находятся в относительно статичных областях клетки. Фокальные комплексы менее изучены, более динамичные адгезионные участки обычно встречаются на переднем крае мигрирующей клетки (Nobes and Hall 1995). Хотя фокальные спайки и фокальные комплексы функционально и морфологически различны, мы, как нам известно, не знаем какого-либо известного биохимического различия между ними. Казалось возможным, что APP и FE65 могут функционировать совместно в фокальных спайках, фокальных комплексах или в обоих случаях.

Здесь мы показываем, что APP и FE65 выборочно локализуются с Mena в фокальных комплексах на основе интегрина в мобильных мембранных компартментах. Кроме того, мы подтверждаем, что APP модулирует движение клеток и что APP-зависимые изменения в подвижности клеток регулируются FE65. Мы предлагаем связь между FE65-зависимыми изменениями в торговле АПФ и метаболизмом и подвижности мембран на основе актина.

Использовались стандартные методы культивирования тканей. H4 клетки нейроглиомы и клетки MDCK поддерживали в DME, дополненном 10% FBS и антибиотиками. Клетки MDCK, которые сверхэкспрессируют изоформу 695 аминокислот APP (+ APP / -FE65), были подарком доктора С. Хааса (Университет Людвига Максимилиана, Мюнхен, Германия) (Haass et al., 1994). Эти клетки стабильно трансфицировали кДНК FE65 с получением клеток, которые сверхэкспрессируют как APP, так и FE65 (+ APP / + FE65, Sabo et al., 1999). Сверхэкспрессия FE65 не изменяет уровни экспрессии APP в стационарном состоянии.

Поликлональные антитела FE65 170/173, которые распознают WW-домен FE65, были аффинно очищены, как описано ранее (Sabo et al., 1999). Поликлональное APP-антитело 369, которое распознает цитоплазматический домен APP, было сродством, очищенным пептидом, соответствующим последним 50 аминокислотам APP. Моноклональные антитела APP 5A3 / 1G7 (подарок доктора Э.Х. Ку, Калифорнийский университет в Сан-Диего, Калифорния) распознают эпитопы во внеклеточном домене APP. Поликлональные антитела против Мены были подарком доктора Ф. Гертлера (MIT, Cambridge, MA) и ранее использовались для иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции (Ermekova et al., 1997; Lanier et al., 1999). Моноклональные антитела Integrin β1 и фосфотирозина были приобретены у Upstate Biotechnology.

Клетки H4 высевали при 3,5 × 104 клеток / см-2 в лабораторных камерах Labtek. Клетки фиксировали в холодном 4% параформальдегиде в PBS с 0,12 М сахарозы в течение 10 мин при комнатной температуре. После проницаемости в течение 5 мин с 0,1% Triton X-100 в PBS культуры блокировали 10% нормальной сывороткой коз (NGS) в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. Клетки инкубировали в течение ночи при 4 ° С с первичными антителами, разведенными в 5% NGS в PBS, затем инкубировали с вторичными антителами, также разбавляли в 5% NGS в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Челюсти были установлены с DABCO в поливиниловом спирте.

Вторичные антитела использовались при разведениях 1: 400 для зеленоватого козьего антимышиного и овечьего козьего анти-кролича (Молекулярные зонды), 1: 200 для кошачьей антимышии Cy5 и 1: 100 для родамино-красного X-козьего анти- кролик (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Орегоновый зеленый фаллоидин (Молекулярные зонды) использовали при разведении 1:40 и добавляли вторичное антитело.

Во всех случаях иммунофлуоресценцию удаляли путем пропуска первичного антитела. Для маркировки FE65 и APP сигналы также устранялись путем конкуренции с избыточным растворимым антигеном (рис. 3d и рис. H). В экспериментах с двойными и тройными метками образцы маркировки были идентичны тем, которые были отмечены с помощью единой маркировки. Кроме того, каждая схема маркировки была идентичной, когда использовался альтернативный набор вторичных антител. Иммунофлуоресценцию исследовали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (LSM510, Carl Zeiss, Inc.) с использованием линзы для погружения воды 63 ×; Ar 488-, HeNe 543- и HeNe 633 нм; и BP505-550, BP560-615 и LP650. Для экспериментов с колокализацией оптические секции не были толще 1,5 мкм, и каждый канал отображался отдельно, исключая возможность «просачивания».

Слитые белки GST очищали от бактериальных лизатов путем инкубации с бусами глутатион-сефарозы (Amersham Pharmacia Biotech) с последующей интенсивной промывкой с помощью HBS. Очищенные слитые белки определяли количественно как SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси, так и элюированием с помощью анализа глутатиона, диализа и BCA (Pierce Chemical Co.). H4-клетки гомогенизировали в 10 мМ Трис-HCl, pH 7,5; 150 мМ NaCl; 0,1 мМ ванадата натрия; 50 мМ NaF; 0,5% NP-40 и ингибиторы протеазы. Бисер блокировали 2% BSA. Экстракты инкубировали с равным количеством различных слитых белков GST в течение 2-3 часов. Комплексы, осажденные на гранулах глутатион-сефароза, промывали несколько раз буфером для лизиса. Затем шарики отваривали в буфере Лаэмми и белки, разделенные SDS-PAGE и переносили в нитроцеллюлозу. Клетки подвергали исследованию с использованием поликлональных первичных антител и антикроличного HRP-конъюгированного IgG (Amersham Pharmacia Biotech), затем исследовали ECL (Pierce Chemical Co.).

Конфлюэнтные монослои клеток MDCK разделяли 1: 3 и покрывали. Спустя 24 ч клетки гомогенизировали в 0,25% NP-40 в PBS, содержащем коктейль ингибитора протеазы (Amersham Pharmacia Biotech) и 2% BSA при 4 ° C. После центрифугирования в течение 10 мин при 10000 г супернатант инкубировали в течение 1,5 ч при 4 ° С с антителом Мена, который был предварительно очищен до белков А-сефарозы. Затем гранулы гранулировали и промывали несколько раз буфером для лизиса. Иммунопреципитаты кипятили в буфере Лаэмми и разделяли SDS-PAGE. Иммуноблоттинг проводили в 5% обезжиренном молоке и 0,05% Твин-20 в TBS с 6E10, моноклональное антитело против APP и антитело против Flag-M2 для распознавания метки флагового эпитопа на экспрессированном FE65. Обнаружение проводили с антителом против мышиного HRP-конъюгированного вторичного антитела (Amersham Pharmacia Biotech) и ECL (Pierce Chemical Co.).

Ранние исследования с использованием клеток MDCK были опубликованы ранее (Rosen and Misfeldt 1980, Fenteany et al., 2000). Конфлюентные монослои клеток MDCK были ранены скребкой 200-миллилитровым наконечником пипетки. Отобранные клетки удаляли промыванием и перемешиванием. Для иммунофлуоресценции раненым монослоям давали возможность остыть в течение 2 ч и затем фиксировали и иммунизировали. Для измерения заживления ран клетки выращивали на сетках. Фотографии ран были взяты в тех же точках на сетке в разные моменты времени. Расстояния, на которые проходили края раны, определялись путем измерения в каждый момент времени расстояния между двумя краями через регулярные интервалы от маркера сетки. Кроме того, раны были исследованы на степень закрытия после ~ 1 г заживления ран и забиты как полностью закрытые, частично закрытые или полностью открытые.

Изображения собирались для клеток, помеченных как описано выше. Коэффициент усиления детектора регулировался таким образом, чтобы ни один из уровней флуоресценции не достигал насыщения. Ряд линий ~ 5-10 мкм был оттянут перпендикулярно ламеллиподиальному переднему краю с интервалами ~ 3-5 мкм. Длина линии была постоянной для отдельной lamellipodium. Профиль интенсивности был сформирован для всех трех меток вдоль каждой линии. Полученные интенсивности сравнивались с помощью кросс-корреляционного анализа. Более подробное описание кросс-корреляционного анализа можно найти в другом месте (Bendat and Piersol 1971, Oppenheim and Schafer 1975; Brody 1999a, Brody, 1999b). Чтобы избежать артефактов из-за различий в общей интенсивности каждой метки, был рассчитан «кросс-коррелограмм с коррекцией в случайном порядке», также называемый кросс-ковариограммой. Кросс-коррелограмма и кросс-ковариограмма по существу эквивалентны корреляции и ковариации, которые обычно вычисляются для скаляров и задаются следующими уравнениями: documentclass [10pt] {article}
Usepackage {amsmath}
Usepackage {wasysym}
usepackage {amsfonts}
Usepackage {amssymb}
Usepackage {amsbsy}
usepackage {mathrsfs}
Usepackage {} PMC
Usepackage [Эйлера] {}: греческий
Pagestyle {пустой}

oddsidemargin -1.0in

Начать {документ}
begin {equation *} begin {matrix} r = { ll} xy { gg} \ v = { ll} xy { gg} — { ll} x { gg} { ll} y { gg} end {matrix} end {equation *} end {document}, где r — корреляция, а v — ковариация двух скаляров, x и y
Documentclass [10pt] {статья}
Usepackage {amsmath}
Usepackage {wasysym}
usepackage {amsfonts}
Usepackage {amssymb}
Usepackage {amsbsy}
usepackage {mathrsfs}
Usepackage {} PMC
Usepackage [Эйлера] {}: греческий
Pagestyle {пустой}

oddsidemargin -1.0in

Начать {документ}
begin {equation *}. end {equation *} end {document} <> указывает операцию ожидаемого значения. Кросс-коррелограмма и кросс-ковариограмма даются следующими уравнениями: documentclass [10pt] {статья}
Usepackage {amsmath}
Usepackage {wasysym}
usepackage {amsfonts}
Usepackage {amssymb}
Usepackage {amsbsy}
usepackage {mathrsfs}
Usepackage {} PMC
Usepackage [Эйлера] {}: греческий
Pagestyle {пустой}

oddsidemargin -1.0in

Начать {документ}
begin {equation *} begin {matrix} R left left (x right) right = { ll} I_ {1} left left (x right) right { otimes} I_ {2 } left left (x right) right { gg} \ V left left (x right) right = { ll} I_ {1} left left (x right) right { otimes} I_ {2} left left (x right) right { gg} — { ll} I_ {1} left left (x right) right { gg} { otimes } { ll} I_ {2} left left (x right) right { gg} end {matrix} end {equation *} end {document}, где R (x) — кросс-коррелограмма и V (x) является скорректированным в случайном порядке коррелограмме. I (x) — интенсивность вдоль одной из линий. Подписчики обозначают проверяемую метку. Ковариограммы были рассчитаны с использованием функции «xcov» в Matlab (панель обработки сигналов, Mathworks). Кросс-ковариограммы были нормированы так, что автокорреляция, скорректированная в случайном порядке, равна 1,0 при нулевом смещении. Автокорреляция вычисляется путем корреляции вектора с самим собой и, таким образом, дает самую высокую корреляцию. Эта нормализация приводит к кросс-ковариограмме, в которой значения на оси y соответствуют коэффициенту корреляции при каждом смещении.

FE65 взаимодействует с Mena in vitro, но релевантность этого взаимодействия с APP и функцией FE65 неизвестна. Кроме того, неизвестно, взаимодействует ли FE65 с APP и Mena одновременно. Чтобы проверить, возможен ли трехсторонний комплекс между APP, FE65 и Mena, мы тройным образом помечены клетками нейроглиомы человека H4 либо с помощью моноклонального антитела APP, поликлонального антитела Mena, и зеленого фаллоидина Oregon, либо с моноклональным антителом APP, поликлональным антителом FE65 и зеленым ореолом Oregon фаллоидин. Маркировка фаллоидинов позволила нам идентифицировать мембранные домены, в которых локализовались APP, FE65 и Mena. APP и Mena колокализовались на взъерошенных краях клеток, которые содержали характерную ламеллоподиальную структуру актина (рис.1, a-d). Фактически, края, содержащие APP и Mena, можно было идентифицировать, основываясь исключительно на наличии плотной сетки коротких актиновых филаментов. APP также колокализуется с FE65 в lamellipodia (рис.1, f-i). Чтобы избежать чрезмерной или недооценки колокализации, мы провели новый количественный объективный анализ колокализации (описанный в «Материалах и методах»). Количественная оценка интенсивности сигналов иммунофлуоресценции и кросс-корреляционного анализа показала, что APP и Mena (рис.1 e) и APP и FE65 (рис.1, j) действительно колокализуются, поскольку кросс-ковариограммы, полученные из профилей интенсивности ламелиподиальной линии, показывают значительную корреляцию без сдвига в пике.

Чтобы определить, существует ли трехсторонний комплекс APP-FE65-Mena, были проведены соосаждения и иммунопреципитации. Когда лизаты клеток H4 инкубировали с гибридным белком GST, содержащим цитоплазматический домен APP, FE65 осаждали на гранулах глутатион-сефароза путем взаимодействия с слитым белком APP (фиг.2а). Аналогичным образом, когда одни и те же лизаты инкубировали с гибридным белком GST, содержащим WW-домен FE65, Мена, связанная с слитым белком FE65, осаждалась на бусах глутатион-сефароза (фиг.2b). Наконец, когда лизаты из клеток MDCK, стабильно экспрессирующие как APP, так и FE65, подвергали иммунопреципитации антителами, выращенными против Mena, FE65 и APP были обнаружены в иммунопреципитатах путем иммуноблоттинга (фиг.2c и рис. D). Когда лизаты из клеток MDCK, стабильно экспрессирующие только APP, использовали бок о бок в том же эксперименте, APP не подвергали коиммуноосаждению с Mena, что указывает на то, что APP, обнаруженный в иммунопреципитатах, связанных с Mena, опосредованно через FE65. Эти данные дают сильную поддержку идее о том, что макромолекулярный комплекс, содержащий APP, FE65 и Mena, существует in vivo. Поскольку Мена, как известно, связывается с профилином и, как считается, регулирует динамику актина (Gertler et al., 1996; Lanier and Gertler, 2000), колокализация и взаимодействие APP и FE65 с Mena свидетельствуют о косвенной связи между комплексом APP-FE65 и ламеллиподиальный актиновый цитоскелет.

Чтобы подтвердить, что мембранные домены, содержащие APP и FE65, являются динамическими ламеллиподиальными мембранами, клетки H4 были дважды помечены антителами против APP и кортактина или FE65 и кортикала. Кортактин является актинсвязывающим белком, высоко обогащенным ламеллиподией (Wu and Parsons 1993). Оба APP (фиг.3, a-c) и FE65 (рис.3, e-g) локализованы специально для ламеллиподий, богатых кортактином. Маркировка FE65 и APP в ламеллиподии была специфической, так как конкуренция с избыточным растворимым антигеном устраняла ламеллиподиальное окрашивание (рис. 3d и рис. H). Мембраны, содержащие APP и FE65, также содержали еще один маркер динамических мембран Rac1 (данные не показаны). Rac1 является членом семейства Rho небольших GTP-связывающих белков, который после активации нацелен на мембраны, где он индуцирует образование ламелиподий (Bokoch et al., 1994; Nobes and Hall 1995). Это подтвердило, что маркированные края действительно были подвижными ламеллиподами клеток.

APP и Mena colocalized в lamellipodia (фиг.4b и f-h), но не в фокальных спайках (фиг.4b и c-e). Иногда APP и Mena были видны в тонких линиях по краям ламеллиподий, которые, скорее всего, соответствовали фокальным комплексам. Фокальные комплексы являются сайтами адгезии на основе интегрина, расположенными в основании выступающих и вздутых ламеллиподий (Hotchin and Hall 1995, Nobes and Hall 1995, Rottner et al., 1999b). Ламеллиподиальная актиновая сетка заканчивается в фокальных комплексах, роль которых неясна. Они не требуются для ламелиподиального образования, но могут быть важны для движения клеток или сигнализации.

В отсутствие моноклонального антитела к FE65 или Mena для двойной маркировки FE65 и Mena мы тестировали, был ли FE65 также избирательно обнаружен в мобильных мембранах путем маркировки сайтов адгезии с антифосфотирозиновыми антителами. Тирозин-фосфорилированные белки накапливаются в сайтах адгезии как в динамических, так и в статических мембранах, что делает фосфотирозин хорошим маркером как фокальных спаек, так и фокальных комплексов. FE65 колокализуется фосфотирозином в мембранных областях, который показывает характеристики ламеллиподий, таких как агрегаты актина и взъерошенные края (фиг.4i и m-o), но не в фокальных спайках (фиг.4i и j-l). Таким образом, как FE65, так и APP выборочно локализуются в мобильных мембранных отделениях, содержащих слабые места прикрепления клеток-субстратов.

В нескольких исследованиях была предложена роль APP в клеточной адгезии (Mattson 1997). Учитывая локализацию APP и FE65 в ламеллиподии, казалось, что они могут играть определенную роль в регуляции адгезии или сигнализации в интегрин-зависимых ламеллиподиальных фокальных комплексах. Поскольку интегрины, содержащие субъединицу интегрина β1, находятся в фокальных комплексах (Hotchin and Hall 1995, Rottner et al., 1999b), мы использовали β1-интегрин в качестве маркера. Для определения того, что FE65 и APP колокализуются с β1-интегрином на сайтах адгезии в ламеллиподии, клетки H4 были трижды мечены с моноклональным антителом β1-интегрина, зеленым фаллоидином Орегона и поликлональными антителами FE65 или APP. Lamellipodia были идентифицированы и выбраны для визуализации по их характерной взъерошенной структуре и актиновой сетке. APP и β1-интегрин колокализуются в ламеллиподии (рис.5, a-d). Аналогичную картину ламелиподиального окрашивания наблюдали при использовании антитела FE65 (фиг.5, f-i), как и ожидалось из данных о колокализации APP / FE65, представленных выше. Количественный анализ с помощью кросс-корреляции показал, что для маркировки APP и β1-интегрина, а также для APP и актина сигналы коррелировали без значительного сдвига в пике, что указывает на колокализацию (рис.5e). Как и ожидалось из колокализации FE65 и APP, сигнал FE65 также хорошо коррелировал с сигналами β1-интегрина и актина (фиг.5 j). Корреляция, как правило, была лучше в середине ламеллиподий. Фокальные комплексы не могут распространяться на боковые поверхности ламеллиподий или может быть предпочтительной колокализацией в направлении движения. Эти данные подтверждают идею о том, что FE65 и APP взаимодействуют в мобильных ламеллиподиях и, возможно, на слабых сайтах адгезии в этих мембранах.

Часто, когда клетки вырываются с их субстратов, места адгезии, которые закрепляли клетку на подложке, остаются позади. Эти сайты адгезии содержат много белков, связанных с сайтами адгезии в интактных клетках. APP можно найти на таких сайтах (Yamazaki et al., 1997). Чтобы проверить, присутствует ли FE65 в сайтах с адгезией без клеток, мы рассмотрели клетки H4, меченные антителами FE65 и β1-интегрина. Когда ламеллиподии отслаивали назад с поверхности, на которой выращивали клетки, оставшиеся места адгезии были помечены как антителом β1-интегрина, так и антителом FE65 (фиг.6, a и b). Это поразительно, поскольку ожидается, что FE65 будет растворимым белком. Чтобы подтвердить предыдущие сообщения об APP, оставшиеся сайты адгезии также были помечены APP-антителом (фиг.6c). Чтобы подтвердить специфичность ассоциации FE65 с APP-содержащими сайтами адгезии, параллельно использовалось антитело против X11 / Mint2, другого цитоплазматического белка, который может взаимодействовать с цитоплазматическим хвостом APP. Адгезионные сайты, содержащие APP, не были помечены антителом X11 / Mint2 (фиг.6d). Эти результаты также подтверждают идею о том, что комплекс FE65-APP колокализуется с β1-интегринами в фокальных комплексах.

Наконец, когда клетки были дважды помечены моноклональными антителами APP и поликлональным антителом Mena, APP и Mena могли быть найдены, связанные с теми же сайтами без клеточной адгезии (рис.6, e-g), поддерживая гипотезу о том, что FE65 и APP функционируют в фокальных комплексов как часть содержащего Мена макромолекулярного комплекса. Специфическая локализация APP и FE65 в фокальных комплексах, но не фокальные спайки, особенно интересна, поскольку ранее не сообщалось о различии в биохимическом составе этих двух структурно и функционально различных адгезионных структур (Rottner et al., 1999b).

Недавно было показано, что Мена локализуется в фокальных комплексах в выступающих ламеллиподиях (Rottner et al., 1999a). Это говорит о том, что FE65 и APP, возможно, в комплексе с Mena, могут играть роль в расширении мембраны. Чтобы дополнительно протестировать, если FE65 и APP могли участвовать в расширении ламелиподиальных клеток, мы вынуждали клетки в состояние, в котором мембраны активно расширялись и исследовали локализацию APP и FE65 в индуцированных ламеллиподиях. Чтобы индуцировать подвижность, сливные монослои MDCK-клеток, стабильно трансфицированные как APP, так и FE65, были ранены кончиком пипетки. В ответ на ранение клетки вдоль края раны сначала отправили ламеллиподии, а затем мигрировали в рану. Мы исследовали локализацию APP и FE65 в раненых монослоях с помощью иммунофлуоресцентной маркировки моноклональными антителами APP и поликлональными FE65 антителами. Конфокальная микроскопия монослоев, фиксированных и помеченных через 2 часа после ранения, показала, что оба белка локализуются в расширяющихся ламеллиподиях (рис.7, а-с). Внутри ламеллиподий FE65 и APP колокализуются тонкой линией вблизи ламеллиподиального края. Интересно, что не все ламеллиподии, вызванные ранами, были помечены антителами APP или FE65, что указывает на то, что эти белки специфически обнаруживаются в ламеллиподиях в определенном функциональном состоянии. Это согласуется с опубликованными наблюдениями для Мены, которые обнаруживаются в выступающих, но не втягивающихся ламеллиподиях (Rottner et al., 1999a). Важно отметить, что иммунофлуоресцентная маркировка раненых MDCK-монослоев с антителами APP и Mena показала, что индуцированные ламеллиподии, содержащие APP, также содержат Mena (фиг.7, g-i). Это подтверждает идею о том, что комплекс FE65-APP локализуется в мобильных мембранах и может функционировать в регуляции подвижности мембраны.

Для обеспечения того, чтобы выступающие края, содержащие APP и FE65, были вызваны ранениями, а не просто общим свойством, общим для всех краев клеток MDCK, мы помещали кластеры клеток MDCK с антителами APP и FE65 без индукции моторики при ранении. В этих условиях клетки MDCK «отдыхают» и обычно не расширяют ламеллиподии (Fenteany et al., 2000). APP и FE65 иногда локализовались на сайтах клеточных клеток, но не локализовались на краях стационарных кластеров, где не было контакта с другими клетками (рис.7, d-f).

Раннее исцеление использовалось ранее как показатель скорости миграции или движения клеток (Rosen and Misfeldt 1980, Fenteany et al., 2000). В этом контексте термины «миграция клеток» и «движение клеток» предназначены для охвата любого из механизмов, участвующих в таких процессах, включая, но не ограничиваясь ими, динамику актина, мембранную динамику и адгезию. В качестве анализа возможной роли комплекса APP-FE65 в движении клеток мы измерили скорость закрытия ран, образовавшихся, как описано выше. Мы сравнили раневую оболочку 1 г после ранения сливных монослоев клеток MDCK дикого типа, MDCK-клеток, стабильно трансфецированных APP или FE65, и MDCK-клетки, стабильно трансфецированные как APP, так и FE65. В качестве меры закрытия раны мы забивали раны как полностью закрытые, частично закрытые или полностью открытые (Таблица). Ни одна рана дикого типа не была закрыта после 1 дня заживления ран (n = 25). С избыточной экспрессией APP 17% ран были полностью закрыты, а 74% были частично закрыты после 1 д (n = 23). За тот же период 91% ран были полностью закрыты и 9% были частично закрыты, когда клетки выражали как APP, так и FE65 (n = 57). Аналогичные результаты были замечены с дополнительными стабильно сверхэкспрессирующими клональными клеточными линиями. Эффекты FE65 и APP вместе не могли быть учтены только FE65, поскольку сверхэкспрессия FE65, но не APP, дала полное закрытие только 20% ран (n = 20). Таким образом, APP и FE65 ускоряют закрытие раны, а эффекты обоих белков значительно усиливаются дополнительной сверхэкспрессией другой, что согласуется с ролью комплекса APP-FE65 в регуляции движения клеток.

Затем мы определили скорость миграции клеток вдоль края раны. Сверхэкспрессия FE65 и APP увеличивала скорость перемещения клеток кромки раны по сравнению с клетками, трансфецированными только APP (фиг.8). К 15 часам выздоровления различия в расстоянии, которое проходили сверхэкспрессирующие клетки FE65 и APP, по сравнению с сверхэкспрессирующими клетками APP, достигли значимости (n = 18, P <0,05 по результатам теста ANOVA и Fisher PLSD post hoc). Морфология конфлюэнтных клеток и клеток на краю раны не была заметно изменена при трансфекции APP или FE65 (данные не показаны). Эти данные показывают, что FE65 и APP увеличивают скорость миграции клеток на краю раны. Хотя мы не можем различать изменения скорости движения из-за измененной адгезии, измененной динамики актина или того и другого, эти данные сильно поддерживают роль комплекса FE65-APP в регуляции клеточного движения.

Здесь мы приводим убедительные доказательства того, что APP участвует в подвижности клеток и что эта функция APP модулируется FE65. АФР-зависимое увеличение скорости миграции клеток усиливалось при сверхэкспрессии FE65. Кроме того, APP и FE65 колокализуются в местах адгезии динамических, но не статических мембран. Получив дополнительную поддержку для роли комплекса APP-FE65 в регуляции клеточного движения, мы недавно обнаружили, что APP и FE65 колокализуются в другой типе мобильной мембраны, нейронный конус роста in vivo (Sabo, SL, AF Ikin, JD Буксбаум, П. Грингард, неопубликованные наблюдения).

На основании представленных здесь данных и ранее опубликованных результатов мы предполагаем, что APP и FE65 регулируют пластинчатую подвижность как часть более крупного макромолекулярного комплекса (рис.9). Ранее было показано, что FE65 и Mena взаимодействуют в клеточных лизатах (Ermekova et al., 1998). Мы показали здесь, что FE65 и APP колокализуются с Mena в lamellipodia и что оба APP и Mena взаимодействуют с FE65 одновременно. В свою очередь, Мена, как полагают, регулирует актиновый цитоскелет через его взаимодействие с профилином (Gertler et al., 1996; Lanier et al., 1999; Lanier and Gertler, 2000). Интересно, что участки связывания FE65 и профилина в Мена перекрываются, что указывает на то, что комплекс APP-FE65 может отрицательно регулировать ассоциацию Mena с профилином. Интегрины концентрируются в ламеллиподиальных сайтах адгезии (Hotchin and Hall 1995, Rottner et al., 1999b), где, как показано здесь, они колокализуются с APP и FE65. В цитоплазматическом домене β1-интегринов имеются два моста NPXY (Howland et al., 1995). Возможно, что больше NH2-терминального PID FE65 взаимодействует с одним из них. Мы еще не знаем, могут ли различные белки этого макромолекулярного комплекса взаимодействовать одновременно или последовательно, чтобы регулировать движение клеток.

Мы предполагаем, что по крайней мере некоторые из эффектов этого макромолекулярного комплекса, содержащего APP- и FE65, на клеточное движение опосредованы Меной. Недавно было показано, что lamellipodial Mena регулирует подвижность клеток в фибробластах (Bear et al., 2000). В отличие от увеличения клеточного движения, вызванного FE65 и APP, Мена снижает подвижность клеток. Кроме того, Ena, гомолог Drosophila Mena, отрицательно регулирует миграцию конуса роста через взаимодействие с Robo, трансмембранным рецептором, который опосредует отталкивание аксонов на средней линии (Bashaw et al., 2000). Возможно, что Мена действует как коммутатор, связанный с Robo или с комплексом FE65-APP: когда Мена связывается с Robo, подвижность тормозится, но когда условия сдвигаются так, что Mena ассоциируется с комплексом FE65-APP, а не с Robo, торможение высвобождается, а подвижность увеличивается. Потому что отрицательная регуляция подвижности Мена была видна Bear et al. 2000 с избыточной экспрессией и недостаточной экспрессией в ламеллиподии, вполне вероятно, что в «нестимулированном» состоянии Мена связывается с Robo-подобным рецептором, чтобы отрицательно регулировать подвижность, тогда, в ответ на некоторый сигнал, Мена завербовывается в комплекс FE65-APP и от Robo-подобного рецептора. Сверхэкспрессия FE65 и APP может увеличить локальную концентрацию комплекса FE65-APP в достаточной степени, чтобы нанять некоторую Мена из Robo-подобного рецептора в FE65-APP. Мы еще не знаем, какие сигналы регулируют взаимодействие между FE65 и Mena, FE65 и APP. Если Мена связывается только с FE65, когда FE65 интегрируется с APP, либо взаимодействие может служить источником регулирования.

Для перемещения клетки должны привязать свои подвижные мембраны к поверхности или матрице, по которой они сканируются, но эти якоря должны быть более динамичными, чем места сцепления, обнаруженные в стационарных мембранах. Мы показываем, что FE65 и APP колокализуются β1-интегринами в относительно нестабильных фокальных комплексах, но не обнаруживаются в более устойчивых фокальных спайках. Это особенно интересно, поскольку фокальные комплексы могут быть предшественниками фокальных спаек (Rottner et al., 1999b), и до сих пор, насколько нам известно, не было обнаружено каких-либо различий в биохимическом составе этих двух типов адгезионных сайтов. Комплекс APP-FE65 может помочь дестабилизировать сайты адгезии. Влияние FE65 и APP на миграцию клеток в анализе заживления ран может быть связано с изменениями адгезии.

Поскольку мы показали ранее, что FE65 увеличивает трафик APP на клеточную поверхность (Sabo et al., 1999), мы предлагаем, чтобы FE65 регулировал роль APP в движении клеток путем ориентации APP на клеточную поверхность. APP может функционировать там как трансмембранная молекула или как секретируемый фрагмент. Усредненная среда из клеток, сверхэкспрессирующих APP, значительно не увеличивала скорость миграции краев раны в анализе заживления ран (данные не показаны). К сожалению, эти эксперименты не позволили нам провести различие между этими двумя механизмами, поскольку локальная концентрация секретируемых фрагментов APP в ламеллиподиях может быть не такой высокой во время купания в кондиционированной среде, как это происходит, когда фрагменты APP секретируются непосредственно из клеток раневого края ,

Имеются некоторые доказательства, подтверждающие идею о том, что роль APP и FE65 в регуляции движения клеток может быть непосредственно связана с протеолитической обработкой APP. Ранее мы показали, что FE65 увеличивает протеолитическую обработку APP (Sabo et al., 1999). Кроме того, TACE, протеаза семейства ADAM, расщепляет APP на поверхности клетки в ответ на активность PKC (Buxbaum et al., 1998), которая также, как известно, стимулирует подвижность клеток. Активность интегрина также регулируется протеолитической обработкой ее α-субъединиц (Delwel et al., 1996), вероятно, протеазами семейства ADAM (Chen et al., 1999). Секретируемые фрагменты APP могут конкурировать с лигандами внеклеточных матриц для связывания с интегринами или с лигандом APP, снижая прочность места адгезии и стимулируя подвижность. Было показано, что экзогенное применение APP-фрагментов может увеличить рост нейритов (Koo et al., 1993; Jin et al., 1994; Perez et al., 1997). Более того, наиболее распространенные секретируемые фрагменты APP содержат последовательность RHDS, которая напоминает сайт связывания интегрина на лиганде внеклеточного матрикса β1-интегрина, фибронектин (Sabo et al., 1995) и, следовательно, потенциально может взаимодействовать с интегринами через эту последовательность , Интересно отметить, что пресенилины, которые также регулируют протеолитическую обработку APP (Haass and De Strooper 1999), недавно были обнаружены на поверхности ламеллиподий (Schwarzman et al., 1999).

В последнее время наблюдается большой интерес к белкам, которые выполняют двойные функции в регуляции подвижности мембран на основе актина и при транспортировке белков в плазматическую мембрану или из нее. Например, члены семейства Rho небольших GTP-связывающих белков регулируют подвижность клеток и участвуют в регуляции эндоцитарного пути (Lamaze et al., 1996; Kroschewski et al., 1999; Merrifield et al., 1999). Было показано, что как миозин II, моторный белок на основе актина, так и cdc42, активация которого индуцирует образование филоподиальных актиновых шипов, было показано, что они регулируют секреторный оборот (Musch et al., 1997; Kroschewski et al., 1999). В дополнение к своей роли в подвижности мембран на основе актина FE65 регулирует перенос APP на плазматическую мембрану (Sabo et al., 1999). Это помещает FE65 в растущее семейство двойных функциональных белков.

Мы благодарим д-ра Майкла Сценика за вдохновляющие дискуссии о взаимной корреляции. Мы также благодарим д-ра. Эдвард Х. Ку и Фрэнк Гертлер за антитела.

Эта работа была поддержана грантом государственной службы здравоохранения США AG09464 (П. Грингард), грантом по обучению национальных институтов здравоохранения GM07524 (С.Л. Сабо) и стипендией Университета Рокфеллера (С.Л. Сабо).

Сокращения, используемые в этой статье: APP, белок-предшественник амилоида; NGS, нормальная сыворотка козы; PID, домен взаимодействия белка.

Закрытие раны после 1 дня

Конфлюэнтные монослои клеток MDCK дикого типа (-APP / -FE65), MDCK-клетки, стабильно сверхэкспрессирующие APP (+ APP / -FE65) или FE65 (-APP / + FE65) и MDCK-клетки, стабильно сверхэкспрессирующие как APP, так и FE65 (+ APP / + FE65), выращенные на сетках, были ранены кончиком пипетки. Ранам разрешалось лечить на 1 д, а затем исследовать на пересечениях сетки и забивать как полностью закрытые, частично закрытые или полностью открытые.

APP colocalizes с FE65, Mena и актином в lamellipodia. Ламеллиподии характеризуются агрегатами актина и плотной сеткой коротких актиновых филаментов и поэтому могут быть выбраны для визуализации на основе их актиновой структуры, в то время как слепые к иммуноблоке. Изображения представлены в псевдоколоре. (a-d) Изображение с высоким увеличением клеток H4, трижды помеченных моноклональными антителами APP (a), поликлональным антителом Mena (b) и зеленым конъюгированным фаллоидином (c) Орегона, затем исследуется конфокальной микроскопией. Наложение APP, Mena и актина обозначается белым в наложении (d). (f-i) Изображение с высоким увеличением клеток H4, трижды меченных моноклональными антителами APP (f), поликлональными антителами FE65 (g) и конъюгированным с орегоном фаллоидином (h), затем исследуется конфокальной микроскопией. Перекрытие APP, FE65 и актина обозначается белым в наложении (i). (e и j) Кросс-ковариограммы из кросс-корреляционного анализа APP, Mena и актина (e) и APP, FE65 и актина (j) в ламеллиподии. Линии были вытянуты перпендикулярно ламеллиподиальному краю (обозначены оранжевым цветом и обозначены a’-e для APP, Mena и actin и f’-j ‘для APP, FE65 и актина). Интенсивности определяли для каждой линии и кросс-ковариограмм, рассчитанных, как описано в «Материалах и методах». Все приведенные здесь кросс-ковариограммы, за исключением с ‘для Мены и актина, имеют пики> 0,5, что указывает на значительную корреляцию. Ни один из них не имеет смещения, превышающего полуширину на половине высоты, что указывает на колокализацию. Бары, 5 мкм.

APP и Mena одновременно взаимодействуют с FE65. (a и b) лизаты клеток H4 инкубировали с гибридными белками GST, соответствующими либо цитоплазматическому домену APP (APP C50-GST), либо WW-домену FE65 (FE65 WW-GST) для осаждения глутатион-сепарарозой. Осажденные комплексы иммуноблоттировали антителами FE65 (a) и Mena (b), соответственно. В качестве контроля неспецифической соосаждения эксперименты проводились параллельно с GST. (c и d) Гомогенаты из клеток MDCK, которые сверхэкспрессировали как клетки APP, так и FE65 (+ FE65) и MDCK, которые сверхэкспрессировали APP, но не FE65 (-FE65), были иммунопреципитированы антителами Mena. Затем иммунопреципитаты иммуноблоттировали APP (c) и FE65 (d) антителами. APP coimmunoprecipated с Mena только тогда, когда FE65 присутствовал.

APP и FE65 колокализуются β1-интегринами и актином в ламеллиподиях. (a-e) клетки H4, трижды помеченные поликлональными антителами APP (a), моноклональным антителом β1-интегрина (b) и зеленым конъюгированным фаллоидином (c). Перекрытие всех трех белков обозначается белым в наложении (d). (f-j) клетки H4, трижды помеченные поликлональным антителом FE65 (f), моноклональным антителом β1-интегрина (g) и зеленым конъюгированным фаллоидином (h) Орегона. Перекрытие всех трех белков обозначается белым в наложении (i). (e и j) Кросс-корреляционный анализ колокализации APP и FE65 с β1-интегринами и актином в фокальных комплексах. Линии были вытянуты перпендикулярно ламеллиподиальному краю (обозначены оранжевым цветом и обозначены a’-e для APP и f’-k ‘для FE65). Интенсивности определяли вдоль каждой линии и поперечных ковариаграмм, рассчитанных, как описано в «Материалах и методах». Все поперечные ковариаграммы имеют пики> 0,5, что указывает на значительную корреляцию. Ни один из них не имеет смещения, превышающего полуширину на половине высоты, что указывает на колокализацию. Бары, 10 мкм.

Мембраны, обогащенные APP и FE65, также обогащены кортактином, маркером ламеллиподий. (a-c) клеток H4, иммуноблочных с комбинацией поликлонального антитела APP (a) и моноклонального антитела кортатина (b). Наложение обозначается желтым в наложении (с). (d) Ламеллиподиальное окрашивание APP устраняется путем предварительной инкубации APP-антитела с избытком растворимого антигена. (e-g) клетки H4, иммуномеханизированные комбинацией поликлональных антител FE65 (e) и моноклонального антитела кортактина (f). Наложение обозначается желтым в наложении (g). (h) иммунофлуоресценцию FE65 устраняют путем предварительной инкубации антител FE65 с избытком растворимого антигена.

APP и FE65 накапливаются в мобильных ламеллиподиях, но не в очаговых спайках. Стрелки указывают расположение фокальных комплексов и наконечников стрелок, указывающих расположение фокальных спаек. (a) Принципиальная схема. Фокальные спайки обнаруживаются на концах стресс-волокон в стабильных мембранах, тогда как фокальные комплексы фиксируют сетку коротких актиновых филаментов на подложке под подвижными ламеллиподами клетки. (b-h) клетки H4, трижды помеченные комбинацией моноклональных антител APP, поликлонального антитела Mena и зеленого фаллоидина Oregon. Изображения меченых клеток собирали с помощью конфокальной микроскопии. (b) Наложение APP (красный), Mena (зеленый) и актин (синий). Перекрытие окрашивания для всех трех обозначается белым. (c-e) Отдельные сигналы из сплошной коробки в панели b для APP (c), Mena (d) и actin (e). Обратите внимание на отсутствие иммунореактивности APP от фокальных спаек. (f-h) Отдельные сигналы из штрихового поля в панели b для APP (f), Mena (g) и actin (h). Обратите внимание, что APP colocalizes с Mena в тонкой линии на краю lamellipodia. (i-o) H4, тройной меченый комбинацией поликлональных антител FE65, моноклонального антитела фосфотирозина и зеленого фаллоидина Oregon. Фосфотирозиновые антитела использовали здесь в качестве маркера для сайтов адгезии, так как антитело FE65 и антитело Mena были выращены у кроликов. (i) Наложение FE65 (красный), фосфотирозин (зеленый) и актин (синий). Перекрытие окрашивания для всех трех обозначается белым. (j-l) Индивидуальные сигналы из сплошной коробки в панели i для FE65 (j), фосфотирозина (k) и актина (l). Обратите внимание на отсутствие иммунореактивности FE65 от фокальных спаек. (м-о) Индивидуальные сигналы от пунктирной коробки в панели i для FE65 (м), фосфотирозина (n) и актина (o). Обратите внимание, что ламеллиподии маркируются как FE65, так и фосфотирозиновыми антителами. Бар, 10 мкм.

FE65 и APP колокализуются в выступающих ламеллиподиях, вызванных ранениями. (a-c) Ламеллиподиальный выступ был вызван ранением сливного монослоя MDCK-клеток, стабильно трансфицированных как APP, так и FE65. Монослой оставляли для восстановления в течение 2 ч, достаточно времени, чтобы обеспечить возможность ламелиподиального растяжения в рану, затем фиксировали и маркировали антителами FE65 и APP. (a) Изображение с высоким увеличением протяжного ламеллипомина, меченного поликлональными антителами FE65. (б) Тот же самый ламеллиполид, меченный моноклональными антителами APP. (c) Наложение изображений на a и b. Колокализация FE65 и APP обозначается желтым в наложении. APP и FE65 колокализуются тонкой линией на краю расширяющегося lamellipodium, что согласуется с локализацией в фокальных комплексах. (d-f) Изображение с меньшим увеличением кластеров «покоящихся» клеток MDCK, меченных антителами FE65 (d) и APP (e). (f) Наложение изображений на панели d и e. APP и FE65 колокализуются при контактах с ячейками (стрелки), но не на краях кластеров (наконечники стрел). (g-i) Изображение с высоким увеличением растягивающего ламеллиподия, вызванное ранениями и помеченное поликлональными антителами Мена (g) и моноклональными антителами APP (h). Colocalization обозначается желтым в оверлее (i).

FE65 и APP остаются связанными с фокальными комплексами, оставленными после отделения ламеллиподий. (a и b) клетки H4 были помечены поликлональными антителами FE65 и моноклональным β1-интегринным антителом. Когда ламеллиподий отделяли от субстрата, интегрин-зависимый фокальный комплекс оставался позади и помечен как антителами FE65 (а), так и антителом интегрина (б). (c и d) клетки H4 были помечены поликлональным антителом APP и моноклональным антителом X11 / Mint. Когда ламеллиподии были отделены от субстрата, места адгезии, оставленные позади, были помечены антителом APP (с), но не с антителом X11 / Mint (d). (e-g). Аналогичные сайты адгезии, которые дважды помечены моноклональными антителами APP (e) и поликлональным антителом Мена (f). Перекрытие между APP и Mena в сайтах адгезии обозначается желтым в наложении (g). Стрелки указывают на области, которые содержат высокие уровни как APP, так и Mena. Бары, 10 мкм.

FE65 повышает способность APP увеличивать скорость заживления ран. Конфлюэнтные монослои клеток MDCK, сверхэкспрессирующих APP (+ APP / -FE65, a, c, e и g) или оба APP и FE65 (+ APP / + FE65, b, d, f, и h) выращивались на сетках, затем раненых с наконечником пипетки. Раны фотографировались сразу после ранения (a и b). Те же самые точки на сетках снова фотографировались 9 (c и d), 12 (не показаны), 15 (e и f), 18 (не показаны) и 21 ч (g и h) после ранения. (i) Расстояние, пройденное краями раны, определялось в тех же трех точках на каждой из шести ран. Данные представляют собой средства ± SE. * P <0,05, ** P <0,001 и ** P <0,0001 по ANOVA. Аналогичные результаты наблюдались и с двумя дополнительными сверхэкспрессирующими клонов FE65.

APP и FE65, вероятно, регулируют подвижность мембраны как часть более крупного макромолекулярного комплекса. На схеме изображены возможные компоненты макромолекулярного комплекса и их предполагаемые взаимодействия. FE65 может взаимодействовать с APP через его COOH-терминал PID и с Mena через его WW-домен. Мена модулирует полимеризацию актина, возможно, благодаря его взаимодействию с профилином, тогда как интегрины косвенно связаны с актином через множество интегрин- и актинсвязывающих белков, таких как -актинин. Регулирование различных взаимодействий могло бы связать экологические сигналы с динамикой актина в ламеллиподиальном фокальном комплексе.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *