Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Апоптотическая активность дикого типа и болезни Альцгеймера, связанные с болезнями, в присутствии дрозинофил-меланогастеров

Apoptotic Activities of Wild-Type and Alzheimer's Disease-Related Mutant Presenilins in Drosophila melanogaster
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2156122/

Мутантные человеческие пресенилины вызывают раннее начало семейной болезни Альцгеймера и делают клетки восприимчивыми к апоптозу в моделях культивируемых клеток. Мы показываем, что потеря функции пресенилина у Drosophila melanogaster увеличивает уровни апоптоза в развивающихся тканях. Более того, избыточная экспрессия пресенилина вызывает апоптотические и нейрогенные фенотипы, сходные с аналогами пресенилин-функциональных мутантов, предполагая, что пресенилин оказывает доминирующее отрицательное влияние при выражении на высоких уровнях. В клетках Drosophila S2 избыточная экспрессия Psn приводит к уменьшению синтеза рецепторов Notch, влияющих на уровни интактного предшественника ~300 кД и его обработанных COOH-концевых производных ~ 120 кД. Пресенилин-индуцированный апоптоз является клеточным автономным и может блокироваться конститутивной активацией Notch, предполагая, что повышенная гибель клеток обусловлена ​​механизмом развития, который устраняет неправильно определенные типы клеток. Мы описываем генетическую модель, в которой можно оценить апоптотическую активность пресенилинов дикого типа и мутантов, и мы обнаруживаем, что мутантные пресенилины, связанные с болезнью Альцгеймера, менее эффективны при индуцировании апоптоза, чем пресенилин дикого типа.

Болезнь Альцгеймера является наиболее распространенной причиной старческого слабоумия у людей и характеризуется невропатологически накоплением амилоидных бляшек и селективной потерей нейронов в определенных областях мозга (обзор в Price et al., 1998). Умирающие нейроны проявляют характерные особенности апоптоза, генетически контролируемый механизм удаления вредных или лишних клеток в развитии и во многих заболеваниях (см. Jacobson et al., 1997; Raff, 1998). Мутации в трех генах, белке-предшественнике амилоида (APP) 1, пресенилине 1 (PS1) и пресенилине 2 (PS2), составляют большинство случаев ранней болезни Альцгеймера (см. Haass 1997, Selkoe, 1998). APP подвергается комплексной протеолитической обработке, которая генерирует амилоидные пептиды, присутствующие в амилоидных бляшках, наблюдаемых в мозговой ткани болезни Альцгеймера (обзор в Haass and Selkoe 1993). Два человеческих пресенилиновых белка PS1 и PS2 являются тесно связанными мембранными белками с множественными трансмембранными доменами и большой гидрофильной петлей. Пресенилины человека и мыши широко экспрессируются и локализуются преимущественно в отделениях ER и Golgi (см. Haass 1997). В нескольких исследованиях показано, что мутантные варианты пресенилина, связанные с болезнью Альцгеймера, приводят к повышенным уровням более нейтрального нейротоксического 42-аминокислотного амилоидного пептида (Aβ42) по сравнению с более мягким пептидом из 40 аминокислот (Aβ40), рассмотренным в Haass 1997, Selkoe 1998). В нематоде Caenorhabditis elegans белки пресенилина были идентифицированы независимо как стимуляторы сигнальной передачи Notch / Lin-12 (Levitan and Greenwald 1995, Li and Greenwald 1997).

В многочисленных исследованиях изучалась проа- и антиапоптотическая активность белков дикого типа и мутантных PS в культивируемых клетках млекопитающих или первичных культурах нейронов с учетом потенциального участия апоптоза при болезни Альцгеймера. Первоначально избыточная экспрессия связанного с болезнью Альцгеймера мутанта PS1 в культивируемых клетках PC12 показала, что мутантный, но не дикого типа, PS1 увеличивает клеточную уязвимость к апоптозу, вызванному удалением трофического фактора или добавлением β-амилоида (Guo et al., 1996, Guo et al., 1997; Weihl et al., 1999). Точно так же сверхэкспрессия PS2 дикого типа и мутантная форма PS2, вызванная болезнью Альцгеймера, в клетках PC12 увеличивает чувствительность клеток к этим апоптотическим стимулам, а мутантные формы проявляют повышенную апоптозную активность (Deng et al., 1996; Wolozin et al., 1996; Janicki and Monteiro, 1997). Пресенилин-1 образует комплекс с β-катенином, который защищает нейроны от апоптоза, вызванного амилоидом, и этот комплекс дестабилизируется семейными белковыми мутантными белками PS1, связанными с болезнью Альцгеймера, в клеточных линиях человека и ткани мозга (Zhang et al., 1998). Эти наблюдения подтверждают идею о том, что усиленная гибель нейронов в тканях мозга болезни Альцгеймера может быть связана с увеличением апоптотической активности пресенилина, вызванной аутосомно-доминантными мутациями, связанными с болезнью Альцгеймера. Кроме того, COOH-концевые фрагменты PS1 или PS2, генерируемые либо посредством каспаз-опосредованного протеолиза, либо путем альтернативного инициации транскрипции, обладают антиапоптотическими свойствами (Vito et al., 1996, Vito et al., 1997; Vézina et al., 1999). Однако различные про-и антиапоптотические эффекты различных PS-протеинов или PS-протеолитических фрагментов, выведенных из различных исследований, трудно согласовать, и недавнее исследование показывает, что избыточная экспрессия PS1 дикого типа и мутантного PS1, связанного с болезнью Альцгеймера, не имеет заметных эффектов на апоптозе в культивируемых первичных кортикальных нейронах (Bursztajn et al., 1998). Все исследования, посвященные апоптотической активности пресенилина до сих пор, проводились в культивируемых клетках с использованием методов сверхэкспрессии, которые могут объяснять противоречивые результаты (Barinaga, 1998). Данных не имеется, относящихся к апоптотической активности особей C. elegans presenilin Sel-12 и Hop-1. Поэтому важно исследовать опосредованный пресенилином апоптоз в контексте четко определенного многоклеточного экспериментального организма, используя как традиционные генетические методы, так и методы сверхэкспрессии, которые параллельно выполняли на сегодняшний день работу млекопитающих.

Поэтому мы проанализировали апоптотические фенотипы мутантов с потерей функции Drosophila Presenilin (Psn) и трансгенных мух, экспрессирующих Psn дикого типа или различные мутантные белки. Усиленный апоптоз наблюдается как у мутантов потери функции Psn, так и в трансгенных тканях мух, которые выражают высокие уровни Psn. Сверхэкспрессия Psn дикого типа индуцирует апоптоз в воображаемых глазных дисках в автономном режиме клетки, что приводит к шероховатому внешнему фенотипу глаз у взрослых мух. Этот фенотип очень чувствителен к дозе гена Notch или активации рецептора Notch, что указывает на то, что апоптоз может возникать как ответ развития на аберрантную сигнализацию клеток и спецификацию клеточной судьбы. Мы также выразили четыре различные формы мутантов, связанных с болезнью Альцгеймера, и три других пресенилиновых фрагмента в развивающемся глазу. В отличие от предыдущих исследований, демонстрирующих, что связанные с болезнью Альцгеймера замены в PS1 или PS2 повышают апоптозную активность, все мутации, связанные с болезнью Альцгеймера, которые мы тестировали, уменьшили апоптозную активность по сравнению с диким типом и, таким образом, функциональные мутации. Так как повышенные уровни апоптоза также являются признаком фенотипа мутаций потери функции Drosophila Psn, мы предлагаем, чтобы проапоптотическая активность белков PS млекопитающих и мух могла быть вызвана доминирующим отрицательным эффектом, а не усилением функции Psn. Эта идея подтверждается нашим нахождением, что избыточная экспрессия Psn в клетках S2 специфически блокирует синтез белка Notch, что приводит к более низким уровням незрелого 300-kD Notch и обработанных 120-kD COOH-концевых фрагментов. Трансгенные мухи, экспрессирующие пресенилин, представляют собой генетическую модель, в которой активность дополнительных мутаций PS, связанных с болезнью Альцгеймера, может быть проанализирована in vivo и в которой другие компоненты пресенилин-опосредованных биологических процессов могут быть идентифицированы с помощью генетических экранов.

Дифракционные полноразмерные кДНК Psn (варианты Psn + 14 и Psn-14) клонировали в вектор pUAST как фрагменты EcoRI-XbaI. Были созданы четыре конструкции мутационной мутации путем стандартного ПЦР-сайт-направленного мутагенеза. Мутированные кДНК Psn клонировали в pBS-SK и подтверждали секвенированием, а затем вставляли в вектор pUAST ниже по течению от регуляторной области UAS. Конструкции усечения D-ALG3 и цикла были сгенерированы по той же стратегии после ПЦР со следующими парами праймеров: D-ALG3, 5′-CAAGAGTGGTCAGAATTCAAAATGGAACGTGTGGC-3 ‘, 5′-TACTGTAAGACTCTAGATGTGTCCTTG-3′; Loop, 5’-TCTATTTGGGAATTCAAAATGGTCCTTTCGCC-3 ‘, 5′-GGCCACAAAGCTCTAGATTTAGGTCGTCCAGTC-3’. pHS-GV был получен из N + -GV3 (Struhl и Adachi 1998) с помощью ПЦР с помощью пары праймеров: 5′-GAAAGCGGTCGCGGCCGCCAAAATGAAGCTTCTGTC-3 ‘, 5′-AACCCCCGATATCTCACCCACCAAAGTCGTC-3’ и вставлен в сайты NotI / StuI pCaSpeR-hs. Для получения трансгенных мух каждая конструкция вводилась в эмбрион w1118, как описано в Spradling and Rubin 1982.

Муравьиная культура и кресты проводились в соответствии со стандартными процедурами. Генерировать Nts1; vg (усилитель квадранта) -lacZ или Nts1; личинки ac-lacZ, гомозиготные Nts1females, собранные при разрешающей температуре (18 ° C), пересекались с гомозиготными vg (quadrant enhancer) -lacZ мухами (P {vg-806}, Kim et al., 1996) или ac-lacZ мух (P {0.9ac-lacZ}, Van Doren et al., 1992). Hemizygous Nts1 мужское потомство от этих крестов спаривалось с гомозиготными самками Nts1 для получения личинок мутантов Nts1 с соответствующими маркерами lacZ. Эти кресты выдерживали при температуре непермисса (29 ° C) в течение разных периодов времени до того, как личинки были проанализированы окрашиванием акридинового оранжевого цвета и окрашиванием β-галактозидазой.

Для сканирующей электронной микроскопии (SEM) взрослые мухи последовательно дегидратировали в 25, 50, 75 и 100% этаноле в течение> 12 часов каждый и две стадии 100% этанола перед сушкой критической точки с гексаметилдисилазаном (Electron Microscopy Sciences, Inc.) , Мухи затем устанавливали на заглушки, распыляли с золотом и визуализировали с помощью сканирующего электронного микроскопа JEOL 6400. Пластиковые секции готовили, как описано в Tomlinson and Ready 1987. Окрашивание сульфида кобальта кукурузной сетчатки проводили, как описано в Wolff and Ready 1991. Окрашивание оранжевого оранжевого вещества проводили путем рассечения глазных имагинальных дисков в растворе Рингера, помещая ткань в 0,2 мг / мл акридинового апельсина в растворе Рингера в течение 4 мин и установки дисков в растворе Рингера для немедленной флуоресцентной фотомикроскопии (Spreij 1971). Определение β-галактозидазы проводили, как описано в Ye et al. 1999. Иммуностойкость проводили, как описано в Ye и Fortini 1998, с использованием следующих первичных антител: анти-ELAV mAb 7E8A10 крысы, разведение 1: 200 (Robinow and White 1991); мышь anti-Psn Ab L7, разведение 1: 100 (Ye and Fortini 1998). Взрослые крылья были удалены и смонтированы в DPX-монтаже (Electron Microscopy Sciences, Inc.) для фотомикроскопии.

Анализы TUNEL (Gavrieli et al., 1992) проводились с использованием набора Oncor S7110. Короче говоря, имагинальные диски фиксировали 2% параформальдегидом в течение 20 мин и промывали в PBS-DT (1 × PBS, 0,3% Triton X-100, 0,3% дезоксихолата) в течение 20 минут на льду. Диски затем промывали PBS четыре раза в течение 5 мин каждый, а затем переносили в уравновешивающий буфер в течение 5 мин с последующим реакционным буфером рабочей силы, содержащим терминальную дезоксинуклеотидную трансферазу. Диски инкубировали с ферментом в 96-луночном планшете в увлажненной камере при 37 ° С в течение 1,5 ч. Реакцию останавливали путем переноса дисков в стоп-буфер для промывки / промывки в течение 10 мин, а затем диски промывали тремя изменениями PBS с последующим окрашиванием либо раствором антигидоксигенин-флуоресцеина рабочей силы, либо раствором антигидоксигенин-AP (Boehringer Mannheim Corp.) в течение 45 мин и еще две PBS промывают в течение 10 мин каждый. Затем диски были иммунореактивны с мышиным анти-Psn Ab L7, разведение 1: 100, как описано выше, или были разработаны в соответствии с инструкциями набора S7110.

Трансфекции клеток Drosophila S2, анализ западного иммуноблота и окрашивание антителами проводили, как описано в Fehon et al. 1990 и Ye et al. 1999, с использованием конструкций Notch pMTNMg и Notch mAb C17.9C6 и C458.2H (Fehon et al., 1990), Myc mAb 1-9E10.2 и β-tubulin mAb E7 (Университет Айовы по изучению развития гибридного банка).

Учитывая обширную гибель нейронов, наблюдаемую при болезни Альцгеймера, а также повышенную восприимчивость культивируемых клеток к апоптотическим стимулам, вызванным сверхэкспрессией нормальных и мутантных вариантов белков PS млекопитающих, мы попытались определить, связан ли пресенилин с апоптозом в генетически приемлемом экспериментальный организм. Поэтому мы производили генетические поражения с потерей функции в гене Drosophila Presenilin (Psn) (Ye et al., 1999) и анализировали образцы клеточной смерти в развивающихся тканях мутантных животных. Имагинальные диски от личинок мутантов Psn значительно меньше, чем контрольные диски дикого типа, совпадающие с возрастом, а мутантные глазные диски Psn не имеют почти всех дифференцирующих нейронов позади морфогенетической борозды (Ye et al., 1999). Чтобы определить, является ли эта потеря нейронной клетки апоптозом, мы исследовали мутантные третичные диски третьего возраста Psn, используя TUNEL-анализ для апоптотических ядерных фрагментов (Gavrieli et al., 1992). Резкое увеличение числа тел апоптотических клеток легко обнаруживается в муравьиных глазных дисках Psn (фиг.1A и рис. B). Аналогичным образом высокие уровни апоптоза наблюдаются в других тканях имагина, включая диски крыла и ноги, когда функция пресенилина устранена (данные не показаны). Наши данные согласуются с ролью пресенилина как в регуляции самого апоптоза, так и в событиях развития, которые приводят к высоким уровням апоптоза, когда они не выполняются должным образом.

Чтобы дополнительно исследовать способность пресенилиновых белков влиять на апоптотические события в контексте многоклеточного организма, мы сверхэкспрессировали Drosophila Psn в трансгенных тканях мух и сравнили результаты с аналогичными экспериментами, которые уже были выполнены исключительно в клетках культивируемых млекопитающих. Ген Drosophila Psn подвергается альтернативному сплайсингу для генерации двух белковых изоформ, один из которых содержит еще 14 аминокислот в области гидрофильной петли (Ye and Fortini 1998). Мы эктопически выражали как короткую изоформу дикого типа (называемую Psn-14), так и длинную изоформу дикого типа (называемую Psn + 14), а также четыре различные мутации, связанные с болезнью Альцгеймера, и три усеченные формы мух-пресенилина (рис. 2 A) в личиночных глазных дисках третьего возраста с использованием системы GAL4-UAS (Brand and Perrimon 1993). В качестве конструкций драйверов мы использовали sev-GAL4, который выражает GAL4 под контролем семимерного промотора и GMR-GAL4, в котором GAL4 находится ниже по потоку от мультимеризированной копии сайта связывания фактора транскрипции стекла. Эти регуляторные последовательности активны в разных нейрональных подмножествах незрелой сетчатки, и они широко используются в исследованиях гибели клеток в глазу (см. McCall and Steller 1997). Гены без семени сильно экспрессируются в предшественниках фоторецепторных клеток R3, R4 и R7 и предшественниках конусообразных клеток, тогда как GMR более выражен во всех клетках позади морфогенетической борозды (Tomlinson et al., 1987; Ellis et al., 1993). Экспрессия конструкций Psn в глазных дисках была подтверждена окрашиванием антителом, исключая D-ALG3, который не кодирует эпитопы, распознаваемые доступными Psn-антителами (фиг.2, B-D).

Мухи, несущие одну копию UAS-Psn + 14 или UAS-Psn-14, вместе с sev-GAL4 или GMR-GAL4, морфологически неотличимы от дикого типа, как и мухи, несущие только конструкции драйвера GAL4 (фиг.3A, Фиг.1 и фиг.1). При 25 ° C две копии UAS-Psn + 14 (называемые 2X UAS-Psn + 14) с одной копией sev-GAL4 продуцируют грубый глазный фенотип, состоящий из нерегулярной омматидиальной упаковки, случайных омматидиальных слияний и отсутствующих щетинок (рис. 3В и фиг. F). Тангенциальные участки этих глаз показали, что пигментные клетки отсутствуют, в то время как массив фоторецепторных клеток в основном нормальный (рис.3J). В целом аналогичные результаты были получены с использованием UAS-Psn + 14 и UAS-Psn-14, поэтому для последующих экспериментов использовали UAS-Psn + 14, если не указано иное. Две копии UAS-Psn + 14, приводимые в действие одной копией GMR-GAL4, приводят к более сильному шероховатому фенотипу глаз, характеризуемому слиянием материала линзы смежных омматидий и потерей межматочных щетинок, создающих глянцевую внешнюю поверхность глаза (рис. 3C и Фиг. G). Подобный глянцевый фенотип глаза вызван фасетными аллелями гена Notch и обусловлен специфическим дефектом в развитии первичных пигментных клеток (Cagan and Ready 1989). Большинство пигментных клеток отсутствуют в сетчатке GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14, что приводит к почти полному отсутствию решетки пигментных клеток между массивами фоторецепторных клеток разных омматидий (рис. 3 K). Кобальтовое окрашивание сетчатки из куколок показывает, что почти у всех омматидий есть нормальное количество конусных клеток, но отсутствуют пропущенные первичные, вторичные и третичные пигментные клетки, соответствующие фенотипу взрослого глаза (рис.3, М-Р). Чтобы проверить, являются ли два альтернативных сплайсированных варианта Psn функционально эквивалентными или антагонистическими, мы создали мухи с двумя копиями UAS-Psn + 14 и одной копией UAS-Psn-14 в дополнение к GMR-GAL4. Грубый глазный фенотип, вызванный двумя копиями только UAS-Psn + 14, сильно усиливается одной копией короткой формы Psn. Поверхности линз полностью слиты в гладкий глянцевый лист, который почти лишен межсосушливых щетинок (рис. 3D, рис. H и рис. L). Эти данные свидетельствуют о том, что длинный и короткий изоформы белков Psn аналогичным образом функционируют в этом анализе.

Хотя семимерный промотор не активен в пигментных клетках и клетках-предшественниках щетинок, эти два типа клеток являются основными, которые затрагиваются в наших трансгенных линиях, экспрессирующих Psn под контролем sev-GAL4. Одним из возможных объяснений этого несоответствия является то, что избыточная экспрессия Psn может уменьшить количество клеток, доступных для формирования паттернов глаз, воздействуя на пролиферацию клеток или гибель клеток. В этом случае клетки, набранные на более поздних стадиях сборки ommatidial, такие как пигментные клетки и группы клеток щетины, будут непропорционально затронуты, потому что все типы клеток взрослого глаза набираются из общего пула незафиксированных клеток-предшественников в третьем возрасте личиночный глазной диск (Ready et al., 1976).

Учитывая апоптотические эффекты PS1 и PS2 в культивируемых клетках млекопитающих, мы исследовали запрограммированную гибель клеток в личиночных глазных дисках третьего возраста с использованием окрашивания акридиновым апельсином, который специфически маркирует апоптотические клетки, но не некротические клетки, у Drosophila (Abrams et al., 1993) , Хотя низкий уровень гибели клеток обычно наблюдается сзади морфогенетической борозды глазного диска, значительное увеличение апоптоза последовательно наблюдается в дисках, содержащих две копии UAS-Psn + 14 и либо трансгена sev-GAL4, либо GMR-GAL4 (Фиг.4, данные не показаны). Поскольку повышенные уровни апоптоза также являются отличительной чертой фенотипа мутации гена Drosophila Psn, наши данные повышают вероятность того, что проапоптотические эффекты белков PS млекопитающих могут фактически представлять собой частичную потерю функции Psn из-за олигомеризации и агрегации белка когда эктопический Psn экспрессируется на очень высоком уровне (Seeger et al., 1997).

Чтобы определить, является ли апоптоз, индуцированный Psn, автономным в ядре, мы проанализировали глазные инальные диски третьего возраста генотипа sev-GAL4, UAS-Psn + 14 с маркировкой TUNEL в сочетании с окрашиванием Psn-антителом. Сева-промотор сильно активен только на подмножестве клеток на этой стадии развития глаза, а именно на предшественниках фоторецепторных клеток R3, R4 и R7, предшественниках конусообразных клеток и одной или двух так называемых тайных клетках, которые временно связаны с пятиклеточный омматидиальный препаутер. Способность этих клеток-предшественников идентифицироваться исключительно на основе их положений в зарождающихся омматидиях позволила нам непосредственно сопоставить TUNEL-позитивные ядра апоптотических клеток с соответствующими клеточными телами, выражающими высокие уровни Psn (рис.5). Psn распределяется по всей цитоплазме, но исключается из ядра (Ye и Fortini 1998). Однако метод TUNEL специально окрашивает фрагментированную ДНК в ядрах апоптотических клеток и, таким образом, маркирует другой субклеточный отдел, чем окрашивание Psn-антителом. Тем не менее, тщательный анализ соседних оптических секций с использованием конфокальной микроскопии ясно показывает, что как антитела TUNEL, так и Psn отмечают многочисленные идентичные клетки во всех проанализированных дисках (рис.5, C-H), подтверждающие, что гибель клеток, вызванная Psn, автономного процесса и что только меньшинство клеток, сверхэкспрессирующих Psn, подвергается апоптозу. Мы также заметили, что сборка кластеров фоторецепторных клеток в значительной степени невозмущена, несмотря на увеличение гибели клеток, поскольку нормальное зеркальное симметричное паттернирование предшественников фоторецепторных клеток R3 и R4 вдоль экватора глаза все еще может быть визуализировано окрашиванием Psn антителом (рис. 5 A). Очевидно, что апоптотические клетки быстро удаляются из кластеров предшественников фоторецепторов и заменяются соседними клетками, которые, как правило, не устраняются апоптозом.

Хотя мутации, связанные с болезнью Альцгеймера, связанные с заболеванием, не являются полными аллелями с потерями функции (Levitan et al., 1996; Davis et al., 1998; Qian et al., 1998), неясно, являются ли они частичной потерей функции или мутации с усилением функции. Все мутации, связанные с болезнью Альцгеймера, встречаются у аминокислотных остатков, которые сохраняются в белке Drosophila Psn, что позволяет нам вводить эти мутации в белок мух и оценивать их апоптотические эффекты у трансгенных животных. Таким образом были протестированы четыре missense мутации N141I, M146V, L235P и E280A. Было показано, что мутант N141I PS2 индуцирует больший апоптоз в определенных типах клеток по сравнению с PS2 дикого типа и может, таким образом, представлять мутацию с усилением функции (Deng et al., 1996; Wolozin et al., 1996; Janicki and Монтейро, 1997). Оба мутанта M146V и E280A PS1 увеличивают отношение Aβ42 / Aβ40 за счет увеличения уровня более нейротоксического и амилоидогенного продукта расщепления Aβ42 белка предшественника амилоида (см. Selkoe 1998). Мутация L235P была идентифицирована в семье с началом болезни Альцгеймера уже в возрасте 29 лет (Campion et al., 1996) и поэтому может представлять собой особенно тяжелую мутантную форму пресенилина. Кроме того, были также включены усеченный белок Psn, названный D-ALG3, состоящий из большинства аминокислот с COOH-100, двух петлевых конструкций, состоящих из длинной или короткой переменной гидрофильной петли и трансмембранного домена 7 (TM7) после цикла в нашем анализе. Эти конструкции были выбраны, потому что D-ALG3 напоминает усеченные белки PS млекопитающих, которые придают устойчивость к гибели клеток в клетках PC12 (Vito et al., 1996, Vito et al., 1997), и петля может быть цитоплазматическим доменом, необходимым для взаимодействия белок-белок ,

Апоптотическая активность мутантных пресенилинов оценивалась по следующим критериям: их способность генерировать грубый фенотип глаз у мух, несущих две копии каждого мутантного трансгена и GMR-GAL4; их способность модифицировать фенотип глаз GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14 мух; и их способность модифицировать фенотип глаз мух, выражающих Drosophila death-domain protein Reaper под контролем GMR-промотора (таблица). Для каждой конструкции были проанализированы по меньшей мере пять независимых трансгенных линий. Только замена M146V вызывает грубый глазный фенотип в двух независимых трансгенных линиях из пяти проанализированных. Оставшиеся мутации и фрагменты Psn не могут продуцировать шероховатые фенотипы глаз, когда они экспрессируются под контролем GMR-GAL4, но все четыре мутанта, связанные с болезнью Альцгеймера, усиливают грубый глазный фенотип GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14 мух и M146V и N141I также улучшают фенотип мух, несущих GMR-reaper. Хотя фрагмент ALG-3 PS2 ингибирует запрограммированную гибель клеток в клетках PC12, эквивалентный сегмент Drosophila Psn, D-ALG3 вместо этого слабо усиливает фенотип GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14, что указывает на то, что он может обладать слабым апоптозом Мероприятия. В этих трансгенных анализах фрагменты с двумя циклами не обладают модифицирующей активностью.

Чтобы получить более полное представление о механизме гибели клеток, вызванной Psn, мы попытались подавить этот апоптоз путем коэкспрессии ингибиторов гибели клеток дрозофилы (DIAP1 или DIAP2) или бакуловирусного фактора выживания p35. DIAP1 и DIAP2 являются гомологами дрозофилы бакуловирусного ингибитора протеинов апоптоза (IAP) и могут блокировать запрограммированную гибель клеток, вызванную проапоптотическими факторами или мутациями (Hay et al., 1995). Бакуловирусный р35-белок ингибирует каспазы и, таким образом, блокирует апоптоз у многих видов (см. McCall and Steller 1997). В присутствии какого-либо из этих антиапоптотических белков фенотип шероховатого глаза, вызванный Psn, в значительной степени подавляется, что обнаруживается с более регулярной внешней поверхностью глаза, более нормальным трапециевидным рисунком и ориентацией клеток фоторецептора R1-6 и восстановлением решетки пигментных клеток между омматидиями (рис.6). Наблюдение, что Psn-индуцированные фенотипы шероховатого глаза подавляются путем совместного экспрессии DIAP1, DIAP2 или p35, подтверждает, что повышенная гибель клеток является основной причиной фенотипа шероховатого глаза. Таким образом, индуцированная Psn запрограммированная клеточная смерть может быть опосредована консервативным каспазным путем апоптоза или, альтернативно, ее можно обойти путем ингибирования этого пути.

Способность дикого типа и, в меньшей степени, мутантных форм Drosophila Psn индуцировать низкие уровни апоптоза, подобные тем, которые наблюдаются при развитии имагинальных тканей мутантов потери функции Psn, предполагает, что апоптотические эффекты Psn могут быть вторичное последствие сниженной или доминирующей-отрицательной активности Psn во время паттернов развития. Было показано, что у C. elegans и мышей пресенилиновые белки облегчают передачу сигналов Notch, а у червей или мышей, у которых отсутствует активность пресенилина, проявляются типичные фенотипы потери функциональности Notch или lin-12 / glp-1 (Levitan and Greenwald 1995; Li and Greenwald 1997; Wong et al., 1997). Аналогично, мухи, лишенные функциональной активности гена Psn, обнаруживают эмбриональные нейрогенные фенотипы и фенотипы фенотипических дисков, характерные для ослабленной сигнализации Notch (Struhl and Greenwald 1999, Ye et al., 1999). Более того, повышенные уровни апоптоза были отмечены ранее в крылатых имагинальных дисках мух, имеющих неполный гетеросексуальный генотип Notch генома Nts / N55e11; neurA101 / + (Rulifson and Blair, 1995). Эти наблюдения повышают вероятность того, что апоптические эффекты избыточной экспрессии PS могут быть связаны с первичным вмешательством в сигнальную передачу Notch, а затем с элиминацией клеток, которые не приняли правильную клеточную участь нормальным корректирующим механизмом апоптоза, контролируемого с точки зрения развития (рассмотренный в Бонини и Fortini 1999).

Наша генетическая модель in vivo для опосредованного Psn апоптоза позволила нам исследовать потенциальное участие сигналов Notch в апоптотическом ответе, что является важной проблемой, которая не была оценена в широко используемых анализах клеточной культуры млекопитающих для апоптоза, индуцированного Psn. Во-первых, мы хотели определить, могут ли конструкции UAS-Psn, которые вызывают апоптоз в глаз Drosophila при управлении GMR-GAL4, способны продуцировать фенотипы пути Notch в других тканях, когда они выражены с использованием подходящих конструкций драйвера GAL4. Мы обнаружили, что несколько линий драйвера GAL4, которые активны в крыле и кутикулярном анлагене, действительно способны продуцировать взрослые Notch-подобные фенотипы в лезвии крыла и грудной клетке, включая зазубрины края поля, утолщение вены, щетины с периферическим крылом, внематочную крышу вены сенсилла, эктопические грудные макрохеты и отсутствующие грудные микрохеты (рис.7). Эти фенотипы согласуются с представлением о том, что избыточная экспрессия Psn приводит к доминантно-отрицательным эффектам, так как мутанты потери функции Psn имеют сходные фенотипы типа Notch (Struhl and Greenwald 1999, Ye et al., 1999). Чтобы определить, может ли апоптоз, вызванный Psn, быть косвенным эффектом пониженной активности Notch, мы сначала проанализировали апоптоз в дисках воображаемого крыла условного чувствительного к температуре Notch мутантного Nts1. Повышенные уровни запрограммированной гибели клеток пространственно коррелируют с прогрессирующей потерей активности Notch, как визуализируется с помощью уменьшенной специфической для крыла мешочка экспрессии репортера гена Notch-мишеней (усиление квадранта) -lacZ и расширения кластеров проневральных клеток, положительных для экспрессии ac-lacZ (Van Doren et al., 1992; Kim et al., 1996), предполагая, что дефекты паттернов развития, вызванные снижением активности Notch, непосредственно приводят к элиминации пораженных клеток апоптозом (рис.8). Во-вторых, мы проверили, снижает ли снижение дозировки гена Notch дикого типа или коэкспрессия конститутивно активированного Notch может подавлять или усиливать апоптотические фенотипы, связанные с Psn. Мы обнаружили, что фенотип шероховатого глаза GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14 сильно усиливается на фоне мутанта N54l9, несущим только одну функциональную копию гена Notch (фиг.9). Апоптоз, вызванный либо избыточной экспрессией Psn, либо удалением функции гена Psn, также резко подавляется путем коэкспрессии конститутивно активированного Notch в сетчатке (рис.9). Эти исследования показывают, что генетическое удаление или сверхэкспрессия Psn при развитии тканей дрозофилы способно индуцировать Notch-подобные фенотипы, а также апоптоз, и что, когда генетические методы используются для компенсации эффектов передачи сигналов Notch, уровни апоптоза резко снижаются , Наши результаты вместе с наблюдаемой корреляцией между ослабленной сигнализацией Notch и высокими уровнями апоптоза развития дают потенциальное объяснение апоптоза, опосредованного Psn, в качестве реакции развития на первичный отказ в событиях сотового паттерна, требующих активности Psn для правильного синтеза Notch или передачи сигналов.

Для дальнейшего выяснения молекулярного механизма, лежащего в основе фенотипов сверхэкспрессии Psn, мы проанализировали обработку Notch и торговлю клетками S2, котрансфицированными Psn и Notch. При экспрессии до индукции Notch, Psn дикого типа и различные мутанты Psn приводят к снижению уровней белка Notch, влияя как на полноразмерные, так и на обработанные COOH-концевые фрагменты Notch (фиг.10). В соответствии с нашими генетическими результатами биохимический эффект, по-видимому, более выражен для Psn дикого типа, чем для мутантных форм. Экспрессия контрольного белка, не связанного с мембраной, Suppressor of Hairless, не зависит от белков типа Phn или мутантных Psn (рис.10). Эффект на синтез Notch вряд ли будет связан с повышенной деградацией белка, поскольку эктопическая экспрессия той же конструкции Psn в клетках S2 после индукции Notch не оказывает заметного влияния на уровни белка Notch (данные не показаны). Кроме того, иммуноокрашивание живой клеточной поверхности показывает, что белок Notch продается и вставляется в клеточную мембрану, как правило, несмотря на снижение уровней белка, вызванное избыточной экспрессией Psn (фиг.10 C).

У мышей удаление PS1 приводит к серьезной потере нейронных клеток-предшественников в определенных областях мозга, что указывает на то, что PS1 обычно может играть нейропротективную роль при нейрогенезе (Shen et al., 1997). Однако другие исследования показали, что избыточная экспрессия PS1 и PS2 в клеточных линиях млекопитающих сенсибилизирует клетки до апоптоза, вызванного удалением трофического фактора или пептидом Aβ, что указывает на то, что пресенилин может способствовать гибели клеток, вызванной определенными стимулами (Guo et al., 1996, Guo et al. 1997, Deng et al., 1996; Wolozin et al., 1996; Janicki and Monteiro 1997; Weihl et al., 1999). Сообщается, что COOH-терминальные фрагменты PS1 и PS2 обладают антиапоптотической активностью в аналогичных анализах (Vito et al., 1996, Vito et al., 1997; Vézina et al., 1999), и существуют противоречивые данные о проапоптотических эффектах дикого -тип и мутантные варианты, связанные с болезнью Альцгеймера, PS1 (Barinaga 1998; Bursztajn et al., 1998). Поэтому мы стремились проанализировать роль пресенилина в продвижении или предотвращении апоптоза в многоклеточном экспериментальном организме с использованием как классической генетики, так и трансгенного подхода, который тесно связан с стратегиями сверхэкспрессии, используемыми в исследованиях клеточной культуры млекопитающих.

Используя несколько повреждений потери функции в эндогенном гене Дезофилы Пресенилина, мы показали, что мутантные ткани, лишенные активности Psn, демонстрируют повышенные уровни апоптоза развития. Имагинальные ткани значительно меньше, чем контрольные ткани дикого типа, соответствующие возрасту, что указывает на то, что апоптоз играет значительную роль в снижении числа клеток у мутантов Psn. Высокие уровни апоптоза коррелируют с селективной потерей фоторецепторных нейронов в образных глазных дисках мутантов, что согласуется с предположениями, что белки PS млекопитающих могут нормально функционировать как антиапоптотические факторы, необходимые для защиты нейронов от дегенерации. Однако следует отметить, что апоптотические тела также легко обнаруживаются в других типах клеток мутантов Psn, что указывает на то, что антиапоптотические эффекты не ограничиваются тканями нейронов у Drosophila. Наш генетический анализ потери функциональности согласуется с недавним исследованием, показывающим, что антисмысловое ингибирование PS1 в клеточной культуре млекопитающих блокирует дифференцировку нейронов и индуцирует апоптоз (Hong et al., 1999).

В нашей трансгенной модели сверхэкспрессии мы обнаруживаем, что Psn дикого типа наиболее эффективен при индуцировании апоптоза. Поскольку чрезмерная экспрессия Psn вызывает фенотипы, которые напоминают фенотипы мутантных апоптозов Psn-функции, проапоптотическая активность сверхэкспрессированного Psn может быть фактически вызвана доминантно-негативными эффектами. Возможно, клетки, сверхэкспрессирующие Psn, подвергаются апоптозу не из-за специфической регуляторной роли Psn при апоптозе, а скорее из-за блокировки основных путей переноса внутриклеточного белка путем чрезмерного накопления Psn в отделениях ER и Golgi. Альтернативно, избыточная экспрессия Psn может влиять на эндогенную функцию Psn, что приводит к фенотипам, сходным с фенотипическими мутантами потери функции Psn. Ранее было показано, что оба NH2- и COOH-концевые фрагменты PS1 образуют олигомеры in vitro (Seeger et al., 1997). Поэтому возможно, что избыточная экспрессия Psn in vivo дикого типа может способствовать избыточной или преждевременной олигомеризации Psn, что приводит к образованию нефункциональных комплексов, которые истощают эндогенный функционал Psn внутри клетки или нарушают функцию отделения ER / Golgi.

Наши результаты показывают, что апоптотический эффект пресенилиновых белков может включать их хорошо документированную роль в передаче сигналов Notch (Levitan and Greenwald 1995, Li and Greenwald 1997, Wong et al., 1998; Struhl and Greenwald 1999, Ye et al., 1999). В C. elegans прелогенин-гомолог Sel-12 необходим для нормального накопления клеточной поверхности белка Lin-12, члена семейства рецепторов Notch (Levitan and Greenwald, 1998), а у дрозофилы и млекопитающих пресенилин необходим для нормальная протеолитическая обработка Notch во время рецепторной сборки или лиганд-индуцированной сигнализации (De Strooper et al., 1999; Struhl and Greenwald 1999, Ye et al., 1999). Мы показываем здесь, что апоптотические эффекты мухи Psn сильно зависят от дозы гена Notch и что эффекты могут быть частично подавлены путем снабжения мух конститутивно активированным белком Notch. Более того, когда сверхэкспрессия Psn ограничена некоторыми развивающимися структурами, мы наблюдаем типичные Notch-подобные крылатые и нейрогенные фенотипы. Исходя из этих результатов, мы предполагаем, что апоптические эффекты избыточной экспрессии Psn могут быть вторичным следствием ослабленной сигнализации Notch, возможно, из-за доминантно-негативного эффекта, который мешает активности Notch, приводя к тому, что клетки, которые были неправильно запрограммированы и, следовательно, выборочно устранены нормальный коррекционный механизм апоптоза. Эта интерпретация согласуется с наблюдением, что увеличение количества гибели клеток коррелирует с уменьшенной сигнализацией Notch (фиг.9, Rulifson and Blair 1995, Jehn et al., 1999). Как обсуждалось выше, предыдущие исследования показали, что белок Psn сам агрегатируется в некоторых условиях (Seeger et al., 1997); аналогичная агрегация может влиять на функцию отделения ER / Golgi in vivo. Наше обнаружение того, что избыточная экспрессия Psn в клетках S2 приводит к снижению уровней белка Notch, согласуется с этим понятием и дает правдоподобное молекулярное объяснение апостерических и нейрогенных фенотипов с избыточной экспрессией Psn. Этот доминантно-отрицательный эффект на синтез Нотча отличается от влияния мутаций потери функции Psn, которые вызывают чрезмерное накопление специфических терминальных фрагментов НО1Т-COOH за счет других фрагментов (Ye et al., 1999).

Мы оценили проапоптотическую активность различных мутантных вариантов, связанных с болезнью Альцгеймера, и обнаружили, что они обладают меньшей апоптотической активностью, чем пресенилин дикого типа, что согласуется с идеей о том, что этот класс пресенилинских мутаций представляет собой частичные мутации потери функции в нематодах и трансгенных мышей (Levitan et al., 1996; Davis et al., 1998; Qian et al., 1998). В отличие от предыдущих исследований, свидетельствующих о том, что мутантные мутации, связанные с болезнью Альцгеймера, усиливают способность PS1 и PS2 индуцировать гибель клеток и что COOH-терминальный фрагмент ALG-3 блокирует проапоптотическую активность PS2 (Vito et al., 1996, Vito et al. 1997), соответствующие missense мутанты мухи Psn индуцируют меньшую гибель клеток, чем Psn дикого типа, а фрагмент D-ALG3 Drosophila Psn COOH-концевой ДНК, по-видимому, индуцирует апоптоз лишь слабо in vivo. Ввиду доминантно-негативной роли, которую мы предлагаем для сверхэкспрессированного Psn, приведенная апоптотическая активность этих вариантов мутантов может отражать уменьшенную способность вмешиваться в эндогенную функцию пресенилина или более быстрое удаление несогласованных мутантных белков из отделения ER / Golgi. Аналогичные эффекты частичной потери функции на секрецию Aβ мутантных пресенилинов человека могут быть относительно слабыми в физиологических условиях, но могут способствовать постепенному ухудшению мозговой ткани во время процесса старения и, в конечном счете, вызвать начало заболевания, когда потеря нейронов достигает определенного порога.

Используя генетические инструменты, разработанные другими для анализа апоптоза в глаз Drosophila (Hay et al., 1995), мы показали, что фенотипы шероховатого глаза, связанные с избыточной экспрессией Psn, частично подавляются, когда DIAP или бакуловирус p35 коэкспрессируются с использованием того же промотора. Этот результат подтверждает, что апоптоз, вызванный сверхэкспрессией Psn, является основной причиной конечного фенотипа взрослого глаза, независимо от его происхождения развития. Кроме того, эффекты Psn, скорее всего, будут происходить на этапе выше по течению от консервативного каспазой-эффекторного пути апоптоза или через параллельный путь, так как индуцированная Psn клеточная смерть ингибируется p35, что антагонизирует активность каспазы и DIAP, что может блокируют способность белка дрозофилы-Reaper активировать каспазой каспазы-эффектора (Hay et al., 1995; McCall and Steller, 1997). Ранее было продемонстрировано, что клетки, спасенные от апоптоза, могут быть физиологически функциональными, поскольку блокирование гибели клеток путем ингибирования активности каспазы предотвращает слепоту у мутантов нейродегенерации дрозофилы (Davidson and Steller 1998). В связи с этим наши результаты подтверждают, что предотвращение апоптоза нейронов может быть полезной терапевтической стратегией для противодействия нейродегенерации, связанной с болезнью Альцгеймера.

Таким образом, мы демонстрируем, что как потеря активности Drosophila Psn, так и избыточная экспрессия Psn в развивающейся сетчатке мух индуцируют запрограммированную гибель клеток в автономном режиме клетки. Апоптотические эффекты Psn могут быть результатом доминантно-негативных эффектов сверхэкспрессированного пресенилина и, вероятно, будут следствием вмешательства в Notch-опосредованную сигнализацию развития, препятствуя синтезу Notch. Апоптотические эффекты мухи Psn и, возможно, также вызванные белками PS млекопитающих, могут, таким образом, отражать нормальное устранение аберрантных клеток, вызванных первичной недостаточностью в межклеточной коммуникации и спецификацией клеточной судьбы. Кроме того, мы демонстрируем, что мутации пресенилина, связанные с болезнью Альцгеймера, могут быть частичными мутантами потери функции, использующими разные генетические критерии. Кроме того, фенотипы шероховатого глаза, индуцированные Psn, очень чувствительны к дозам трансгенов и модифицируют эффекты других генов, включая эволюционно сохраняющиеся компоненты пути, опосредованного каспазой апоптоза. Таким образом, трансгенные мухи Psn могут быть полезным генетическим инструментом для расщепления функции Psn путем создания экранов генетических модификаторов для дополнительных факторов, которые взаимодействуют с пресенилином.

Мы благодарим Г.М. Рубин, Н. М. Бонини, Э. Уайлдер и Х. Солнце для летных запасов, Дж. Ли для создания конструкции M146V и Н. М. Бонини, Т.А. Jongens и A.B. Яффе за советом и комментариями к рукописи. Мы также благодарим Л. Пече и Н. Бонини за доступ к их конфокальному микроскопу.

Эта работа финансировалась Национальным институтом здравоохранения, грантом AG14583, Ассоциацией Альцгеймера и грантом по исследованиям Merck.

1. Используется в этой статье: амилоидный пептид Aβ40, 40 аминокислот; Aβ42, 42-аминокислотный амилоидный пептид; APP, белок-предшественник амилоида; DIAP, ингибитор дрозофилы белка апоптоза; PS1, пресенилин 1; PS2, пресенилин 2

Апоптотическая активность мутантов Psn, связанных с болезнью Альцгеймера

Повышенные уровни запрограммированной гибели клеток в тканях мутантных функций потери Psn. Маркировка TUNEL выявляет ядра апоптотических клеток в воображаемых глазных дисках от личинок третьего возраста. Генотипы следующие: A, дикого типа; B, гомозиготный PsnB3-мутант. Удаление функции гена Psn приводит к увеличению числа клеток, подвергающихся апоптозу в определенных участках диска, что визуализируется ярко окрашенными ядерными фрагментами. Стрелки, мф, морфогенетическая борозда; a, антенный диск, спереди справа.

Дистрикт и мутант пресенилитов дрозофилы и их экспрессия в трансгенных глазных имагинальных дисках. A, Структуры дикого типа и мутантных форм Psn, закодированные трансгенными конструктами. Название каждой конструкции показано слева. Трансмембранные домены показаны в виде синих коробок, а переменная вставка с 14 аминокислотами обозначена желтыми прямоугольниками. Позиции различных мутантных мутаций, связанных с болезнью Альцгеймера, обозначены стрелками. Экспрессия конструкций в образных глазных дисках трансгенных мух указана справа, что определяется иммуногистохимическим окрашиванием поликлональным антителом L7 против Psn. Н. Д., Не определено. B-D, Схема экспрессии белка Psn, управляемого GMR, в трансгенной дрозофиле. Образ имагинального диска от личинки третьего возраста генотипа GMR-GAL4, UAS-Psn + 14, дважды окрашен анти-ELAV-антителом (B), который маркирует ядерный антиген всех новорожденных нейронов позади морфогенетической борозды (стрелка) и с анти-Psn-антителом L7 (C) и объединенным изображением обоих каналов флуоресценции (D). Трансгены Psn, управляемые GMR, по-видимому, экспрессируются во всех ELAV-позитивных клетках, как и ожидалось, и локализуются в основном в цитоплазме. Передняя часть в правом нижнем углу B-D.

Сверхэкспрессия Psn дикого типа вызывает грубый фенотип глаз, характеризующийся отсутствием пигментных клеток. A-L, изображения сканирующего электронного микроскопа (SEM) при низких (A-D) и высоких (E-H) увеличениях и 1 мкм пластиковых срезах (I-L) взрослых летящих глаз следующих генотипов: A, E, и я, дикий тип; B, F и J, sev-GAL4, 2X UAS-Psn + 14; C, G и K, GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14; D, H и L, GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14; UAS-ПСН-14. Фенотип, вызванный Psn, включает в себя нерегулярные формы линз роговицы, омматидиальные слияния и отсутствующие щетинки. Количество фоторецепторных клеток внутри каждой омматидии в значительной степени не затрагивается, хотя регулярное трапецеидальное расположение фоторецепторной клетки частично нарушено. Фенотип GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14 усиливается дополнительной копией UAS-Psn-14. M-P, окрашивание кобальтом 60-часовых глазных дисков из дикого типа (M и N) и GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14 (O и P). N, схематическое отслеживание диска кукольного глаза дикого типа в М, показывающее, что каждый омматидиум состоит из четырех конусных клеток (c), окруженных двумя первичными пигментными клетками (1), шестью общими вторичными пигментными клетками (2), тремя разделенными третичными пигментами клетки (3) и три клетки-предшественника общей группы щетинок (b). P, схематическое отслеживание диска GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14 в O, выявление недостающих пигментных клеток (звездочки в O), но нормальные дополнения конуса. Передняя часть слева.

Повышенные уровни апоптоза в трансгенных глазных дисках, которые сверхэкспрессируют пресенилин дикого типа. Генотипы следующие: A, sev-GAL4 один (контроль); B, sev-GAL4, 2X UAS-Psn + 14. Лицевые глазные диски третьего возраста окрашивались акридиновым апельсином, жизненно важным красителем, специфичным для клеток, подвергающихся апоптозу (Abrams et al., 1993). Увеличение числа апоптотических тел наблюдается как ярко окрашивающие частицы, когда экспрессия Psn индуцируется sev-GAL4 в областях глазных дисков позади морфогенетической борозды (белые стрелки). Передний справа.

Двойная маркировка антител TUNEL / Psn с использованием конфокальной лазерной микроскопии показывает, что Psn индуцирует запрограммированную гибель клеток в автономном режиме клетки. A и B, маркировка TUNEL (зеленая) в сочетании с окрашиванием Psn-антителом (красным) диска воображаемого глаза sev-GAL4, 2X UAS-Psn + 14, обнаруживают апоптотические ядерные фрагменты (небольшие наконечники стрел в B) в развивающейся сетчатке позади морфогенетической борозды (стрелка, м.ф.) в базальной фокальной плоскости, где ясно видна схема sev трансгенной экспрессии Psn. Как правило, общий паттерн предшественников фоторецепторных клеток обнаруживается невозмущенным зеркальным симметричным рисунком предшественников фоторецепторных клеток R3 и R4 вдоль экватора (стрелка, экв. В А). C-E, сектор диска (белый квадрат в B), отображаемый при более высоком увеличении, что наглядно показывает, что маркировка TUNEL и окрашивание Psn-антителом обнаруживают некоторые из тех же клеток (скобки в E указывают пары предшественников фоторецепторов R3 / R4 отдельных омматидиальных преклонов ). F-H, двойная маркировка антител TUNEL / Psn другого sev-GAL4, 2X диска UAS-Psn + 14 с высоким увеличением, показывая, что клетки, подвергающиеся апоптозу, выражают высокие уровни пресенилина (небольшие стрелки). Передняя часть слева.

Фенотип глаза, индуцированный Psn, подавляется путем коэкспрессии антиапоптотических факторов DIAP и p35. A-D, Взрослые глаза, просматриваемые SEM. E-H, 1 мкм пластиковые секции следующих генотипов: A и E дикого типа; B и F, GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14; C и G, GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14; ГМР-DIAP1; D и H, GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14; ГМС-p35. Нарушенная омматидиальная картина, вызванная избыточной экспрессией Psn, подавляется путем коэкспрессии либо DIAP1, либо белка бакуловирусного антиапоптоза p35, о чем свидетельствует относительно нормальная решетка пигментных клеток и правильно ориентированных трапециевидных массивов фоторецепторных клеток в GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14 трансгенных мухи также имеют GMR-DIAP1 или GMR-p35. Сам по себе трансгены GMR-DIAP1 и GMR-p35 не производят заметного фенотипа взрослого глаза, хотя они подавляют нормальный круг апоптоза в сетчатке глаза куколок, что приводит к небольшому избытку пигментных клеток (Hay et al., 1995) , Передняя часть слева.

Notch-подобные фенотипы, полученные эктопической экспрессией Psn в крыле Drosophila и эпидермисе. A, лезвие крыла дикого типа. LI-LV, продольные вены крыла; ac, передний крест; pc, задний крест. B, выемка лезвия дистального лезвия (стрелка) и щетины эктопического края (наконечник стрелы, вставка) в dpp-GAL4; 2X UAS-Psn + 14 трансгенных мух. C, утолщенные вены и дельта-подобные фенотипы кончиков вены (наконечники стрел) в T80-GAL4; 2X UAS-Psn + 14 летит. D, отсутствующие кроссиверы (наконечники стрел) и скручивание лезвия заднего крыла (стрелка) в e16E-GAL4; 2X UAS-Psn + 14, в котором GAL4 находится под контролем гравюры гена. E-H, одиночная колониальная сенсилла (наконечники стрел) возникают в определенных положениях вдоль вен LIII (E) и LI (G) в крыльях дикого типа, но множественная сенсилла возникает вдоль вены LIII (F) и LI (H) в Hc-GAL4; 2X UAS-Psn + 14 летит. I, Macrochaetae и microchaetae на грудной клетке и ном. J, эктопические макрохеты (наконечники стрел) на ноте C625-GAL4; 2X UAS-Psn + 14 летит. K, эктопические макрохеты на ноте (наконечники стрел) и отсутствующие микрохеты на грудной клетке (выделенные области) 19A-GAL4; 2X UAS-Psn + 14 летит. Оба C625-GAL4 и 19A-GAL4 широко экспрессируются во всем воображаемом диске крыла (данные не показаны). Передняя часть вверху в A-D и I-K; спереди слева в E-H.

Функция потери Notch связана с увеличением уровней апоптоза в дисках воображаемого крыла чувствительного к температуре условного мутантного Notch Nts1. Окрашивание оранжевого окрашивания акридином (A-C) или β-gal (D-I) крыловых дисков от личинок третьего возраста генотипов Nts1 (A-C), Nts1; vg (усилитель квадранта) -lacZ (D-F) или Nts1; ac-lacZ (G-I) при любой разрешающей температуре (A, D и G), через три дня после перехода к непермиссивной температуре (B, E и H), или через пять дней после сдвига (C, F, и я). Потеря сигнала Notch на дисках Nts1wing может быть визуализирована уменьшенной экспрессией vg (quadrant enhancer) -lacZ в корпусе крыла (D-F) и расширением экспрессии ac-lacZ (G-I, наконечники стрел). Связанные с этими изменениями, повышенные уровни апоптоза сначала обнаруживаются в основном в области нотумов, где впервые наблюдается экспрессия экспрессии ac-lacZ (B и H). После пятидневного сдвига температуры апоптотические клетки в основном ограничиваются зоной крыла, где экспрессия vg (quadrant enhancer) -lacZ значительно снижается (C и F). Передняя часть слева.

Подавление и усиление апоптотического фенотипа, вызванного Psn, путем изменения дозы гена Notch. A и B, SEM-изображения, показывающие, что фенотип взрослого шероховатого глаза, вызванный повышенной гибелью клеток в GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14 (A), сильно усиливается удалением одной дозы Notch дикого типа у мух генотипа N54l9 ; GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14 (B). N54l9 является делецией Notch (Lindsley and Zimm 1992), которая не обнаруживает фенотипа доминирующего глаза у гетерозигот. C и D, TUNEL, показывающий, что Psn-опосредованная запрограммированная клеточная смерть, наблюдаемая в GMR-GAL4, 2X UAS-Psn + 14 глазных дисках (C), сильно снижается путем коэкспрессии конститутивно активированной формы Notch, называемой sev-Notchact (Fortini et al., 1993; D). E и F, избыточная экспрессия активированного Notch с использованием hs-Notch (внутри) (Struhl et al., 1993) у гомозиготных личинок мутантов PsnB3 (F) частично спасает фенотип потери функции Psn, производя диски, которые больше, чем ткани из эквивалента PsnB3 мутантные личинки (E). A, B, E и F, спереди слева; C и D, спереди справа.

Экспрессия Psn приводит к снижению уровней белка Notch в клетках S2. A, S2 клетки трансфицировали pMTNMg, который выражает полноразмерный Notch; pHS-Su (H) 4, который экспрессирует Myc-tagged Su (H); и пару конструкций сверхэкспрессии, состоящих из pHS-GV, который экспрессирует слитый белок GAL4-VP16 вместе с конструкциями pUAS-Psn или pUAS-GFP, обозначенными над каждой полосой. Клеточные лизаты анализировали путем иммуноблоттинга смесью из трех антител: mAb C17.9C6, который обнаруживает как полноразмерные, так и ~ 120 кД СООН-концевые фрагменты Notch (стрелки); mAb 9E10, который обнаруживает Myc-tagged Su (H) дублетные полосы (наконечники стрел); и mAb E7, который обнаруживает β-тубулин (в нижней части геля). Как полноразмерный, так и COOH-терминальный уровень фрагментов Notch значительно снижаются, когда конструкции Psn экспрессируются до экспрессии Notch, тогда как уровни Su (H) и тубулина не влияют. B, S2, трансфицированные pMTNMg, фиксировали и окрашивали mAb C458.2H, антителом, распознающим внеклеточный домен Notch. В клетках, трансфицированных pMTNMg (отмеченных зеленой котрансфекцией GFP), Notch накапливается на высоких уровнях (красный) и демонстрирует как везикулярное цитоплазматическое, так и окрашивание поверхности клеток (вставка, более высокое увеличение). Когда Psn коэкспрессируется в этих клетках (C), уровни Notch резко уменьшаются (стрелки). В этих клетках не обнаружено явного везикулярного окрашивания, хотя Notch по-прежнему локализуется в плазматической мембране, как показано окрашиванием антител на клеточной поверхности живых, неперфибилизированных клеток S2 (вставка).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *