Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Пресенилин 1 отрицательно регулирует сигнал β-catenin / T Cell Factor / Lymphoid Enhancer Factor-1 независимо от протеинов-предшественников β-амилоида и обработки Notch

Presenilin 1 Negatively Regulates β-Catenin/T Cell Factor/Lymphoid Enhancer Factor-1 Signaling Independently of β-Amyloid Precursor Protein and Notch Processing
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2195782/

В дополнение к его документированной роли в протеолитической обработке Notch-1 и белка-предшественника β-амилоида пресенилин 1 (PS1) ассоциируется с -катенином. В этом исследовании показано, что это взаимодействие играет критическую роль в регуляции передачи сигналов β-catenin / T Cell Factor / Lymphoid Enhancer Factor-1 (LEF). Дефицит PS1 приводит к накоплению цитозольного β-катенина, что приводит к β-catenin / LEF-зависимому увеличению транскрипции циклина D1 и ускоренному входу в S-фазу клеточного цикла. И наоборот, PS1 специально подавляет LEF-зависимую транскрипцию дозозависимым образом. Гиперпролиферативный ответ может быть отменен путем повторного введения экспрессии PS1 или сверхэкспрессирующего аксина, но не мутанта PS1, который не связывает β-катенин (PS1Δcat) или двух разных семейных мутантов болезни Альцгеймера. Напротив, PS1Δcat восстанавливает протеолитическое расщепление Notch-1 и генерацию Aβ в клетках с дефицитом PS1, что указывает на то, что функция PS1 в модулирующих уровнях β-катенина может быть отделена от его ролей в облегчении расщепления γ-секретазы белка-предшественника β-амилоида и в Notch -1. Наконец, мы показываем измененный ответ на сигнализацию Wnt и нарушение ubiquitination β-catenin в отсутствие PS1, фенотипа, который может объяснить повышенную стабильность в клетках с дефицитом PS1. Таким образом, PS1 добавляется к молекулам, которые, как известно, регулируют быстрый оборот β-catenin.

Presenilin 1 (PS1) является основным геном, ответственным за семейную болезнь Альцгеймера (FAD). Унаследованные мутации в PS1 вызывают раннюю форму болезни Альцгеймера (AD) с аутосомно-доминантной картиной (Levy-Lahad et al., 1995; Sherrington et al., 1995). PS1 необходим для конститутивного протеолитического расщепления белка-предшественника β-амилоида (APP) для генерации амилоидного β-пептида (Aβ), тогда как мутации в PS1 избирательно увеличивают более длинные формы Aβ (De Strooper et al., 1998; обзор Haass and De Strooper 1999). PS1 представляет собой многопроходный трансмембранный белок, локализованный главным образом в эндоплазматическом ретикулуме и мембранах Гольджи в ненейрональных клетках, а также в клеточных телах и дендритах в нейронах (Cook et al., 1996; Anna et al., 1999) и выражен во всех тканях (Doan et al., 1996; Kovacs et al., 1996; De Strooper et al., 1997; Lehmann et al., 1997; Li et al., 1997). Недавние исследования также показали, что PS1 взаимодействует с калсенилином (Buxbaum et al., 1998) и присутствует в комплексах кадгерин / катенин и локализуется в межклеточных контактах (Georgakopoulos et al., 1999). Полноразмерный PS1 подвергается конститутивной эндопротеолитической обработке с образованием аминоконцевого фрагмента ~ 28 кД и карбоксиконцевого фрагмента ~ 17 кД, которые остаются стабильными как часть одного и того же комплекса (Thinakaran et al., 1996a; Zhang et al., 1998b ). Внезапные мыши PS1 умирают в конце эмбрионального развития или вскоре после рождения, проявляют церебральные кровоизлияния и аномальное паттернирование осевого скелета и спинномозговых ганглиев (Shen et al., 1997; Wong et al., 1997). В Caenorhabditis elegans гомолог класса S1-1 PS1 облегчает передачу сигналов Lin-12 / Notch (Levitan and Greenwald 1995). В последних докладах были убедительные доказательства того, что эта деятельность является высококонсервативной. В частности, существует абсолютное требование для PS1 в протеолизе трансмембранного домена Notch после связывания лиганда с последующим высвобождением внутриклеточного домена Notch (NICD), который транслоцирует в ядро ​​(De Strooper et al., 1999; Struhl and Greenwald 1999; Ye et al., 1999).

Было показано, что PS1 взаимодействует с β-катенином, и эта ассоциация участвует в модуляции сигнального пути Wnt-β-catenin (Zhou et al., 1997; Murayama et al., 1998; Yu et al., 1998; Kang et al., 1999; Stahl et al., 1999). Белки Wnt представляют собой семейство важных для развития сигналов сигнальных молекул, в основе которых лежит регуляция цитозольного пула β-catenin (рассмотренная в Willert and Nusse 1998). В отсутствие Wnt цитозольный β-catenin быстро превращается протеасомой в путь, требующий фосфорилирования гликогенсинтазой киназой-3β (GSK-3β) и убиквитинированием. Аденоматозные полипозы coli (APC) и аксины объединяются для позитивной модуляции активности GSK-3β и способствуют деградации β-катенина (Hart et al., 1998; Ikeda et al., 1998). Связывание Wnt-лигандов с рецепторами клеточной поверхности запускает путь, который антагонизирует деградацию β-катенина путем инактивации GSK-3β, что приводит к стабилизации β-катенина и последующей транслокации в ядро. В ядре β-catenin связывается с фактором транскрипции фактора Т-клеточного фактора / лимфоидного фактора-1 (LEF) и опосредует транскрипционную активацию генов-мишеней, расположенных ниже по течению (Behrens et al., 1996).

Было показано, что ряд генов активируется комплексом β-catenin / LEF. Первыми двумя идентифицированными генами были c-myc и cyclin D1 (He et al., 1998; Shtutman et al., 1999; Tetsu and McCormick, 1999). Ген циклина D1 кодирует регуляторную субъединицу голофермента, который фосфорилирует и инактивирует белок-супрессор опухолей Rb. Транскрипционная индукция гена циклина D1 несколькими онкогенами (Ras, Src, Erb-B2, Rac, рассмотренная в Sherr 1996) способствует увеличению избытка белка cyclin D1. Установлено требование циклан D1 в прогрессировании фазы G1, вызванное различными митогенами и онкогенами. Фибробласты, полученные из мышей с удаленным геном cyclin D1, уменьшают пролиферативную способность и увеличивают апоптоз, что указывает на критическую роль циклона D1 в клеточной пролиферации и выживаемости (Brown et al., 1998; Albanese et al., 1999).

Хотя PS1, по-видимому, модулирует стабильность β-катенина in vitro, сообщается спорные данные. Хотя мы и Мураяма и др. 1998, показали, что PS1 дикого типа отрицательно регулирует стабильность β-катенина (Kang et al., 1999), другие (Zhou et al., 1997; Weihl et al., 1999) представили доказательства того, что PS1 стабилизированного β-catenin дикого типа. Таким образом, недавнее открытие, что cyclin D1 активируется посредством передачи сигналов LEF, дает возможность проверить нашу гипотезу о том, что PS1 является отрицательным регулятором стабильности β-катенина. В настоящем исследовании мы показали, что PS1 действительно облегчает быстрый оборот β-catenin. В нулевых клетках PS1 мы обнаружили повышенную стабильность β-катенина, более высокие уровни белка cyclin D1 и повышенную скорость прогрессирования фазы G1-S в клеточном цикле. Гиперпролиферативный ответ можно обратить вспять путем повторного введения экспрессии PS1 или сверхэкспрессирующего аксина, но не с помощью форм PS1, лишенных сайта связывания β-катенина или укрывающихся FAD-мутаций, и не зависит от сигналов Notch-1 и генерации Aβ. Наконец, мы показываем измененный ответ на сигнализацию Wnt и нарушаем ubiquitination β-catenin в отсутствие PS1, предлагая потенциальный механизм того, где PS1 облегчает оборот β-катенина.

Были описаны PS1-поликлональные антитела J27 (против остатков 27-42), PS1NT (1-65), αPS1Loop (против остатков 319-442) и моноклональное антитело PSN2 (против остатков 31-56) (Thinakaran et al., 1996b, Thinakaran et al., 1998; Zhang et al., 1998b, Kang et al., 1999). APP-антитела 3134, 26D6 и CT15 описаны (Soriano et al., 1999; Lu et al., 2000). Поликлональное антитело против c-myc было получено от BabCO. Другие используемые моноклональные антитела были против β-катенина (Transduction Laboratories и Sigma-Aldrich), убиквитина, cyclin D1, cyclin A и Cdc2 (Calbiochem), β-тубулина (Amersham Pharmacia Biotech) и 9E10 против c-myc (DSHB) , используемый против c-myc-tagged ΔEMV и ICV Notch-1 белков.

КДНК, кодирующую последовательность PS1 дикого типа, лишенную аминокислот 330-360 (PS1Δcat), генерировалась посредством ПЦР-опосредованной делеции и подтверждалась секвенированием. Дикий тип PS1, PS1Δcat и axin (подарок Фрэнка Костантини, Колумбийский университет, Нью-Йорк, Нью-Йорк) были субклонированы в pIND (Invitrogen) или pBabe-puro (Morgenstern and Land 1990). Последний вектор использовался для создания репликационно-некомпетентных ретровирусов в упаковочной клеточной линии GP + E-86. Myc-tagged NH2-терминальная усеченная конструкция Notch-1 (ΔEMV, в которой метионин 1726 мутирован в валин для устранения инициации трансляции в этом месте, описанный в Kopan et al., 1996) и Notoc-1 внутриклеточный домен (ICV, в котором валин 1744 является первой аминокислотой после инициации метионина) были предоставлены доктором Р. Копаном (Вашингтонский университет, Сент-Луис, Миссури). Первый представляет собой искусственную конструкцию, специально предназначенную для исследования трансмембранного расщепления белка Notch-1 (Kopan et al., 1996). Ранее описывались репортерные конструкции промотора-промотора человеческого цикла D1-163CD1Luc, -163ΔlefCD1Luc, -1745CD1Luc, а также репортер PALUC, который содержит 7 kb промотора cyclin A человека и промотора cyclin E (Shtutman et al., 1999).

PS1 — / — и PS1 +/- фибробласты были приготовлены из целых эмбрионов на эмбриональном дне 15,5. Голова и печень отбрасывали и тела растирали в 5 мл 0,25% раствора трипсина / PBS и инкубировали при 37 ° С в течение 15 мин с непрерывным вращением. Тканевому мусору давали оседать при 4 ° С и супернатант с клетками переносили в новую пробирку. Свежий трипсин добавляли к оставшейся ткани, и процесс повторяли три раза. Клетки всех инкубаций объединяли, центрифугировали при 200 г и ресуспендировали в среде RPMI, содержащей 10% FCS. Клетки высевали на колбы на 25 см2 и дали достичь слияния (обычно ~ 16 ч). Клетки из ранних проходов (от двух до пяти) использовались во всех экспериментах. Для получения первичных фибробластов, экспрессирующих PS1 или PS1 дикого типа, не обладающих аминокислотами 330-360 (PS1), ранние первичные фибробласты были инфицированы соответствующими ретровирусами в присутствии 10 мкг / мл полибрена в течение 8 ч и позволили расти до слияния без выбор антибиотиков. Клетки затем трипсинизировали и использовали непосредственно для указанных экспериментов. Использовались только клетки, прошедшие один раз после заражения. Уровни экспрессии как PS1, так и PS1-типа дикого типа в клетках PS1 — / — были обнаружены с помощью Вестерн-блоттинга и были сопоставимы с уровнями в клетках PS1 +/-. Были описаны Immortalized fibroblasts (используемые в исследованиях Notch-1 трансфекций и активации транскрипции) и клетки EcR293, индуцируемые экспрессией PS1 и PS1-дикого типа дикого типа (Kang et al., 1999; Soriano et al., 2001).

Культивированные клетки лизировали в 1% 3 — [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -2-гидрокси-1-пропансульфонате (CHAPS) буфере, содержащем 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 100 мкг / мл аминоэтилбензолсульфонилфторида (AEBSF), и 10 мкг / мл лейпептина на льду в течение 20 мин. Лизаты преклировали с нормальной сывороткой кролика и агарозой белка А (для кроличьих поликлональных антител) или с антимышиной IgG-агарозой (для мышиных моноклональных антител). Затем очищенные лизаты инкубировали с первичным антителом и агарозой агарозы или агарозы белка А в агарозе в течение 3 ч при 4 ° С (Kang et al., 1999). Иммунопреципитаты дважды промывали CHAPS-буфером и белки разделяли на SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Коиммунопреципитированные белки были обнаружены с помощью Вестерн-блоттинга, как указано выше.

Ночные культуры эмбриональных фибробластов из 6-луночных планшетов для культивирования культуры инкубировали в среде, свободной от метионина, в течение 20 мин с последующей метаболической маркировкой 200 мкКи / мл [35S] метионина в течение 20 мин и чеканкой в ​​течение указанных периодов. В каждый момент времени клетки помещали на лед и дважды промывали ледяным PBS. Для выделения цитозольных белков клетки инкубировали дважды в течение 10 мин с 0,1% сапониновым буфером, содержащим 25 мМ Hepes и 75 мМ ацетата калия. Две растворимые фракции объединяли и β-catenin иммунопреципитировали моноклональным антителом β-catenin. Иммунопреципитаты дважды промывали буфером, содержащим 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl и 1% NP-40 и белки, разделенные стандартным SDS-PAGE. Сухие гели подвергали воздействию пленки или определяли путем фосфорирования (Bio-Rad Laboratories). Все эксперименты проводились по меньшей мере три раза, и результаты, полученные либо из представительного эксперимента, либо с помощью средних значений ± SD.

Анализ репортерного гена в PS1 — / — и +/- проводили с помощью системы репортерного анализа с двойной люциферазой (Promega) в соответствии с инструкциями производителя после трансфекции репортерными конструкциями -163CD1 и -163ΔLefCD1 (Shtutman et al., 1999). 50 нг pRL-TK renilla luciferase были подвергнуты трансплантации в каждом образце в качестве внутреннего контроля эффективности трансфекции. Результаты выражают как среднее из трех независимых экспериментов, выполненных в трех повторениях. В экспериментах с 293 клетками проводили переходную трансфекцию конструкций промотора cyclin D1, cyclin A и cyclin E с осаждением фосфатом кальция в течение 6 часов. Через 24 часа активность люциферазы определяли сравнением с активностью равного количества пустого вектора (Albanese et al., 1999). Результаты выражаются как среднее ± SEM из семи отдельных трансфекций.

Общая РНК была экстрагирована Trizol (Life Technologies). Обратную транскрипцию (RT) ПЦР (25 мкг общей РНК / реакция) проводили с использованием H-обратной транскриптазы Superscript II RNAase (Life Technologies) для синтеза первично-цепной кДНК и ДНК-полимеразы Taq (Promega) для реакций ПЦР. Была проведена полуколичественная ПЦР, в которой количество циклов приводило к получению амплифицированных продуктов кДНК β-катенина, циклина и актина в линейном диапазоне. Оптимизированный профиль цикла для цикла D1 был: 1 цикл, 94 ° C, 3 мин; 24 цикла, 94 ° C, 1 час; 55 ° С, 45 мин; 72 ° С, 1 ч.

Первичные фибробласты эмбриональных эмбрионов за 15,5 дней культивировали на стеклянных покровных стеклах в течение ночи и инкубировали с BrdU в течение 45 мин при 37 ° С и фиксировали и окрашивали для включения BrdU с использованием набора для маркировки и обнаружения BrdU I (Boehringer) в соответствии с инструкциями производителя. Ядра были противопоставлены йодидом пропидия для анализа на общее количество клеток.

APP COOH-терминальные фрагменты были идентифицированы в нулевых клетках PS1, инфицированных ретровирусами, содержащими PS1-дикого типа или PS1-α-последовательности, с использованием антитела CT15. Секрецию Aβ анализировали путем иммунопреципитации кондиционированных сред с использованием антитела 3134 с последующим иммуноблоттингом с 26D6.

Ранее описанные Wnt3a-трансфицированные L-клетки (Shibamoto et al., 1998) использовали в качестве источника среды, кондиционированной Wnt-3a. Клетки Wnt-стимулировали в течение 2 ч и интенсивно промывали, а свежую среду добавляли в течение 2,5, 5 и 7,5 часов. Уровни цитозольного β-катенина определяли, как описано выше. В экспериментах, где было проанализировано состояние фосфорилирования аксина, клетки лизировали в NP-40 в присутствии ингибиторов фосфатазы (0,4 мкМ микроцистина-LR, 1 мМ ванадата, 50 мМ NaF) на протяжении всего эксперимента, а полосы аксина были обнаружены с помощью антиаксиновая антисыворотка, ранее описанная Willert et al. 1999. Для исследований фосфорилирования in vivo клеточные монослои ~70% конфлюентные (пластины 10 см2) обрабатывали Wnt3a-CM или контрольной средой. Через 90 мин обе среды отсасывали и заменяли без фосфатов средой с Wnt3a-CM или без нее вместе с ортофосфатом 500 мкКи / мл [32P]. После 30-минутной инкубации среды отсасывали и клетки один раз промывали ледяным PBS и лизировали с помощью буфера для лизиса NP-40 (1% NP-40, 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис, рН 8,0, 5 мкг / мл лейпептин, 100 мкг / мл AEBSF, 0,4 мкМ микроцистина-LR, 1 мМ ванадата и 50 мМ фторида натрия). Лизаты преклировали в течение 10 мин при 10000 г и супернатанты использовали для иммунопреципитации β-catenin, как описано выше. Радиолокализованный β-катенин разделяли SDS-PAGE и визуализировали фосфоримагером (Bio-Rad Laboratories) или авторадиографией.

Для исследований ubiquitination клеточные монослои при ~ 70% слияния в 6-луночных планшетах обрабатывали 10 мкМ ингибитора протеасомы MG-132 (Calbiochem). В указанные моменты времени клетки лизировали с помощью буфера для лизиса NP-40, и накопление убиквитинированного β-катенина анализировали непосредственно Вестерн-блоттингом с антителом против β-catenin или путем иммунопреципитации с тем же антителом, за которым следовало вестерн-блоттинг с поликлональным анти- -букикитина.

Ранее сообщалось, что скорость метаболизма β-катенина в PS1-дефицитных иммортализованных фибробластах была медленнее по сравнению с гемизиговыми клетками PS1 +/-, что приводило к более высоким уровням цитозольного β-катенина (Kang et al., 1999). Соответственно, исходя из недавнего открытия, что транскрипция циклина D1 активируется β-catenin / LEF, мы предсказали сопоставимые изменения в транскрипции циклина D1 в первичных фибробластах из ранних проходов. Вестерн-блоттинг показал, что клетки PS1 — / — содержат более высокие количества белка β-catenin и cyclin D1 (фиг.1а). Напротив, уровни cdc2 и cyclin A, два других родственных гена, не подверженных β-catenin-опосредованной транскрипции (Tetsu и McCormick, 1999), не были увеличены в PS1 — / — клетках. Это подтвердилось количественной ОТ-ПЦР, которая показала, что PS1 — / — клетки выражают ~ 2,5 раза более высокие уровни мРНК cyclin D1, чем у контрольных PS1 +/- (2,53 ± 0,1, среднее ± SD, n = 3), в то время как β -катениновых мРНК не изменялись (рис.1, б). В соответствии с нашим предыдущим отчетом с использованием иммортализованных клеточных линий с дефицитом PS1 (Kang et al., 1999) эксперименты с импульсной цепью в первичных фибробластах показали, что в клетках PS1 — / — уменьшался оборот β-catenin (данные не показаны, см. Фиг.3 ). Не было обнаружено разницы в обороте циклина D1 (рис.1, с), что свидетельствует о том, что на уровне транскрипции наблюдаются различия в уровнях циклина D1.

Для определения того, увеличили ли более высокие уровни циклина D1 повышенную скорость входа в S-фазу в PS1 — / — фибробластах, мы проанализировали включение BrdU в первичные фибробласты из PS1 +/- и PS1 — / — эмбрионов. В самом деле, включение BrdU было приблизительно в два раза выше в PS1 — / -, чем PS1 +/- клетки (фиг.1d). Таким образом, дефицит PS1 в эмбриональных фибробластах мыши сопровождается повышенными уровнями β-catenin и cyclin D1 и ускоренной пролиферацией клеток.

Последовательность от -81 до -73 в промоторе цикла D1 содержит консенсусный сайт связывания LEF и, как было показано, представляет основной вклад в трансактивацию β-катенина (Shutman et al., 1999; Tetsu and McCormick, 1999). Чтобы подтвердить, что возвышение мРНК cyclin D1, наблюдаемое в клетках PS1 — / -, представляет собой усиленную β-catenin-опосредованную транскрипцию, мы использовали репортерные конструкции, содержащие сайт связывания -81 -73 LEF (-163CD1) или с LEF-связывающим доменом (-163CD1ΔLEF) (Shtutman et al., 1999) и определил LEF-зависимую транскрипционную активацию промотора cyclin D1 путем измерения активности люциферазы репортера в PS1 +/- и PS1 — / — клетках. Как видно на фиг.1, активность люциферазы, полученная исключительно из сайта связывания LEF -81 до -73 (-163 CD1 вычитает -163 CD1ΔLEF), была в три раза выше в PS1 — / — клетках по сравнению с PS1 +/- клетками (10,7 ± 0,2 против 3,7 ± 0,25, в среднем ± SD, n = 3). Эти результаты показали, что более высокие уровни цитозольного β-катенина в PS1 — / — клетках коррелируют с усиленной лефзависимой транскрипцией циклан D1.

Предыдущие наблюдения можно утверждать, что предположить, что в гиперпролиферирующих клетках с дефицитом PS1 транскрипция cyclin D1 будет дополняться параллельно, как эпифеномен более быстрого роста клеток. Поэтому важно подтвердить, что экспрессия PS1 может специфически модулировать транскрипцию циклина D1. Чтобы определить, является ли промотор cyclin D1 мишенью репрессии PS1, мы оценивали активность транскрипции из репортерных конструкций люциферазы, содержащих последовательности для cyclin D1, а также циклы цикла A (которые, несмотря на то, что содержат предполагаемый сайт связывания LEF-1, представляют собой не активируется β-catenin / Lef, Tetsu и McCormick, 1999) и cyclin E (который не имеет консенсусного сайта LEF-1) в 293 клетках. Как показано на фиг.2а, репортер LEF дикого типа (Topflash) был репрессирован дозозависимым образом PS1. -1745 CD1Luc-репортер (промотор циклического D1 дикого типа), который был индуцирован ~ 10-кратным β-catenin (Shutman et al., 1999), был значительно подавлен PS1. Подавление репортерной активности с помощью PS1 поддерживали в CD1Luc -163, который содержит консенсусный сайт связывания LEF. Однако мутация или удаление сайта LEF отменили репрессию (рис.2, б). Важно отметить, что ни циклическая, ни E-репортерная активность не были подавлены PS1 (фиг.2с). Эти результаты дают убедительные доказательства в пользу концепции, согласно которой повышенные уровни cyclin D1, наблюдаемые в PS1-дефицитных фибробластах, возникают, по крайней мере частично, из-за дисрегуляции оборота β-катенина и последующего повышения активности β-catenin / Lef-опосредованного, а не как эпифеномен более быстрого роста клеток.

Более ранние исследования показали, что PS1 взаимодействует с β-catenin через его гидрофильный цитоплазматический домен петли, хотя точный сайт связывания не был тщательно отображен (Zhou et al., 1997; Yu et al., 1998; Stahl et al., 1999). Мы проводили вытягивающие анализы с использованием слитых белков глутатион-S-трансферазы-PS1 в гомогенатах клеток и подтвердили, что аминокислоты 330-360 в петле PS1 необходимы для его связи с β-катенином (Saura et al., 2000). На основании этих данных мы сгенерировали мутант делеции PS1, не содержащий остатков 330-360 (PS1Δcat), чтобы определить, требуют ли эффекты PS1 по сигналу β-катенина и пролиферации клеток взаимодействие между PS1 и β-catenin. Используя ранее описанные мышино-индуцируемые клетки EcR293 (Kang et al., 1999), мы подтвердили, что индукция PS1Δcat привела к получению укороченного полноразмерного PS1Δcat, который был обработан в ~ 28 кД аминоконцевого фрагмента (NTF) неотличимы от NTF дикого типа и карбокси-концевого фрагмента ~14-кД, лишенных аминокислот 330-360. Эксперименты с иммунопреципитацией показали отсутствие связывания PS1-αc с β-катенином (Soriano et al., 2001).

Затем мы рассмотрели последствия экспрессии PS1Δcat в PS1 — / — первичных фибробластах после ретровирусной опосредованной инфекции. В PS1Δcat инфицированных PS1 — / — фибробластах были обнаружены NH2- и COOH-концевые фрагменты, но не полноразмерные PS1, и было подтверждено отсутствие связывания PS1-α-cat-β-catenin в этих клетках (фиг.3а). Экспрессия PS1 дикого типа приводила к уменьшению уровней цитозольного β-катенина, тогда как введение PS1Δcat не оказывало значительного эффекта (фиг.3b, верхний уровень, уровень тубулина показан снизу как контроль загрузки). По парадигме импульсного преследования оборот β-catenin был увеличен в PS1-инфицированных PS1-образных клетках дикого типа, как и ожидалось, но экспрессия PS1Δcat в клетках PS1 — / — не оказала значительного эффекта (фиг.3 с). Как было предсказано из наших ранних результатов, восстановление оборота β-катенина в первичных клетках PS1 — / — после реинтродукции PS1 дикого типа приводило к сопутствующему снижению включения BrdU (и, следовательно, к клеточной пролиферации, фиг.3d). В заметном контрасте вход в S-фазу в клетках PS1 — / — не изменялся путем повторного введения PS1Δcat или векторного контроля.

Axin в сочетании с APC и GSK-3β регулирует деградацию β-катенина. Таким образом, мутации в аксине были недавно обнаружены при гепатоцеллюлярной карциноме, и в этих опухолевых клетках было показано, что избыточная экспрессия аксина дикого типа снижает уровень β-катенина и подавляет рост клеток (Satoh et al., 2000). Воспользовавшись этим наблюдением, мы выразили аксинус в PS1-дефицитных фибробластах, чтобы определить, может ли гиперпролиферативный эффект блокироваться специфическим ингибированием сигнального пути β-catenin. Как показано на фиг.3, сверхэкспрессия аксина приводила к уменьшению как уровня β-катенина, так и клеточной пролиферации в клетках PS1 — / — до степени, сравнимой с экспрессией PS1 дикого типа (фиг.3b и фиг. D ). Эти результаты утверждают, что усиленная сигнализация β-catenin играет функциональную роль для ускоренной клеточной пролиферации в отсутствие PS1.

Эффекты FAD-мутаций на оборот β-катенинов также противоречивы. Ранее сообщалось, что в культивируемых клетках и трансгенных мышах, экспрессирующих FAD-мутации, перенос эндогенного β-catenin был задержан, что указывает на частичную потерю функции (Kang et al., 1999). Ввиду предыдущих наблюдений мы исследовали уровни цитозольного уровня β-катенина и включение BrdU в нулевые клетки PS1, экспрессирующие эти мутации FAD PS1. Как показано на фиг.4а, экспрессия PS1 M146L или PS1 ΔX9, в отличие от PS1 дикого типа, не приводила к снижению уровня цитозольного β-катенина. В соответствии с этим нахождением включение BrdU в эти клетки оставалось неизменным по сравнению с экспрессией PS1 дикого типа (фиг.4b). Таким образом, FAD мутации в PS1 приводили к потере функции в отношении ее способности модулировать оборот β-катенина.

Недавние сообщения показали, что PS1 играет центральную роль в протеолитическом высвобождении NICD (De Strooper et al., 1999; Struhl and Greenwald 1999, Ye et al., 1999), сигнальный домен рецептора Notch-1, который транслоцирует ядро для активации транскрипции генов ниже по течению. Кроме того, роль PS1 в обработке Notch может быть отделена от его роли в модуляции активности γ-секретазы (Kulic et al., 2000). Поэтому, хотя исследования, описанные выше, дают убедительные доказательства того, что одна из функций PS1 заключается в регулировании цитозольного метаболизма β-катенина, роль, которая требует взаимодействия обоих белков, мы не можем исключить возможность того, что клеточные последствия, которые мы определили, обусловлены сопутствующее ухудшение передачи сигналов Notch и / или γ-секретазы. Чтобы решить эту проблему, мы проанализировали обработку Notch-1 и APP в нулевых клетках PS1, инфицированных ретровирусами, экспрессирующими PS1 или PS1Δc типа дикого типа, чтобы определить, способен ли PS1Δat восстанавливать обработку Notch-1 и генерацию Aβ. В PS1 — / — фибробластах NICD не был расщеплен из конструкции ΔEMV Notch (Myc-tagged NH2-терминальный усеченный Notch-1, в котором метионин 1726 был мутирован к валину для устранения инициации трансляции в этом месте, Kopan et al., 1996 ). Тем не менее, как в PS1-дикого типа, так и в PS1Δcat-инфицированных PS1 — / -клеточных линиях, высвобождение NICD из ΔEMV Notch было четко восстановлено (рис.5а). В соответствии с этим восстановлением расщепления Notch экспрессия как дикого типа PS1, так и PS1Δcat также восстанавливала секрецию Aβ и нормальный оборот APP COOH-терминальных фрагментов (фиг.5b). Также следует отметить, что форма PS1, лишенная всей цитозольной петли, которая не связывает β-катенин, также восстанавливает расщепление Notch-1 в нулевых клетках PS1 (Saura et al., 2000) в соответствии с приведенными выше результатами. Таким образом, повышенная цитозольная стабильность β-катенина и сигнализация нижестоящего потока в клетках PS1 — / — не являются следствием ослабленной передачи сигналов Notch-1 или γ-секретазы. По-видимому, повышение регуляции транскрипции циклина D1 и усиление пролиферации клеток в клетках PS1 — / — скорее всего связано с нарушенной сигнатурой β-катенина, а не с ослаблением передачи сигналов Notch-1 или APP.

Поскольку, как полагают, аберрантная стимуляция Wnt приводит к опухолегенезу в нескольких тканях (см. Barker et al., 2000), мы задали вопрос, влияет ли потеря PS1 на реакцию Wnt. В первичных эмбриональных фибробластах мыши с PS1 или без них уровни цитозольного фосфорилирования β-катенина и аксина, параметры, которые, как было показано, модулируются сигналами Wnt (Willert et al., 1999 и ссылки на них), определяли после стимуляции Wnt-3a , В частности, мы исследовали фосфорилирование аксинов и уровни β-catenin при следующих условиях: (a) базальное, нестимулированное состояние, (b) стимуляция Wnt и (c) после удаления сигнала Wnt. Мы выбрали эти условия, потому что адекватный ответ на сигнализацию Wnt in vivo предполагает не только адекватную регуляцию уровней β-катенина и ядерную сигнализацию после стимуляции, но, по-видимому, своевременное восстановление базальных уровней после отключения активации Wnt. Как было показано выше, в базисных условиях уровни β-catenin были выше при отсутствии PS1 (фиг.6 a, дорожка 1, сравнение сверху и снизу). После обработки кондиционированной средой из Wnt-3a-трансфицированных клеток (Wnt3a-CM) в течение 2 ч β-catenin значительно увеличивался в обеих клетках PS1 +/- и — / -, вероятно, из-за инактивации GSK-3β (фиг.6а , полоса 2). Одновременно наблюдалось появление слабых, быстрее мигрирующих, дефосфорилированных аксиновых видов (фиг.6b, дорожки 2 и 3, наконечники стрел), согласующиеся с дефосфорилированными формами аксина, как описано ранее (Willert et al., 1999). Этот вид был неотличим между клетками PS1 +/- и — / — и больше не обнаруживался через 5 часов после отмены Wnt3a (фиг.6b, дорожка 4). Напротив, в то время как цитозольные уровни β-catenin последовательно восстанавливались в PS1 +/- клетках в течение 7,5 ч после отмены Wnt3a (фиг.6а, нижний, дорожка 5), уровни β-катенина оставались неизменно повышенными в этот же момент времени в PS1 — / — (фиг.6а, сверху, полоса 5). Таким образом, наши результаты показали, что, хотя стимуляция Wnt правильно повышает уровень β-catenin в нулевых клетках PS1, сигнал аномально затягивается.

Чтобы определить, какой пул цитозольного β-catenin был аномально повышен в отсутствие PS1, уровни фосфорилированного β-катенина оценивали в присутствии или отсутствии Wnt3a-CM. При маркировке 32Р уровни фосфорилированного β-катенина были заметно увеличены в базальных условиях в клетках PS1 — / — по сравнению с клетками PS1 +/- (рис. 7а, сравните полосу 1 с 3, верхнюю). После стимуляции Wnt3a уровни фосфорилированного β-катенина были заметно уменьшены в обоих типах клеток (фиг.7а, сверху). Быстрое снижение фосфорилированных уровней β-катенина, связанное с инактивацией GSK-3β, показало, что в ответ на стимуляцию Wnt3a эта стадия дефосфорилирования β-катенина не зависела от отсутствия PS1.

В текущей модели деградации β-катенина фосфорилированный β-катенин должен быть быстро убиквитирован и деградирован протеосомой (Orford et al., 1997). Накопление фосфорилированного β-катенина подсказывало нам, что в клетках PS1 — / — β-catenin ubiquitination (т.е. ниже фосфорилирования) может быть аномальным. Ингибирование протеасомы приводит к накоплению убиквитинированных форм белков, обычно деградированных с помощью пути ubiquitin-proteasome. Соответственно, высокомолекулярные (HMW) β-катениновые виды, содержащие убиквитин, накапливаются после ингибирования протеосом (Aberle et al., 1997; Orford et al., 1997; Salomon et al., 1997). В контрольных клетках PS1 +/- виды HMW β-catenin были обнаружены через 30 минут лечения ингибитором протеосом MG-132 и дополнительно увеличивались через 120 мин (рис. 7b, дно). Эти полосы β-catenin HMW были идентичны видам, которые, как было показано, представляют собой убиквитинированный β-катенин (Aberle et al., 1997; Orford et al., 1997). Напротив, формы HMW β-catenin были очевидны в клетках с дефицитом PS1 только через 60 мин лечения, а общий ответ затуплялся даже через 120 мин (фиг.7b, верхний), что указывает на то, что убиквитинированный пул β-catenin был уменьшен. Таким образом, более высокие уровни фосфорилированного β-катенина в клетках с дефицитом PS1, по-видимому, соответствовали задержке ubiquitination, совпадающей с пониженной деградацией β-catenin.

Было показано, что в дополнение к его документированной роли в протеолитической обработке Notch и APP, PS1 взаимодействует с β-катенином. Однако биологические последствия этого последнего взаимодействия остаются спорными. В настоящем исследовании мы представили доказательства того, что потеря функции PS1 приводит к повышенной стабильности цитозольного β-катенина, что приводит к усиленной сигнатуре β-catenin / Lef-зависимой передачи, в том числе к повышению уровней циклина D1. Это, в свою очередь, связано с увеличением проникновения в клеточный цикл и пролиферацию клеток, фенотип, который может быть отменен путем экспрессии PS1 дикого типа, но не формы PS1, которая не связывается с β-катенином. Напротив, сверхэкспрессия PS1 in vitro приводит к LEF-опосредованной репрессии транскрипции cyclin D1 дозозависимым образом. Все эти эффекты на оборот β-катенина PS1 не зависят от протеолиза APP и надрезов и, по-видимому, опосредуются на уровне фосфорилирования / ubiquitination β-catenin. Наконец, FAD-мутации в PS1 не могут эффективно восстанавливать деградацию β-катенина в первичных фибробластах PS1.

Используя первичные мышиные эмбриональные фибробласты, дефицитные в PS1, мы продемонстрировали, что PS1 отрицательно модулирует цитозольный (и, следовательно, сигнальный) пул β-catenin. Мы показали, что как мРНК, так и белок cyclin D1 были увеличены в клетках PS1 — / -, и это коррелировало с более высокой β-catenin / LEF-зависимой транскрипционной активностью от промотора cyclin D1 в этих клетках. Более того, мы наблюдали, что, как ранее описано для раковых клеток толстой кишки, повышенные уровни циклина D1 в клетках PS1 — / — коррелировали с ускоренным прогрессированием через фазу G1 клеточного цикла. Важно отметить, что увеличение уровней циклина D1 вряд ли будет представлять собой эпифеномен гиперпролиферации в нулевых клетках PS1. Это связано с тем, что экспрессия PS1 может специфически модулировать LEF-опосредованную транскрипцию дозозависимым образом, что согласуется с концепцией о том, что увеличение уровней циклина D1 происходит до самой гиперпролиферации и как следствие дефицита PS1. Другими словами, мы предоставили убедительные доказательства того, что PS1 посредством модуляции передачи сигналов β-catenin напрямую влияет не только на уровни cyclin D1, но также и на рост клеток, связанный с активностью cyclin D1. Наконец, дальнейшая поддержка прямого причинного эффекта, а не только корреляционной связи была продемонстрирована с использованием мутантной PS1-конструкции, где было потеряно взаимодействие между PS1 и β-catenin (рис.3). Короче говоря, накопление β-catenin и увеличение пролиферации клеток в клетках с дефицитом PS1 можно изменить путем повторного введения PS1 дикого типа, но не PS1Δcat, мутанта PS1, который не связывает β-катенин.

Наши результаты также предложили модель, в которой PS1 функционирует для регулирования оборота β-катенина на этапе после фосфорилирования β-катенина. В отсутствие PS1 быстрое дефосфорилирование β-catenin после стимуляции Wnt-3a сохранялось. Более того, модуляция фосфорилирования аксинов также не изменялась во время стимуляции и отмены Wnt в клетках с дефицитом PS1. Однако повышение уровня цитозольного β-катенина наблюдалось как в базальном (то есть нестимулированном), так и после стимуляции Wnt, и сопровождалось увеличением уровней фосфорилированного β-катенина. Таким образом, в отсутствие PS1, оборот β-catenin был пролонгирован как в Wnt-3a-стимулированном, так и в основном состояниях. Наконец, увеличение фосфорилированного β-catenin, которое обычно должно быть на очень низких уровнях из-за быстрой деградации, коррелировало с уменьшением ubiquitination. Поэтому мы выдвигаем гипотезу о том, что PS1 модулирует деградацию β-катенина путем облегчения ubiquitination. Этот механизм согласуется с двумя недавними сообщениями, посвященными взаимодействию гомологи Drosophila presenilin (DPS) и Armadillo / β-catenin (Arm / βcat). У Drosophila потеря эндогенного DPS приводила к накоплению Arm / β-cat в цитоплазме (Noll et al., 2000), что заставило авторов предположить возможную роль DPS в протеосомной деградации. Кроме того, на генетическом экране кандидатов, которые модифицируют фенотип Arm / βcat, DPS был идентифицирован как отрицательный регулятор передачи сигналов Wg / Wnt (Cox et al., 2000). Поэтому оба этих вывода в Drosophila полностью согласуются с нашими настоящими наблюдениями.

PS1 необходим для расщепления Notch-1 для высвобождения сигнального внутриклеточного домена (NICD), этапа, необходимого для инициирования последующей транскрипционной активации гена (De Strooper et al., 1999; Struhl and Greenwald 1999, Ye et al., 1999). Имеются данные, свидетельствующие о том, что пути Notch и Wnt являются взаимно ингибирующими (Axelrod et al., 1996). Поэтому можно утверждать, что усиленная сигнализация β-catenin / LEF и повышенная пролиферация клеток в отсутствие PS1 могут быть вторичными по отношению к дефектной сигнализации Notch. Однако Notch-1 из PS1 — / — клеток, экспрессирующих PS1Δcat, эффективно расщепляется. Тот факт, что этот мутант не восстанавливает фенотип β-катенина, настоятельно указывает на то, что недостаток Notch-1 не является причиной аномального фенотипа β-катенина. Таким образом, модулирование передачи β-катенина и облегчение протеолитического расщепления Notch-1, вероятно, являются независимыми и параллельными функциями PS1. По-прежнему возможно, что активность β-катенина, облегчаемая PS1 in vivo, требуется на более поздних стадиях развития и, следовательно, маскируется из-за его раннего требования к передаче сигналов Notch-1.

В соответствии с результатами протеолиза Notch-1, требование PS1 в расщеплении γ-секретазы не зависит от оборота β-катенина. PS1Δcat также эффективно восстанавливает активность γ-секретазы в PS1 — / — клетках как в терминах APP COOH-терминальных фрагментов, так и в гене Aβ. Эти результаты полностью согласуются с недавним докладом Сауры и др. 2000 снова настоятельно указывают на то, что эта последняя активность и роль в гомеостазе β-катенина, вероятно, будут независимыми функциями PS1. Таким образом, связь PS1 с β-катенином не требуется во внутриклеточном отделении, где протеолиз APP и Notch имеет место.

Взятые вместе, наши результаты дают расчетную интерпретацию, которая согласуется с текущей моделью пути Wnt-β-catenin, в которой стабилизация β-катенина, в этом случае за счет потери PS1, приводит к пролиферативному сигналу посредством активации циклина D1. Эти результаты также утверждают, что результаты расхождения, представленные различными лабораториями, могут отражать измерения разнородных пулов β-catenin. В то время как мы исследовали Wnt-3a-чувствительный цитозольный пул эндогенного β-катенина, определяемый как фракция, которая была экстрагируемой сапонином, другие оценивали как цитозольный, так и связанный с мембраной β-катенин, экспрессируемый переходными трансфекциями (Zhang et al., 1998a). Однако связанный с мембраной пул β-catenin не реагирует на стимуляцию Wnt (данные не показаны). Кроме того, присутствие низкомолекулярных β-катениновых соединений было использовано для стимуляции деградации без формального доказательства. Хотя идентичность и функциональное значение этих видов остаются неизвестными, мы подозреваем, что они накапливаются, когда деградация полноразмерного β-катенина является дефектной (см., Например, Schlosshauer et al., 2000). Короче говоря, эти несоответствия подчеркивают важность точного определения изучаемого пула β-catenin, поскольку его биологическая роль тесно связана с его субклеточной локализацией.

В нашем предложенном сценарии потеря PS1 была бы такой же, как и в ряде случаев рака человека, включая двоеточие, меланому, гепатокарциномы и пиломатотрику кожи. В этих опухолях мутации в APC, аксине или β-catenin приводят к аномально высоким уровням β-catenin, и считается, что повышенная сигнальная связь β-catenin / LEF способствует неопластической трансформации (обзоры см. В Polakis 1999; Roose and Clevers 1999 ). В этом отношении представляет интерес, что эпителиальная гиперплазия и опухоли кожи были описаны у большинства нулевых мышей PS1, спасенных с трансгеном PS1 человека (hPS1), приводимым в действие нейронным специфическим промотором Thy-1 (hThy) человека (Zheng et al., 2000). PS1 нулевые мыши умирают либо эмбрионально, либо перинатально. Однако животные, спасенные Thy-1-driven hPS1, выживают во взрослую жизнь. Поскольку кожа этих животных оказалась недостаточной в PS1 и показала повышенные уровни β-катенина, фенотип опухоли у этих спасательных животных согласуется с конститутивно усиленной транскрипцией циклалина D1 в коже с дефицитом PS1 из-за ослабленного ослабления Wnt. Однако окончательная причинно-следственная связь между уровнями β-катенина, дефицитом PS1 и образованием опухолей еще предстоит установить.

Таким образом, наши результаты показали, что PS1 является частью механизма деградации β-катенина, тем самым добавляя PS1 к списку известных белков, которые регулируют стабильность β-катенина (Orsulic and Peifer 1996; Hart et al., 1998; Ikeda et al., 1998). Seeling et al., 1999; Zorn et al., 1999). Мы предлагаем модель, в которой PS1 способствует быстрому обтеканию β-catenin после его фосфорилирования, возможно, путем некоторого улучшения процесса ubiquitination. Мы показали, что FAD-мутации в PS1 представляют собой потерю его функции в качестве β-катенинового модулятора. Является ли этот фенотип вкладом в болезнь Альцгеймера, проблема, не затронутая в этом исследовании. Тем не менее, наши результаты еще раз подчеркивают важность поддержания быстрого оборота цитозольного β-катенина при нормальном росте клеток и их дифференцировке.

Мы благодарим доктора. G. Thinakaran, H. Mori, K. Willert, J. Buxbaum и M. Kounnas за щедрые дары антител, д-р Р. Копан за подарок конструкций Notch и полезные обсуждения, д-р S. Takada для Wnt3a-трансфицированных клеток и д-ра Ф. Костантини для ксина аксина. Мы также благодарим д-ра. W. Cavenee и R. Hampton за критическое чтение рукописи.

Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения грантами NS01812 и NS28121 (E.H. Koo), AG05131 (S. Soriano) и CA70897 и CA75503 (R.G. Pestell).

Сокращения, используемые в этой статье: Aβ, амилоидный β-пептид; APC, аденоматозный полипоз коли; APP, β-амилоидный белок-предшественник; ФАД, семейная болезнь Альцгеймера; GSK, гликогенсинтаза киназа; LEF, фактор Т-клеток / лимфоидный энхансер-фактор-1; NICD, внутриклеточный домен Notch; PS1, пресенилин 1; RT, обратная транскрипция.

(a) Иммуноблот-анализ β-catenin, cyclin D1, cyclin A и Cdc2 из PS1 +/- и — / — клеток. Уровни β-catenin и cyclin D1 были увеличены в клетках с дефицитом PS1. (b) Клетки с дефицитом PS1 показали более высокие уровни мРНК cyclin D1. Полуколичественный ОТ-ПЦР-анализ β-catenin, cyclin D1 и актина из PS1 — / — и +/- первичных фибробластов. Для ПЦР-реакций использовали 25 нг общей РНК-производной кДНК. Элементы управления без обратной транскриптазы не дают полос (не показаны). Показаны результаты репрезентативного эксперимента. (c) Потеря PS1 не повлияла на текучесть циклина D1. Клетки маркировали в течение 20 мин и преследовали в течение 15, 30 и 60 мин. (Средний). Поскольку клетки PS1 — / — имеют более высокие конститутивные уровни циклина D1, показано более короткое воздействие на пленку той же авторадиограммы, которая сопоставима с показанной в PS +/- клетках. Показана количественная оценка из трех независимых экспериментов (снизу). (d) включение BrdU в клетках PS1 +/- и — / -. Первичные фибробласты эмбрионов эмбрионального дня 15,5 инкубировали с BrdU в течение 45 мин при 37 ° С и определяли включение BrdU, как описано в материалах и методах. Результаты показаны как доля от общего количества клеток (рассчитанных из ядер, окрашенных пропидием иодидом), которые были положительными для окрашивания BrdU, и представляют собой среднее из двух независимых экспериментов, каждое из которых выполнено в трех повторностях (1000 клеток из по меньшей мере 10 независимых полей были забиты для каждый образец). (e) Усиление активации β-catenin / LEF промотора cyclin D1 в клетках с дефицитом PS1. PS1 +/- и PS1 — / — фибробласты были трансфицированы конструкциями, содержащими репортер люциферазы, приводимый в действие промоторами циклина D1. 1 мкг -163CD1 (дикого типа) или -163ΔlefCD1 (без основной связывающей последовательности LEF) использовали вместе с 50 нг конструкции pRL-TK renilla luciferase в каждом образце в качестве внутреннего контроля эффективности транскрипции. Результаты показаны как отношение репортерной люциферазы для контроля люциферазы в почках и представляют среднее ± SD трех независимых экспериментов, выполненных в трех повторениях.

(a) PS1 подавляет транскрипцию из LEF-связывающей последовательности, связанной с минимальным промотором (TopFlash) зависимым от дозы образом. Репортер люциферазы TopFlash (1,2 мкг) подвергали трансплантации в 293 клетках с увеличением количества PS1 дикого типа (150-1,200 нг). Транскрипционная репрессия показана ее сравнением с эффектом на равные количества пустого вектора экспрессии (произвольно назначают люциферазную активность 1). (b) Сайт TCF в промоторе cyclin D1 необходим для репрессии PS1. Подавление промотора циклина D1 после трансфекции PS1 (300 нг) поддерживали при удалении последовательностей от -1745 до -163 промотора. Напротив, удаление сайта связывания LEF (-163CD1ΔLefLuc) полностью отменяет подавление PS1. (c) PS1 специально регулирует транскрипцию циклалина D1. Пропионат дикого типа cyclin D1 (-1745CD1) и -163CD1, оба из которых содержат основной сайт связывания LEF, ингибируются экспрессией PS1. Напротив, ни одна транскрипция cyclin A или E не зависит от PS1.

Эффекты PS1 на стабильность и сигнализацию β-катенина требуют взаимодействия двух белков. (a) Экспрессия PS1 дикого типа и PS1Δcat была сопоставимой во всех экспериментах и ​​аналогична экспрессии в клетках PS1 +/- (не показана). Поскольку ΔCTF не содержит аминокислот 330-360, домена, распознаваемого антителом αPS1Loop, его сигнал, по-видимому, слабее, чем карбоксиконцевой фрагмент дикого типа. Иммунопреципитация с J27, антителом к ​​NH2-концу PS1, показывает, что PS1Δcat не взаимодействует с β-catenin. (b, Top) Ретровирусная инфекция PS1 дикого типа или аксина, но не PS1Δcat, в нулевых клетках PS1 приводит к снижению уровня цитозольного β-катенина. (Снизу) β-тубулина, показанного как контроль загрузки. (c) Экспрессия PS1 дикого типа в нулевых клетках PS1 восстанавливает эффективную деградацию β-catenin. Напротив, экспрессия PS1Δcat не оказывает существенного влияния. Клетки метаболически мечены [35S] метионином в течение 20 мин, преследовали в течение 0, 10 и 30 мин и иммунопреципитировали для цитозольного β-катенина, как описано в материалах и методах. Показаны результаты репрезентативного эксперимента, выполненного в двух экземплярах. (d) Уменьшение включения BrdU в PS1 — / — клетки после экспрессии PS1 дикого типа и аксина, но не PS1Δcat. Клетки инфицировали указанными ретровирусными векторами, а включение BrdU выполняли, как описано через 48 часов после нанесения покрытия, когда клетки достигали 70-80% от слияния.

(a, Top) Ретровирусная инфекция PS1 дикого типа, но не FAD-мутантов M146L и ΔX9, приводит к снижению уровней цитозольного β-катенина. (Средний) β-тубулин, показанный как контроль загрузки. Показан репрезентативный эксперимент. (b) Уменьшение включения BrdU в первичные нуклеотидные клетки PS1 после экспрессии PS1 дикого типа, но не FAD-мутантов M146L и ΔX9. Клетки инфицировали указанными ретровирусными векторами, а включение BrdU выполняли, как описано через 48 часов после нанесения покрытия, когда клетки достигали 70-80% от слияния. Показаны результаты двух независимых экспериментов, выполненных в трех повторениях.

(а) нуклеиновые клетки PS1 трансфицировали с помощью myc-tagged ΔEMV (Notch, у которого отсутствовал внеклеточный домен, в котором внутренний метионин 1726 был изменен на валин для устранения инициации трансляции на этом сайте) и ICV (внутриклеточный домен Notch, в котором валин 1744 является первой аминокислотой после инициирующих метионинов). Через 48 ч после трансфекции клетки лизировали и высвобождение NICD анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Расщепленный фрагмент Notch-1 обнаруживается в клетках, экспрессирующих как PS1, так и PS1 дикого типа, дефицитные по отношению к β-катенину (PS1-α), но не в PS1 — / — клетках. Показаны результаты репрезентативного эксперимента. (b) Клетки PS1 — / — были инфицированы ретровирусными вирусами, содержащими APP (сверху), вместе с последовательностями PS1 дикого типа или PS1Δcat, а оборот терминальных фрагментов APP COOH (средний) и секрецию Aβ (внизу) анализировали, как описано в материалах и методах. PS1 +/- клетки, выражающие аналогичные количества APP (сверху), показаны как контрольные.

(a) Аномальный оборот β-катенина после стимуляции Wnt в отсутствие PS1. Первичные PS1 — / — и PS1 +/- фибробласты инкубировали с Wnt-3a-кондиционированной средой (Wnt-CM), как описано в материалах и методах. Через 2 часа обработки Wnt-CM удаляли, и клетки интенсивно промывали и инкубировали в указанные моменты времени со свежей нормальной средой. Показаны уровни цитозольного β-catenin. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. (б) Клетки обрабатывали Wnt-CM точно так, как описано для фиг.5а, а уровни аксина анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Обратите внимание, что картина фосфорилирования аксина в ответ на Wnt не отличается между клетками PS1 +/- и — / -. В выраженном контрасте восстановление уровней β-catenin задерживается в PS1 — / — клетках по отношению к контрольным клеткам (a).

(a, Top) Улучшенное фосфорилирование β-катенина в нулевых клетках PS1. Клетки метаболически мечены 32Р в отсутствие или присутствии Wnt3a-CM, как описано в материалах и методах. Обратите внимание на накопление фосфорилированного β-катенина в нулевых клетках PS1 как в базальных условиях, так и после стимуляции Wnt. (Bottom) Эксперимент, выполненный параллельно и идентичный описанному (сверху), за исключением того, что маркировка 32P была опущена. (b) Аномальное накопление высокомолекулярных видов β-катенина в нулевых клетках PS1 после ингибирования протеасом. Клетки обрабатывали MG-132, как описано в Материалах и методах, и в течение указанного времени контролировали накопление β-катенина.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *