Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Сверхэкспрессия Tau Protein ингибирует кинезин-зависимую торговлю везикулами, митохондриями и эндоплазматической ретикулумом: последствия для болезни Альцгеймера

Overexpression of Tau Protein Inhibits Kinesin-dependent Trafficking of Vesicles, Mitochondria, and Endoplasmic Reticulum: Implications for Alzheimer's Disease
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2148132/

Нейронный микротрубочковый белок tau играет важную роль в установлении полярности клеток путем стабилизации аксонных микротрубочек, которые служат в качестве путей для транспортных процессов, управляемых двигателем. Чтобы исследовать роль тау во внутриклеточном транспорте, мы изучили эффекты экспрессии tau в стабильно трансфецированных клетках СНО и дифференцированных клетках N2a нейробластомы. Тау вызывает изменение формы клеток, замедляет рост клеток и резко изменяет распределение различных органелл, которые, как известно, транспортируются с помощью микротрубообразных моторных белков. Митохондрии не переносятся в периферические клеточные отсеки и кластер вблизи центра организации микротрубочек. Эндоплазматический ретикулум становится менее плотным и больше не распространяется на периферию клетки. В дифференцированных клетках N2a сверхэкспрессия тау приводит к исчезновению митохондрий из нейритов. Эти эффекты вызваны связыванием тау с микротрубочками и замедлением внутриклеточного транспорта за счет преимущественного нарушения транспорта с положительным концом, опосредованного кинезин-подобными двигательными белками. Так как при болезни Альцгеймера тау-белок повышается и неправильно локализуется, эти наблюдения указывают на возможную причину постепенного дегенерации нейронов.

Сеть микротрубочек играет важную роль в поддержании клеточной морфологии, в митотических процессах, во внутриклеточной торговле и установлении клеточной полярности и роста нейритов в дифференцирующих нейронах (Drubin and Nelson, 1996; Li and Black, 1996; Goodson et al., 1997 ). Микротрубочки служат треками для движения митохондрий (Nangaku et al., 1994; Morris and Hollenbeck, 1995; Rickard and Kreis, 1996), лизосомы (Hollenbeck и Swanson, 1990), пероксисом (Wiemer et al., 1997) и различные другие органеллы, такие как эндоцитотические или экзоцитотические везикулы (Scales et al., 1997). Более того, они важны для установления и поддержания функциональности эндоплазматического ретикулума (Waterman-Storer et al., 1995). Микротрубочка (MT) 1-зависимый транспорт достигается с помощью моторных белков, таких как динеин или кинезин, и их родственников (Waterman-Storer and Salmon, 1997; Hirokawa, 1998; Lippincott-Schwartz, 1998). Кинезин является двигателем с плюсом-концом, тогда как двигательные белки динеина движутся в противоположном направлении (Brady, 1995; Vallee and Sheetz, 1996). Органеллы связаны с двигателями посредством мембранных / органеллированных адаптивных белков, таких как кинектин или динактин (Kumar et al., 1995; Burkhardt et al., 1997).

Треки микротрубочек стабилизируются белками, связанными с микротрубочками (MAP), такими как MAP2, tau, MAP4 и другие. Это в основном нитевидные белки, которые связываются с поверхностью микротрубочек и способствуют сборку микротрубочек (обзоры см. В Hirokawa, 1994; Mandelkow and Mandelkow, 1995). Регулирование развития MAP, например, при дифференцировке нейронов, указывает на важную роль в организации цитоскелета микротрубочек (Matus, 1994). Тау обогащен аксонами, MAP2 в соматодендритном отделении нейронов (Binder et al., 1985), тогда как MAP4 может быть обнаружен во многих типах тканей (Chapin and Bulinski, 1991; West et al., 1991). MAP2, tau и MAP4 обладают замечательной гомологией последовательностей в консервативных регионах повторения, расположенных в домене связывания с микротрубочками COOH (Chapin and Bulinski, 1992). Повторяющимся мотивам предшествует домен с NH2-терминальной проекцией, который предлагается использовать в качестве спейсера между микротрубочками (Chen et al., 1992) или в качестве якоря для клеточных ферментов (Obar et al., 1989).

Поскольку двигательные белки и МАР взаимодействуют с поверхностью микротрубочек, возникает вопрос, мешают ли МАР двигать двигательные белки. В нескольких исследованиях было высказано предположение, что это имеет место для определенных MAP, особенно с более высокой молекулярной массой. Таким образом, MAP2 может ингибировать подвижность динеина или кинезина in vitro (Paschal et al., 1989; Von Massow et al., 1989; Lopez and Sheetz, 1993; Hagiwara et al., 1994), тогда как более мелкие фрагменты имели только слабую эффект. Это можно объяснить несколькими способами: (a) MAP могут иметь общий эффект стерического блокирования расширенного домена проекции NH2; (b) MAP могут конкурировать с двигателями для общих сайтов связывания, вероятно, на бета-тубулине (Hagiwara et al., 1994); и (c) MAP могут косвенно влиять на транспортные процессы, изменяя динамику микротрубочек (Waterman-Storer and Salmon, 1997).

Когда MAP4 сверхэкспрессируется в клетках Ltk-клеток мыши, он препятствует моторизированной моторизированной моторики и торговле людьми in vivo (Bulinski et al., 1997). Кроме того, чрезмерная экспрессия тау или MAP2c в COS-фибробластах указывает на то, что оба MAP могут функционировать как зависимые от фосфорилирования регуляторы переноса органелл (Sato-Harada et al., 1996). Считается, что фосфорилирование и дефосфорилирование связанных с микротрубочками белков являются ключевым фактором, регулирующим сродство к микротрубочкам, тем самым облегчая и поддерживая жизненно важные клеточные процессы, такие как пролиферация, дифференциация и торговля людьми путем стабилизации треков для моторных белков (Lopez and Sheetz, 1995, Mandell and Banker, 1996; Sato-Harada et al., 1996; Drewes et al., 1997). Действительно, MAP, выделенные из клеток, фосфорилированы, и хорошо документировано, что это фосфорилирование препятствует связыванию с микротрубочками in vitro и in vivo (Drechsel et al., 1992; Biernat et al., 1993; Illenberger et al., 1996).

В аксоновном росте, где динамическая структура микротрубочек является необходимой для дифференциации, фосфорилирование и распределение тау коррелируют (Mandell and Banker, 1996; Li and Black, 1996), предполагая регулируемый баланс между киназами и фосфатазами, а также мелко настроенный градиент концентрации тау. При болезни Альцгеймера (AD) этот баланс между киназами и фосфатазами, по-видимому, нарушен (Trojanowski and Lee, 1995; Mandelkow et al., 1995). Нейрофибриллярные путаницы, одна из отличительных черт этого заболевания, состоят из парных спиральных нитей, которые в основном состоят из гиперфосфорилированного связанного с микротрубочками белка тау (Wischik et al., 1988). Кроме того, tau в AD неправильно локализуется в соматодендритном отделении нейронов (Braak et al., 1994), и, как сообщается, повышенная концентрация тау повышается в мозге AD в значительной степени (Khatoon et al., 1992). Это еще больше усиливает важность правильного контроля посттрансляционных модификаций, локализации и внутриклеточной концентрации связанных с микротрубочками белков in vivo.

Эти наблюдения заставляют нас исследовать, влияет ли избыточная экспрессия тау-белка на метаболизм органелл и везикул в культивируемых клетках. Этот подход был полезен для изучения распределения экзогенных MAP (Barlow et al., 1994; Olson et al., 1995; Bulinski et al., 1997; Kaech et al., 1996). В предыдущих исследованиях мы показали, что клетки CHO и нейробластомы N2a могут служить моделями для состояния фосфорилирования MAP во время клеточного цикла и что фосфорилирование tau киназной MARK приводит к разрушению микротрубочек (Preuss et al., 1995; Drewes et al., 1997; Illenberger et al., 1998). Здесь мы демонстрируем, что избыточная экспрессия тау приводит к изменению формы ячейки, потере поляризации и замедлению роста клеток. Одним из наиболее заметных последствий является резко измененное распределение митохондрий. Вместо того, чтобы рассеиваться по всей цитоплазме, митохондрии кластеризуются вблизи ядра в центре организации микротрубочек (MTOC). В дифференцированных клетках нейробластомы нейриты становятся почти лишенными митохондрий. Эндоплазматический ретикулум становится менее плотным и убирается с периферии клетки или из нейритов. Transferrin, эндоцитированный везикулами, покрытыми клатрином, накапливается вблизи MTOC, и рециркуляция значительно замедляется. Эти эффекты можно объяснить, предположив, что tau препятствует транспорту, управляемому МТ, в случае митохондрий преимущественно с транспортом, направленным на плюс-конец (кинезин-подобными двигателями), так что перенос с отрицательным концом (путем динеина) превалирует. Это приводит к чистому внутреннему переносу митохондрий и других органелл, таких как пероксисомы, к MTOC, где организованы микроконцы микротрубочек. Возмущения баланса в транспорте, зависящем от микротрубочек, особенно в нейритах, были бы согласуются с наблюдаемым нарушением аксонального движения в нейронах болезни Альцгеймера, их потерей полярности и их последующей дегенерацией.

Клетки CHO выращивали в среде F12 HAM, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамином (Biochrom, Berlin, Germany). Для иммунофлюоресценции клетки высевали на покровные стекла с плотностью 2 × 104 клеток / см2 в 24-луночных культуральных чашках и выращивали в течение ночи при 37 ° С с 5% СО2. N2a клетки нейробластомы выращивали в MEM Earle, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, 2 мМ глутамина (Biochrom) и 1% несущественных аминокислот (Sigma Chemical Co., Deisenhofen, Germany). Дифференциацию клеток N2a достигали добавлением 1 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma Chemical Co.) в течение 24-48 ч в присутствии 0,1% фетальной телячьей сыворотки. Для стабильной трансфекции плазмиды, полученные из pcDNA3 (Invitrogen Corp., Leek, The Netherlands), кодирующие самую длинную человеческую тау-изоформу htau40 под контролем промотора цитомегаловируса, вводили в клетки с помощью метода DOTAP (Boehringer Mannheim, Mannheim, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Стабильные трансфектанты отбирали в присутствии 800 мкг / мл (CHO) или 1 мг / мл генетина (N2a), как описано (Preuss et al., 1995), и впоследствии были отброшены.

Использовали следующие антитела: моноклональные антитела против мышиного антитела YL1 / 2 мыши и мышиные моноклональные антитела DM1A были приобретены у Serotec (Oxford, UK) и Sigma Chemical Co. соответственно. Поликлональное кроличьи антитау-антитела K9JA было от DAKOPATTS (Гамбург, Германия), поликлональное кроличье антитело, используемое в качестве маркера ER, было подарком от доктора Д. Лувара (Institut Curie, Paris, Louvard et al., 1982) и поликлонального антаталазного антитела был от доктора В. Just (Университет Гейдельберга, Гейдельберг, Германия). Антителовое антитело V9 было получено от Boehringer Mannheim. Все флуоресцентные (TRITC, FITC и AMCA), помеченные вторичными антителами, были получены от DIANOVA (Гамбург, Германия). Флуоресцентные красители DiOC6 (3), MitoTracker ™ Green, MitoTracker ™ Red и меченый родамином трансферрин были приобретены у Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). DiOC6 (3) использовали в качестве пятна для наблюдения in vivo ER при 2,5 мкг / мл.

Клетки фиксировали 2% параформальдегидом или метанолом, и инкубацию с антителами проводили, по существу, как описано (Preuss et al., 1995). Изоформы Tau, плотно связанные с микротрубочками, могут быть визуализированы с помощью фиксации метанолом (что позволяет рассеивать несвязанный белок, см. Рис.2
с). Напротив, слабосвязанные конструкции (например, K10, K12) не могут быть визуализированы путем фиксации метанола (поскольку они будут диффундировать). Вместо этого необходимо использовать параформальдегид, который фиксирует все клеточные белки, но имеет тенденцию диссоциировать тау из микротрубочек (см. Рис.3, подробности см. В Illenberger et al., 1998). Чтобы визуализировать митохондрии, MitoTracker ™ Green добавляли при концентрации 400 нМ 30 мин до фиксации. Клетки СНО, стабильно трансфицированные клетками человека tau40 или mock-transfected, инкубировали в течение 1 часа с 5 мкМ нокодазолом (Sigma Chemical Co.) или 6 ч с таксотоном 1-10 мкМ (Rhone-Poulence Rorer, Vitry, Франция). Клетки фиксировали до и через 1 или 4 часа после нокодазола и через 6 часов после таксотерапии соответственно. Клетки исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan (Carl Zeiss Jena GmbH, Йена, Германия), оснащенного объективом для масляного погружения 100 × и фильтрами, оптимизированными для экспериментов с тремя метками. Картинки были сделаны с охлажденной ПЗС-камерой (Visicam; Visitron, Puchheim, Germany) и проанализированы с использованием программного пакета MetaMorph® (Visitron). Фракцию клеточной области, содержащей митохондрии, определяли количественно следующим образом: после фиксации и иммунофлуоресцентной маркировки были записаны снимки, а области, содержащие митохондрии, были описаны вручную (опуская ядро) и рассчитаны. То же самое было сделано с общей площадью ячеек, видимой в окраске микротрубочек. В эксперименте измерялось не менее 30 клеток, а соотношение составлено (например, см. Фиг.11).

Микроинъекционные эксперименты проводили, как описано (Preuss et al., 1997). Короче говоря, клетки высевали на покровные стекла с плотностью 2 × 104 клеток в 35-миллиметровых чашках и инкубировали в течение ночи. Рекомбинантный белок, полученный, как описано (Biernat et al., 1993; Gustke et al., 1994), концентрировали в микроконцентраторах Microcon (Amicon Inc., Beverly, MA) в соответствии с инструкциями производителя. Во время этой процедуры буфер был изменен на 25 мМ HEPES, pH 7,2, 1 мМ PMSF и затем микроинъекцию микроинъектировали с помощью микроманипулятора Eppendorf 5171 при постоянном давлении в течение 15 мин. MitoTracker ™ Red добавляли за 30 минут до фиксации при концентрации 200 нМ, и клетки окончательно фиксировали параформальдегидом в определенные моменты времени и готовили для иммунофлуоресценции. Для количественного анализа внутриклеточной концентрации тау-белка в устойчивой к tau40 клеточной линии 1,9, 0,95 и 0,38 мг / мл очищенного рекомбинантного тау-белка, а также только буфера, были микроинъецированы в клетки СНО. Затем клетки фиксировали параллельно с устойчивой к тау клеточной линии и окрашивали поликлональным антитау-антителом. Затем флуоресценцию окраски тау количественно определяли с использованием ПЗС-камеры и программного пакета MetaMorph® и нормировали на размеры ячеек. На микроинъекцию анализировали минимум 80 клеток и оценивали по меньшей мере 100 тау-стабильных клеток. Регрессионный анализ нормированных интенсивностей флуоресценции микроинъекционных клеток проводили с помощью программы Sigma Plot (R = 0,9995) и вычисляли среднюю внутриклеточную концентрацию тау стабильной клеточной линии.

Для визуализации митохондрий in vivo клетки высевали на лабораторное покровное стекло LabTek (NUNC, Inc., Naperville IL.) С 70% слиянием. За 30 мин до иммунофлуоресцентного исследования MitoTracker ™ Green или Red добавляли к клеткам при конечной концентрации 200 нМ, клетки затем промывали один раз средой. Для мониторинга перераспределения митохондрий tau-стабильные клетки СНО инкубировали в течение 1 часа с 5 мкМ нокодазолом и 200 нМ MitoTracker ™ Green. Разборка сети микротрубочек подтверждается фиксацией и окрашиванием тубулина в иммунофлуоресцентной микроскопии. Затем Nocodazole удаляли и клетки исследовали с помощью охлажденной ПЗС-камеры на инвертированном микроскопе (Axiovert 10, Carl Zeiss Jena GmbH) с использованием стандартных фильтров для флуоресценции FITC. Окрашивание эндоплазматического ретикулума было достигнуто с помощью DiOC6 (3) при концентрации 2,5 мкг / мл, 30-минутной инкубации при 37 ° С и промывании клеток один раз средой. Затем проводили иммунофлуоресцентную микроскопию, как описано выше.

Клетки выращивали в 35-миллиметровых 6-луночных планшетах для культивирования ткани при слиянии от 2 до 80 раз при 37 ° С и 5% СО2. Супернатант затем заменяли средой, свободной от сыворотки, и через 2 ч добавляли тетраметилбродамин (TMR) -меченой трансферрин до конечной концентрации 380 нМ. Клетки дополнительно инкубировали в течение 1 ч для достижения максимального поглощения трансферрина. Среду, содержащую избыток или рециркулированный трансферрин, удаляли и добавляли новую среду, содержащую 60 мкг / мл частично Fe2 + -насыщенного трансферрина (Sigma Chemical Co.). После этого рециркуляцию контролировали путем повторного удаления среды в заданные моменты времени и количественной оценки флуоресценции меченного TMR трансферрина в спектрофлуорометре Fluoro Max (Spex Industries Inc., Edison, NJ) при длине волны 575 нм и длине волны возбуждения 552 нм. Клетки затем трипсинизировали, лизировали и определяли концентрацию белка, чтобы нормализовать флуоресцентные сигналы до общего белка, присутствующего в культуральных чашках, представляющих плотность клеток. По меньшей мере пять независимых экспериментов проводились с tau-стабильными и mock-трансфицированными клетками CHO для обеспечения статистической значимости. Для количественного определения остаточного внутриклеточного трансферрина клетки высевали на покровные стекла, выращивали в течение ночи и затем насыщали TMR-трансферрином (см. Выше). Затем клетки фиксировали в метаноле либо сразу, либо через 7 мин после удаления ПМР-трансферрина. Остаточную флуоресценцию трансферрина количественно определяли, как указано выше, с использованием стандартных фильтров для флуоресценции родамина. Картинки были скорректированы с помощью вычитания фона и коррекции затенения, предоставляемых программным пакетом MetaMorph® (Visitron). По меньшей мере 300 различных ячеек в момент времени и клеточной линии были определены количественно путем порогового значения.

Человеческий мозг содержит в основном шесть изоформ тау, полученных путем альтернативного сращивания (Goedert et al., 1989). В настоящей работе основное внимание уделяется крупнейшим (tau40, 441 остаткам) и самым маленьким (tau23, 352 остаткам) изоформам, содержащим четыре или три повтора в области связывания с микротрубочками (фиг.1). Клонирование, бактериальную экспрессию и очистку проводили, как описано (Biernat et al., 1993; Gustke et al., 1994). Другие тау-конструкции также генерировались, как описано, например K12 и K10 (полученные из htau23, три повтора с фланкирующей областью COOH или весь хвост СООН-конца), K35 (который содержит домен, связывающий микротрубочки тау, включая богатая пролином область выше по течению от повторов) и K23 (вариант tau23, не имеющий трех повторов). Константы диссоциации этих конструкций и их связывание с клеточными микротрубочками сообщалось ранее (Gustke et al., 1994; Preuss et al., 1997): tau40 (K
d = 1,1 мкМ), tau23 (2,5 мкМ), K35 (1,0 мкМ), K23 (6,5 мкМ), K10 (18,5 мкМ) и K12 (7,1 мкМ).

Плазмиду экспрессии Dynamitin (p50) трансфецировали в tau-стабильные клетки CHO с помощью DOTAP-метода. Через 6 ч после трансфекции клетки фиксировали в параформальдегиде, как описано (см. Выше). Митохондрии окрашивали MitoTracker ™ Red (Molecular Probes, Inc.), тубулином с моноклональным антитубулиновым антителом крысы (YL1 / 2, Serotec) и трансфецированным p50-dynamitin с мышиным моноклональным антидинаминином 50-I. Иммунофлуоресцентный анализ проводили, как описано выше. Экспрессионная плазмида p50 и антитело были щедрыми подарками от C. Echeverri и R. Vallee (Worcester Foundation, Shrewsbury, MA) (Burkhardt et al., 1997).

Клетки высевали на лабораторное покрытое стекло LabTek (NUNC, Inc.) с 70% слиянием. Затем нокодазол добавляли при конечной концентрации 1 мкМ в течение 2 ч и затем удаляли. За 30 минут до удаления MitoTracker ™ Red добавляли в концентрации 200 нМ для визуализации митохондрий. Спустя еще 30 мин, чтобы обеспечить восстановление цитоскелета микротрубочек, реагрегирование органелл контролировалось in vivo на инвертированном микроскопе с охлаждаемой ПЗС-камерой (см. Выше) путем записи изображений каждую секунду в течение 2 мин со следующим ограничением: только перемещенные митохондрии с минимальным расстоянием 1 мкм и скоростью 0,5 мкм / с, чтобы исключить диффузионные процессы. Используя ядро ​​в качестве эталона, переносимые митохондрии были сгруппированы по трем категориям: движение по направлению к ядру (центростремительное, обозначенное как — на рис.7) рассматривалось как отрицательное, направленное движение к периферии клетки (центробежное, обозначенное как + ) как направленный плюс конец, так и все другие движения как окружные (обозначаемые как — / +).

Чтобы исследовать влияние экспрессии человеческого тау in vivo, мы установили клетки СНО, стабильно трансфицированные tau40, изоформу, содержащую четыре повтора (Preuss et al., 1995 и этот отчет). Иммунофлуоресцентное окрашивание микротрубочек показало, что их сеть была нормальной и содержала связанный tau (рис.2), что согласуется с аналогичными результатами на MAP4-трансфицированных клетках (Olson et al., 1995; Nguyen et al., 1997). В частности, не было обнаружено связывания микротрубочек вопреки экспериментам с переходной трансфекцией (Kanai et al., 1989; Lee and Rook, 1992) или с микроинъекцией (Preuss et al., 1997), где получены более высокие клеточные концентрации MAP , Для калибровки внутриклеточной концентрации тау мы микроинъектировали различные количества очищенного рекомбинантного тау-белка в клетки СНО и готовили их для анализа иммунофлуоресценции параллельно с тау-стабильными клетками (см. Материалы и методы). Это дало среднюю концентрацию 0,04 мкг / мл тау в стабильно трансфицированных клетках, что соответствует ~ 1 мкМ. Поскольку концентрация клеточного тубулина составляет ~ 40 мкМ (Hiller and Weber, 1978), отношение tau к тубулину оставалось низким, ~ 1: 40, как и для PC12 (Drubin et al., 1985) или HeLa-клеток (Булинский и Borisy, 1979). Более того, стабильная экспрессия tau в клетках PC12 под контролем промотора цитомегаловируса (которая использовалась в наших экспериментах) приводила к двукратному увеличению внутриклеточного уровня тау-белка (Brandt et al., 1995). Взятые вместе, эти данные показывают, что концентрация тау в стабильно трансфецированных клетках СНО и N2a находится в диапазоне эндогенных уровней МАП в контрольных клетках и увеличивает общее количество МАР только в два-три раза.

Несмотря на низкую концентрацию клеток, экспрессия тау приводит к заметным изменениям в форме клеток и росте. В то время как контрольные клетки были удлинены, tau-трансфицированные клетки CHO округлились (сравните рис.2, b и e). Этот фенотип может быть вызван несколькими способами, но одной из возможностей является ингибирование кинезина моторного белка, как описано Rodionov et al. (1993), и аналогичная интерпретация уместна и в нашем случае (см. Ниже). Вторым заметным эффектом было то, что избыточная экспрессия тау в клетках СНО замедляла пролиферацию примерно в два раза (данные не показаны), аналогичные наблюдениям с MAP4-трансфицированными клетками (Nguyen at al., 1997).

Мы хотели исследовать, действительно ли наблюдаемые изменения формы и пролиферации были связаны с транспортом, зависящим от микротрубочек, и поэтому анализировали клетки с несколькими маркерами для органелл. Это выявило замечательную кластеризацию митохондрий в tau40-экспрессирующих клетках СНО вблизи ядра вблизи центра организации микротрубочек (рис. 2, а и в). Этот эффект был воспроизведен в двух независимо генерируемых tau40-стабильных клеточных линиях, таким образом исключая реклонирующие артефакты. Напротив, мак-трансфицированные клетки СНО показали, что митохондрии были диспергированы по всей цитоплазме (фиг.2
г), часто выровненного с микротрубочками, что указывает на зависящую от микротрубочек организацию митохондрий. Доля клеточной области, содержащей митохондрии, уменьшилась с 66,1% в мак-трансфицированных клетках до 27,7% в устойчивой к тау клеточной линии (см. Рис. 10). Чтобы исключить возможность артефакта фиксации, мы установили клетки СНО, стабильно трансфицированные с помощью гибридного белка зеленого флуоресцентного белка (EGFP), который позволил нам контролировать влияние тау на распределение митохондрий в живых клетках. EGFP tau был тесно связан с микротрубочками (как видно из флуоресценции EGFP) и приводил к такому же воздействию на митохондриальную кластеризацию (данные не показаны).

Поскольку имеется несколько сообщений (например, Summerhayes et al., 1983), связывающих распределение митохондрий с целостностью системы промежуточных волокон, мы исследовали, была ли изменена сеть виментина посредством сверхэкспрессии тау. В стабильных tau40 клетках расширение этой нитевидной сети значительно уменьшается и становится в перинуклеарной области (Trinczek, B., A. Ebneth, E.-M. Mandelkow, E. Mandelkow, подготовка рукописи). Таким образом, можно предположить, что влияние тау на систему промежуточных нитей может объяснять агрегацию митохондрий в MTOC. Однако при лечении клеток нокодазолом для разрушения микротрубочек митохондрии снова начали диспергироваться (см. Ниже), тогда как расширение сети промежуточных волокон не было изменено в стабильных к тау клетках СНО, несмотря на разрушение микротрубочек. Было показано, что разрушение микротрубочек приводит к коллапсу системы промежуточных нитей (Klymkowski et al., 1989). Удаление нокодазола снова не влияло на расширение сети виментина (данные не показаны), но приводило к рекрутированию митохондрий, что указывает на то, что целостность системы микротрубочек, а не промежуточной системы нитей, отвечает за наблюдаемый фенотип кластеризации митохондрий в стабильных по tau40 клетках.

Интересно отметить, что ингибирование кинезиновых двигателей путем микроинъекции ингибирующего антитела в фибробласты привело к поразительно сходному фенотипу перинуклеарной локализации системы виментина (Gyoeva and Gelfand, 1991).

Митохондрии являются органеллами, которые могут исчезнуть из клеточных областей с пониженным метаболическим спросом (например, Morris and Hollenbeck, 1993). Это повышает вероятность того, что кластеризация митохондрий не связана с нарушением транспорта клетки, а с изменением метаболической активности на периферии из-за избыточной экспрессии тау. По этой причине мы искали другие органеллы, которые, как известно, транспортировались через моторы, зависящие от микротрубочек, и спросили, сгруппированы ли они. Это действительно так. При окрашивании тау-стабильных клеток с антителом, выращенным против каталазы, ферментом, присутствующим в матриксе пероксисом, органеллы были значительно обогащены в перинуклеарной области, тогда как в контрольных клетках они были равномерно распределены (данные не показаны). Это говорит о том, что группировка органелл вблизи MTOC вызвана общим влиянием tau на микротрубочковый перенос с концевым концом, а не на селективное ретракцию митохондрий в ответ на измененные потребности в метаболизме.

Для идентификации доменов tau, ответственных за кластеризацию митохондрий, мы изучали клетки СНО, стабильно трансфицированные несколькими изоформами тау или конструкциями, поведение которых уже было охарактеризовано in vitro (Gustke et al., 1994; фиг.1): человеческий tau40 ( самая длинная изоформа в центральной нервной системе), tau23 (самая короткая изоформа, обнаруженная преимущественно в эмбриональном мозге), K12 (конструкция тау, содержащая только три повтора плюс COOH-терминальная фланкирующая область), K10 (содержащий три повтора плюс весь COOH -терминальный остаток молекулы), K35 (содержащий три повтора и обе фланкирующие области) и K23 (вариант tau23 без повторов). Изоформы tau40, tau23 и K35 индуцировали выраженную митохондриальную кластеризацию вокруг MTOC (фиг.2 и 3, a-d и данные не показаны), тогда как K10 (данные не показаны), K12 и K23 не показывали эффект ( Фиг.3, e-h). Это хорошо коррелирует с сильными связями (константы диссоциации ~ 1,2 мкМ для tau40, tau23 и K35 по сравнению с ~ 7-20 мкМ для других конструкций Gustke et al., 1994). K35 связывается плотно, но не имеет частей домена NH2-терминального проецирования, так что этот домен, по-видимому, имеет меньшее значение для переноса митохондрий. И наоборот, K10 и K12 содержат повторы, но не имеют NH2-терминальной проекции и фланкирующих доменов. Таким образом, их связывание с микротрубочками является слабым, и это объясняет, почему они не влияют на распределение митохондрий. K23 — частный случай, поскольку он содержит область проектирования, две фланкирующие области, но не повторы. Он связывается с микротрубочками с разумным сродством (K
d ~ 7 мкМ), но все же не влияет на трафик на основе микротрубочек. Эти наблюдения утверждают, что высокое сродство тау к микротрубочкам является основным определяющим фактором для наблюдения эффектов сверхэкспрессии тау и маловероятно, что тау ингибирует перенос плюс-конец, непосредственно связываясь с кинезинами.

Затем мы спросили, не отвечает ли высота тау-белка за фенотип кластеризации митохондрий в MTOC, или это связано с другими факторами, не связанными с уровнем белка. Рекомбинантный tau40 подвергали микроинъекции в модулированные трансформированным клетками СНО до конечной концентрации ~ 1,2 мкМ, где не затрагивалась сеть микротрубочек (Preuss et al., 1997). Тем не менее, митохондрии начали накапливаться вблизи ядра в течение 4 ч (рис.4). Микроинъекция сыворотки мыши в той же концентрации, что и контроль, с другой стороны, не влияла на распределение митохондрий (данные не показаны). Таким образом, фенотип может генерироваться без влияния на цитоскелет микротрубочек, предполагая, что тау-белок оказывает прямое влияние на перераспределение митохондрий, предположительно, задерживая их направленное движение плюс-конец (см. Ниже).

Чтобы выяснить, важна ли организация и целостность микротрубочек для кластеризации митохондрий, мы применили два препарата для микротрубочек, нокодазол и таксотер. Нокодазол вызывает разборку микротрубочек, таксотер (производное таксола) вызывает их сборку и стабилизацию (Jordan and Wilson, 1998). В присутствии таксотера новые микротрубочки случайно зарождаются в цитоплазме независимо от MTOC, так что определенная полярность и ориентация теряются (McNiven and Porter, 1986; Weisshaar et al., 1992). Если бы микротрубочки опосредули релокализацию митохондрий к центру клетки, можно было бы ожидать, что нарушение сети микротрубочек в сверхэкспрессирующих клетках тау может привести к распределению дикого типа. Это действительно наблюдалось. На фиг.5 показано нарушение микротрубочек в tau-стабильных клетках СНО, обработанных нокодазолом, что привело к увеличению цитозольного фонового окрашивания, возникающего в результате дизассемблированных димеров тубулина. В течение 1 ч после лечения нокодазолом митохондрии перераспределялись в периферические области клетки. Таким образом, область, содержащая митохондрии, увеличивается с 27,7 до 63,9%, что достигает значения контрольных клеток в пределах поля погрешности (см. Рисунок 10). Напротив, когда нокодазол снова удалялся, по-видимому, нормальная сеть микротрубочек вновь появлялась в течение примерно 15 мин (данные не показаны), происходящие из MTOC, и фенотип митохондриальной кластеризации, хорошо видимый уже в течение ~ 1 ч, был полностью восстановлен после ~ 4 ч, что указывает на то, что органеллы были активно транспортированы к МТОК (см. рис. 6 и 10). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что сдвиг в балансе между двигателями с положительным и отрицательным концом через сверхэкспрессию тау отвечает за фенотипические эффекты. Таким образом, ожидается, что отношение митохондрий, активно переносимых к периферии клеток (то есть направленное на плюс-конец), или к центру клетки (MTOC, направленное против минус конца) в tau-stable против контрольных клеток, будет изменено сверхэкспрессией tau. Чтобы более подробно исследовать это, клетки обрабатывали нокодазолом для достижения равномерного распределения митохондрий в обеих клеточных линиях. Затем матрице микротрубочек было позволено восстанавливаться путем вымывания лекарственного средства и анализировалось направление движения отдельных митохондрий. Несмотря на то, что на транспорте в целом влияет сверхэкспрессия тау (рис.7), независимо от вида двигательной активности, перенос плюс-конец уменьшился в 10 раз, тогда как перенос с уменьшенным концом упал только примерно в два раза, в результате чего чистый перенос митохондрий в тау-стабильные клетки по сравнению с контрольными клетками.

Эти результаты показывают, что процессы, зависящие от микротрубочек, ответственны за кластеризацию митохондрий. Это также означает, что митохондрии могут рассеиваться независимо от микротрубочек, предположительно путем диффузии (в отличие от ER, см. Ниже). Тот факт, что восстановление сети МТ приводит к разукрупнению митохондрий вблизи клеточного центра, свидетельствует о том, что избыточная экспрессия тау снижает преимущественно перенос этих органелл на плюс-конец (см. Ниже). Если бы это было так, можно было бы ожидать, что нормальное распределение митохондрий может быть восстановлено даже в сверхэкспрессирующих клетках тау, отменив полярную организацию микротрубочек. Это может быть достигнуто путем лечения клеток с таксотером (при конечных концентрациях до 10 мкМ), что приводит к зарождению микротрубочек со случайными ориентациями по всей цитоплазме. На рисунке 8 показано, что таксоторная терапия имеет аналогичный эффект, как нокодазол, при восстановлении дисперсного распределения митохондрий. Опять же, область, содержащая митохондрии в устойчивых к тау клеткам, возрастает до 58,1%, что сопоставимо с 66,1% клеток, трансфицированных макетом (см. Рисунок 10). Этот результат кажется противоречащим друг другу, поскольку оба препарата оказывают противоположное воздействие на микротрубочки, но это становится понятным, учитывая, что таксотор рандомизирует микротрубочки (при используемых микромолекулярных концентрациях) и таким образом разрушает основу для направленного транспорта. Другими словами, фенотип, вызванный нарушением транспорта с положительным концом, может проявляться только в присутствии поляризованной сети микротрубочек, где концы микротрубочек минус сходятся на MTOC. Рандомизированная полярность микротрубочек путем добавления таксотера позволяет переносить митохондрии на периферию клеток с помощью электродвигателей с отрицательным концом и, таким образом, приводит к повторной дисперсии этих органелл.

Предполагается, что перенос митохондрий с отрицательным концом митохондрий зависит от dynein (Hirokawa et al., 1990; Vallee et al., 1995), и поэтому можно было бы ожидать, что ингибирование dynein будет противодействовать кластеризации митохондрий, вызванных сверхэкспрессией тау. Мы ингибировали динеин путем переходной трансфекции тау-сверхэкспрессирующих клеток с помощью динамитина, субъединицы комплекса динактина, которая имеет решающее значение для связывания между органеллами и микротрубочками (Burkhardt et al., 1997). Сверхэкспрессия dynamitin в tau-стабильных клетках значительно уменьшала кластеризацию митохондрий, тогда как трансфекция EGFP как контроль не влияла на распределение митохондрий (рис.9). Площадь, содержащая митохондрии в клетках после трансфекции, увеличилась с ~ 28% в EGFP-трансфецированных тау-стабильных клетках до 47,9% в сверхэкспрессирующих клетках динамита (P <0,0001, двухсторонний тест Стьюдента, рис. 10). Тот факт, что митохондрии не были полностью редиспергированы (в отличие от обработанных нокодазолом клеток, где полнота рассеяния), вероятно, связана с фиксацией клеток через 6 ч после трансфекции. Поскольку чрезмерная экспрессия dynamitin влияет на организацию MTOC (Burkhardt et al., 1997), которая, в свою очередь, мешает направленному микротрубозависимому транспорту митохондрий, мы анализировали только те клетки, чья сеть микротрубочек явно не затронута. Однако эксперимент демонстрирует, что двигатели dynein активно участвуют в переносе митохондрий и спорят о различных типах механизмов, которые действуют в других ситуациях (например, привязывание к сокращающимся микротрубочкам, Lombillo et al., 1995).

До сих пор мы концентрировались на зависящем от микротрубочек переносе митохондрий в трансфецированных клетках СНО. Однако микротрубочки также ответственны за транспортировку других везикул и органелл, в частности эндоплазматического ретикулума (Terasaki and Reese, 1994). Его распределение, по-видимому, зависит как от кинезинзависимого транспорта, так и от нетронутой сети микротрубочек (Vale and Hotani, 1988; Hamm-Alvarez et al., 1993; Feiguin et al., 1994). Чтобы исследовать, повлияет ли избыточная экспрессия тау на ER, мы окрашивали живые клетки с помощью DiOC6 (3), флуоресцентного маркера для ER. Сверхэкспрессия тау вызывала выраженные изменения в форме и расширении ER (рис.11). Во-первых, в tau-stable клетках расширение ER было сильно уменьшено, так что оно больше не достигало периферии клетки. Во-вторых, плотность и разветвление ER значительно снизились. Как и в случае с митохондриями, этот результат согласуется с предположением о том, что перенос плюс-конец по микротрубочкам нарушен.

С другой стороны, наблюдения с препаратами таблеток азота и нокодазола на микротрубочках показали, что поведение ER является более сложным. Таксотер частично восстановил распределение дикого типа, хотя ЭР не полностью достигла периферии клетки (данные не показаны). Напротив, после нарушения микротрубочек с нокодазолом, ER снова не расширялся. Эти результаты подтверждают, что организованные микротрубочки необходимы для общей конституции ER, в дополнение к кинезину (Lippincott-Schwartz, 1998).

Эндо- и экзоцитотические процессы зависят от интактного микротрубочного цитоскелета. Поэтому мы задавали вопрос о том, влияет ли и на сверхэкспрессию тау в этих процессах, используя маркер, помещенный в родамин, в качестве маркера. Транстрин эндоцитируется через рецепторы трансферрина и везикулы, покрытые клатрином, и активно транспортируется по микротрубочкам с помощью моторных белков через ранние и сортирующие эндосомы в рециркулирующие отделения в перицентриолярной области клетки. Он, наконец, высвобождается экзоцитозом, опять же через процессы, зависящие от микротрубочек (Martys et al., 1995). Отток трансферрина измеряли удалением супернатанта в разные моменты времени и путем количественного определения экзоцитированного трансферрина флуоресценцией (фиг.12
а). В ранние моменты времени (через несколько минут после удаления избыточного трансферрина) устойчивые к тау клеточные линии показали значительно более низкий уровень экзоцитированного трансферрина, чем контрольные клетки, но эта разница исчезла позже (~ 20 мин). Таким образом, внешний поток экзоцитарных везикул был замедлен, но не прерывался.

Это наблюдение было подтверждено путем количественного определения иммунофлуоресценции остаточного TRITC-меченого трансферрина в клетках, устойчивых к таутону, и контрольно-контрольных клеток. Устойчивые к метанолу тау-стабильные клетки приводили к значительному увеличению количества трансферрина в течение 7 мин после удаления трансферринсодержащих сред по сравнению с клетками, подвергнутыми трансплантации (фиг.12
а; P <0,0001, двухсторонний тест Стьюдента), в основном в районе MTOC (область отделения для рециклинга, Martys et al., 1995). В то время как ~ 50% исходного внутриклеточного трансферрина были эксцизированы в мак-трансфицированных клетках, только 10% были переработаны в устойчивых к тау, клетках в течение того же периода времени. Это хорошо коррелирует с экспериментом, показанным на фиг.12 b, где, наоборот, количественно определяли эксцицированный трансферрин. Опять же, через ~7 мин, только 50% трансферрина подвергали экзоцитозу в стабильных по сравнению с контрольными клетками.

В экспериментах, описанных до сих пор, мы сосредоточились на клетках СНО, чтобы исследовать влияние тау на транспортные процессы. Главными причинами были то, что клетки СНО хорошо подходят для изучения транспорта из-за их сплюснутой формы клеток и их размера, что облегчает наблюдение и микроинъекцию. Во-вторых, клетки СНО обычно не выражают tau, так что дискриминация между эндогенными MAP (например, MAP4) и стабильно введенная тау намного проще, чем в клетках нейробластомы. С другой стороны, тау выражается в основном в ткани нейронов, ставя вопрос о том, проявляются ли эффекты сверхэкспрессии тау в нейронных клетках. По этой причине мы стабильно трансфицировали человеческий тау40 в клеточную линию нейробластомы мыши N2a. Хотя клетки клеток N2a очень компактны и малы (~ 10-20 мкм, по сравнению с ~ 40 мкм для клеток СНО), так что трудно обнаружить различия в локализации митохондрий, органеллы, по-видимому, сгруппированы в окрестности ядро в tau-stable по сравнению с контрольными клетками. С другой стороны, транспортные процессы в нейритах с дифференцированными клетками N2a можно контролировать гораздо легче, поскольку транспортный дефицит в этих структурах накапливается в более значительной степени. Как показано несколькими сообщениями, тау-белок важен для генерации нейритов, а перенос материала в нейриты зависит от кинезина (Baas et al., 1991; Feiguin et al., 1994).

Дифференцированные клетки N2a дикого типа содержат обильные митохондрии в их нейритах, простирающиеся вплоть до кончика (рис.13
г). В поразительном контрасте нейриты дифференцированных клеток N2a, трансфицированных тау, показали очень мало митохондрий (рис.13
a и таблица I). Замечательное истощение митохондрий из нейритных расширений в этих клетках указывает на то, что избыточная экспрессия тау в нейронных клетках приводит к тому же фенотипу, что и в клетках СНО, и снова может быть объяснена ухудшением транспорта митохондрий, зависящего от микротрубочек. Отсутствие этих органелл серьезно ограничило бы энергоснабжение нейритов и могло бы вызвать их дегенерацию. Эти наблюдения имеют значение для клеточных причин болезни Альцгеймера, где повышенное и неправильно локализованное тау сопровождается дегенерацией нейронов (как обсуждается ниже).

Поскольку распределение митохондрий было нарушено в дифференцированных клетках нейробластомы N2a, сверхэкспрессирующих тау, мы спросили, затронуто ли ER также (судя по иммунофлюоресценции с ER-специфическим антителом, Louvard et al., 1982). Контрольные клетки показали элементы ER по всему телу клетки, в основном окружающие ядро, но видимые в нейритных структурах. Напротив, большинство тау-сверхэкспрессирующих клеток (~82%, таблица I) показали, что ER был разрушен к центру клетки, не распространяясь вокруг ядра (рис.14
а). Общая интенсивность ER-окрашивания оставалась неизменной в двух типах клеток. В частности, ER, распространяющийся в нейриты, сильно уменьшался в стабильных по tau клетках (сравните рис.14, а и d). Таким образом, повышенный уровень тау в дифференцированных клетках N2a вызывает ретракцию структуры ER в теле клетки, аналогичную эффекту, наблюдаемому в клетках СНО, что приводит к уменьшению ER в нейритах, возможно, путем воздействия на внутриклеточные транспортные процессы. В соответствии с этим, нейриты сверхэкспрессирующих клеток тау значительно короче, чем у контрольных клеток (например, количество нейритов, простирающихся на 30 мкм, уменьшается примерно в три раза, таблица I).

В этом исследовании мы исследовали, как повышенный уровень белка тау (вызванного сверхэкспрессией или микроинъекцией) влияет на внутриклеточный перенос в клетках СНО и нейробластомы. Основные результаты можно резюмировать следующим образом: (a) увеличение tau приводит к кластеризации митохондрий и пероксисомов вблизи MTOC (рис.2), к сокращению промежуточной системы нитей и ER (рис.11) и к снижение скорости экзоцитоза (например, рецептора трансферрина, фиг.12). Клетки теряют свою вытянутую форму и округляются (рис.2), и их темп роста замедляется. Митохондрии и ER уменьшаются в нейритных процессах (рис. 13 и 14, таблица I). (б) Все вышеуказанные эффекты наблюдаются при относительно низких уровнях сверхэкспрессии тау, где сеть микротрубочек не ухудшается (нет связывания, никакого отрыва от MTOC); Фактически, они зависят от целостности сети микротрубочек. Эффекты также зависят от сильного связывания тау с микротрубочками (K
d ~ 1 мкМ, обеспечиваемый повторами и богатым пролином фланкирующим доменом). (c) Если сеть микротрубочек разрушена лекарственными средствами (т.е. разборкой нокодазолом, фиг.5) или отрывом микротрубочек от MTOC и рандомизацией таксотерами (фиг.8), индуцированные тау изменениями в митохондриях обратный, так что органеллы снова рассеиваются по всей клетке (рис.10). (d) Ингибирование динеина (посредством сверхэкспрессии динамимита) отменяет эффекты сверхэкспрессии tau и позволяет дисперсию митохондрий (рис. 9 и 10).

Эти эффекты могут быть объяснены предположением, что tau интерферирует преимущественно с переносом плюс-конец по микротрубочкам с участием кинезина, тогда как перенос минус-конца с участием dynein менее подвержен влиянию. Направленность транспорта органелл, наблюдаемая с тау-трансфицированными клетками, согласуется с рядом сообщений, показывающих, что перенос с концевым концом достигается главным образом кинезин-подобными двигателями и обратным транспортом dynein (Vallee and Sheetz, 1996; Rickard и Kreis, 1996; Hirokawa, 1998; Lippincott-Schwartz, 1998). Например, митохондрии транспортируются кинезинными двигателями KIF1B (Nangaku et al., 1994) и KIF5B (Tanaka et al., 1998) или в противоположном направлении dynein (Hirokawa et al., 1990), и, следовательно, ингибирование кинезина приводит к чистому ретроградному переносу митохондрий. Родионов и др. (1993) показали, что микроинъекция ингибирующего кинезинового антитела, которая перекрестно реагирует с несколькими членами надсемейства кинезина, приводит к поразительно сходному фенотипу митохондриальной кластеризации. Кроме того, целенаправленное разрушение мышиной обычной кинезиновой тяжелой цепи KIF5B приводит к перинуклеарной кластеризации митохондрий (Tanaka et al., 1998). Аналогично, расширение ER и системы промежуточных нитей или торговля везикулами определяется балансом между кинезин- и dynein-зависимыми движениями, так что ER и виментин-сеть разрушаются при подавлении кинезина (Feiguin et al., 1994; Gyoeva and Gelfand, 1991). (Термин «антероград» используется для переноса аксонов с положительным концом вдоль микротрубочек, а также для переноса с конца до конца от ER до Гольджи, так что мы предпочитаем термин «плюс-конец» для настоящее обсуждение.)

Функция tau или MAP обычно обсуждается с точки зрения их роли в стабилизации микротрубочек (Matus, 1994), генерации клеточных процессов (Kosik and McConlogue, 1994) в их спейсерной функции между микротрубочками (Chen et al., 1992) , или в качестве фиксирующих сайтов для других белков (Obar et al., 1989; Ookata et al., 1995). Представленные здесь данные указывают на новую функцию tau; т. е. регулирование транспорта внутри клеток путем изменения внутриклеточной концентрации тау на поверхности микротрубочек. Поскольку связанные эффекты наблюдались с MAP4 (Bulinski et al., 1997), это может быть общей функцией MAP. В этом контексте интересно отметить, что, хотя MAP4 эффективно стабилизирует микротрубочки in vitro и in vivo, было обнаружено, что митохондриальное распределение в MAP4-сверхэкспрессирующих клетках не изменяется (Nguyen et al., 1997). Это говорит о том, что изменение времени жизни микротрубочек объясняет влияние кластеризации митохондрий, поскольку срок жизни будет увеличен как с помощью MAP4, так и с tau. Что более важно, сравнение, возможно, указывает на различные функции tau и MAP4 in vivo.

Вопрос о том, могут ли МАР и двигатели влиять друг на друга на микротрубочку, является предметом расширенных обсуждений, главным образом потому, что экспериментальные данные, полученные in vitro, остаются двусмысленными (например, Paschal et al., 1989; Von Massow et al. 1989; Rodionov et al., 1990; Lopez and Sheetz, 1993; Hagiwara et al., 1994). Результаты зависели не только от типа используемых MAP и двигателей, их эффективных концентраций (в растворе или связанных с поверхностью), но также и от экспериментальной конструкции (микропланшетное сканирование или исследование движения шариков). Большинство результатов in vitro показало, что обязательное обязательное наблюдение за любым ингибированием подвижности связано с плотным связыванием MAP с микротрубочками через связывающий микротрубочку домен и большой проекционный домен. Таким образом, MAP2 может замедлять кинезин или динеин, тогда как меньшие MAP (например, tau, MAP2c) оказывали гораздо меньший эффект или вообще не наблюдались (Von Massow et al., 1989; Lopez and Sheetz, 1993).

Понятно, что можно проанализировать интерференцию между MAP и двигателями с точки зрения конкуренции за общие сайты связывания на микротрубочке и / или с точки зрения стерических помех (Lopez and Sheetz, 1993). Для чисто конкурентного механизма потребуется только область связывания микротрубочек MAP (повторы плюс фланкирующие области), в то время как стерическое затруднение будет зависеть как от связывания микротрубочек, так и от домена NH2-терминального проецирования. Поскольку некоторые из ранних исследований подчеркивали, что для моторного торможения необходимы большие проекционные области MAP, мы с удивлением обнаружили, что небольшая MAP, такая как tau, сверхэкспрессированная только умеренно в клетках, может быть ингибирующей для переноса с плюсом-концом. Это может быть достигнуто даже при конструкциях, не имеющих проекционной области (K35). Конструкции с низкой аффинностью вообще не имели эффекта (K10, K12), даже когда присутствовала проекционная область, как в K23 (рис.3). Очевидно, что клеточная среда более чувствительно реагирует на MAP, чем экспериментальные системы, используемые in vitro. Это можно объяснить несколькими факторами: в переполненной среде клетки даже более короткие MAP могут иметь заметные эффекты для транспорта, что было бы наиболее очевидно для небольших двигателей (обратите внимание, что KIF1B, ответственный за перенос митохондрий, имеет длину всего 35 нм , по сравнению с 75 нм для обычного кинезина, Nangaku et al., 1994; Scholey et al., 1989). Во-вторых, периоды наблюдения длинны по сравнению с экспериментами in vitro, так что небольшие различия в скоростях переноса могут накапливаться в измеримой степени. В-третьих, клеточные эффекты возникают в результате взаимодействия между двигателями с плюсом и минус-концами, которые по-разному влияют на MAP, в то время как эксперименты in vitro проводились только с одним типом двигателя. Наконец, исследования in vitro обычно выполняются с избытком двигателей, которые, как правило, подавляют сопротивление, которое могут предложить MAP. Сравнение между различными изоформами и конструкциями тау показывает, что в ингибировании движения везикулы преобладает конкуренция между тау и двигателями для сайтов связывания на микротрубочках, в то время как стерическое препятствие имеет меньшее значение.

Считается, что направление транспорта на основе микротрубочек определяется конкретными двигательными белками, закрепленными на органеллере с помощью переходных комплексов (например, кинектин, динактин, Кумар и др., 1995; Burkhardt et al., 1997). Разнообразие моторных белков в клетках позволяет, в принципе, для каждого типа пузырьков или органелл выбирать один или несколько типов двигателей в зависимости от требуемого назначения (Hirokawa, 1998; Hamm-Alvarez et al., 1993). Несмотря на прикрепленные двигатели, движение везикул является не просто однонаправленным, а скорее соляционным, с частыми отрядами и даже разворотами (Wacker et al., 1997). Таким образом, сетевое движение является результатом многих испытаний, смещенных в определенном направлении. Внутри ячейки MAP могут подавлять активность двигателя несколькими способами; например, путем предотвращения первоначального прикрепления, путем уменьшения скорости или уменьшения длины прогона. В данном контексте важным моментом является то, что tau, скорее всего, влияет на баланс между разными направлениями, что ухудшает движение митохондрий с положительным концом больше, чем минус-направленные, и это приводит к кластеризации этих органелл вблизи MTOC, тогда как фенотип ретракции ER или замедление экспорта трансферрина может быть достигнуто путем простого снижения общих транспортных процессов или влияния длины прогона моторных белков на микротрубочки.

Помимо движения соленой частицы с направленным смещением, следует также рассмотреть и другие механизмы. Например, расширение сети ER может управляться полимеризацией микротрубочек, где кончики микротрубочек прикрепляются к мембране с помощью специальных комплексов прикрепления (Allan and Vale, 1994; Waterman-Storer et al., 1995) и анафазного переноса хромосом могут быть вызваны деполимеризацией микротрубочек (Lombillo et al., 1995; Merdes et al., 1997). Комплексы прикрепления могут содержать моторные белки, которые в этом случае работают как анкеры микротрубочек, а не как независимые двигатели. На практике в клетке могут сосуществовать двигательные и сборные механизмы (Родионов и Борисы, 1997). Однако в нашем случае прямые мотор-зависимые процессы, по-видимому, являются доминирующими, о чем свидетельствует индуцированное динамитами ингибирование динеина (рис. 9 и 10, Burkhardt et al., 1997). Более того, поскольку tau стабилизирует микротрубочки, ожидается, что он будет улучшать перенос с плюсом-концом, если это было связано с сборкой, а не ингибировать его, как это наблюдается. Наконец, отметим, что на распределение органелл в цитоплазме могут влиять два дополнительных механизма, диффузия и движение на основе актомиозина. Последний, по-видимому, ограничен специализированными областями (например, вблизи коры клетки или аксона, Morris and Hollenbeck, 1995; Mermall et al., 1998), но диффузионный компонент, вероятно, будет работать в любое время. Он объясняет дисперсию кластеризованных митохондрий при разборке микротрубочек с помощью нокодазола, но на это вряд ли повлияет тау.

Определив эффекты сверхэкспрессии тау в клетках СНО, очевидный вопрос заключался в том, будут ли наблюдаться аналогичные эффекты в клетках нейронного происхождения. В этом случае экспериментальные подходы более ограничены из-за меньшего размера клеток. Например, перераспределение органелл в теле клетки трудно наблюдать, а уровень эндогенного тау слишком мал для многих биохимических анализов. С другой стороны, везикулы и органеллы легко обнаруживаются в длинных нейритных процессах дифференцированных клеток. Таким образом, нейриты контрольных клеток N2a показывают окрашивание маркерами митохондрий и ER, но клетки N2a сверхэкспрессируют tau только на значительно более низком уровне. В соответствии с предыдущей интерпретацией это означает, что перенос с плюсом-концом, по крайней мере в случае митохондрий, нарушается, что приводит к накоплению этих элементов в теле клетки.

Эффект тау на торговлю везикулами, описанный здесь, представляет собой новую функцию, которая пока мало привлекала внимания. Частично это объясняется тем фактом, что влияние MAP на активность моторных белков в основном изучалось in vitro, показало лишь слабые эффекты, видимые только при высоких концентрациях MAP и, по-видимому, были ограничены высокомолекулярными MAP (Paschal et al. 1989, Von Massow et al., 1989; Lopez and Sheetz, 1993; Hagiwara et al., 1994). Тем не менее, в контексте клеток, тонкие эффекты становятся увеличенными и видимыми как перераспределение клеточных компонентов. Важнейшей предпосылкой для влияния тау на внутриклеточное движение является жесткое связывание с микротрубочками из-за повторов и фланкирующих доменов (~1-2 мкМ), в то время как проекционный домен имеет лишь незначительный эффект. Это означает, что фосфорилирование тау должно играть важную роль, поскольку это регулирует сродство тау к микротрубочкам. Можно широко различать два типа фосфорилирования тау, пролин, направленных (влияющих на мотивы Ser-Pro или Thr-Pro и индуцированные пролин-направленными киназами, такими как MAP-киназа, GSK3, cdk5) и непролин, направленные (индуцированные вторым посланником -зависимые киназы, такие как PKA, PKC, CaMK, MARK, для обзора см. Mandelkow et al., 1995). Пролин-направленное фосфорилирование оказывает лишь умеренное влияние на взаимодействия тау-микротрубочек (Biernat et al., 1993), тогда как два других сайта сильно нарушают взаимодействие, Ser262 (фосфорилированный MARK, Drewes и др., 1997) и Ser214 (фосфорилированный PKA; Zheng-Fischhöfer et al., 1998; оба эти места усилены в тау). До сих пор такие сайты в основном рассматривались как модуляторы стабильности микротрубочек. Однако в свете наших настоящих результатов следует также рассматривать реакции фосфорилирования, связанные с аффинностью MAP-микротрубочек, как модуляторы внутриклеточного трафика. В этом случае tau, связанный с микротрубочками, будет оказывать сопротивление движению плюс-конец, которое будет облегчено путем фосфорилирования и отсоединения тау от микротрубочек. Поскольку внешний поток материала является предпосылкой для полярности и дифференцировки клеток (Feiguin et al., 1994; Bradke and Dotti, 1997), активность тау-киназ станет важной в этот момент. Интересно отметить, что перенос везикул может быть ингибирован MAP2, но облегчается киназой, которая, вероятно, связана с MARK (Drewes et al., 1997; Lopez and Sheetz, 1995), киназой, которая фосфорилирует MAP2c и MAP4 in vitro ( Illenberger et al., 1996), и поэтому можно ожидать, что он будет регулировать сродство MAP к микротрубочкам в целом. Это указывает на еще одно интересное наблюдение: было показано, что MAP1A может компенсировать отсутствие тау у нокаутных мышей (Harada et al., 1994), предполагая, что функция MAP частично избыточна. В то время как аксональное удлинение не влияло на этих животных, стабильность микротрубочек снижалась в некоторых аксонах. Вполне возможно, что различные МАР регулируют транспортировку различных органелл и в разных клеточных отсеках. Таким образом, было бы интересно сопоставить распределение органелл и MAP в моделях мыши, лишенных или сверхэкспрессирующих MAP, чтобы получить дополнительные сведения о функциях MAP во внутриклеточном транспорте.

Эффекты сверхэкспрессии тау при распределении митохондрий, везикуле и ОР имеют важные последствия для болезни Альцгеймера. В AD тау аномально фосфорилируется, агрегируется в парные спиральные нити и неправильно локализуется от аксона до соматосендритового отделения (Binder et al., 1985; Wischik et al., 1988; Braak et al., 1994). Кроме того, сообщалось, что концентрация внутриклеточного тау-белка в мозге AD повышена (Khatoon et al., 1992). В нейронах эта неправильная локализация и повышенная внутриклеточная концентрация тау влияют на перенос митохондрий или ER в самые периферические области аксонов и приведут к снижению метаболизма глюкозы и синтезу АТФ в этих отделениях, вызывая дефицит энергии, потерю Ca2 + гомеостаза или синтеза липидов (Futerman and Banker, 1996; Mattson and Guo, 1997). Наконец, это может привести к дегенерации нейрона, по-видимому, начиная с самых дистальных областей, что приводит к так называемому «отмиранию» аксонов (Braak et al., 1994; Trojanowski and Lee, 1995). В этом контексте представляет особый интерес, что скомпрометированная митохондриальная функция действительно ассоциируется с поздней стадией болезни Альцгеймера (Davis et al., 1997). Кроме того, замедление транспортных процессов может повлиять на правильное распределение белков, в частности белка предшественника амилоида (APP), другого ключевого игрока в развитии болезни Альцгеймера, которая перенаправляется трансцитозом (Simons et al., 1995) и чья протеолитическая обработка в амилоидогенный пептид Aβ1-42 происходит в эндоплазматическом ретикулуме (Cook et al., 1997; Hartmann et al., 1997). Таким образом, ингибирование транспорта из-за избыточной экспрессии и неправильной локализации тау в нейронах может увеличить продукцию Aβ1-42. Напротив, перепроизводство амилоидогенных вариантов APP коррелирует с повышенным уровнем тау-белка и тау мРНК (Lee et al., 1996), а в синдроме Дауна, страдающем от болезни Альцгеймера, APP и tau оба регулируются (Oyama et al., 1994). Наконец, было показано, что мутантные пресенилины PS1 и PS2, ответственные за семейное заболевание Альцгеймера, взаимодействуют с APP в эндоплазматическом ретикулуме, тем самым усиливая продуцирование Aβ (Xia et al., 1997). Таким образом, будущая работа может дать новые подсказки для понимания болезни Альцгеймера, поскольку она может экспериментально связать функцию AD-специфических генных продуктов, таких как APP и пресенилины, с митохондриальным источником энергии и тау-белком.

Мы благодарим И. Тилке и К. Альма за отличную техническую помощь и Дж. Биерната за щедрое обеспечение конструкций тау. Мы с благодарностью отмечаем дар ER-антител от D. Louvard (Institut Curie, Paris, France), подарок плазмиды экспрессии dynamitin (p50) и антидинамитин-50-1-антитело от доктора RB Vallee (Worcester Foundation, Shrewsbury, MA ), и подарок антикаталазного антитела от доктора В. Просто. Эта статья частично основана на докторской диссертации Р. Годеманна и К. Стамера на биологическом факультете Гамбургского университета (Гамбург, Германия).

Этот проект был поддержан грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Обращайтесь со всей корреспонденцией к Экхарду Манделькову или Андреасу Эбнету, MPG-ASMB, Notkestrasse 85, D-22607 Hamburg, Германия. Тел .: 49-40-8998-2810. Факс: 49-40-8971-6822. E-mail: mand@mpasmb.desy.de или ebneth @ mpasmb.desy.de

Болезнь Альцгеймера

усиленный зеленый флуоресцентный белок

связанный с микротрубочками белок

микротрубочек

центр организации микротрубочек

тетраметилродамин

Митохондрии накапливаются вблизи МТОК в клетках СНО, сверхэкспрессирующих тау. Клетки стабильно трансфицировали tau40 (a-c) и mock-трансфицированные клетки CHO (d-f). Микротрубочки окрашивали антителом DM1A (b и e) и tau с поликлональным антитау-антителом K9JA (c и f). Митохондрии визуализировали с помощью MitoTracker ™ Green (a и d). Клетки фиксировали в метаноле через 30 мин после добавления MitoTracker ™ Green. В tau-стабильных клетках (a-c) наблюдается поразительная кластеризация митохондрий вблизи MTOC (наблюдается вблизи ядра, где окраска микротрубочек наиболее интенсивна), тогда как в mock-transfected клетках (d-f) митохондрии рассеиваются во всей цитоплазме. Кроме того, стабильные по tau клетки более округлены по сравнению с контрольными клетками. Бар, 20 мкм.

Влияние различных тау-конструкций на митохондриальное распределение в клетках СНО. Распределение митохондрий в клетках СНО, стабильно трансфицированных различными конструкциями тау, исследовали после фиксации параформальдегида. Это позволяет визуализировать общее количество тау в клетках, но имеет тенденцию диссоциировать тау из микротрубочек (см. Материалы и методы). Человеческий tau23, самый короткий tau-isoform (a и b), а также K35 (c и d), конструкция tau, не имеющая почти всей проекционной области (см. Рис.1), привела к фенотипу митохондриальной кластеризации вблизи MTOC как видно в стабильных по tau40 клетках. С другой стороны, K23 (e и f), тау-конструкция, не обладающая областью связывания микротрубочек и K12 (g и h), состоящая в основном из этой области MT-связывания (рис.1), не изменяла распределение митохондрий , Это говорит о том, что жесткое связывание тау с микротрубочками является предпосылкой для ухудшения переноса этих органелл с плюсовым концом и исключает возможность того, что тау может ингибировать кинезин путем непосредственного взаимодействия с моторным белком. Митохондрии окрашивали MitoTracker ™ Red (a, c, e и g) и трансфицировали tau поликлональным антитау-антителом K9JA (b, d, f и h). Бар, 20 мкм.

Организация ER изменена в клетках CHO, сверхэкспрессирующих tau. Tau40-стабильные (a и b) и mock-трансфицированные клетки CHO (c и d) окрашивались DiOC6 (3) для визуализации ER. В tau-стабильных клетках ER менее разветвлен и не достигает периферии клетки, тогда как в контрольных клетках ER простирается почти до плазматической мембраны и отображает более сложную структуру. Обратите внимание, что хотя расширение ER меньшего размера ячейки на рисунке 11
b, по-видимому, менее эффективно по сравнению с более крупными клетками, разветвление и сложность эндоплазматического ретикулума значительно снижаются по сравнению с ложно-трансфицированными клетками в c и d. Для ясности выделена периферия ячейки. Бар, 10 мкм.

Доменная структура изоформ и конструкций тау. Tau40 — самая длинная изоформа тау в ЦНС человека, встречающаяся главным образом в аксонах (Goedert et al., 1989). Он состоит из 441 аминокислотных остатков и может быть разделен на NH2-терминальный проекционный домен и домен связывания с COOH-концевой микротрубочкой, содержащий четыре несовершенных повтора (R1-R4) и основные пролиновые богатые последовательности с обеих сторон, которые действуют как домены микротрубочек (затененные темные, P1 и P2). Повторения показывают высокую гомологию между tau, MAP2 и MAP4. Заштрихованные вставки NH2-конца и повторение двух могут быть альтернативно сплайсированы, что приводит к шести различным изоформам тау. В основном эмбриональной изоформе tau23 не хватает всех трех вставок (352 остатка). Конструкции Тау K12 и K10 получены из tau23, они содержат три повтора плюс либо COK-концевую фланкирующую область (K12), либо весь конец COOH-конца (K10). K35 содержит три повтора и основные богатые пролином области с обеих сторон, включая хвост COOH-терминала. K23 содержит все tau23, кроме повторов.

Соотношение между транспортом митохондрий с положительным и отрицательным концом изменяется с помощью сверхэкспрессии тау. Таустабильные и контрольные клетки обрабатывали нокодазолом для разрушения цитоскелета микротрубочек и для достижения равномерного распределения митохондрий в обеих клеточных линиях. Препарат вымывали после 2 часов инкубации, и митохондрии окрашивали MitoTracker ™ Red. Затем транслокации органелл регистрировали в течение 2 мин с временным интервалом 1 с. Направление движения рассматривалось как «плюс-конец», когда органеллы были перенесены на периферию (+), минус-конец, направленный, когда транспорт был направлен к ядру (-) и нейтральному (- / +), когда движение было вертикальным по отношению к оси между ядром и периферией клеток. Обратите внимание, что относительное количество переносимых митохондрий значительно ниже для всех трех групп в устойчивой к тау клеточной линии (Р <0,0001, двух хвостовых тестах Стьюдента). Однако в устойчивых к тау-клетке движениях с положительным концом значительно сильнее (в 10 раз), чем в обратном направлении (в 2 раза). Это приводит к фенотипу митохондриальной кластеризации. Для количественного анализа было проанализировано по меньшей мере 40 клеток, общее количество митохондрий варьировалось от 100 до 700 в обеих клеточных линиях.

Количественное определение кластеризации митохондрий после сверхэкспрессии тау, лечения лекарств и ингибирования динеина. Распределение митохондрий определяли количественно, как описано в материалах и методах. В эксперименте (n) анализировали минимум 30 клеток. В ложно трансфицированных клетках митохондрии занимают до 65% от общей площади клеток. То же самое верно и в клетках, стабильно трансфицированных K23, тау-конструкции, в которой отсутствуют повторяющиеся микротрубочки (CHO-K23). Это значение падает до ~ 30% в tau40-стабильных клетках (CHO-tau). Обработка стабильно трансфицированных клеток либо нокодазолом, либо таксотиром восстанавливает распределение митохондрий дикого типа (CHO-тау-нокодазол или так называемый таксотор CHO-тау, соответственно). Тот же эффект проявляется после трансфекции с помощью динамитина (CHA-tau transfection dynamitin), но не после трансфекции EGFP в качестве контрольного белка (трансфекция CHO-tau EGFP, P <0,0001, двухсторонний тест Стьюдента t). Удаление нокодазола снова приводит к кластеризации митохондрий в ядре (удаление CHO-тау, 4 часа).

Микроинъекция рекомбинантного тау-белка приводит к митохондриальной кластеризации вблизи MTOC. Клетки CHO дикого типа подвергали микроинъекции с 1,3 мг / мл (~ 1,2 мкМ) очищенного рекомбинантного тау-белка и инкубировали в течение 4 часов. После добавления MitoTracker ™ Red (a и b) клетки фиксировали параформальдегидом и окрашивали антителами против тубулина (c и d) и tau (e и f). Митохондриальная кластеризация проявляется даже в течение 4 часов после микроинъекции. Отметим, что сеть микротрубочек сохраняет свой нормальный вид и что митохондрии в микроинъекционных клетках, подобные тем, которые устойчивы к тау, клетки CHO и N2a, как правило, группируются на одной стороне ядра в окрестности MTOC. Для ясности выделена периферия клеток микроинъекционных клеток. Бар, 10 мкм.

Нарушение микротрубочек с помощью нокодазола приводит к случайному распределению митохондрий в tau-стабильных клетках СНО. Tau-стабильные клетки (a и b) и mock-трансфицированные клетки CHO (c и d). Клетки обрабатывали нокодазолом, чтобы разрушить цитоскелет МТ, зафиксированный метанолом, и иммуноглобулированный антителами против тубулина (b и d). В обеих клеточных линиях митохондрии, визуализированные путем добавления MitoTracker ™ Green до фиксации (а и с), теперь видны во всей цитоплазме даже на периферии клетки, что свидетельствует о существовании цельной сети МТ в качестве предпосылки для митохондриальной кластеризации. Бар, 20 мкм.

Повторная сборка микротрубочек после удаления нокодазола восстанавливает кластеризацию митохондрий. Цитоскелет микротрубочек трансфицированных тау клеток CHO нарушался добавлением 5 мкМ нокодазола в течение 2 часов. Фотографии живых клеток затем брали после удаления нокодазола и повторной сборки микротрубочек в указанные моменты времени. Митохондрии окрашивали MitoTracker ™ Green. Обратите внимание, что, вместе с повторной сборкой микротрубочек, фенотип митохондриальной кластеризации на MTOC вблизи ядра начинает появляться через ~1 ч. Для ясности выделена периферия ячейки. Бар, 10 мкм.

Рандомизация полярности микротрубочек с помощью таксотера позволяет разложить кластеризованные митохондрии. Таустабильные клетки обрабатывали 10 мкМ таксотоном в течение 6 ч, что приводило к изменению структуры микротрубочек. Обратите внимание, что MTOC в клетках, обработанных таксотиром, едва заметен в пятне тубулина (b), в отличие от не обработанных клеток (сравните рис.2). Микротрубочки случайным образом зарождаются во всей цитоплазме, тем самым отменяя роль MTOC как организующего элемента и, следовательно, отменяя полярность микротрубочек. Минусоидальные двигатели теперь способны переносить митохондрии обратно в периферические области в устойчивых к тау я клеткам. Клетки фиксировали в метаноле, а митохондрии окрашивали MitoTracker ™ Green (a), тубулин иммунизировали DM1A (b). Бар, 10 мкм.

Сверхэкспрессия динамита восстанавливает распределение митохондрий дикого типа. Таустабильные клетки трансфицировали динамитином (р50), субъединицей комплекса динактина. Через 6 ч после трансфекции митохондрии снова начали рассеиваться, визуализировавшись с помощью MitoTracker ™ Red после фиксации параформальдегида (a). Обратите внимание, что клетка, трансфецированная тау и dynamitin (наконечники стрел), показывает рассеянные митохондрии, тогда как соседние устойчивые к тау, клетки показывают типичную кластеризацию вблизи MTOC. Dynamitin окрашивали антидинамитином 50-1 антителом (b) и тубулином с YL1 / 2 антителом (c). Бар, 20 мкм.

Транспортировка реципиента замедляется сверхэкспрессией тау. Клетки высевали на покровные листы и предварительно инкубировали с TMR-меченым трансферрином в бессывороточной среде в течение 2 часов. Избыток трансферрина удаляли, а в метаноле фиксировали tau-stable и mock-transfected клетки. Затем остаточную флуоресценцию трансферрина определяли количественно и наносили на график (а). Заметим, что в ранние моменты времени (7 мин) флуоресценция трансферрина в стабильных по tau клетках уменьшается на ~ 10%, тогда как в контрольных клетках 50% трансферрина подвергается экзоцитозу за тот же промежуток времени. 300 клеток определяли количественно в момент времени и клеточную линию. (б) Временной ход экзоцитоза трансферрина после уравновешивания тау-стабильных и мокко-трансфицированных клеток с флуоресцентно меченным трансферрином. Значительное снижение экзоцитированного трансферрина можно наблюдать через 5-10 мин после начала эксперимента в tau-stable по сравнению с контрольными клетками. Флуоресцентные сигналы были нормализованы до общего количества клеток в каждом эксперименте. Данные представляют собой средние значения четырех независимых экспериментов.

Транспортировка митохондрий в невриты дифференцированных нейробластомы клеток нарушается сверхэкспрессией тау. Tau40-стабильные (a-c) и mock-трансфицированные клетки N2a (d-f) были дифференцированы в течение 2 дней добавлением 1 мкМ ретиноевой кислоты в среду, содержащую 0,1% фетальной телячьей сыворотки и фиксированную в метаноле. Митохондрии визуализировали с помощью MitoTracker ™ Green (a и d), иммуноокрашивание проводили с помощью антител против тубулина (b и e) и tau (c и f). Можно ясно видеть, что в нейритах устойчивых к тау, клеток в отличие от контрольных клеток значительно меньше митохондрий (сравните a и d и таблицу I). Кроме того, митохондрии в тау-стабильных клетках, по-видимому, более сгруппированы в окрестности MTOC (a), подобно тау-стабильным клеткам СНО. Сопоставимая интенсивность окрашивания тел клеток указывает на то, что эффект кластеризации обусловлен не меньшим количеством митохондрий в трансфицированной тау клетке. Бар, 10 мкм.

Количественное определение фенотипических эффектов сверхэкспрессии тау в клетках N2a-нейробластомы

Не менее 150 клеток анализировали по четырем (нейритная длина и митохондрия) или три (независимые от ER) эксперименты. В дифференцированных, модифицированных клетками клетках 15% клеток развивали нейриты более 30 мкм, тогда как в устойчивых к тау клеткам это значение снижалось лишь до 5,4%. Эффект тау-сверхэкспрессии становится еще более впечатляющим при анализе митохондрий, присутствующих в нейритных структурах: только 17% тау-устойчивых клеток перевозили более шести митохондрий в их нейриты по сравнению с 94% контрольных клеток. Среднее число митохондрий в контрольных клетках составляло ~ 10-20 на один нерит (данные не показаны). ER считался сгруппированным, когда он не окружал ядро ​​клеток. В тау-стабильных клетках до 82% проявляли этот фенотип. Напротив, в mock-transfected клетках только 23% клеток имели сходный вид.

Расширение эндоплазматического ретикулума в дифференцированных клетках нейробластомы значительно снижается за счет сверхэкспрессии тау. Тау-стабильные клетки N2a (a-c) или m00-трансфицированные клетки (d-f) индуцировали для дифференциации, а затем фиксировали в параформальдегиде и трехкратно мечеными антителами против ER (a и d), тубулина (b и e ), tau (c и f). В отличие от контрольных клеток ~82% тау-стабильных клеток нейробластомы показывают ER, сгруппированные на одной стороне ядра (a), тогда как в mock-transfected клетках ER окружает все ядро ​​(d, сравните таблицу I). Более того, можно ясно видеть расширение ER в нейритах в контрольных клетках (d). В tau-стабильных клетках в нейритных процессах наблюдается лишь слабый сигнал ER-иммунореактивности. Общая интенсивность окраски ER одинакова в обеих клетках. Стрелки в а и d указывают положение нейритов относительно тела клетки. Бар, 10 мкм.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *