Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Емкостные дефекты поступления кальция и повышенное содержание люминального кальция в мутантных мышах-пресенилинах-1

Capacitative Calcium Entry Deficits and Elevated Luminal Calcium Content in Mutant Presenilin-1 Knockin Mice
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2174559/

Диссервация сигналов кальция была причинно связана с старением головного мозга и болезнью Альцгеймера. Мутации в генах пресенилина (PS1, PS2), ведущей причиной аутосомно-доминантной семейной болезни Альцгеймера (FAD), вызывают очень специфические изменения внутриклеточных сигнальных путей кальция, которые могут способствовать нейродегенеративным и патологическим поражениям болезни. Для выяснения клеточных механизмов, лежащих в основе этих нарушений, мы изучали сигнализацию кальция в фибробластах, выделенных из мутантных мышей PS1. Клетки мутантов PS1 knockin проявляли выраженное потенцирование в амплитуде переходных процессов кальция, вызванных стимуляцией агонистов. Эти клетки также проявляли значительные нарушения в емкостном введении кальция (CCE, также известном как хранение кальцием в хранилище), важный клеточный сигнальный путь, в котором истощение внутриклеточных запасов кальция вызывает приток внеклеточного кальция в цитозоль. Примечательно, что дефицит CCE был очевидным после стимуляции агонистов, но не в том случае, если внутриклеточные запасы кальция были полностью истощены тапсигаргином. Лечение иономицином и тапсигаргином показало, что уровни кальция в ER достоверно увеличиваются в клетках-мутантах PS1. В совокупности наши результаты показывают, что переполнение запасов кальция представляет собой фундаментальный клеточный дефект, лежащий в основе изменений в сигнале кальция, передаваемых мутациями пресенилина.

Болезнь Альцгеймера (AD) является основной причиной возрастной деменции (Selkoe, 1999). Определенные семейные формы AD (FAD) характеризуются аутосомно-доминантной картиной наследования и трагически ранним началом начала, и большинство из них связаны с мутациями в двух генах пресенилина (PS1, PS2). Гены PS1 и PS2 кодируют высококонсервативные политопические интегральные мембранные белки, которые широко экспрессируются не только в центральной нервной системе (Cribbs et al., 1996), но также и во многих периферических тканях (Sherrington et al., 1995). Внутриклеточно, как в нервных, так и в ненейрональных клетках, пресенилины локализуются преимущественно в ER (Cook et al., 1996).

Точные механизмы, с помощью которых мутации пресенилина приводят к нейродегенерации AD, в настоящее время не решены. Хорошо известно, что мутации пресенилина приводят к увеличению продуцирования более длинных видов β-амилоида (Aβ) из белка-предшественника Aβ (APP; Scheuner et al., 1996). Однако антиметаболизм APP не является исключительным или самым основным последствием мутаций пресенилина. Остается возможным, что другие патологические эффекты мутаций пресенилина выше и / или не зависят от генерации Aβ также могут влиять на молекулярные и клеточные изменения, характеризующие нейродегенерацию AD.

Установление доказательств установило, что мутации presenilin придают очень специфические изменения во внутриклеточных сигнальных путях. Например, потенцирование inositol 1,4,5-трифосфата (InsP3) -содержащих сигналов кальция было зарегистрировано в массиве экспериментальных систем, экспрессирующих мутации PS1, от ооцитов Xenopus до трансгенных животных (Guo et al., 1996, Guo et 1998, Guo et al., 1999; Begley et al., 1999; Leissring et al., 1999a, Leissring et al., 1999b). Аналогичные изменения наблюдались и в исследованиях фибробластов человека, несущих мутации FAD (Ito et al., 1994; Gibson et al., 1996; Etcheberrigaray et al., 1998). Изменения сигнала кальция в фибробластах FAD являются высокоселективными и специфичными для заболевания, присутствуя у пораженных людей, но не у незатронутых членов семьи (Etcheberrigaray et al., 1998). Более того, мутации в PS2 продуцируют изменения в сигнале кальция, неотличимые от мутаций PS1 (Leissring et al., 1999a, Leissring et al., 1999b), обеспечивая дополнительную поддержку, что эти изменения представляют собой общую патогенную особенность всех связанных с FAD мутаций пресенилина.

Несколько линий доказательств свидетельствуют о том, что дисрегуляция кальциевой передачи, передаваемая мутациями пресенилина, играет каузальную роль в патогенезе FAD, что обусловлено как дегенерацией нейронов, так и признаками патологических особенностей заболевания. Например, повышенные уровни цитозольного кальция ([Ca2 +] i) в культивируемых клетках могут модулировать обработку APP и тем самым увеличивать продукцию Aβ (Querfurth and Selkoe 1994). Это подчеркивает вероятность того, что дисрегуляция кальция является по меньшей мере одной из причин увеличения продуцирования Aβ и, следовательно, может способствовать образованию бляшек. Кроме того, было показано, что увеличение [Ca2 +] i увеличивает гиперфосфорилирование тау (Mattson et al., 1991). Наконец, измененный гомеостаз кальция централизованно связан с повышенной восприимчивостью к гибели клеток, вызванной мутациями PS1 (Guo et al., 1996, Guo et al., 1998, Guo et al., 1999; Mattson et al., 2000).

Несмотря на вероятное участие нарушений кальция в патогенезе FAD, очень мало известно о точных клеточных механизмах, посредством которых мутации пресенилина изменяют пути передачи сигналов кальция. Для решения этой проблемы мы изучали сигнализацию кальция в фибробластах у гомозиготных мутантных мышей PS1 knockin (KI). У этих генетически измененных мышей эндогенный ген PS1 мыши был заменен человеческим партнером, содержащим FAD-связанную мутацию PS1M146V (Guo et al., 1999). Эта модель обладает многими преимуществами по сравнению с другими экспериментальными парадигмами, поскольку мутантный человеческий PS1-белок выражается физиологическими уровнями, и сохраняется структура эндогенной ткани и клеточной экспрессии. Следовательно, устраняются опасения относительно артефактов сверхэкспрессии белка, эктопической экспрессии или смешения влияний белка дикого типа. Здесь мы демонстрируем, что сигналы, вызванные агонистами, заметно усилены в фибробластах PS1M146V-KI. Кроме того, мы сообщаем о новом нахождении, что клетки PS1M146V-KI обнаруживают дефицит в емкостном введении кальция (CCE), то есть приток внеклеточного кальция, вызванный истощением внутриклеточных запасов кальция. Наконец, мы предоставляем доказательства того, что оба эти изменения связаны с аномальным увеличением запасов кальция ER в мутантных клетках. Таким образом, эти данные дают новый клеточный механизм для учета изменений сигнализации кальция, передаваемых мутациями пресенилина, что может привести к разработке новых терапевтических средств для ассоциированного с пресенилином FAD.

Вывод и характеристика мышей PS1M146V-KI описана в другом месте (Guo et al., 1999). Для выделения фибробластов срезы хвоста у неонатальных гомозиготных животных PS1M146V-KI и контрольные образцы промывали 70% -ным этанолом, измельчали ​​в CMF (Ca2 + — и Mg2 + -бесконечный HBSS) и инкубировали в течение 30 минут при 37 o C в 2,5 мл TCH раствор (0,125% трипсина, 0,5 мМ ЭДТА и 1 мг / мл коллагеназы типа V (Sigma Chemical Co.) в HBSS. После гашения реакции добавлением DME, дополненного 20% FBS, супернатант удаляли и центрифугировали при 225 г для 5 мин, и осажденные клетки ресуспендировали в DME / 20% FBS. Клетки выдерживали при 37 ° С в атмосфере 5% СО2. Для экспериментов по визуализации кальция культуры P1-P4 высевали на стеклянные чашки Петри 6 см (MatTek Corp.) и выращивали до близкого слияния. За 1-2 ч до визуализации клетки загружали в течение 45 мин при комнатной температуре с 5 мкМ Fura 2-AM, дополненной плуроновой кислотой F-127 (Молекулярные зонды) в Hepes-буферизованном контроле раствор (HCSS), содержащий 120 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 0,8 мМ MgCl2, 2 мМ CaCl2, 15 мМ глюкозы, 20 мМ Hepes, pH 7,3 и 0 .5% фенол-красный (дефицит кальция HCSS содержал 1 мМ EGTA и без CaCl2). Клетки промывали три раза HCSS и позволяли инкубировать в течение по меньшей мере 30 минут перед визуализацией. Все реагенты были приобретены у Life Technologies, Inc., если не указано иное.

Измерения [Ca2 +] i были получены с использованием InCyt Im2 ™ Ratio Imaging System (Intracellular Imaging Inc.) с использованием возбуждения при 340 и 380 нм. Система была откалибрована с использованием исходных растворов, содержащих либо кальций (0 кальций плюс 1 мМ EGTA), либо насыщающий уровень кальция (1 мМ) с использованием формулы [Ca2 +] i = K
d (225) [(R-Rmin) / (Rmax-R)] (Fo / Fs). Препараты добавляли путем суперфузии через перистальтический насос и удаляли вакуумом. Все эксперименты проводились с использованием фибробластов, собранных по меньшей мере из трех разных животных (n = 5-28 клеток на эксперимент). Количественные данные анализировали однонаправленным ANOVA и выражались как среднее ± SEM.

Мы изучали сигналы кальция в фибробластах, выделенных от мышей неонатальной мутантной мыши PS1 KI, и контролировали использование цитозольного индикатора кальция Fura-2 AM. Чтобы активировать каскад сигнализации фосфоинозитид / кальций, клетки стимулировали агонисты рецептора клеточной поверхности, брадикинин (БК, рис.1) или бомбезин (данные не показаны). В контрольных фибробластах стимуляция BK вызывала кальциевые сигналы с двумя характерными фазами: переходный рост в [Ca2 +] i длительные секунды, за которым последовала устойчивая фаза повышенного [Ca2 +] i, продолжающаяся несколько минут (рис.1а).

Сигналы кальция в фибробластах PS1M146V-KI отличались от контролей в нескольких существенных аспектах. Во-первых, скорость подъема кальциевого сигнала была значительно увеличена (рис.1, а и б, вставка). Во-вторых, пик переходной фазы был значительно усилен (рис.1, а и б). Наконец, устойчивая фаза повышенного [Ca2 +] i, присутствующая в контрольных клетках, практически отсутствовала в мутантных фибробластах (фиг.1, a и b).

Устойчивое повышение концентрации [Ca2 +] i в контрольных клетках напоминает CCE, в котором истощение запасов кальция ER вызывает приток внеклеточного кальция через контролируемые кальцием каналы (SOCCs, Lewis, 1999). Чтобы определить, была ли устойчивая фаза обусловлена ​​притоком кальция, мы стимулировали клетки с BK в среде с дефицитом кальция. Удаление внеклеточного кальция отменило устойчивую фазу в контрольных клетках, но мало влияло на сигнал кальция в клетках PS1M146V-KI, что указывает на то, что устойчивая фаза повышенного [Ca2 +] i в контрольных клетках отражает приток кальция (сравните рис.1, a и c). Примечательно, что исходные переходные процессы кальция как в контрольных клетках, так и в клетках PS1M146V-KI, которые отражают выделение кальция из внутриклеточных хранилищ, были относительно не затронуты удалением внеклеточного кальция (сравните рис.1, а и с). Следовательно, потенцирование начального переходного процесса кальция, наблюдаемого в клетках PS1M146V-KI, объясняется увеличением выделения кальция из внутриклеточных хранилищ, а не притока кальция.

Чтобы определить, отражена ли постоянная фаза кальция CCE, мы обработали контрольные клетки SKF-96365, который, как известно, блокировал CCE через SOCC (Merritt et al., 1990). Как показано на фиг.1d, обработка SKF-96365 устраняет пролонгированную фазу [Ca2 +] i в контрольных клетках, стимулированных BK в кальцийсодержащей среде. В совокупности эти данные показывают, что устойчивая фаза повышенного [Ca2 +] i в контрольных клетках является CCE и что CCE нарушается в клетках, несущих мутацию в PS1.

Чтобы количественно оценить величину CCE после стимуляции агониста, клетки первоначально стимулировали BK в среде с дефицитом кальция. Впоследствии, после того как исходные переходные процессы кальция вернулись к исходному состоянию, среда с дефицитом кальция была заменена средой, содержащей 2 мМ кальция (фиг.2а). Относительно контролей величина ССЕ после кальция была значительно снижена в клетках PS1M146V-KI после стимуляции 50 нМ BK (фиг.2, a и b). Интересно, что в аналогичных экспериментах с использованием более высоких концентраций BK (5 мкМ) дефицит CCE в клетках PS1M146V-KI, хотя и все еще присутствовал, значительно ослаблялся (см. Рис.3). Кроме того, после полного истощения запасов кальция с тапсигаргином (ТГ, рис. 2с и рис. 3 и 3) не наблюдалось различий в ССЕ. Таким образом, как показано на рисунке 3, величина дефицита в CCE в клетках PS1M146V-KI варьировалась в зависимости от степени и типа стимуляции, при слабой стимуляции агониста, вызывающей наибольший дефицит и полное истощение запасов, не вызывающее дефицита.

Предыдущие результаты предполагали, что клетки PS1M146V-KI обладают функциональными SOCC, но нарушаются в их способности запускать CCE при слабой стимуляции. Поскольку триггер CCE является истощением внутриклеточных запасов кальция, мы предположили, что CCE нарушается в клетках PS1M146V-KI, потому что их уровни кальция ER аномально повышенны. С этой точки зрения, слабая агонистическая стимуляция, которая вызывает только временное высвобождение ER-кальция через быстро инактивирующие рецепторы InsP3 (Parekh et al., 1997), не позволяет разрушать запасы в клетках PS1M146V-KI до порога, необходимого для активации CCE (см. Рис. 5). Чтобы проверить эту идею, внутриклеточные запасы кальция покоящихся клеток высвобождались путем лечения ТГ или иономицином при номинальном отсутствии внеклеточного кальция (фиг.4). TG-высвобождаемый кальциевый пул был значительно больше в PS1M146V-KI относительно контролей, о чем свидетельствуют увеличение как пикового значения TG-вызванных переходных процессов кальция (фиг.4, а, так и b) и их скорости роста (1,67 ± 0,12 нМ с-1 против 1,11 ± 0,11 нМ с-1, соответственно, P <0,01). Аналогичные результаты были получены, когда клетки обрабатывали ионоцидом кальция ионофором в среде с дефицитом кальция (фиг.4с и рис. D). Эти данные показывают, что внутриклеточные запасы кальция, включая ER, увеличиваются в клетках у мышей PS1M146V-KI. В совокупности наши результаты показывают, что потенцирование переходных процессов кальция и отсутствие CCE, наблюдаемое в мутантных клетках PS1M146V-KI, объясняется увеличением уровней ER-кальция.

В этом исследовании мы исследовали кальциевую сигнализацию у фибробластов у мышей KI, несущих мутацию PS1, связанную с FAD. Относительно контролей цитозольные сигналы кальция из фибробластов PS1M146V-KI проявляли значительное потенцирование в кальция, выделяемом агонистической активацией пути передачи фосфоинозитидов. Кроме того, клетки KI проявляли дефицит в CCE, вызванный стимуляцией агонистов, но не полным истощением запасов кальция ER. Мы заключаем, что оба эти изменения связаны с повышением содержания ER-кальция в фибробластах PS1M146V-KI.

Активированные агонистом кальциевые сигналы в фибробластах PS1M146V-KI практически неотличимы от сопоставимых экспериментов с фибробластами человека от пациентов FAD, несущих мутации PS1 (сравните наш рисунок 1a с рисунком 1a в Ito et al., 1994). Таким образом, животные PS1M146V-KI добросовестно имитируют изменения сигналов кальция, наблюдаемые в ассоциированных с пресенилином FAD. Важно отметить, что поскольку мутантный белок PS1 экспрессируется физиологическим уровнем у этих животных (Guo et al., 1999), ни одно из наблюдаемых изменений не связано с избыточной экспрессией белка.

Примечательно, что в отличие от человеческих FAD фибробластов клетки в этом исследовании были выделены у неонатальных животных. Это говорит о том, что изменения в сигнале кальция в FAD фибробластах не просто отражают вторичные последствия патогенеза AD, такие как накопление митохондриальных мутаций в течение жизни человека, которое, как было показано, влияет на сигнализацию кальция в кибридах, трансформированных митохондриями из несемейных AD (Sheehan et al., 1997). Скорее, наши результаты подтверждают гипотезу о том, что измененная сигнализация кальция является ранним и хроническим последствием мутаций PS1, которые могут сыграть причинную роль в патогенезе FAD.

Хотя настоящее исследование было сфокусировано на фибробластах, потенцирование переходных процессов кальция было описано в нейронных клетках этих же животных (Guo et al., 1999; Leissring, M.A., Y. Akbari, F.M. LaFerla, рукопись в процессе подготовки). Это наводит на мысль о том, что изменения в сигнале кальция, наблюдаемые в периферических клетках у пациентов с ФАД, могут быть непосредственно вовлечены в нейродегенерацию и потерю памяти FAD (Disterhoft et al., 1994; Mattson et al., 2000). Этот вывод также поддерживает использование фибробластов в качестве модели для изучения патологических изменений в сигнале кальция, связанных с мутациями пресенилина.

Наши результаты свидетельствуют о том, что повышенные уровни кальция ER являются фундаментальным клеточным дефектом, лежащим в основе изменений в сигнале кальция, передаваемых мутациями пресенилина. Как показано на рисунке 5, мы постулируем, что более высокие уровни ER-кальция в клетках PS1M146V-KI будут нарушать CCE, предотвращая стимуляцию агониста из истощения внутриклеточных запасов кальция за пороговым уровнем, необходимым для активации CCE. Более того, эта модель обеспечивает удовлетворительный клеточный механизм для учета нескольких наблюдений, сделанных в других экспериментальных системах. Во-первых, повышенный уровень кальция ER, увеличивая движущую силу кальция на ER, как ожидается, увеличит амплитуду переходных процессов выделения кальция, как это было зафиксировано во многих системах (Ito et al., 1994; Gibson et al., 1996; Guo et al., 1996, Guo et al., 1998; Etcheberrigaray et al., 1998; Leissring et al., 1999a, Leissring et al., 1999b). Во-вторых, повышенная движущая сила кальция также увеличивала бы скорость высвобождения ER-кальция (см. Рис. 1а) и будет учитывать наши наблюдения в ооцитах Xenopus, что мутант PS1 увеличивает как скорость оттока кальция, так и среднее содержание квантов элементарного выбросы кальция, фундаментальные строительные блоки, составляющие глобальные сигналы кальция (Mattson et al., 2000; Leissring, MA, FM LaFerla, N. Callamaras и I. Parker, рукопись, представленная для публикации). В-третьих, поскольку уровни ER кальция могут модулировать активность рецепторов IP3 (Missiaen et al., 1992), повышенные концентрации кальция могут также объяснять повышенную чувствительность клеток, экспрессирующих мутации пресенилина, к стимуляции IP3. Наконец, переполнение запасов кальция может также объяснить интересное замечание о том, что долгосрочное потенцирование изменяется у мутантных трансгенных животных PS1 (Parent et al., 1999; Mattson et al., 2000), поднимая спектр, что дисрегуляция кальция может лежать в основе нарушений памяти характеризующий AD (Disterhoft et al., 1994).

Механизм, посредством которого мутации PS1 повышают внутриклеточные запасы кальция, пока не известен. Интригующе, однако, что FAD-фибробласты, несущие мутации PS1, имеют повышенные уровни ацилфосфатазы, фермента, который модулирует активность ER-кальций-АТФаз, ответственных за загрузку ER (Liguri et al., 1996). Таким образом, чрезмерная перезагрузка кальциевых насосов ER может зависеть от переполнения запасов кальция. Будущие исследования молекулярных механизмов, с помощью которых мутации presenilin увеличивают уровни ER кальция, могут выявить новые цели для терапевтического вмешательства.

Мы благодарим доктора Луетт Форрест и г-жу Тритиа Ямасаки за превосходную техническую помощь.

Мы благодарны за поддержку Национального института по проблемам старения (P50 AG16573) и Американского фонда поддержки здравоохранения.

Сокращения, используемые в этой статье: Aβ, β-амилоид; AD, болезнь Альцгеймера; APP, β-амилоидный белок-предшественник; BK, брадикинин; [Ca2 +] i, цитозольный кальций; CCE, емкостный ввод кальция; ФАД, семейная болезнь Альцгеймера; InsP3, инозитол 1,4,5-трифосфат; KI, knockin; PS1, пресенилин-1; PS2, пресенилин-2; SOCC, управляемый кальцием канал; TG, тапсигаргин.

Агонист-вызванные сигналы кальция изменяются в фибробластах PS1M146V-KI: свидетельствуют об ухудшении емкостного входа кальция. a, Типичные следы, показывающие сигналы кальция, вызванные 50 нМ BK. b, Количественные данные из n = 11 экспериментов показывают средний базальный [Ca2 +] i, пик BK-вызванный [Ca2 +] i и [Ca2 +] i 5 мин после стимуляции агониста. Цитозольные сигналы кальция в контрольных клетках содержат две фазы: переходный рост в [Ca2 +] i, за которым следует устойчивое повышение [Ca2 +] i, продолжающееся много минут. Обратите внимание на отсутствие длительной фазы в фибробластах PS1M146V-KI. На вставке представлены количественные данные о скоростях нарастания исходных переходных процессов кальция. c, Репрезентативные сигналы кальция, вызванные 50 нМ BK в среде с дефицитом кальция. Обратите внимание, что контрольные клетки не имеют устойчивой фазы повышенного [Ca2 +] i, наблюдаемого при наличии внеклеточного кальция, тогда как PS1M146V-KI относительно не изменяются (см. А). d, Типичные сигналы, вызванные BK-кальцием, в контрольных клетках, инкубированных в среде, содержащей кальций, с SFK-96365 или без него (10 мкМ) или без него. Обратите внимание, что SKF-96365 уменьшает устойчивую высоту [Ca2 +] i, обычно наблюдаемую в контрольных клетках. * P <0,01.

Емкостный всасывание кальция нарушается в фибробластах PS1M146V-KI после слабой стимуляции агониста, но не для полного истощения запасов кальция. a, Репрезентативные сигналы кальция, вызванные добавлением 50 нМ BK в среде с дефицитом кальция, с последующим добавлением 2 мМ внеклеточного кальция. b, Количественные данные из n = 7 экспериментов с базальным [Ca2 +] i, пиковым BK-вызванным [Ca2 +] i и пиком [Ca2 +] i 30 с после введения внеклеточного кальция. На вставке представлены количественные данные о скоростях нарастания исходных переходных процессов кальция. c, Репрезентативные сигналы кальция после добавления 1 мкМ TG в среде с дефицитом кальция с последующим добавлением 2 мМ внеклеточного кальция. d, Количественные данные из n = 9 экспериментов с базальным [Ca2 +] i, пиковым TG-вызванным [Ca2 +] i и пиком [Ca2 +] i после получения внеклеточного кальция. * P <0,01.

Сравнение емкостного входа кальция, вызванного слабой или сильной стимуляцией агониста или терапией ТГ. Данные показаны для экспериментов с использованием протокола, показанного на фиг.2, в котором клетки стимулировали либо 0,05 мкМ BK, 5 мкМ BK, либо 1 мкМ TG. Обратите внимание, что данные выражаются как увеличение [Ca2 +] i по сравнению с [Ca2 +] i 30 с до получения внеклеточного кальция. * P <0,01.

Содержание внутриклеточного содержимого кальция повышается в фибробластах PS1M146V-KI. a, Типичные сигналы кальция, вызванные 1 мкМ TG в среде с дефицитом кальция. b, Количественные данные для n = 7 экспериментов с базальным [Ca2 +] i и пиком [Ca2 +] i, индуцированным TG-обработкой. c, Типичные сигналы кальция, вызванные 1 мкМ иономицином (IONO) в среде с дефицитом кальция. d, Количественные данные для n = 9 экспериментов с базальным [Ca2 +] i и пиком [Ca2 +] i, вызванным обработкой иономицином. * P <0,01.

Модель возмущений в сигнализации кальция у мышей PS1M146V-KI. a, Схематическая диаграмма, иллюстрирующая изменения сигналов цитозольного кальция после слабой агонистической стимуляции. b, Аналогичная диаграмма, показывающая уровни кальция в просвете ER. После слабой агонистической стимуляции уровни люминального кальция в контрольных клетках значительно ниже порогового уровня, необходимого для активации КЦВ. Напротив, слабая стимуляция агониста едва запускает CCE в фибробластах PS1M146V-KI, потому что уровень просвета в просвете аномально повышен.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *