Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Комплемент-зависимые провоспалительные свойства β-пептида болезни Альцгеймера

Complement-dependent Proinflammatory Properties of the Alzheimer's Disease β-Peptide
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2212467/

Переписка с Нилом Р. Купером, отдел иммунологии, ИММ-19, 10550 North Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037. Телефон: 619-784-8152; Факс: 619-784-8472; E-mail: nrcooper@scripps.edu

Большое количество невритных бляшек (NP), в основном состоящих из фибриллярной нерастворимой формы β-амилоидного пептида (Aβ), обнаружено в гиппокампе и неокортеке пациентов с болезнью Альцгеймера (AD) в сочетании с поврежденными нейронными процессами, увеличением числа активированные астроциты и микроглии и несколько белков, включая компоненты системы воспалительных комплемента. Эти исследования касаются гипотезы о том, что активированная система комплемента опосредует клеточные изменения, которые окружают фибриллярные отложения Aβ в NP. Мы сообщаем, что Aβ пептиды непосредственно и независимо активируют альтернативный путь комплемента, а также классический путь комплемента; инициируют образование ковалентных сложноэфирных комплексов Aβ с продуктами активации третьего компонента комплемента (C3); генерируют фрагмент, активирующий комплементацию C5a, подобный цитокину; и опосредуют образование провоспалительного комплекса мембранной атаки С5b-9, в функционально активной форме, способной вставлять и пермеабилизировать мембрану клеток-предшественников нейронов. Эти результаты обеспечивают механизмы, основанные на воспалении, для учета наличия компонентов комплемента в НП в сочетании с поврежденными нейронами и увеличением числа активированных глиальных клеток, и они могут иметь потенциальные последствия для терапии АД.

Мы и другие (1-3) отметили, что патологические изменения, характеризующие болезнь Альцгеймера (AD) 1, могут быть результатом активации комплемента в нейритных бляшках (NP), поскольку эта эффекторная система обладает способностью активировать различные типы клеток с высвобождением цитокины и вторичные медиаторы; индуцировать направленную миграцию этих клеток к активатору комплемента; изменять сотовые функции; и повредить клетки (4, 5). Потенциальное участие комплемента в мозге не зависит от нарушения гематоэнцефалического барьера, поскольку нейроны, астроциты, микроглия и олигодендроциты синтезируют большинство и, вероятно, все из белков системы комплемента (6).

Поскольку активация является необходимым условием для проявления всех биологических активностей системы комплемента, β-амилоидный пептид (Aβ) или другой компонент NP должен обладать способностью активировать комплемент, чтобы дополнение могло участвовать в опосредовании патологической клеточной характеристики AD. В этом отношении мы и другие ранее показали, что фибриллярные формы Aβ связывают первый реагирующий фактор классического пути комплемента (CCP), C1q (3, 7) и истощают активность четвертого компонента комплемента (C4), а также (CH50), при инкубации с человеческой сывороткой в ​​качестве источника комплемента in vitro (3, 7). Остатки 14-26 коллагеноподобной части полипептидной цепи A1 молекулы C1q были вовлечены в связывание фибриллярного Aβ (7). Недавние исследования подтвердили это наводящее доказательство активирования CCP агрегированным Aβ (8-12), а также подчеркнули критическую роль β-плиссированной структуры Aβ в опосредовании этих эффектов (9, 11). В исследованиях ингибирования участвуют Aβ-остатки 1-11 в связывании C1q (11, 12). Анализы истощения, ингибирования и расщепления комплемента, используемые в этих различных исследованиях, дали наводящие доказательства активации CCP фибриллярным Aβ; однако, как косвенные анализы, они подвержены другим интерпретациям. В этом контексте мы недавно представили предварительные данные, свидетельствующие о том, что Aβ образует комплексы с C3 после инкубации фибриллярного Aβ с источником комплемента (9).

В ходе этих исследований мы обнаружили, что добавление фибриллярного Aβ к источнику комплемента привело к образованию ковалентных сложноэфирных комплексов Aβ с фрагментами активации C3, что дает однозначные доказательства активации комплемента Aβ, поскольку ковалентное присоединение C3 активационные фрагменты для дополнения активаторов представляют собой фундаментальный принцип действия дополнения. Мы также обнаружили, что фибриллярный Aβ обладает способностью активировать альтернативный путь комплемента (ACP) в сыворотке, а также в смесях шести очищенных белков альтернативного пути в физиологических концентрациях, обеспечивая первое указание на то, что Aβ независимо активирует оба пути комплемента , Кроме того, мы заметили, что такая активация является высокоспецифичной для Aβ и полностью не зависит от окислительных процессов. Эти исследования описаны здесь. Наконец, мы также сообщаем в первый раз, что активация Аβ-опосредованного комплемента является биологически значимой, поскольку она приводит к генерации фрагмента, активирующего комплементацию цитокиноподобного C5a, и опосредует образование провоспалительного комплекса мембранной атаки C5b-9 (MAC) , в функционально активной форме, способной вставлять и пермеабилизировать мембраны клеток-предшественников нейронов.

Aβ 1-40 и 1-42 (Bachem California, Torrance, CA; Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA; Anaspec, Inc., San Jose, CA; California Peptide Research, Inc., Napa, CA) растворяли либо в 100% ДМСО при 10 мг / мл, либо в дистиллированной (dd) H2O, дважды разбавленной в ddH2O до 2 мг / мл, а затем доводили до 1 мг / мл в 0,1 М Трис-буфера, рН 7,4. Aβ немедленно использовали (неагрегатировали) или позволяли агрегировать путем инкубации при комнатной температуре в течение 48 ч (от А 1-42) до 72 ч (А 1-40); дальнейшая инкубация в течение 2 недель не уменьшала потенциал активации комплемента. Преагрегированные препараты Ab инкубировали с равным объемом 1: 5 нормальной сыворотки человека (NHS), сыворотки с обедненными дозами (Advanced Research Technologies, Inc.) или шестью очищенными белками ACP (Advanced Research Technologies, Inc.) в физиологические соотношения (13). Разбавления проводились в буферном растворе с буфером, рН 7,4, содержащем кальций и магний. Исследования ингибирования проводили с использованием предварительно сгруппированного Aβ 1-42 в присутствии дефероксамина, глутатиона, диметилтиомочевины, каталазы или супероксиддисмутазы (SOD), которые были приобретены у Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури). Через 1 ч при 37 ° С добавляли ЭДТА для прекращения дополнительной активации комплемента и образцы разбавляли (1: 20-1: 300) и добавляли в реплике к лункам для микротитрации, предварительно покрытым в течение ночи (4 ° С) 1 мкг (100 мкл) mAb до Aβ (10D5), mAb к неоантигену C3b (клон 129) или mAb к неоантиту iC3b (Quidel, San Diego, CA) при рН 7,4 и затем блокировали (BLOTTO; Pierce Chemical Co. , Rockford, IL). Через 1 ч при комнатной температуре связывали комплексы Aβ-C3b / iC3b с кроликом Ab до C3 или с Aβ, конъюгированным с пероксидазой хрена антителом против кроликов (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) и ABTS (Kirkegaard & Perry Laboratories). Стандартные кривые C3 генерировали с разведениями очищенного iC3b (Advanced Research Technologies, Inc.), захваченного на лунках, предварительно покрытых анти-iC3b (Quidel). C5b-9 фиксировали на лунках, предварительно покрытых mAb, на неоантиген C5b-9, расположенный в поли-C9-части комплекса (Quidel) и детектировали поликлональным козлом Ab до C6 с последующим конъюгированным с пероксидазой хрена IgG против козлиного IgG (Accurate Chemical и Science Corp., Westbury, NY) и ABTS. Значения для анализа C5b-9 были рассчитаны обратно к значениям в неразбавленной NHS. В некоторых экспериментах нейропептид Y-свиньи, уротензин I или экзендин 3 (все из Калифорнийского пептидного исследования, Inc.); цепь B инсулина (Sigma Chemical Co.); белковый белок-предшественник амилоида (657-667 (Bachem California) и фрагмент 50-остатка аденовирусного пентонового основания (остатки 317-366, ссылка 14), а также преагрегированные препараты A 1-42 и мономерный Aβ 1-42 растворяли в DMSO или ddH2O и выдерживали при комнатной температуре, точно так же, как описано выше для Aβ. В некоторых исследованиях пептиды после растворения, как только что описано, но разбавленные в Hepes-буферном NaCl при рН 7,4, были ковалентно сшиты в концентрации 200 мкМ с первичный аминовый реактивный агент, бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3, Pierce Chemical Co.), при концентрации 5 мМ. Через 30 минут реакцию прекращали гашением. Все пептиды инкубировали с NHS в течение 1 часа при 37 ° После разбавления активацию комплемента оценивали с помощью обычного анализа CH50 (15) путем количественного определения остаточного функционального C3 с использованием C3-обедненной сыворотки в соответствии с инструкциями продукта (Advanced Research Technologies, Inc.) или путем оценки образования C5b-9.

После захвата комплексов на лунки, покрытые 10D5, реплицированные лунки обрабатывали 0,1 М Трис, рН 9,5 или 1 М гидроксиламина в 0,1 М Трис, рН 9,5, в течение 2 ч при 37 ° С. После промывки оставшуюся связанную С3 детектировали, как описано выше. Остаточный Аβ был обнаружен с кроликом Ab до Aβ, как описано выше. Образование ковалентных комплексов Aβ с продуктами активации C3 также оценивали с использованием процедуры Вестерн-блоттинга на гелях SDS-PAGE. Реплицированные образцы агрегированного Aβ 1-42 или Aβ 1-40 инкубировали с человеческой сывороткой в ​​течение 1 часа при 37 o C в присутствии или в отсутствие EDTA и затем реакционную смесь микроочищали, промывали в трис-буфере и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° С с 0,1 М Трис при рН 7,4, 0,1 М Трис при рН 9,5 или 1 М гидроксиламина в 0,1 М Трис при рН 9,5. Образцы снова подвергали микроочистке и промывали трис при рН 7,4, а затем тот же буфер, содержащий 0,1% SDS. Образцы затем подвергали SDS-PAGE в нередуцирующих условиях и подвергали электроблоке, а полосы детектировали с помощью кролика Ab до C3, а затем с помощью козьего кроличьего IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories) и системы SuperSignal (Pierce Chemical Co.). После десорбции Aβ детектировали с помощью мыши 6E10 Ab до Aβ (Senetek PLC, St. Louis, MO), а затем с козьим антимышиным IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories) и системой SuperSignal. В некоторых экспериментах электроблочные гели сначала подвергали взаимодействию с кроликом Ab до Aβ (полученным в этой лаборатории) или с 6E10 mAb до Aβ (Senetek PLC), а затем с козьим антикроличьим IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories) или с козьим антимышиным IgG ( Kirkegaard & Perry Laboratories), удаляли и реагировали с mAb anti-iC3b (Quidel) или кроликом Ab до C3 (сгенерировали в этой лаборатории), а затем с козьим антимышиным IgG или козьим антикроличьим IgG. Количественное определение проводилось с помощью PhosphorImager (Molecular Dynamics, Саннивейл, Калифорния).

После солюбилизации в 70% муравьиной кислоте образцы анализировали с помощью MALDI-спектроскопии (Perseptive Voyager ELITE, Perseptive Biosystems, Inc., Framingham, MA).

C5a (и C5a des-Arg) детектировали в разбавленных образцах комплексом радиоиммуноанализа Biotrak (Amersham Corp., Arlington Heights, IL); перед анализом образцы подвергали кислотным осаждениям (16). Значения были обратно рассчитаны на концентрации в неразбавленной NHS.

Клетки Ntera2 / D1 (NT2) (Stratagene Inc., La Jolla, CA) выращивали до субконфлюэнции, высвобождали с помощью неферментного раствора диссоциации клеток (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), промывали и ресуспендировали (2 × 107 клеток / мл). Клетки NT2 (100 мкл) инкубировали с 50 мкл NHS в присутствии или в отсутствие EDTA и 50 мкл преагрегированного Aβ. Через 15 мин при 37 ° С МАК детектировали с помощью кролика Ab (Advanced Research Technologies, Inc.) или mAb (Quidel) до неоантигенов C5b-9, а затем FITC-анти-кроликом или мышиным Ig и пропидием иодидом. Чтения проводились на FACScan® и анализировались с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Сэндвич-ELISA показали, что комплексы, содержащие Aβ и C3b / iC3b, были получены в NHS в качестве источника комплемента после инкубации с агрегированным Aβ 1-42. Комплексы были очевидны после захвата с помощью mAb активационно-зависимым неоантигенам в первом (C3b) или втором (iC3b) продукте расщепления C3 и обнаружении с кроликом Ab до Aβ (фиг.1, a и b), а также после захвата с mAb к Aβ и обнаружению с кроликом Ab до C3 (фиг.1c) или C3d (не показано). ЭДТА, который блокирует активацию комплемента путем хелатирования кальция и магния, предотвращает образование комплексов (фиг.1с). ELISA, в которых комплексы были захвачены с mAb на Aβ и были обнаружены с Ab до C3, были использованы для большинства исследований, поскольку такие ELISA разрешали количественное определение путем ссылки на включенные стандартные кривые, полученные с очищенным C3, захваченным на лунках, покрытых mAb-C3, и детектировали с помощью кролик Ab до C3 (фиг.1d). Активация комплемента обнаруживалась до ~ 1 мкМ Aβ 1-42 (фиг.1d). В качестве таких комплексов были созданы 10 различных преагрегированных Aβ 1-40 и 20 различных преагрегированных препаратов A 1-42 от 5 производителей. В этом отношении Аβ 1-42 обычно в 5-10 раз более активен, чем Аβ 1-40. Катион-зависимое образование комплексов Aβ-C3b / iC3b после инкубации агрегированного Aβ с NHS дает однозначные доказательства активации комплемента агрегированным Aβ.

Образование комплекса Aβ-C3b / iC3b было очевидным после инкубации агрегированного Aβ 1-42 с NHS, лишенным фактора B, существенного компонента ACP (фиг.1е); такие сыворотки содержат интактный ЦКА, но не позволяют активировать АКТ. Значительное снижение комплексообразования также проявилось в сыворотке, обедненной C1q, по сравнению с NHS (фиг.1е). Эти данные показывают, что ЦКА опосредует комплексное образование агрегированными Аβ, результаты, которые ожидались из результатов описанных ранее анализов истощения комплемента. Неожиданно, однако, АКТ также опосредовал образование комплексов, так как они также генерировались после добавления агрегированного Aβ 1-42 к NHS, не имеющего фактора C1q, и образование комплексов было снижено в сыворотке, истощенной фактором B, по сравнению с NHS (фиг. 1 e), результат реплицируется в четырех дополнительных экспериментах с различными препаратами Aβ 1-42. Способность Aβ 1-42 активировать ACP была подтверждена в трех исследованиях, в которых преагрегированный Aβ 1-42 инкубировали со смесью шести очищенных белков ACP (факторы B, D, H и I, галдин и C3) в физиологических соотношениях (ссылка 13, фиг.1f). Эти данные документируют способность агрегированного Aβ не только активировать CCP, но и независимо активировать ACP. Это первый признак того, что агрегированный Аβ активирует АКТ; было предположено, что активация комплемента Aβ была исключительно через CCP из-за отсутствия компонентов ACP (фактор B и надлежащий) в NP (1, 17, 18). Невозможность обнаружить компоненты ACP в NP может быть обусловлена ​​крайней лабильностью конверсии ACP C3.

Множество различных агрегированных препаратов Aβ 1-42 активировали, как определено классическим методом потребления комплемента CH50 (фиг.1 g). Процедура старения, используемая для агрегации Aβ, генерирует β-плиссированные фибриллы (9). Нефибриллярные «аморфные» агрегаты Aβ лишены способности к активации комплемента (9). В отличие от агрегированных препаратов, Aβ, используемый сразу же после растворения, имел ограниченную способность активировать комплемент (фиг.1 g). Эти данные документируют важную роль образования фибрилл для активации комплемента Aβ in vitro. Амилин, другой пептид, который спонтанно образует β-плиссированные фибриллы, также был испытан на способность к активации комплемента в этих исследованиях. 37-остаток амилинполипептида представляет собой основную составляющую амилоидных отложений при диабете 2 типа. На гелях SDS-PAGE в возрасте амилина мигрировали в основном в виде больших SDS-нерастворимых окрашенных полос. Однако этот фибриллярный пептид существенно не активировал комплемент в концентрации 100 мкМ (7% потребления CH50).

Специфичность активации комплемента Aβ также оценивалась путем определения того, активировали ли комплемент другими небольшими пептидами (20-50 аминокислот), содержащими множественные остатки, способные опосредовать ковалентную связь с глутаматным остатком гидролизованного тиоэфира C3 (серин, тирозин, треонин, лизин) и выражают аналогичный общий заряд Aβ. Все пептиды обрабатывали и выдерживали таким же образом, как и Aβ. Ни один из пептидов, включая цепь B (30 остатков) инсулина, нейропептид Y-свиньи (36 остатков), urotensin I (41 остаток), эксендин 3 (39 остатков), пептид предшественника амилоида 657-676 (20 остатков) и фрагмент основанного на аденовирусном пентоне (50 остатков) значительно активированного комплемента в концентрации 20 мкМ, как оценивается классической методикой CH50 (фиг.1 г). Пептиды также практически не проявляли способности активировать комплемент в других анализах, включая способность истощать остаточный функциональный C3 и образовывать комплекс SC5b-9 (не показан). Чтобы определить, будет ли пептидная агрегация увеличивать способность к активации комплемента, уротензин I, нейропептид Y-свиньи и эксендин 3 ковалентно сшивают с реагентом BS3 с первичным амином, прежде чем оценивать их способность активировать комплемент методом CH50. Сшитый urotensin I и нейропептид Y-свиньи дали лестницу окрашенных кумасси-полос на анализах SDS-PAGE, но эксендин 3 не окрашивал полосы, возможно, из-за образования очень больших агрегатов. Эти три сшитых пептида существенно не активировали комплемент (<10% истощения CH50) в концентрации 20 мкМ. В другом исследовании сшитый urotensin I показал 7% потребления CH50 в концентрации 100 мкМ, тогда как агрегированный Aβ 1-42 показал 45% потребления. Эти данные кумулятивно демонстрируют выраженную специфичность активации комплемента фибриллярным Аβ.

С3 предпочтительно связывается с активаторами через сложноэфирные связи, хотя амидная связь описана (19, 20); такие связи образуют между реакционноспособной γ-карбонильной группой глутаматного остатка активированной расщепленной внутренней тиоэфирной связи в C3 и гидроксильной (сложноэфирной) или амино (амидной) группы активатора (19). Для оценки возможной сложноэфирной связи комплексы захватывали с помощью mAb до Aβ и инкубировали с трис-буфером, содержащим 1 М гидроксиламин, при рН 9,5 в течение 2 ч при 37 ° С, обработку, которая разрушала сложноэфирные, но не амидные связи (19, 20). Приблизительно 50% связанного C3, но ни один из Aβ, не удаляли из захваченных комплексов этой обработкой (фиг.2, a и b), результат повторялся в двух дополнительных исследованиях с Aβ 1-40 и 1-42.

Образование ковалентных комплексов Aβ с продуктами активации C3 также было независимо продемонстрировано с использованием метода Вестерн-блоттинга. В этих исследованиях агрегированный Аβ 1-40 инкубировали с сывороткой, и комплексы нерастворимых фибриллярных Aβ с C3-активационными фрагментами затем осаждали, промывали и инкубировали с 1 М гидроксиламином при рН 9,5 или контрольных буферах. После промывки была обнаружена заметная полоса с молекулярной массой ~ 180 кДа, молекулярная масса С3, а также несколько полос более высокой молекулярной массы с Ab до C3 (фиг.2с). Было обнаружено, что после отгонки те же полосы взаимодействуют с Ab с Aβ, хотя гели были темнее из-за присутствия больших количеств агрегированного Aβ (фиг.2с). Полоски тех же молекулярных масс, реакционноспособных с Abs, как к Aβ, так и к C3, наблюдались также при проведении исследований блоттинга в обратном направлении, т. Е. С блоттингом сначала с mAb или поликлональным Ab до Aβ с последующим удалением путем блоттинга с кроликом Ab или mAb к C3 (не показан). Полоса 180 кД и более широкие полосы, которые содержат как C3, так и Aβ, несомненно представляют собой комплексы мономеров Aβ с мономерами C 3b и олигомерами, поскольку они не были очевидны в реакциях, проводимых в присутствии EDTA или в отсутствие фибриллярных Aβ (фиг.2с).

С3 также был обнаружен в больших агрегатах Аβ на вершине гелей (за исключением полосы ЭДТА) при более длительной экспозиции (не показан). Меньшая реакционная способность C3 в больших агрегатах Aβ в верхней части гелей по сравнению с мономерами C3 и олигомерами в гелях указывает на то, что не все мономеры Aβ несут молекулу C3b; это не удивительно, так как Аβ находится в больших агрегатах и, кроме того, в молярном избытке над С3. Также может быть, что молекулы Aβ, несущие ковалентно связанные C3b, диссоциируют из агрегатов по аналогии с диссоциацией иммунных комплексов путем ковалентного связывания C3b (21, 22).

Обработка гидроксиламином нарушала примерно половину комплексов (рис. 2, с). Количественное сканирование вестерн-блоттинга C3 показало, что обработка 1 М гидроксиламином при рН 9,5 удаляла 42% связанного С3 по сравнению с контролем рН 9,5; буферная обработка pH 9,5 удаляла только тривиальные количества (5,1%) связанного С3 по сравнению с обработкой рН 7,4. Захват вестерн-блоттинга не может быть удовлетворительно сканирован из-за большого фона, но визуальный осмотр показывает тот же шаблон (рис.2, с). Идентичные результаты были получены с Aβ 1-42 (не показано). Эти две независимые аналитические системы показывают, что сложноэфирные связи частично опосредуют ковалентное присоединение фрагментов активации C3 к Aβ. Аβ 1-42 содержит два серина в положениях 8 и 26 и тирозин в положении 10, который может опосредовать сложноэфирные связи с C3-активационными фрагментами.

Что касается связи (-ов), ответственной за комплексы Aβ-C3b / iC3b, не связанные с неэстером, как сообщалось, только Aβ генерирует свободные радикалы (23) при инкубации в водном растворе, а окислительные процессы связаны с денатурацией Aβ, фрагментацией , и окисление (24, 25). Из-за потенциальной значимости этих процессов для образования комплексов Aβ с C3-активационными фрагментами Aβ 1-42 оценивали с помощью масс-спектроскопии MALDI после старения от 0 до 10 дней. Агрегаты не обнаруживаются в этих анализах, так как образцы растворяют в 70% муравьиной кислоте для масс-спектроскопического анализа. Молекулярная масса основного пика в различных образцах составляла от 4510 до 4514, а других пиков не было, исключая значительное окисление, фрагментацию и ковалентное сшивание Aβ. Для определения того, способствовали ли окислительные процессы образование комплексов Aβ с фрагментами активации C3, активацию комплемента проводили в присутствии дефероксамина, глутатиона, диметилтиомочевины, каталазы, SOD и каталазы плюс SOD. Поскольку ни один из этих антиоксидантов или поглотителей свободных радикалов не ингибировал образование или мешал обнаружению комплексов (рис. 2d), маловероятно, что в образовании комплексов Aβ с активацией C3 участвует малорадикальные или окислительные процессы фрагменты. По всей вероятности, амидные связи отвечают за оставшиеся комплексы Aβ-C3b / iC3b. Aβ 1-42 содержит два лизиновых остатка в положениях 16 и 28, которые могут опосредовать такие связи.

Дополнительные исследования показали, что Aβ инициирует активацию терминальной, провоспалительной части последовательности комплемента-реакции в NHS. C5a, цитокиноподобный продукт расщепления активации C5 с многочисленными биологическими свойствами, эффективно генерируется агрегированным Aβ 1-42 в NHS, как определено специфическим радиоиммуноанализом, который обнаруживает C5a и C5a des-Arg (без содержания COOH-концевого аргининового остатка ) (ссылка 26, фиг.3а). Сэндвич-ELISA, в котором mAb к неоантигену C5b-9, находящемуся в поли C9, служил захватом Ab, а поликлональный Ab-C6 служил детектированием Ab, показал, что активация Aβ-опосредованного комплемента приводит к образованию комплекса C5b-9 (Фиг.3b). Этот ELISA обнаруживает C5b-9, а также комплексы SC5b-9; последние образуются в NHS в отсутствие клеток, как следствие связывания белка S, белка контроля комплемента, с комплексом. Aβ 1-42, как правило, более эффективен при образовании C5b-9, чем Aβ 1-40 (фиг.3b). Напротив, другая группа недавно сообщила, что активация Аβ-опосредованного комплемента не приводит к образованию комплекса С5b-9 (10). Причина (причины) их неспособности продемонстрировать образование C5b-9 неизвестна. Одна из возможностей — известная изменчивость свойств различных препаратов Aβ. В связи с этим мы наблюдали большую изменчивость в способности различных препаратов Aβ 1-40 и Aβ 1-42 инициировать образование комплекса С5b-9, чем в их способности генерировать комплексы Aβ-C3b и Aβ-iC3b. Другие объяснения могут заключаться в незначительных различиях в экспериментальных условиях. Например, их эксперименты по формированию C5b-9 проводили в NHS, разведенном 1:10 в фосфатно-буферном NaCl; эта комбинация обеспечивает субоптимальные концентрации кальция и магния, которые необходимы для активации CCP и ACP. В связи с этим мы получили 10-кратное более высокое образование SC5b-9, чем полученные с 1 мкМ агрегированного IgG в их контрольных исследованиях (не показаны).

С5b-9-комплекс, продуцируемый активацией комплемента Aβ 1-42-комплемента, способен вставлять в мембраны клеток NT2, целую линию клеток-предшественников нейронов, когда такие клетки были включены в реакционные смеси с агрегированными Aβ и NHS (фиг.4) а). Показаны проточные цитометрические анализы с кроликом Ab для активирующих специфических неоантигенов в MAC C5b-9. C5b-9 мембранная вставка, вероятно, была пропорциональна степени активации комплемента, поскольку она зависела от концентрации Aβ 1-42. mAb к C5b-9 неоантигенам дал тот же результат (не показан). Идентичные концентрации Aβ 1-40 опосредуют более низкие уровни мембранной вставки C5b-9 (не показаны), вероятно, из-за значительно более низких уровней образования C5b-9 с Aβ 1-40. Клетки NT2 и другие линии нейронных клеток устойчивы к комплементарно-зависимому цитолизу, вероятно, из-за присутствия CD59 (27), регуляторного белка комплемента, подтвержденный здесь. Тем не менее, введение C5b-9 в мембраны клеток NT2 опосредовало увеличение проницаемости клеток к иодиду пропидия, которое зависело от концентрации Aβ 1-42 (фиг.4b). Эти данные указывают на то, что C5b-9, продуцируемый активацией Aβ-опосредованного комплемента, является функционально компетентным, поскольку он встраивается в мембраны нейронных клеток-предшественников и делает их проницаемыми для малых молекул.

Таким образом, Aβ непосредственно и независимо активирует ACP, а также CCP, что приводит к образованию ковалентных комплексов Aβ-C3b и Aβ-iC3b; генерирует C5a; и опосредует сборку функционально активных комплексов С5b-9 in vitro. Эти результаты имеют потенциальные последствия для понимания механизмов, которые приводят к продолжающемуся повреждению нейронов и измененным глиальным функциям в окрестности НП, и, следовательно, к прогрессированию AD. Во-первых, они дают объяснение ассоциации связанного C3 с Aβ в NP (1-3), поскольку ковалентно связанные молекулы C3b в NP остаются связанными и обеспечивают очаг для активации хронического комплемента. Во-вторых, C5a, генерируемый Аβ-опосредованной активацией комплемента, может быть причиной увеличения числа активированных астроцитов и микроглии вокруг НП по сравнению с диффузными бляшками Aβ (28), поскольку эти клетки обладают C5a-рецепторами и активируются и мигрируют в ответ на C5a (6 , 29-31). C5a также может инициировать высвобождение провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8 и TNF-α) из глиальных клеток, как и у других типов клеток (26, 32); Провоспалительные цитокины увеличиваются в головном мозге AD (2, 28, 33). Эти цитокины могли бы дополнительно активировать глиальные клетки и изменять нейронные и глиальные функции (28, 32). В-третьих, входящие активированные глиальные клетки могут связываться и оставаться присоединенными через их рецепторы комплемента к фрагментам активации C3, присоединенным к Aβ (6). В-четвертых, введение C5b-9 в клеточные мембраны дает объяснение ассоциации этого комплекса с дистрофическими нейритами в NP (2, 3). Несмотря на то, что они не могут быть непосредственно цитотоксичными для нейронов, поскольку они несут CD59 (6, 34), C5b-9, а также комплексы C5b-7 и C5b-8 могут изменять функциональные свойства нейронов во времени посредством хронического низкоуровневого запуска различных сотовых сигнальные пути (35). Если этот сценарий, основанный на воспалении, проверен, ингибиторы комплемента должны оцениваться для использования в AD. Такие ингибиторы должны были пройти через гематоэнцефалический барьер, нацеливаться на пути активации комплемента и предотвращать активацию С5b-9.

ELISA демонстрирует опосредованное комплементом образование комплексов Aβ с фрагментами активации C3 (a-d). Комплексы были захвачены, обнаружены и количественно определены, как описано в «Материалах и методах». NHS или очищенные белки ACP не содержат Aβ. (a) Преагрегированный Aβ 1-42 (100 мкМ и 50 мкМ) инкубировали в NHS, захватывали с mAb до C3b и детектировали с помощью кролика Ab до Aβ. (b) Два преагрегированных препарата Aβ 1-42 (Aβ1 и Aβ2 при 20 мкМ) инкубировали в NHS, захватывали с mAb до iC3b и детектировали с помощью кролика Ab до Aβ. (c) Преагрегированный Aβ 1-42 (58 мкМ) инкубировали в NHS или в NHS, содержащем 10 мМ EDTA, захватывали с mAb до Aβ и детектировали с помощью кролика Ab до C3. (d) Преагрегированный Aβ 1-42 инкубировали в NHS в указанных конечных концентрациях, захватывали с mAb до Aβ и детектировали с помощью кролика Ab до C3. (e) Преагрегированный Aβ 1-42 (58 мкМ) инкубировали в NHS, обедненном факторами NHS (B-dpl) или обедненном C1q NHS (C1q-dpl), захватываемом с mAb до Aβ и обнаруживаемом с помощью кролика Ab до С3. (f) Преагрегированный Aβ 1-42 (58 мкМ) инкубировали с шестью очищенными белками ACP (PAP) или NHS, захватывали с mAb до Aβ и обнаруживали с кроликом Ab до C3. Исходные уровни, полученные в контроле ЭДТА, содержащие Aβ и очищенные белки ACP или NHS, в различных экспериментах, описанных выше, были вычтены. G) Специфичность активации комплемента. Преагрегированные препараты Aβ (20 мкМ) и те же концентрации мономерной Aβ (моно), цепи B инсулина (Ins.B), нейропептида Y-свиньи (NPY), уротензина I (Uro.), Эксендина 3 (Exen), предшественника амилоида пептид 657-676 (APP-pep.) и пептид 50-остаток с аденовирусным пентоном (PB50) инкубировали с NHS. Активацию комплемента оценивали методом CH50. Коэффициенты корреляции для определений CH50 варьировались от 0,995 до 1,000.

Оценка связей, связывающих связывание фрагментов активации Aβ с C3. (a) Преагрегированный Aβ 1-42 (25 мкМ) инкубировали в NHS и комплексы захватывали на лунках с покрытием 10D5; NHS только не содержит Aβ. Реплицированные образцы обрабатывали буфером с рН 9,5 или с тем же буфером, содержащим 1 М гидроксиламин (NH2OH), и оставшуюся связанную С3 затем определяли и количественно определяли, как описано в материалах и методах. Контроль, содержащий Aβ, NHS и EDTA, был вычтен. (б) Реплицировать лунки, подвергнутые обработке буфером pH 9,5 или гидроксиламином, оценивали на остаточную связанную Аβ, как описано в материалах и методах. (c) Преагрегированный Aβ 1-40 инкубировали в NHS в присутствии или в отсутствие EDTA; дорожка 5 содержит NHS, но не Aβ. После центрифугирования и промывки фибриллярные гранулы Aβ инкубировали с буфером pH 7 (полосы 1 и 2), буфером с рН 9,5 (дорожка 3) или 1 М гидроксиламином в буфере с pH 9,5 (дорожка 4). После дальнейшей промывки образцы подвергали SDS-PAGE в нередуцирующих условиях с последующим блоттингом в присутствии C3 и после отгонки для Aβ. Стрелка, полоса C3 при ~ 180 кДа. (d) Преагрегированный Aβ 1-42 (50 мкМ) инкубировали только в NHS и в присутствии дефероксамина (Defer, 1 мМ), глутатиона (Glut, 1 мМ), диметилтиомочевины (DMTU, 30 мМ), каталазы (CAT, 2 × 104 U / мл), SOD (10 мкМ) или каталаза плюс SOD, а комплексы Aβ с фрагментами активации C3 были обнаружены, как описано в материалах и методах.

Аβ-опосредованная активация комплемента генерирует C5a и MAC. (a) Преагрегированный Aβ 1-42 инкубировали в NHS, и затем количество C5a определяли количественно, как описано в материалах и методах. (b) C5b-9 количественно определяли после инкубации NHS с различными концентрациями преагрегированных A 1-42 или 1-40. Образование SC5b-9 определяли количественно, как описано в материалах и методах.

C5b-9, продуцируемый активацией комплемента Aβ 1-42, функционально активен. (а) клетки NT2 инкубировали с предварительно сгруппированным Aβ 1-42 в указанных концентрациях в NHS или в NHS, содержащей 10 мМ ЭДТА; сыворотке только не хватает Aβ. Показаны проточные цитометрические анализы с неоантигенами кролика Ab до C5b-9. Числа (справа), Процент C5b-9 + клеток, определяемые их отношением к маркеру (стрелка, пунктирная линия). (b) Показаны плотностные анализы реакционной активности пропидиума и C5b-9 (FITC C5b-9). Для ясности изображены только живые клетки.

Мы благодарим Т. Гугли, Д. Исенмана, Дж. Роджерса и С. Вебстера за полезные обсуждения, Г. Немроув за PB50 и Athena Neurosciences, Inc. (Южный Сан-Франциско, Калифорния), за 10D5. Мы также благодарим Тодда С. Биксби за его экспертную техническую помощь.

Эта работа была поддержана грантом NS-34682 Национального института здоровья и предоставила SFP-1141 от Novartis.

альтернативный путь комплемента

Болезнь Альцгеймера

β-амилоидный пептид

классический путь комплемента

двойной дистиллированный

комплекс мембранной атаки

нейритные бляшки

нормальная сыворотка человека

супероксиддисмутаза

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *