Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Обнаружение нового внутрипанельного пула нерастворимого амилоидного β-белка, который накапливается со временем в культуре

Detection of a Novel Intraneuronal Pool of Insoluble Amyloid β Protein that Accumulates with Time in Culture
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2132781/

Амилоид-β-пептид (Aβ) получают на нескольких участках внутри культивируемых нейронов NT2N человека с Aβ1-42, специфически вырабатываемых в эндоплазматическом ретикулуме / промежуточном отделении. Поскольку Аβ обнаружен как нерастворимые отложения в старческих бляшках головного мозга AD, и пептид Aβ может полимеризоваться в нерастворимые фибриллы in vitro, мы исследовали возможность того, что Aβ1-40, и особенно более высоко амилоидогенный Aβ1-42, накапливаются в нерастворимом пул в нейронах NT2N. Примечательно, что мы обнаружили, что экстракция муравьиной кислотой клеток NT2N солюбилизировала пул ранее необнаруживаемого Aβ, на долю которого приходилось более половины всего внутриклеточного Aβ. Aβ1-42 был более распространен, чем Aβ1-40 в этом пуле, и большая часть нерастворимого Aβ1-42 была получена в пути эндоплазматического ретикулума / промежуточного отсека. Высокие уровни нерастворимого Aβ также были обнаружены в нескольких ненейрональных клеточных линиях, сконструированных для сверхэкспрессии белка-предшественника амилоида-β. Этот нерастворимый внутриклеточный пул Aβ был исключительно стабильным и накапливался в NT2N-нейронах зависящим от времени образом, увеличиваясь в 12 раз за 7-недельный период в культуре. Эти новые данные свидетельствуют о том, что амилоидогенез Аβ может быть инициирован внутри живых нейронов, а не во внеклеточном пространстве. Таким образом, представленные здесь данные требуют пересмотра преобладающего представления о патогенезе отложения Aβ в головном мозге AD.

Болезнь Альцгеймера (AD) 1 характеризуется накоплением фибриллярных амилоидных β-пептидов (Aβ) в старческих бляшках. То, что накопление Aβ является существенным для патогенеза AD, подтверждается генетическими исследованиями, показывающими, что мутации в белке-предшественнике амилоида-β (APP) (который приводит к Аβ через протеолитическую обработку) связаны с подмножеством семейного AD (FAD ) случаев с аутосомной пенетрантностью и изменения продукции Aβ (см. Selkoe, 1997). Например, двойная мутация, обнаруженная в шведском родстве FAD, приводит к перепроизводству Aβ, тогда как другие мутации изменяют относительные уровни двух основных форм Aβ, что приводит к увеличению отношения Aβ1-42 / 1-40 (Citron et al. , 1992; Scheuner et al., 1996). Предыдущие исследования показали, что Aβ1-42 является более нерастворимым, чем более распространенный Aβ1-40, и что он является наиболее распространенным видом Aβ, обнаруженным в старческих бляшках (Iwatsubo et al., 1994). Другие мутации FAD, которые учитывают большинство ранних ранних случаев FAD, были связаны с генами Presenilin 1 (PS1) и Presenilin 2 (PS2) (Levy-Lahad et al., 1995; Sherrington et al., 1995). Мутации в этих генах, как и некоторые из генов APP, также увеличивают соотношение Aβ1-42 / 1-40 (Borchelt et al., 1996; Duff et al., 1996; Scheuner et al., 1996).

Поскольку генетические исследования установили роль Aβ в патогенезе AD, важно понять, как Aβ производится из APP. Например, было показано, что APP расщепляется β-секретазой (ами) для образования NH2-конца Aβ и γ-секретазой (-ами) для получения COOH-конца Aβ (Haass et al., 1992; Shoji et al., 1992). Эти расщепления могут встречаться во множестве субклеточных мест, включая эндоплазматический ретикулум / промежуточный отдел (ER / IC, Chyung et al., 1997; Cook et al., 1997; Hartmann et al., 1997; Xu et al., 1997 ), сеть транс-Гольджи (TGN; Xu et al., 1997) и эндосомальная / лизосомальная система (Koo and Squazzo, 1994). В то время как Aβ, продуцируемый этими путями, может быть секретирован (как показано для TGN-генерируемого Aβ) или может оставаться внутриклеточным (как показано для Aβ, генерируемым путём ER / IC), относительные роли внутриклеточного и секретируемого Aβ в патогенез AD еще предстоит определить.

Хотя в многочисленных исследованиях было зафиксировано, что ненейрональные клетки, сконструированные для экспрессии APP, выделяют как Aβ1-40, так и Aβ1-42, внутриклеточный Aβ обычно не наблюдается в этих клетках (Forman et al., 1997; Xu et al., 1997). Однако внутриклеточный Аβ может быть легко обнаружен в человеческих NT2N-нейронах после метаболической маркировки, и его производство предшествует секретируемому Aβ (Wertkin et al., 1993; Turner et al., 1996). Анализ внутриклеточного Аβ с помощью ELISA показывает, что внутриклеточные и секретируемые Aβ состоят из разных соотношений Aβ1-42 / 1-40, причем Aβ1-40 более распространен в секретируемом материале (Turner et al., 1996). В дополнение к тому, что они продуцируются механизмами с разными временными часами и состоят из разных пропорций Aβ1-40 и Aβ1-42, внутриклеточные и секретируемые Aβ могут быть получены различными путями в нейронах NT2N. Недавние исследования показали, что Aβ1-42, но не Aβ1-40, продуцируется по пути ER / IC и что этот путь не способствует секретируемому пулу Aβ (Cook et al., 1997). Наконец, секреция Aβ NT2N-нейронами со временем возрастает в культуре (Turner et al., 1996). Возрастающее секретирование секреции Aβ нейронами in vivo может играть роль в отложении Aβ в старческие бляшки во внеклеточном пространстве головного мозга при нормальном старении и в AD, а также в коре и гиппокампе трансгенных мышей, которые сверхэкспрессирующие мутантные формы APP (Games et al., 1995; Hsiao et al., 1996).

В дополнение к образованию нерастворимых внеклеточных бляшек, Aβ также может накапливаться внутриклеточно в агрегированном нерастворимом пуле. Например, экзогенный Aβ1-42, добавленный в культуральную среду, может быть взят клетками, после чего его можно солюбилизировать только экстракцией муравьиной кислоты (Knauer et al., 1992; Yang et al., 1995). Таким образом, эти данные повышают вероятность того, что эндогенно продуцируемые внутриклеточные Аβ могут агрегироваться и внутри нейронов. Поскольку муравьиная кислота необходима для солюбилизации Aβ из старческих бляшек, мы стремились обнаружить присутствие нерастворимого Aβ в нейронах NT2N и других клеточных линиях путем экстракции муравьиной кислотой и обнаружили, что значительная часть общего внутриклеточного Aβ, в частности Aβ1-42, был сохранен как нерастворимый пул в этих клетках. Кроме того, этот нерастворимый пул Aβ увеличился в 12 раз в постмитотических нейронах NT2N в течение 7 недель в культуре. Поскольку преобладающий взгляд на амилоидогенез в AD заключается в том, что образование бляшек инициируется во внеклеточном пространстве секретируемым Aβ, наши результаты оспаривают это предположение, подразумевая внутриклеточное отделение как сайт, где Aβ может накапливаться в нерастворимой форме.

Клетки NT2, полученные из клеточной линии эмбриональной карциномы человека (Ntera2 / cl.D1), выращивали и пассировали, как описано ранее (Pleasure et al., 1992; Pleasure and Lee, 1993). Клетки были дифференцированы двумя недельными обработками ретиноевой кислоты (10 мкМ) в течение 5 недель и были заменены (заменять 2 клетки) в присутствии митотических ингибиторов, чтобы получить почти чистые NT2N-нейроны (Pleasure et al., 1992). Чтобы получить 99% чистых нейронов (замените 3 клетки), повторить 2 клетки удаляют ферментативно и механически и их реплицируют в 10-см чашки (Pleasure et al., 1992). Культуры клеток Replate 2 или Replate 3 NT2N использовали для экспериментов, когда они составляли 3-4 wk old, если не указано иное. Клетки CHO Pro5 выращивали и пассировали три раза в неделю в Alpha-MEM (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), содержащем 10% FBS и пенициллин / стрептомицин. Почки почки детеныша хомяка (BHK-21) выращивали и пассировали три раза в неделю в Glascow MEM (Life Technologies, Inc.), дополненную 10% триптозофосфатом, 5% FBS и 0,02 М Hepes. Клетки CHO-695 получали от д-ра S.S.Sisodia и выращивали и пассировали, как описано выше для клеток CHO Pro5, с добавлением 0,2 мг / мл G418 к культуральной среде.

Полуалинизированный вирусный вирус Семлики (SFV), экспрессирующий APP695 дикого типа (SFV-APPwt) или APP-мутант, в котором третья и четвертая аминокислоты из карбоксильного конца APP были заменены на лизины (SFV-APPΔKK) (Chyung et al., 1997; Cook et al., 1997). Клетки CHO-Pro5, BHK-21, NT2 и NT2N инфицировали в бессывороточной среде при множественности инфекции ~ 10. Через 1 ч заменяли полную среду для роста и продолжали инфицирование в течение 12 часов.

Культивированные клетки NT2N были лишены метионином путем инкубации в DMEM (Life Technologies, Inc.) без метионина в течение 30 мин перед добавлением [S35] метионина (500 мкКи / мл в бесмировом DMEM + 5% диализованном FBS, DuPont-NEN, Boston, MA) в течение 12-часовой маркировки. Клетки дважды промывали в PBS и лизировали в 600 мкл буфера RIPA (0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS, 1% NP40, 5 мМ EDTA в TBS, pH 8,0) с коктейлем ингибиторов протеазы (по 1 мкг / мл каждого из пепстатина A, Leupeptin, TPCK, TLCK, STI и 0,5 мМ PMSF). После кратковременной обработки ультразвуком клеточные лизаты центрифугировали при 40000 g в течение 20 минут при 4 o C и супернатант подвергали иммунопреципитации 6E10 (моноклональное антитело, специфичное для Aβ1-17, Kim et al., 1988), как описано выше (Turner et al., 1996). Остальные гранулы ресуспендировали в 100 мкл 70% муравьиной кислоты и обрабатывали ультразвуком до полного очищения. Для прямого извлечения в муравьиную кислоту клетки очищали в 1 мл PBS, осаждали путем центрифугирования и лизировали в 100 мкл 70% муравьиной кислоты с ультразвуком. Муравьиную кислоту как из непосредственно экстрагированных, так и последовательно экстрагированных образцов удаляли вакуумным центрифугированием в течение 40 мин, и полученный сухой осадок ресуспендировали в 100 мкл 60% ацетонитрила. Буфер RIPA (1,9 мл) добавляли к каждому из образцов до того, как они подверглись иммунопреципитации 6E10. Иммунопреципитированный Аβ разрешали на градиенте трис-трицинового градиента с шагом 10/16,5%, фиксировали в 60% метаноле, сушили и помещали на пластины PhosphorImager (Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale, CA) в течение 72 часов.

Клетки CHO Pro5 инфицировали SFV-APPwt в течение 12 ч, дважды промывали в PBS и инкубировали на льду в течение 20 мин только в одном только PBS, 10 мкг / мл трипсина (Life Technologies, Inc.) в PBS или 10 мкг / мл трипсина плюс 0,1% Triton X-100 в адаптации ранее описанной методики (Turner et al., 1996; Chyung et al., 1997). Трипсин затем инактивировали добавлением 100 мкг / мл ингибитора трипсина сои. Обработанные клетки затем промывали ледяным PBS, очищали в PBS-буфере, центрифугировали при 2000 г в течение 2 мин, ресуспендировали в 100 мкл муравьиной кислоты, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали при 40000 g в течение 20 минут при 4 ° C. Супернатант нейтрализуют 1,9 мл 1 М трис-основания и разбавляют 1: 3 в H2O для количественного определения Aβ1-40 и Aβ1-42 с помощью сэндвич-ELISA.

Для последовательной экстракции в RIPA и муравьиной кислоте клетки дважды промывали в PBS и затем лизировали в 600 мкл буфера RIPA и центрифугировали в течение 20 мин при 40 000 g при 4 ° C. Супернатант подвергали непосредственно сэндвич-ELISA и осадок ресуспендировали в 100 мкл 70% муравьиной кислоты с ультразвуком до очистки. Затем образцы муравьиной кислоты нейтрализуют добавлением 1,9 мл 1 М трис-основания и разбавляют 1: 3 в H2O до количественного определения Aβ с помощью сэндвич-ELISA.

Для прямого извлечения в муравьиную кислоту клетки очищали в PBS после промывки дважды PBS. Клетки осаждали центрифугированием при 2000 г в течение 2 мин и затем лизировали в 100 мкл муравьиной кислоты. Нерастворимый материал осаждали путем центрифугирования при 40 000 g при 4 ° C в течение 20 минут и супернатант нейтрализуют добавлением 1,9 мл 1 M трис-основания и разбавляют 1: 3 в H2O до количественного определения Aβ с помощью сэндвич-ELISA.

Для экстракции в PBS клетки очищали в PBS после промывки дважды PBS. Клетки лизировали ультразвуком, а нерастворимый материал осаждали центрифугированием при 40 000 г при 4 ° С в течение 20 мин и Аβ в растворимой фракции количественно определяли с помощью сэндвич-ELISA.

Сэндвич-ELISA выполняли, как описано ранее, с использованием mAb, специфичных для разных видов Aβ (Suzuki et al., 1994; Turner et al., 1996). В качестве захватного антитела использовали BAN-50 (mAb, специфичный для первых 10 аминокислот Aβ), и конъюгированный с пероксидазой хрена BA-27 (mAb, специфичный для Aβ1-40) и конъюгированный с хрена пероксидазой BC-05 (a mAb, специфичные для Aβ1-42) использовали в качестве вторичных антител. Для калибровки чувствительности ELISA для определения Aβ после экстракции и нейтрализации муравьиной кислоты синтетические пептиды Aβ1-40 и Aβ1-42 (Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, PA), используемые для получения стандартных кривых, обрабатывали муравьиной кислотой и нейтрализуют таким же образом, как лизаты клеток. В этих условиях сэндвич-ELISA имел предел обнаружения <1 фемтомола синтетического Aβ на образец. Базы BAN50, BA-27 и BC-05 были приготовлены и охарактеризованы, как описано ранее (Suzuki et al., 1994).

Для экспериментов, связанных с обработкой циклогексимидом, клетки NT2N инкубировали в средах, содержащих 150 мкг / мл циклогексимида в течение различных временных точек до 24 часов. Клетки собирали и последовательно экстрагировали в RIPA и муравьиной кислоте, как описано выше. Затем образцы подвергали анализу сэндвич-ELISA.

Лизаты, экстрагированные RIPA-клетками (15 мкг, как определено с помощью анализа BCA), разрешали на 7,5% трис-глицин-акриламидном геле и переносили в нитроцеллюлозу для иммуноблоттинга с помощью Karen (антитела против козы анти-APP) при разведении 1: 1000 (Turner et al., 1996; Chyung et al., 1997). После применения кроличьего анти-козьего лиганда IgG применяли [125I] белок А, а радиоактивно меченный АРР определяли количественно с помощью анализа PhosphorImager.

Чтобы оценить вероятность того, что Aβ существует в нескольких внутриклеточных пулах с различными характеристиками растворимости, нейроны NT2N последовательно экстрагировали в водном буфере (PBS), моющем растворе (RIPA), а затем 70% муравьиной кислоте. Уровни Aβ1-40 и Aβ1-42, присутствующие в каждой фракции, определяли количественно сэндвич-ELISA. Предыдущие исследования показали, что неионогенные детергенты высвобождают внутриклеточный Aβ, но не Aβ, осажденный в старческих бляшках или фибриллярных Aβ, образованных in vitro (Selkoe et al., 1986; Burdick et al., 1992; Harigaya et al., 1995; Turner et al. , 1996). Однако более строгие методы солюбилизации с использованием 70% муравьиной кислоты высвобождают Aβ из этих нерастворимых агрегатов. Ультразвук клеток в PBS в отсутствие детергента не смог высвободить любой растворимый Aβ (данные не показаны). Напротив, значительные уровни Aβ1-40 и Aβ1-42 были солюбилизированы буфером RIPA. Тем не менее, буфер RIPA высвобождал только часть общего количества внутриклеточного Aβ, поскольку последующая экстракция нерастворимого в моющем веществе материала с 70% муравьиной кислотой показала гораздо больший пул обоих видов Aβ (фиг.1
А). Поскольку увеличение производства Aβ1-42 по сравнению с Aβ1-40 было связано с AD (Borchelt et al., 1996; Duff et al., 1996; Scheuner et al., 1996), мы изучили соотношение этих видов Aβ в детергент-растворимых и нерастворимых пулов в нейронах NT2N. Соотношение Aβ1-42 / 1-40 в растворимом пуле RIPA составляло 1,0 ± 0,1 (фиг.1
B), что согласуется с предыдущими исследованиями в различных экспериментальных системах (Cook et al., 1997; Forman et al., 1997). Однако Aβ1-42 был более обилен в нерастворимом в моющем организме пуле, с отношением Aβ1-42 / 1-40 2,7 ± 0,3 (фиг.1
Б). Это открытие согласуется с пониженной растворимостью Aβ1-42 относительно Aβ1-40 in vitro и преобладанием Aβ1-42 в нерастворимых отложениях в головном мозге AD (Jarrett et al., 1993a)
; Iwatsubo et al., 1994).

Идентификация большого и ранее необнаруженного пула нерастворимых Aβ в нейронах NT2N побудила нас установить точные условия для воспроизводимого восстановления максимального количества экстрагируемого муравьиной кислотой Aβ. Было установлено, что ультразвуковая обработка была необходима для эффективной экстракции Aβ, и было обнаружено, что объем 100 мкл муравьиной кислоты оптимально экстрагирует Aβ из клеточных лизатов, содержащих ~ 1 мг общего белка. Однако более длительное время инкубации в муравьиной кислоте (до 24 ч) или высоких температурах инкубации (до 37 ° С) не увеличивало Аβ-восстановление (данные не показаны). Чтобы подтвердить, что муравьиная кислота, экстрагированная Aβ, присутствовала во внутриклеточных компартментах и ​​не прикреплялась к клеткам или культуральной чашке, клетки обрабатывали трипсином в присутствии или в отсутствие 0,1% Triton X-100. Мы обнаружили, что муравьино-солюбилизированный внутриклеточный Аβ был устойчив к расщеплению трипсина в отсутствие детергента, но чувствителен к перевариванию трипсина после солюбилизации Triton X-100 (данные не показаны). Этот вывод показывает, что растворимый в муравьиной кислоте пул Aβ расположен внутри клетки и доступен для трипсина только тогда, когда мембраны клеток первыми пермеабилизируются моющим средством. Наконец, мы обнаружили, что клетки, экстрагированные непосредственно в муравьиную кислоту, дают количества Aβ, подобные сумме RIPA-растворимых и RIPA-нерастворимых Aβ (фиг.1
А). Из этих исследований мы пришли к выводу, что нейроны содержат по меньшей мере два основных пула внутриклеточного Aβ: детергентный растворимый пул и более растворимый пул из муравьиной кислоты, который обогащен Aβ1-42.

Чтобы определить, присутствует ли нерастворимый внутриклеточный А в типах клеток, отличных от нейронов, клетки NT2, CHO Pro5 и BHK-21 последовательно экстрагировали RIPA с последующей муравьиной кислотой, а уровни Aβ измеряли с помощью сэндвич-ELISA (фиг.2). Чтобы оценить последствия увеличения производства APP для получения растворимого и нерастворимого внутриклеточного Aβ, каждый тип клеток также был инфицирован рекомбинантным SFV-вектором, который привел к экспрессии высоких уровней APP695. Кроме того, были исследованы уровни Aβ в стабильно трансфецированных клетках СНО, экспрессирующих APP695 (CHO-695) (фиг.2
А). Уровни APP устойчивого состояния, присутствующие в каждом типе клеток, определяли путем Вестерн-блоттинга для корреляции уровней внутриклеточного Aβ с APP (фиг.2)
Б).

В отличие от NT2N нейронов, наименее ретиноевая кислота NT2-клеток не вызывала значительных количеств Aβ, несмотря на то, что они выражали почти эквивалентные уровни APP (фиг.2, A и B). Это наблюдение согласуется с предыдущими экспериментами, которые продемонстрировали, что клетки NT2 эффективно не обрабатывают APP по пути β-секретазы и, таким образом, генерируют только низкие уровни Aβ (Wertkin et al., 1993; Forman et al., 1997). Кроме того, сконструированная экспрессия APP695 в клетках NT2 на уровнях, сходных с уровнями, обнаруженными в нейронах NT2N, привела лишь к небольшому увеличению внутриклеточных уровней Aβ (фиг.2, A и B), что указывает на то, что отсутствие внутриклеточного Aβ в клетках NT2 относительно к NT2N-нейронам не было связано с дифференциальным выражением изоформ APP в двух типах клеток (APP751 / 770 в клетках NT2 против APP 695 в клетках NT2N), а в дифференциальной обработке APP. Кроме того, тот факт, что только с низким уровнем Aβ были обнаружены сэндвич-ELISA в этой клеточной линии, также подтверждает, что этот анализ является высокоспецифичным для Aβ и не оказывает существенного перекрестного взаимодействия с другими клеточными белками, включая полноразмерный APP, другие Aβ-содержащие карбокси-концевые фрагменты или фрагменты, не содержащие Aβ-APP.

Ячейки CHO Pro5 и BHK-21 экспрессировали едва различимые уровни APP, и они не вызывали обнаруживаемых уровней растворимого или нерастворимого Aβ, что еще более подтверждало специфичность Aβ-ELISA. Однако клетки CHO-695 продуцировали внутриклеточный Аβ, 22 ± 3% которого было нерастворимым (фиг.2
А). Аналогичным образом, инфицирование клеток CHO Pro5 и клеток BHK-21 SFV-APPwt приводило к значительному увеличению производства APP, а также внутриклеточного Aβ, из которых до 74 ± 5% было нерастворимым. Это резкое увеличение продукции Aβ за относительно короткий период времени может способствовать агрегации Aβ, что приводит к уменьшению растворимости Aβ. Действительно, клетки СНО, стабильно экспрессирующие APP, содержали гораздо более низкую долю нерастворимого Aβ, чем SFV-APP-инфицированные клетки СНО (фиг.2
А).

Эти данные показывают, что в дополнение к факторам, специфичным для клеточного типа, уровень экспрессии APP также определяет осаждение нерастворимого Aβ. В клетках, которые эффективно используют путь β-секретазы для генерации Aβ, повышенная экспрессия APP обычно приводила к увеличению уровней как растворимого, так и нерастворимого Aβ. Однако, в то время как клетки CHO-695 и NT2N-нейроны проявляли одинаковые уровни APP и продуцировали сходные уровни растворимых Aβ, нейроны NT2N накапливали значительно более высокие уровни нерастворимого Aβ (фиг.2, сравнивают треки, обозначенные как NT2N против CHO-695). Это различие может быть связано с более высокой скоростью метаболизма клеток CHO-695, что может привести к увеличению оборота Aβ, что препятствует агрегации. Альтернативно, агрегация Аβ в клетках CHO-695 может быть затруднена непрерывным разбавлением из-за деления клеток. В постмитотических нейронах Aβ может накапливаться внутриклеточно с течением времени и, таким образом, способствует образованию нерастворимых агрегатов.

В совокупности эти результаты показывают, что в то время как NT2N-нейроны накапливают внутриклеточную нерастворимую Aβ вследствие эндогенного продуцирования APP, другие типы клеток также проявляют это свойство, когда они сверхэкспрессируют APP. Интересно отметить, что увеличение экспрессии APP в NT2N-нейронах вследствие инфекции SFV-APPwt не приводило к увеличению уровня внутриклеточного Aβ1-42, что согласуется с некоторыми из наших предыдущих работ, указывающих на то, что расщепление γ-секретазы в ER / IC-путь является ограничивающим скорость (Cook et al., 1997). Напротив, повышенная экспрессия APP в нейронах NT2N приводила к увеличению уровня внутриклеточного Aβ1-40. То, что это увеличение было обусловлено исключительно увеличением уровней растворимого Aβ1-40, согласуется с этой формой Aβ, которая вырабатывается в конце секреторного пути, и восстанавливается из клеток перед секрецией.

Чтобы еще раз подтвердить, что материал, извлеченный путем экстракции муравьиной кислотой и измеренный с помощью сэндвич-ELISA, действительно был Aβ, инфицированные SFV-APPwt-NT2N и клетки CHO были метаболически мечены [35S] метионином в течение 12 часов, а Aβ были иммунопреципитированы с использованием 6E10. Как показано на фиг.3, полоса ~ 4 кД была иммунопреципитирована Aβ-специфическим антителом в RIPA-растворимом клеточном лизате. Дополнительный Aβ был иммунопреципитирован из RIPA-нерастворимой (мутантно-экстрагированной) клеточной фракции, тем самым подтверждая, что пул Aβ остается нерастворимым в буфере RIPA и может быть экстрагирован муравьиной кислотой (фиг.3). Однако выход Aβ после экстракции муравьиной кислоты был ниже, чем у Aβ сэндвич-ELISA. Чтобы определить, удалили ли муравьиную кислоту извлечения Аβ путем иммунопреципитации, [35S] метионин-меченные клетки, инфицированные SFV-APPwt, были экстрагированы непосредственно в муравьиную кислоту. Ожидается, что прямая экстракция клеток в муравьиную кислоту даст количество Aβ, равное сумме Aβ, экстрагированной в RIPA-растворимых и нерастворимых пулах. Тем не менее более низкие уровни Aβ, чем ожидалось, были восстановлены с помощью этого метода (рис.3, сравните полосу 3 с дорожками 1 и 2 и полосу 6 с дорожками 4 и 5). Таким образом, иммунопреципитация клеток, экстрагированных муравьиной кислотой, не была количественной и приводила к частичному излечению Аβ. Такое низкое выделение Aβ могло быть вызвано неполной перерастворимостью Aβ в ацетонитриле после лиофилизации или реагрегированием Aβ во время иммунопреципитации. Чтобы оценить вклад каждого из этих факторов в неполное восстановление Aβ путем иммунопреципитации, мы измерили уровни Aβ в лизате клеток, экстрагированных муравьиной кислотой, до и после лиофилизации и иммунопреципитации сэндвич-ELISA. Мы обнаружили, что ~43% экстрагированного муравьиной кислотой Aβ можно было перерастворить в ацетонитриле после лиофилизации, и ~45% этого перерастворенного Aβ можно было захватить иммунопреципитацией антителом 6E10 (данные не показаны). Тем не менее, несмотря на недостатки протокола иммунопреципитации по сравнению с сэндвич-ELISA Aβ, эти данные подтверждают, что пул, экстрагированный муравьиной кислотой, действительно содержит Aβ.

Хотя было показано, что секретируемый Aβ в основном продуцируется в TGN, внутриклеточный Aβ 1-42, но не Aβ1-40, продуцируется в ER / IC (Cook et al., 1997). Чтобы определить, попадает ли Aβ1-42 в ER / IC в нерастворимый пул, NT2N-нейроны и клетки CHO Pro5 были инфицированы SFV-APPwt или SFV-APPΔKK (мутант APP, содержащий последовательность извлечения дилизина ER). Инфекция обоих типов клеток с помощью SFV-APPΔKK давала аналогичные результаты: почти полное аннулирование продукции Aβ1-40 без уменьшения продукции Aβ1-42 по сравнению с инфицированными SFV-APPwt клетками (фиг.4, A и B). Важно отметить, что уровни нерастворимого Aβ1-42 были одинаковыми в клетках, инфицированных SFV-APPwt и SFV-APPΔKK. Эти результаты показывают, что Aβ1-42, продуцируемый в пути ER / IC, представляет собой объем нерастворимых Aβ1-42 внутри клеток. Напротив, нерастворимый Aβ1-40 продуцируется путем пост-ER / IC-пути. Наконец, эти результаты также доказывают, что нерастворимый Аβ может накапливаться в отсутствие секреции, и они дают дополнительные доказательства того, что Аβ, солюбилизированный муравьиной кислотой, является внутриклеточным.

Наши предыдущие исследования показали, что секреция Aβ1-40 и Aβ1-42 нейронами NT2N возрастает со временем в культуре без увеличения синтеза APP (Turner et al., 1996). Однако не зависящее от времени увеличение внутриклеточного Аβ. Напротив, мы обнаружили, что сохранение APP в ER / IC привело к продолжению производства Aβ1-42, но без выделения или внутриклеточного накопления (Cook et al., 1997). Наше наблюдение здесь заключается в том, что внутриклеточный Аβ (в частности, виды Aβ1-42, продуцируемые в ER / IC) образует нерастворимый пул, что является возможным объяснением обоих этих ранних результатов. Чтобы проверить гипотезу о том, что нерастворимый Aβ может накапливаться внутриклеточно с течением времени, нейроны NT2N анализировали в различные моменты времени после повторной последовательной экстракции в RIPA и муравьиной кислоте с последующим сэндвич-ELISA для количественного определения Aβ. Мы обнаружили резкое увеличение (в 12 раз более 7 недель в культуре) на уровнях экстрагируемых муравьиной кислотой внутриклеточных Aβ1-40 и Aβ1-42 в клетках NT2N, что сопровождалось увеличением времени в культуре (рис.5, A и B). В дополнение к увеличению абсолютного количества нерастворимого Aβ с более длительными временами в культуре наблюдалось также увеличение доли нерастворимого Aβ. Например, при 4 wk ~58% Aβ было нерастворимым, а при 7 wk ~78% Aβ было нерастворимым (фиг.5, A и B). Этот результат позволяет предположить, что равновесие растворимого до нерастворимого Аβ может быть смещено в сторону нерастворимого Aβ в клетках NT2N, которые культивировались дольше (то есть более старые нейроны).

Зависимое от времени накопление нерастворимого внутриклеточного Aβ в нейронах может быть обусловлено несколькими факторами, включая медленный оборот нерастворимого Aβ. Чтобы изучить эту возможность, мы обработали клетки NT2N циклогексимидом для предотвращения синтеза белка и измеряли эндогенные уровни Aβ в растворимых и нерастворимых пулах в течение времени в культуре. Такой подход был необходим (а не стандартный анализ импульсно-чейзов), поскольку иммунопреципитация Aβ после экстракции муравьиной кислоты не была количественной (рис.3). На фиг.6 показано, что в течение 24-часовой циклогексимидной обработки растворимые Aβ1-40 и Aβ1-42 уменьшались на ~ 63% и ~ 77% соответственно. Предполагая постоянную скорость деградации, мы рассчитали период полураспада ~18 ч и ~ 12 ч для распада внутриклеточного растворимого Аβ1-40 и Аβ1-42 соответственно. Напротив, нерастворимые уровни Aβ1-40 и Aβ1-42 значительно не уменьшались в течение 24 часов. Медленный оборот нерастворимого пула Aβ не позволил точно оценить период полураспада этого пула. Кроме того, этот анализ осложняется двумя факторами. Во-первых, хотя новый APP не будет синтезирован в присутствии циклогексимида, существующие пулы APP продолжают обрабатываться для получения Aβ. Однако период полураспада APP в нейронах NT2N составляет ~ 3 ч. Таким образом, de novo производство Aβ из существующих пулов APP вряд ли будет в значительной степени способствовать внутриклеточным Aβ-пулам, особенно в более поздние моменты времени. Во-вторых, растворимые Aβ1-40 и Aβ1-42 могут входить в нерастворимый пул с течением времени, что опять-таки затрудняет точные оценки скорости оборота. Тем не менее, наши результаты показывают, что внутриклеточная нерастворимая Аβ очень долговечна и что эта долгая жизнь, вероятно, будет играть важную роль во временном накапливании нерастворимого Аβ, наблюдаемого в клетках NT2N в течение нескольких недель в культуре.

Наличие нерастворимых агрегатов Aβ в старческих бляшках является хорошо охарактеризованной особенностью AD (Selkoe, 1997). Aβ состоит из двух основных видов, которые заканчиваются у остатков 40 и 42 интактной последовательности Aβ. Оба вида могут быть выделены из CSF нормальных и AD-индивидуумов, причем Aβ1-40 примерно в 10 раз больше, чем Aβ1-42 (Citron et al., 1992). Однако Aβ1-42 является основным видом Aβ, присутствующим в старческих бляшках, причем Aβ1-40 является лишь незначительной составляющей (Iwatsubo et al., 1994). Эти изменения в обработке APP могут привести к развитию AD, было показано несколькими связанными с FAD APP мутациями, которые при экспрессии in vitro или у трансгенных животных приводят либо к общему увеличению продукции Aβ, либо к увеличению количества Aβ1- 42 относительно Aβ1-40 (Borchelt et al., 1996; Duff et al., 1996). Дифференциальное продуцирование Aβ1-40 и Aβ1-42 вследствие AD-ассоциированных мутаций APP, а также предпочтительное осаждение Aβ1-42 в старческих бляшках вызывает важные вопросы относительно внутриклеточных сайтов генерации Aβ1-42, происхождение Aβ, который восстанавливается из старческих бляшек, и факторы, которые контролируют его осаждение.

Оба Aβ1-40 и Aβ1-42 конститутивно продуцируются и секретируются из клеток in vitro и in vivo, о чем свидетельствуют их извлечение из кондиционированной среды и CSF (Shoji et al., 1992; Tamaoka et al., 1996). Поскольку FAD-ассоциированные мутации APP приводят к усиленной секреции Aβ, а старческие бляшки являются внеклеточными поражениями, возможно, что секретируемый Aβ в конечном счете осаждается в старческих бляшках, хотя факторы, контролирующие его осаждение, являются неясными. Однако недавно мы обнаружили, что сохранение APP в ER / IC, вызванное различными методами, приводит к продолжению производства внутриклеточного Aβ1-42, но не Aβ1-40 (Cook et al., 1997). Хотя Aβ1-42 конститутивно продуцируется этим новым путем в нейронах NT2N, другие типы клеток также могут обрабатывать APP для генерации Aβ в ER / IC после сверхэкспрессии APP (Wild-Bode et al., 1997). Было также показано, что Aβ1-42 локализуется в ER / IC с помощью иммуноэлектронной микроскопии и фракционирования клеток (Hartmann et al., 1997; Wild-Bode et al., 1997). Интересно, что это отделение также является местом, где PS1 и PS2 локализованы (Cook et al., 1996; Kovacs et al., 1996). Поскольку мутации в PS1 и PS2 учитывают большинство ранних начальных случаев FAD, и FAD-ассоциированные мутации PS1 и PS2, как было показано, приводят к увеличению отношения Aβ1-42 / 1-40 (Borchelt et al., 1996; Duff et al., 1996; Scheuner et al., 1996), колокализация пресенилинов с основным сайтом конститутивной продукции Aβ1-42 повышает вероятность того, что изменения в продуцировании Aβ по пути ER / IC могут играть важную роль в AD патогенез.

Хотя сохранение APP в ER / IC привело к продолжению и селективному производству Aβ1-42, мы не смогли зафиксировать ни секрецию этого материала, ни его внутриклеточное накопление (Cook et al., 1997). Полученный при номинальной стоимости этот результат показывает, что производство и оборот Aβ1-42 по пути ER / IC находятся в равновесии. Однако, учитывая склонность Aβ1-42 к агрегации in vivo и in vitro, мы спросили, также ли Аβ1-42 агрегируется внутриклеточно. Поскольку показано, что муравьиная кислота эффективно растворяет агрегированный Аβ, присутствующий в старческих бляшках, мы солюбилизировали клеточные лизаты в муравьиной кислоте. Используя этот подход, мы обнаружили, что значительная доля общего внутриклеточного Aβ1-42 и в меньшей степени Aβ1-40 может быть солюбилизирована муравьиной кислотой, но не различными детергентами. В настоящее время мы не знаем, саморазвивается ли муравьиная кислота Аβ или коагрегирует с другими белками. Наше наблюдение, что ни один из связанных с клетками Aβ (в том числе нацеленных на секрецию) не может быть экстрагирован водным буфером, предполагает, что он может быть связан с другими клеточными белками. С другой стороны, in vitro исследования агрегации Aβ предполагают, что Aβ подвержен самоагрегации. Будущие ультраструктурные исследования накопленного внутрисекулярного Aβ помогут решить эту проблему. Внутриклеточный нерастворимый Aβ был выделен в ряде различных линий, экспрессирующих APP. Сверхэкспрессия APP обычно приводила к увеличению производства нерастворимого Aβ. Однако нерастворимый Аβ был продуцирован наиболее эффективно в нейронах NT2N. Таким образом, хотя агрегация внутриклеточного Aβ не является специфичной для клеток, субклеточная среда в нейронах, по-видимому, способствует этому процессу.

Идентификация новой формы внутриклеточного Aβ, которая ранее избегала обнаружения, может объяснить нашу неспособность обнаружить секрецию или внутриклеточное накопление Aβ1-42, продуцируемое путем ER / IC (Cook et al., 1997). Чтобы проверить эту возможность, мы выразили APP, несущий сигнал поиска ER / IC в цитоплазматическом домене в нейронах NT2N и в клетках CHO. Получение внутриклеточного растворимого и нерастворимого Aβ1-40 почти полностью ингибировалось после экспрессии этой конструкции, тогда как уровни растворимого и нерастворимого внутриклеточного Aβ1-42 не менялись при сохранении ER. Таким образом, почти все растворимые в муравьиной кислоте Aβ1-42 могут быть получены из пути ER / IC. Посредством удлинения нерастворимый Aβ1-40 должен быть произведен отделом после ER / IC. Получение нерастворимых Aβ1-40 и Aβ1-42 в разных субклеточных компартментах может помочь объяснить преобладание Aβ1-42 во внутриклеточном пуле. Aβ1-40 продуцируется в конце пути биосинтеза и может проводить относительно небольшое время в клетке до секреции, тем самым минимизируя возможность агрегации. Напротив, основная часть внутриклеточного Aβ1-42 продуцируется путем ER / IC. Этот факт представляет собой среду, отличную от той, в которой продуцируется Aβ1-40, и та, которая не приводит к секреции Aβ1-42. Долгоживущий характер Aβ1-42, его дальнейшее производство на внутриклеточном участке, из которого он не может быть секретирован, и тот факт, что он по своей природе менее растворим, чем Aβ1-40, все может способствовать его склонности к введению стабильного внутриклеточного пула нерастворимого материала. Будет важно дополнительно определить факторы, которые определяют осаждение Aβ в этом нерастворимом пуле, и более тщательно изучить его физическое состояние.

В ходе наших экспериментов мы обнаружили, что восстановление нерастворимого Aβ из NT2N-нейронов было несколько изменчивым. Однако мы обнаружили, что этот результат был обусловлен зависящим от времени накоплением Aβ. В частности, мы обнаружили, что уровни Aβ увеличились в 12 раз по сравнению с нейронами NT2N в возрасте 7 недель в культуре. В то время как нерастворимые Aβ1-40 и Aβ1-42, накопленные с одинаковыми скоростями, необходимы более подробные кинетические исследования, чтобы определить, является ли одновременное производство нерастворимых Aβ1-40 и Aβ1-42, или если последующая полимеризация Aβ1-42 семян Aβ1-42, 40, как сообщалось in vitro. В любом случае зависящее от времени накопление нерастворимого Aβ может быть связано с увеличением производства, уменьшением оборота или стабильным накоплением Aβ с относительно постоянной скоростью. Мы обнаружили, что внутриклеточная нерастворимая Аβ была исключительно стабильной. Таким образом, даже медленное добавление Aβ к нерастворимому пулу в течение недель в культуре может привести к устойчивому накоплению Aβ, наблюдаемому в нерастворимом пуле с течением времени. Это наблюдение может иметь последствия для патогенеза AD, где считается, что накопление Aβ происходит медленно в течение десятилетий. Поскольку AD является возрастным заболеванием, представленные здесь данные свидетельствуют о том, что постепенное накопление внутриклеточного Аβ может быть фактором медленного начала и прогрессирования AD. Важно определить, является ли накопление внутриклеточного нерастворимого Аβ просто результатом стабильности этой формы Аβ или если к этому процессу способствуют другие зависящие от времени факторы (такие как измененная обработка APP или нейротоксические оскорбления).

Хотя внутриклеточные β-амилоидные фибриллы наблюдались в головном мозге AD (Kim et al., 1988), а также в модели трансгенной мыши AD (Masliah et al., 1996), неясно, могут ли фибриллы Aβ образоваться внутри нейронов из эндогенно продуцируемого Aβ. Представленные здесь эксперименты показывают, что значительные уровни Aβ нерастворимы в нейронах. Наблюдение, что Aβ может накапливаться со временем в относительно устойчивом нерастворимом пуле, может объяснить, как может быть нанесено осаждение Aβ в старческих бляшках, несмотря на относительно низкие уровни секретируемого и CSF-растворимого Aβ1-42. Концентрированный внутриклеточный Аβ1-42 может быстро зародить образование фибрилл, и внутриклеточно продуцируемые Aβ1-42 и Aβ1-40 могут с течением времени добавлять к этим фибриллам, тем самым выступая в качестве очага для развивающейся старческой бляшки.

Эта работа была поддержана грантами Национального института по проблемам старения. Доктор медицины Сковронский является лауреатом программы подготовки медицинских ученых по докторантуре от национальных институтов здравоохранения, а Р. В. Домс является лауреатом премии профессора Поля Бисона.

Мы с благодарностью благодарим доктора Н. Сузуки и Tekeda Pharmaceutical за предоставление моноклональных антител для сэндвич-ELISA. Мы также благодарим д-ра Дж. Ванга за ее помощь в экспериментах по старению нейронов и д-р J.Q. Трояновский за критическое чтение рукописи.

Отправляйте всю корреспонденцию доктору Вирджинии М.-Y. Ли, Центр исследований нейродегенеративных заболеваний, Кафедра патологии и лабораторной медицины, Малони 3, HUP, Филадельфия, PA 19104-4283. Тел .: 215-662-6427; Факс: 215-349-5909; E-mail: vmylee@mail.med.upenn.edu

амилоид-β-пептид

Болезнь Альцгеймера

белок-предшественник амилоида-β

почка детского хомяка

эндоплазматический ретикулум / промежуточный отдел

Семейная болезнь Альцгеймера

Лесной вирус Семлики

SFV, выражающий APP695 дикого типа

сеть транс-Гольджи

FA-экстракция NT2N-нейронов обнаруживает большой пул нерастворимых внутриклеточных Aβ. (A) 10-см чашки клеток NT2N (повторите 2, 4 wk old) либо последовательно экстрагировали в RIPA с последующим FA, либо лизировали непосредственно в FA. Уровни Aβ1-40 и Aβ1-42 в образцах RIPA и FA определяли количественно с помощью сэндвич-ELISA. Показаны средние результаты и стандартные ошибки (шесть отдельных экспериментов, каждая из которых выполняется с повторяющимися образцами). (B) были рассчитаны соотношения 1-42 / 1-40 для RIPA-растворимого пула Aβ, RIPA нерастворимого (FA растворимого) пула Aβ и полного внутриклеточного пула Aβ для этих нейронов NT2N, демонстрируя, что нерастворимый внутриклеточный пул Aβ состоит в основном из Aβ1-42, тогда как растворимый пул содержит аналогичные количества Aβ1-40 и Aβ1-42.

FA-экстракция различных клеточных линий выявляет наличие различных уровней нерастворимого внутриклеточного Aβ. (A) Неинфицированные и инфицированные SFV-APPwt клетки NT2, клетки NT2N (замена 2, 4 wk old), клетки CHO Pro5, клетки CHO-695 (только не инфицированные) и клетки BHK-21 последовательно экстрагировали в RIPA, затем FA , Уровни Аβ 1-40 и 1-42 в образцах RIPA и FA определяли количественно с помощью сэндвич-ELISA. Показаны средства и стандартные ошибки (четыре отдельных эксперимента, выполненных в трех экземплярах) уровней Aβ. (B) Образцы из лизатов клеток RIPA каждой из этих клеточных линий (как неинфицированных, так и инфицированных SFV-APPwt) разрешали на 7,5% трис-глицин-акриламидном геле и иммуноблоттировали антителом Карена; полоски были обнаружены PhosphorImager после использования меченого I125 вторичного антитела.

Aβ может быть выделен из RIPA-растворимых и нерастворимых RIPA (FA-солюбилизированных) фракций клеточного лизата. SFV-APPwt-инфицированные клетки NT2N и клетки CHO Pro5 были метаболически помечены в течение 12 часов перед лизисами в FA или RIPA с последующей экстракцией нерастворимого материала FA. Образцы RIPA и FA подвергали иммунопреципитации с помощью 6E10 и растворяли в трис-трицидном геле с градиентным шагом на 10/16,5%. Стандарты молекулярной массы и полосы Aβ маркируются.

Нерастворимый Aβ1-42 может быть получен APPΔKK, экспрессирующим клетки NT2N и CHO. (A) клетки N2TN и (B) клетки CHO Pro5 были инфицированы SFV-APPwt или SFV-APPΔKK в течение 12 ч перед последовательной экстракцией в RIPA, затем FA. Aβ в каждом образце определяли количественно сэндвич-ELISA. Показаны средства и стандартные ошибки (два отдельных эксперимента, каждый из которых выполнен в трех экземплярах).

Нерастворимый внутриклеточный Aβ накапливается в течение времени в клетках NT2N. 10-сантиметровые тарелки клеток Replate 2 NT2N собирали каждую неделю 3-7 недель после репликации. Клетки лизировали в буфере RIPA, и нерастворимый материал ресуспендировали в FA. Aβ1-40 (A) и 1-42 (B) в растворимых и нерастворимых внутриклеточных пулах определяли количественно сэндвич-ELISA. Данные были нормализованы для общего присутствия белка (в мг). Эксперимент повторялся три раза, и для репрезентативного эксперимента показаны средние и стандартные ошибки (от трех до пяти выборок в момент времени).

Нерастворимый пул внутриклеточного Аβ стабилен в течение 24 ч, тогда как растворимый пул клеточного Аβ переходит более быстро. 10-см чашки клеток Replate 2 NT2N обрабатывали 150 мкг / мл циклогексамида в течение времени, указанного перед последовательным экстрагированием в RIPA и FA. Аβ1-40 и 1-42 в растворимом (А) и нерастворимом внутриклеточном пуле (В) определяли количественно сэндвич-ИФА. Эксперимент повторялся три раза, а для типичного эксперимента показаны средние и стандартные ошибки (три отсчета в момент времени).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *