Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Экспрессия белка поверхностно-активного вещества D в дыхательных путях астматиков и интерлейкина-13 модуляции белка поверхностно-активного вещества D в человеческих моделях эпителия дыхательных путей

Expression of surfactant protein D in airways of asthmatics and interleukin-13 modulation of surfactant protein D in human models of airway epithelium
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4352233/

Показано, что сывороточный протеин D (SP-D), молекула распознавания образов, играет роль в защите хозяина, такой как опсонизация, агрегация патогенов и модуляция воспалительного ответа. В свете индуцированных инфекцией обострений и повреждения эпителия дыхательных путей от воспаления эти функции SP-D делают его актуальным в развитии и патогенезе астмы.

Экспрессию SP-D исследовали на участках дыхательных путей человека и первичных эпителиальных клетках дыхательных путей (AEC), выращенных в культурах взаимодействия воздуха с жидкостью (ALI), и проводились сравнения между астматическими и неастматическими донорами. Культуры ALI AEC от неастматических доноров были исследованы на SP-D, Mucin 5AC и экспрессию цитокератина-5 на разных стадиях дифференцировки. Изучение интерлейкина-13 (ИЛ-13) эпителия дыхательных путей и его влияние на экспрессию SP-D изучали с использованием ALI и монослойных культур первичной АЕС у неастматических и астматических доноров.

Воздушный эпителий астматиков по сравнению с неастматиками выражал повышенные уровни SP-D, как показано в срезах тканей дыхательных путей (доля эпителия 0,66 ± 0,026 против 0,50 ± 0,043, p = 0,004) и культуры ALI (доля эпителия 0,50 ± 0,08 против 0,25 ± 0,07). Выражение SP-D уменьшалось по мере того, как культуры ALI отличались от 7 дней до 21 дня (доля эпителия 0,62 ± 0,04-0,23 ± 0,03, p = 0,004). Лечение IL-13 уменьшало SP-D-экспрессию в обеих культурах ALI (доля эпителия 0,21 ± 0,06 против 0,62 ± 0,04, p = 0,0005) и монослойные культуры (изменение экспрессии экспрессии белка 0,62 ± 0,05) неастматической AEC; однако IL-13 не оказывал существенного влияния на экспрессию SP-D в однослойных культурах астматической AEC. Эксперименты с неастматическими однослойными культурами показывают, что IL-13 оказывает свое действие на SP-D через альфа-1 рецептора IL-13 и транскрипционный фактор STAT6.

SP-D выражается по-разному в дыхательных путях астматиков по сравнению с неастматиками. Это может иметь последствия для повышения восприимчивости к инфекциям и изменения воспалительной реакции у пациентов с астмой. Будущие функциональные исследования о роли SP-D в астме могут лучше понять недостатки в структуре и регуляции SP-D.

Онлайн-версия этой статьи (doi: 10.1186 / s12931-015-0177-7) содержит дополнительный материал, доступный для авторизованных пользователей.

Астма — это хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, которое поражает людей всех возрастов. За последние 30 лет он увеличился в распространенности и в настоящее время затрагивает 235 миллионов человек во всем мире [1]. Клинически, астма характеризуется повторяющимися и обратимыми эпизодами хрипов, судорог, одышки и кашля. Структурные и функциональные изменения, связанные с астмой, включают бронхоконстрикцию, воспаление дыхательных путей, гиперплазию эпителиальных бокаловидных клеток, гипертрофию гладких мышц бронхов и пролиферацию кровеносных сосудов и нервов дыхательных путей [2]. Более высокая доля базальных клеток в отличие от дифференцированных клеток также обнаружена в дыхательных путях астматиков [3].

У астматических пациентов может быть повышенная восприимчивость к вирусным и бактериальным инфекциям в дыхательных путях. Респираторные вирусные инфекции оказывают пагубное воздействие на пациентов с установленной астмой; они были связаны с почти 80% обострениями астмы [4]. Респираторный синцитиальный вирус (RSV) является наиболее распространенной причиной острой инфекции нижних дыхательных путей у младенцев и детей во всем мире [5]. Несколько исследований продемонстрировали связь тяжелой инфекции RSV в младенчестве с последующим развитием рецидивирующего хрипов и астмы у детей [6-9]. Астма традиционно тесно связана с адаптивной иммунной системой; однако более поздние исследования показали, что врожденный иммунный ответ также важен в его развитии и прогрессировании [10]. Поэтому особый интерес представляет роль врожденной иммунной системы в защите хозяина от вдыхаемых патогенов и последующего воспалительного ответа.

Легочное поверхностно-активное вещество первоначально было идентифицировано как липопротеиновый комплекс, который уменьшает поверхностное натяжение в альвеолах. Совсем недавно было обнаружено, что белки поверхностно-активных веществ A и D (SP-A, SP-D) участвуют в механизмах защиты хозяина [11]. SP-A и SP-D, относятся к коллекционному семейству белков и являются молекулами распознавания образов, которые связывают широкий спектр патогенов, включая вирусы, бактерии и грибы [11]. Его роль в защите хозяев включает усиление фагоцитоза путем опсонизации, агрегации патогенов и регуляции медиаторов воспаления [11]. SP-A и SP-D являются конститутивными медиаторами антигенного зазора, которые могут взаимодействовать с клеточными компонентами как врожденной, так и адаптивной иммунной системы на поверхности слизистой оболочки [12].

Интерлейкин-13 (IL-13) представляет собой цитокин, секретируемый многими типами клеток, включая клетки TH2, макрофаги и активированные тучные клетки [13-15]. Несколько животных моделей показали, что IL-13 опосредует признаки астмы, такие как гиперреактивность дыхательных путей, гиперплазия клеток слизи и фиброз подэпителиальных дыхательных путей независимо от других цитокинов [13,16,17]. Роль IL-13 в опосредовании фенотипов астмы также подтверждалась сообщениями об увеличении IL-13 в легких у пациентов с астмой [18]. IL-13 имеет два рецептора: рецептор IL-13 альфа 1 (IL-13Rα1) и рецептор IL-13 альфа 2 (IL-13Rα2). IL-13Rα1 образует гетеродимерный рецепторный комплекс с субъединицей IL-4Rα. Передача IL-13 через IL-13Rα1 активирует сигнальный преобразователь Janus kinase (JAK) и активатор транскрипции (STAT), в частности транскрипционный фактор STAT6. IL-13Rα2 известен как высокоаффинный рецептор и может сигнализировать через фактор транскрипции, активаторный белок 1 [19].

Настоящее исследование направлено на то, чтобы охарактеризовать выражение SP-D в дыхательных путях астматиков, с гипотезой о том, что он будет отличаться от экспрессии неастматиков. Эффекты дифференцировки и воздействия IL-13 на экспрессию SP-D были исследованы с использованием поверхностей межжелудочковых интерфейсов (ALI) первичных эпителиальных клеток дыхательных путей (AEC) от неахматических доноров и монослойных культур AEC от неастматических и астматических доноров.

Мышь с анти-человеческим SP-D-антителом, используемым для иммуногистохимии (IHC) и Вестерн-блот-анализа (номер каталога HYB-245-01-02), была приобретена у Thermo Scientific (Rockford, IL). Моноклональное антитело против β-актина мыши, конъюгированное с пероксидазой хрена (sc-47778), было приобретено у Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Мыши антитела против муцина 5AC (MUC5AC) (AB24071) и антитела против цитокератина 5 кролика (CK-5, AB24647) были приобретены у Abcam Inc. (Toronto, ON) для IHC. Рекомбинантные человеческие IL-13 (213-IL), козьи анти-человеческие IL-13Rα1 (AF-152) и IL-13Rα2 (AF-146) нейтрализующие антитела и нормальный козьи IgG (AB-108-C) были приобретены у R & D Systems (Миннеаполис, MN). Мышиное антифосфорилированное антитело STAT6 (p-STAT6) (611566) и мышиное антитело против STAT6 (611290), используемое для Вестерн-блоттинга, было приобретено у BD Biosciences (Mississauga, ON). Реагент Trizol (15596018) был приобретен у Life Technologies (Burlington, ON).

Человеческие легкие выявленных астматических и неастматических доноров, считающихся непригодными для трансплантации и пожертвованные на медицинские исследования, были получены из Международного института по улучшению медицины (Эдисон, Нью-Джерси) для первичной изоляции клеток в соответствии с утверждением исследовательской этики Совет (REB) Университета Британской Колумбии / Providence Healthcare (REB # H00-50110). Эпителиальные клетки дыхательных путей (AEC) выделяли путем переваривания протеазы, как описано Grey и коллегами [20], культивировали в среде для культивирования бронхиальной эпителия (Lonza, Mississauga, ON, CC-3170), инкубировали при 37 ° C в 5% CO2 и выращенных в 12-луночных планшетах. Обработка первичной АЭС в монослое происходила между проходами два и три. С помощью клеток, проходящих через один или два канала в среде PneumaCult (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, 05001), получали эпителиальные культуры, совместимые с донорами (ALI). Эпителиальные культуры ALI выращивали в течение 7, 14 или 21 дня, чтобы представлять различные стадии дифференциации.

Первичная АЕС от неастматических доноров выращивалась до 80% слияния и обрабатывалась в течение 24 часов только с помощью IL-13 (10 нг / мл) или предварительно инкубировалась с контролем изотипа козьего IgG, нейтрализующими антителами для IL-13Rα1 (20 мкг / мл) или IL-13Rα2 (2 мкг / мл) в течение одного часа перед добавлением IL-13. Первичный АЕК от астматических доноров также выращивали до 80% слияния и обрабатывали в течение 24 часов с помощью ИЛ-13 (10 нг / мл).

Псевдостратифицированные культуры ALI AEC, выделенные из неастматических доноров, выращивали в течение 28 дней для изучения эффектов лечения IL-13. Начиная с 14 и 21 дней, IL-13 добавляли в альтернативные дни в течение двух недель и одной недели соответственно.

Человеческая ткань дыхательных путей от астматических и неастматических доноров и культур ALI, выращенных из неастматических AEC (необработанных и обработанных IL-13), фиксировали в 10% формалине, вставляли в парафин и разделяли на 4 мкм срезы. Разделы депарафинизировали в CitriSolv (Fisher Scientific, Toronto, ON, 22-143-975) и регидратировали. Получение антигена осуществляли автоклавированием в растворе Citra при pH 6,0 (Life Technologies, Burlington, ON) в течение 22 минут. Все разделы были заблокированы последовательно с использованием фонового снайпера (Biocare Medical, Markham, ON, B5966L) и двойного эндогенного блока (Dako, Burlington, ON, K5361). Разделы окрашивали антителами против SP-D (0,25 мкг / мл), MUC5AC (1 мкг / мл) или CK-5 (1 мкг / мл) с использованием набора для определения AP-полимеров MACH 3 без биотина (Biocare Medical, Markham, ON, M3U532 для мыши и M3R533 для первичных антител кролика), содержащих щелочную фосфатазу с Warp Red Chromogen (Biocare Medical, Markham, ON, WR806) в качестве субстрата. Соответствующие контрольные антитела изотипа использовались в качестве отрицательных контролей для IHC для демонстрации специфичности антител. Гематоксилин использовался для противокрашивания ядер. Сегментация цвета с помощью ImagePro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) была выполнена для количественной оценки, при которой положительный район был нормализован до общей площади эпителия.

Всего клеточные лизаты, собранные из первичных человеческих монослоев AEC и культур ALI, использовали для Вестерн-блот-анализа в соответствии со стандартными методами [21]. Двадцать микрограмм восстановленных образцов белка подвергали электрофорезу в гель SDS-PAGE с 4-20% градиентом и затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре в TBST (10 ммоль / л Tris-HCl, 150 ммоль / л NaCl и 0,1% Tween-20), содержащем 5% обезжиренного молока для нефосфорилированных белков и 5% BSA для фосфорилирования белки. Затем мембрану инкубировали в течение ночи при 4 ° С в соответствующих первичных антителах в TBST, содержащем 2,5% обезжиренного молока для нефосфорилированного белка или 1% БСА для фосфорилированного белка. Концентрациями первичных антител были: анти-SP-D (1: 1000) и анти-p-STAT6 (1: 2000) с последующим повторным зондированием с анти-β-актином (1: 2500) и STAT6 (1: 1000) для нормализации для SP-D и p-STAT6 соответственно. Мембраны трижды промывали TBST, а затем инкубировали с разбавлением 1: 2000 меченого пероксидазой хрена с козьим антимышиным IgG (BD Biosciences Canada, Mississauga, ON). Образцы были обнаружены с улучшенной хемилюминесценцией Super Signal West Femto (Pierce, Cheshire, United Kingdom). Денситометрию проводили через ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) для количественной оценки. В экспериментах с множественными обработками значения денситометрии для SP-D сначала нормализовались к β-актину, а затем до необработанного контроля, чтобы получить экспрессию белка SP-D с изменением складки.

Общая РНК была выделена с использованием реагента Trizol в соответствии с протоколом производителя, и 0,6 мкг общей РНК превращали в комплементарную ДНК (кДНК) через обратную транскрипцию (RT) с использованием кДНК SuperMix qScript из Quanta Biosciences (Gaithersburg, MD). Реакцию RT инкубировали при 25 ° С в течение 5 минут, 42 ° С в течение 30 минут и 85 ° С в течение 5 минут. Количественная ПЦР в реальном времени (qPCR) была выполнена на ABI ViiA 7 (Life Technologies, Burlington, ON) с 20 мкл реакциями, содержащими 1 мкл кДНК, 5 мкл основной смеси TaqMan (Life Technologies, Burlington, ON) и 0,5 мкл зонда SP-D TaqMan (Hs00358340_m1 SFTPD) или гипоксантин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) TaqMan (Hs99999909_m1HPRT1) в 384-луночных планшетах. Условия qPCR составляли один цикл 50 ° C в течение 2 минут, один цикл активации фермента 95 ° C в течение 10 минут и 40 циклов амплификации. Каждый цикл амплификации состоит из денатурации при 95 ° C в течение 15 секунд с последующим одновременным отжигом и растяжением при 60 ° C в течение 1 минуты. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения ViiA 7 с использованием метода сравнительной количественной оценки, где значения CT SP-D были нормированы на значения CT HPRT с последующей нормализацией к необработанным контрольным образцам для получения ΔΔCT = [(CTSP-D — CTHPRT) Обработано — (CTSP- D — CTHPRT) Необработанный]. Изменение смены выражений определялось как 2-ΔΔT.

GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния) использовался для всех статистических анализов. Данные о цветовой сегментации от участков дыхательных путей человека и исходных участков ALI между астматическими и неастматическими донорами анализировали с использованием двухстороннего непарного теста t, в то время как данные обработанных IL-13 секций ALI анализировали с использованием двухстороннего парного t-теста. Данные об обработанных ИЛ-13 астматических и неастматических монослойных культурах также анализировали с использованием двухстороннего парного t-теста против соответствующих контролей. Данные из культур ALI, которые отличались от 7 до 21 дня, анализировали односторонним ANOVA, а затем с использованием теста множественного сравнения Bonferroni и посттестирования для линейного тренда, где это необходимо. Данные денситометрии от обработанных IL-13 неастматических монослоев (с нейтрализующими антителами и без них) анализировали односторонним ANOVA с помощью теста множественного сравнения Bonferroni. Значения представлены как среднее ± SEM. Статистическая значимость определяется как p-значение <0,05.

Для описания экспрессии SP-D в дыхательных путях человека использовались секции тканей легких, полученные от 11 астматических и 11 неастматических доноров. Иммуногистохимия была выполнена для изучения распределения и относительного количества SP-D-экспрессии. Воздушные трассы как астматических, так и неастматических доноров выражали SP-D в цитоплазме эпителиальных клеток (рис. 1А). Когда положительное окрашивание выражалось в виде доли общей площади эпителия, астматические дыхательные пути демонстрировали более высокое выражение SP-D (0,66 ± 0,026) по сравнению с неастматическими дыхательными путями (0,50 ± 0,043) (n = 11, p = 0,004, рис. 1B). Наличие SP-D было подтверждено в дыхательных путях человека, и, кроме того, его экспрессия была увеличена в дыхательных путях астматиков. Неравномерная интенсивность указывает на то, что SP-D может быть выражен больше в определенных подтипах эпителиальных клеток дыхательных путей, в частности недифференцированных базальных клеток.
Выражение поверхностно-активного белка D в участках дыхательных путей человека. Экспрессия SP-D изучалась на участках дыхательных путей от неастматических и астматических доноров с помощью иммуногистохимии, где розовая показала положительность [A]. Фракцию положительной положительной площади эпителия определяли количественно с использованием сегментации цвета в ImagePro Plus. Экспрессия SP-D в эпителии дыхательных путей астматических доноров была значительно выше по сравнению с неастматическими донорами (n = 11, t-тест p = 0,004) [B].

Хорошо дифференцированные двадцатидневные культуры ALI первичной астматической AEC продемонстрировали более высокие уровни экспрессии SP-D по сравнению с неастматиками, обнаруженными иммуногистохимией (доля общей площади эпителия: 0,50 ± 0,08 против 0,25 ± 0,07, n = 5, p = 0,04, фиг. 2A, B). Вестерн-блоттинг также продемонстрировал более высокую экспрессию SP-D в культурах ALI, полученных из астматических AEC (1,02 ± 0,15, n = 3) по сравнению с неастматическими AEC (0,27 ± 0,11, n = 7, p = 0,005, Рисунок 2C). Эти данные согласуются с данными участков тканей дыхательных путей и предполагают, что эпителиальные культуры ALI являются жизнеспособной моделью для изучения экспрессии SP-D. Фиг. 2
Поверхностно-активное вещество D выражает культуры ALI. Экспрессия SP-D была исследована в секциях ALI, выращенных из неастматических и астматических доноров с помощью иммуногистохимии, где розовая показала положительность [A]. Фракцию положительной положительной площади эпителия определяли количественно с использованием сегментации цвета в ImagePro Plus. Экспрессия SP-D в ALI астматической AEC была значительно выше по сравнению с неастматической AEC (n = 5, t-тест p = 0,04) [B]. Выражение белка SP-D в полных клеточных лизатах культур ALI анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Выражение SP-D определяли количественно денситометрией с использованием ImageJ и нормировали на β-актин. ALI астматического AEC продемонстрировали значительно более высокую экспрессию SP-D по сравнению с показателем неастматической AEC (n = 3-7, t-тест p = 0,005) [C].

Культуры ALI, выращенные из неастматической AEC, подвергались воздействию воздуха и позволяли дифференцироваться в течение 7, 14 и 21 дней. Доля эпителия, окрашенная положительно для SP-D, значительно уменьшилась с 0,62 ± 0,04 в 7 дней до 0,47 ± 0,09 в 14 дней и до 0,23 ± 0,03 в 21 день, как было обнаружено с помощью иммуногистохимии (n = 5, p = 0,004, фиг. 3A , В). Аналогичным образом, смена экспрессии белка SP-D по сравнению с днем ​​0 уменьшилась с 1,68 ± 0,33 до 7 дней до 1,06 ± 0,21 через 14 дней и до 0,74 ± 0,18 через 21 день, как было обнаружено вестерн-блоттингом (n = 3, рисунок 3C ). В то время как снижение вестерн-блоттинга было незначительным, линейный тренд с наклоном -0,5 был обнаружен в течение двухнедельного курса с 7-го дня до 21 дня (p = 0,04). Добавляя к обнаружению неравномерного окрашивания в дыхательных путях, это говорит о том, что недифференцированные клетки имеют более высокую экспрессию SP-D. Фиг. 3
Surfactant protein D, Mucin 5AC и экспрессию цитокератина-5 в культурах ALI на разных стадиях дифференциации. Экспрессия SP-D, MUC5AC и CK-5 была исследована в секциях ALI, выращенных в течение 7, 14 и 21 дней от неастматических доноров с помощью иммуногистохимии, где розовая показала положительность [A]. Фракцию положительной положительной площади эпителия определяли количественно с использованием сегментации цвета в ImagePro Plus. Экспрессия SP-D в эпителии дыхательных путей значительно уменьшалась, поскольку культуры дифференцировались от дня (d) от 7 до 21 (n = 5, односторонний ANOVA p = 0,004) [B]. Выражение белка SP-D в 7, 14 и 21-дневных культурах ALI было обнаружено путем Вестерн-блоттинга, определяемого с помощью денситометрии по сравнению с культурами через 0 дней. Наблюдался линейный тренд (n = 3, p = 0,04) [C]. Экспрессия MUC5AC в эпителии дыхательных путей значительно возрастала по мере роста культур с 7 по 21 год, как показано иммуногистохимией (n = 4, односторонний ANOVA p = 0,007) [D]. Экспрессия CK-5 в эпителии дыхательных путей значительно уменьшилась по мере роста культур с 7 по 21 день (n = 4, односторонний ANOVA p = 0,002) [E].

MUC5AC, муцин, экспрессируемый в бокаловидных клетках дыхательных путей, используется здесь как маркер для дифференциации клеток кубиков. Иммуногистохимия культур ALI, выращенных из неастматической AEC, продемонстрировала повышенную экспрессию MUC5AC с 7 по 21 день (доля общей площади эпителия: 0,08 ± 0,02 7 дней, 0,20 ± 0,06 14 дней, 0,29 ± 0,05 21 дня, n = 4, p = 0,007, фиг. 3A и D). Это указывало на то, что дифференциация в кубические клетки, секретирующие муцин, происходила в модели ALI в течение 21 дня культуры.

CK-5, маркер базальных эпителиальных клеток [3], используется для демонстрации степени дифференциации в культурах ALI, выращенных из неастматической AEC. Иммуногистохимия на этих культурах продемонстрировала значительно сниженную экспрессию CK-5 (доля общей площади эпителия: 0,59 ± 0,04 7 дней, 0,36 ± 0,07 14 дней, 0,27 ± 0,05 21 дня, n = 4, p = 0,002, фиг.3A и E) , Уменьшение когнитивной экспрессии CK-5 при уменьшении экспрессии SP-D при дифференцировке позволяет предположить, что те же положительные базальные клетки CK-5 потенциально могут также быть основным источником продуцирования SP-D в эпителии дыхательных путей.

Двухнедельная обработка IL-13 культур ALI, выращенных из неастматических AEC-индуцированных характерных изменений, включая измененную толщину эпителия и распределение клеточного типа (рисунок 4A). Что касается экспрессии SP-D, IL-13 индуцировал значительное снижение доли эпителия, который окрашивал положительный показатель для SP-D (0,21 ± 0,06) по сравнению с необработанным (0,62 ± 0,04), как показано иммуногистохимией (n = 4, p = 0,0005, фиг. 4B). В эксперименте с временным курсом обработка IL-13 культур ALI приводила к уменьшению экспрессии белка SP-D по сравнению с необработанными культурами, как показано вестерн-блоттингом (0,65 ± 0,15 в 24 часа, 0,47 ± 0,10 в 7 дней, 0,32 ± 0,06 в 14 дней, n = 4-6, фиг. 4C). Значительное снижение было также обнаружено в экспрессии белка SP-D на 14 день по сравнению с 7-м днем ​​(p <0,05). Из-за одновременных изменений в клеточном росте, типе клеток и эпителиальной структуре неясно, является ли это снижение прямым эффектом IL-13 или косвенным следствием индуцированных IL-13 изменений в дифференцировке. Экспрессия поверхностно-активного белка D (SP-D) в неастматических культурах ALI, обработанных IL-13. Экспрессия SP-D была исследована в срезах ALI, обработанных IL-13 (10 нг / мл, 14 дней) ALI, выращенных из сопоставленных неастматических доноров с помощью иммуногистохимии, где розовый указывает на положительность [A]. Фракцию положительной положительной площади эпителия определяли количественно с использованием сегментации цвета в ImagePro Plus. Экспрессия SP-D в эпителии дыхательных путей значительно снижалась в культурах, обработанных IL-13 (n = 4, t-тест p = 0,0005) [B]. Экспрессия белка SP-D в культурах ALI, обработанных IL-13 в течение 24 часов, 7 дней и 14 дней, была обнаружена Вестерн-блоттингом, количественно определена денситометрией и нормирована на необработанный контроль, чтобы получить изменения складки. Все три длительности привели к уменьшению выражения SP-D (n = 6, одностороннее ANOVA p = 0,02) [C].

Для изучения регуляции SP-D в ответ на IL-13 монослойные культуры, выращенные из неастматической AEC, обрабатывали IL-13 (10 нг / мл) в течение 24 часов. При нормализации к необработанному контролю обработка IL-13 либо отдельно, либо после предварительной инкубации с контролем изотипа IgG в течение 24 часов приводила к уменьшению мРНК SP-D (0,62 ± 0,05 и 0,60 ± 0,03 соответственно, n = 3, фиг. 5A ). Клетки, предварительно инкубированные с нейтрализующим IL-13Rα1 антителом до лечения IL-13, продемонстрировали ослабление эффекта IL-13 на экспрессию мРНК SP-D (0,99 ± 0,11). Напротив, клетки, предварительно инкубированные с нейтрализующим IL-13Rα2 антителом, не продемонстрировали существенной разницы в экспрессии мРНК SP-D по сравнению с клетками, предварительно инкубированными с контролем изотипа IgG (0,54 ± 0,07). Фиг. 5
SP-D в монослойных эпителиальных культурах, обработанных IL-13. SP-D мРНК исследовали в неастматических монослойных культурах, обработанных только IL-13 (10 нг / мл), и в культурах, предварительно обработанных либо изотипом козы IgG (20 мкг / мл), нейтрализующим IL-13Rα1 антителом (20 мкг / мл) или нейтрализующее IL-13Rα2 антитело (2 мкг / мл) за один час до воздействия IL-13. Чтобы получить изменения сгиба, значения ΔΔT были получены путем нормализации мРНК SP-D к мРНК HPRT и нормализации групп лечения до необработанного контроля. Значительное различие наблюдалось между предварительно обработанной группой IgG и предварительно обработанной группой нейтрализующего антитела IL-13Rα1 (n = 3, односторонний ANOVA p = 0,01) [A]. Уровни белка SP-D в культурах без астматического монослоя при тех же условиях лечения были обнаружены с помощью Вестерн-блоттинга. Значительная разница была обнаружена между обработанной IL-13 группой и группой, предварительно обработанной нейтрализующим антителом IL-13Rα1. Количественное определение проводили с помощью денситометрии, а экспрессия белка SP-D была нормирована на необработанный контроль (n = 6, односторонний ANOVA p = 0,04) [B]. Выражение Phosphorylated-STAT6 (pSTAT6) в неастматических монослойных культурах из того же эксперимента, что и панель [B], анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Обработка IL-13 значительно увеличивала фосфорилирование STAT6 по сравнению с контролем, тогда как предварительная инкубация с нейтрализующим IL-13Rα1 антителом значительно снижала фосфорилирование STAT6 по сравнению с IgG (n = 5, односторонний ANOVA p = 0,005) [C]. pSTAT6 до STAT6 в неастматических культурах ALI, обработанных IL-13 (10 нг / мл) в течение двух недель, показывают значительное увеличение по сравнению с необработанным контролем (n = 3, односторонний ANOVA p = 0,001) [D ]. Обработка IL-13 привела к значительному снижению экспрессии белка SP-D в культуре неастматического монослоя (n = 5, t-тест p = 0,03), тогда как в астматической монослойной культуре (n = 4) не было обнаружено значительного изменения (n = 4) [E ].

Всего белковые лизаты, собранные из параллельных экспериментов, анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Относительно необработанного контроля обработка IL-13 либо отдельно, либо после предварительной инкубации с контролем изотипа IgG в течение 24 часов вызывала снижение белка SP-D (0,51 ± 0,08 и 0,65 ± 0,07 соответственно, n = 6, фиг. 5B) , Предварительная инкубация с нейтрализующим антителом IL-13Rα1 до IL-13 продемонстрировала аналогичное смягчение эффекта IL-13 на экспрессию белка SP-D (0,85 ± 0,13). Предварительная инкубация с нейтрализующим антителом IL-13Rα2 не вызывала существенной разницы в экспрессии белка SP-D по сравнению с одной только обработкой IL-13 или обработкой IL-13 с предварительной инкубацией IgG (0,60 ± 0,06).

Активацию фактора транскрипции STAT6 анализировали в согласованных белковых лизатах с помощью выражения SP-D для исследования активности IL-13Rα1 в нисходящем направлении. Соотношение фосфорилированного STAT6 и общего STAT6 как маркера активации было низким при необработанном контроле (0,04 ± 0,01), заметно увеличенном в клетках, обработанных IL-13 (1,57 ± 0,27), в предварительно инкубированных IgG клетках (1,59 ± 0,28), и в предварительно инкубированных клетках нейтрализующего антитела IL-13Rα2 (1,25 ± 0,17) (n = 5, p = 0,005, фиг. 5C). Напротив, предварительная инкубация с нейтрализующим антителом IL-13Rα1 приводила к заметному уменьшению отношения (0,52 ± 0,08).

Активацию STAT6, изучаемую в культурах ALI, подвергнутых воздействию IL-13 в течение 24 часов, одной недели и двух недель, определяли количественно фосфорилированным STAT6 до общего отношения STAT6. Это соотношение было низким при необработанном контроле ALI (0,07 ± 0,03) и увеличилось в группах лечения IL-13 (n = 3, рис. 5D). Наибольшее соотношение наблюдалось через 24 часа (1,76 ± 0,27), которое постепенно снижалось через 7 дней (1,27 ± 0,32) и через 14 дней (1,15 ± 0,21). Это говорит о том, что клетки продолжали реагировать на IL-13 через IL-13Rα1 и путь STAT6 в течение двух недель воздействия.

Влияние IL-13 на экспрессию SP-D в астматической AEC изучали в монослоевых культурах и сравнивали с неастматической AEC. Всего белковые лизаты необработанных и обработанных IL-13 (10 нг / мл) астматических и неастматических AEC собирали через 24 часа после обработки и затем анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Никакая значительная разница в экспрессии SP-D не была обнаружена в астматической АЕК группы, обработанной IL-13, относительно необработанных контрольных клеток (n = 4), тогда как значительное снижение экспрессии SP-D было продемонстрировано у обработанного IL-13 (0,31 ± 0,06) неастматический AEC относительно необработанных контрольных клеток (0,62 ± 0,11) (n = 5, p = 0,03, рис. 5E).

В этом исследовании мы сравнили выражение SP-D в дыхательных путях астматиков с неастматиками и начали исследовать, что может регулировать это выражение. Роль SP-D как молекулы распознавания образов в врожденной иммунной системе делает ее актуальной для астмы, поскольку многочисленные исследования показали, что астма может возникать после и усугубляться респираторными инфекциями [7-9,22,23]. Более поздние исследования включали врожденную иммунную систему, признавая, что она может играть важную роль в патогенезе астмы, влияя на восприимчивость хозяина к инфекциям и иммунный ответ на патогены.

Мы продемонстрировали повышенную экспрессию SP-D в дыхательных путях астматиков по сравнению с неастматиками в участках легочной ткани и культурами ALI, моделью эпителиальной дифференциации. Повышенная экспрессия SP-D может возникнуть из-за нескольких возможностей: от структурных различий, таких как пролиферация клеточного подтипа в эпителии, до функциональных различий, таких как чрезмерное продуцирование или отсутствие ингибирования, влияющих на экспрессию гена SP-D. Ранее Cheng et al. показали повышенную концентрацию SP-D в бронхиальном альвеолярном лаваже (БАЛ) астматических пациентов по сравнению с неастматическими средствами контроля; в то время как была обнаружена более высокая средняя концентрация, разница была незначительной [24]. Koopmans et al. наблюдалось увеличение SP-D сыворотки у пациентов с аллергией как на исходном уровне, так и после заражения аллергеном [25]. Мышечные модели хронических воспалительных состояний с поражением легких, вызванным P. Carinii, обнаружили в 7,4 раза и 71 раз увеличение SP-D в БАЛ и сыворотке соответственно [26]. Моринные модели острого аллергического воспаления легких продемонстрировали несоответствие уровней SP-D у БАЛ у мышей C57BL / 6 по сравнению с мышами BALB / c, что свидетельствует о генетическом компоненте исходного продуцирования SP-D в легких [12].

Было обнаружено, что мыши с дефицитом гена SP-D проявляют гиперэозинофилию и повышенные уровни IL-5 и IL-13 при аллергическом вызове Aspergillus fumigatus, ответ, который был обратимым при лечении мышей с помощью SP-D [27]. Поскольку SP-D участвует в защите хозяина и модулирует воспаление, увеличение уровней SP-D может быть полезным, если оно играет защитную или даже компенсаторную роль в астме и других хронических воспалительных состояниях. Хотя более высокие уровни SP-D в дыхательных путях астматиков кажутся противоречивыми в контексте повышенной восприимчивости к вирусной инфекции при астме, это говорит о том, что основные различия в функции SP-D могут существовать у людей между астматиками и неастматиками. В исследовании Wang et al. очищенные SP-A и SP-D подавляли пролиферацию лимфоцитов, стимулированных pteronyssinus Dermatophagonides у наивных мышей, но этот супрессивный эффект был снижен у сенсибилизированных мышей [28]. Хотя исследование проводилось в мышиной модели, это говорит о том, что могут быть дисрегулированные процессы в иммуномодулирующих ролях SP-D у сенсибилизированных пациентов, таких как астма. Что касается функции SP-D, Kishore et al. предложили, чтобы SP-A и SP-D в наивных легких могли помочь смягчить потенциальный ущерб от низкого уровня экзогенных оскорблений; однако, когда они ошеломлены высокими уровнями оскорблений, эти сборники предполагают провоспалительную роль, чтобы дополнить врожденный и адаптивный иммунитет [29].

Иммуногистохимия культур ALI продемонстрировала снижение уровней экспрессии SP-D, поскольку они дифференцировались в течение трех недель. Визуальный осмотр привел к наблюдению SP-D в столбчатых клетках и базальных клетках. Используя MUC5AC в качестве маркера для присутствия муцинов-продуцирующих бокаловидных клеток, в бокаловидных клетках наблюдалось незначительное окрашивание SP-D. Ранее Madsen et al. локализовали SP-D в легких человека в клетки альвеолярного типа II, клетки Клары и на альвеолярных макрофагах или внутри них / 30 /. Ким и др. обнаруженные белки поверхностно-активных веществ, экспрессируемые в ресничных клетках носового эпителия, но не в бокаловидных клетках слизистой оболочки носа человека [31]. Здесь мы приводим новые данные о характеристике SP-D в эпителии дыхательных путей ведения бронха. Наши наблюдения согласуются с предыдущими исследованиями в отношении отсутствия SP-D в бокаловидных клетках. Различия в выражении SP-D в определенных типах клеток могут возникать из разных областей изучаемого дыхательного тракта.

В участках дыхательных путей человека более интенсивное окрашивание SP-D в базальных клетках по сравнению с остальной частью эпителия предполагает, что базальные клетки либо продуцировали больше, либо сохраняли больше SP-D в пределах их цитоплазмы. Это согласуется с наблюдением снижения уровней SP-D в дифференцирующих культурах ALI, где плюрипотентная базальная клетка, визуализированная с помощью CK-5 в качестве маркера, становится значительно менее обильной в течение 21 дня культуры. В свете этих наблюдений увеличение SP-D-экспрессии в дыхательных путях астматиков может быть связано с большей долей недифференцированных клеток. Увеличение количества бокаловидных клеток при астме, что теоретически приводит к более низкому выражению SP-D, может играть относительно небольшую роль по сравнению с недифференцированными клетками.

Обработка IL-13 неастматических эпителиальных клеток дыхательных путей человека, выращенных как в монослое, так и в культуре ALI, приводила к уменьшению экспрессии SP-D. Предыдущие исследования, проведенные в нашей лаборатории, продемонстрировали, что лечение эпителиальных клеток первичных дыхательных путей IL-13 уменьшает спонтанный апоптоз в культуре [32], поэтому апоптозное снижение SP-D маловероятно. Исследования на сегодняшний день не пришли к консенсусу относительно того, как IL-13 модулирует экспрессию SP-D в легких. Haczku et al. обнаружены уровни мРНК и уровня белка SP-D в легких у мышей в ответ на лечение ИЛ-4 и ИЛ-13 [33]. Ито и Мейсон обнаружили, что уровень IL-13 снижал уровень мРНК и белка SP-D в культивируемых клетках человека альвеолярного типа II [34]. Мы продемонстрировали, что IL-4 и IL-6 (дополнительный файл 1; дополнительный файл 2: рисунок S1), в дополнение к IL-13, все уменьшают выражение SP-D неахматическим человеческим AEC. Это расхождение в реакции SP-D на IL-4 и IL-13 может быть связано с различиями в видах; например, неспецифический сайт связывания STAT присутствует в промоторе SP-D крыс и мышей, но не у человека [35]. В отличие от влияния IL-13 на неастматическую АЕК, в выражении SP-D не обнаружено существенной разницы между обработанной ИЛ-13 и необработанной астматической АЕК. Это указывает на то, что астматическая АЕК имеет измененный ответ на IL-13 в отношении выражения SP-D. Это, в свою очередь, может способствовать увеличению SP-D, наблюдаемому в эпителии дыхательных путей астматиков, несмотря на повышенные уровни IL-13 в астматических дыхательных путях, как установлено несколькими группами [18,36-38].

Потенциальные пути регуляции IL-13 SP-D изучались с использованием однослойных культур человеческого AEC. Было показано, что монослойные культуры имеют те же рецепторы IL-13, что и культуры ALI [39]. Нейтрализующие антитела для IL-13Rα1 и IL-13Rα2 использовали для блокирования двух рецепторов IL-13. Данные как мРНК, так и белка демонстрируют, что IL-13 уменьшает экспрессию SP-D и предполагает, что такое снижение опосредовано по пути IL-13Rα1 в отличие от IL-13Rα2. Мы также продемонстрировали увеличение фосфорилированного STAT6, транскрипционного фактора ниже IL-13Rα1, который координируетс с уменьшением экспрессии SP-D. Анализ белков фосфатирования STAT6 подтвердил, что обработка IL-13 активировала транскрипционный фактор STAT6 и что эта активация была в значительной степени блокирована предварительной инкубацией с нейтрализующим IL-13Rα1 антителом.

Исследования в монослойных культурах, выращенных у неастматических доноров с воздействием IL-4, также продемонстрировали снижение SP-D и фосфорилирование STAT6. Это подтверждает роль гетеродимерного рецептора, состоящего из IL4Rα и IL-13Rα1, при модулировании уровней SP-D (дополнительный файл 1, дополнительный файл 2: рисунок S1). Лечение монослойных культур с помощью ИЛ-6 также приводило к снижению SP-D (дополнительный файл 2: рисунок S1). Хотя IL-6 сигнализирует через STAT3 [40], все же возможно, что пути, через которые SP-D уменьшается в ответ на IL-13, IL-4 и IL-6, имеют общие компоненты.

Изучение активации STAT6 на обработанных IL-13 культурах ALI, выращенных из неастматиков, продемонстрировало резкое первоначальное увеличение экспрессии фосфорилированного STAT6 через 24 часа после лечения, а затем постепенное снижение в течение двух недель. Длительное снижение уровня SP-D за тот же период свидетельствует о том, что влияние IL-13 на экспрессию SP-D в неастматической AEC является хроническим и устойчивым.

Диффузия эпителия дыхательных путей и сигнализация IL-13 участвуют в структурных и функциональных изменениях, связанных с астмой. Hackett et al. продемонстрировали, что у пациентов с астмой имеется менее дифференцированный эпителий дыхательных путей [3]. Это может быть следствием постоянных повреждений эпителия и приводит к изменению пропорции типов клеток, а также их профилей экспрессии белка. Было показано, что IL-13 опосредует особенности астмы, не зависящие от других цитокинов на животных моделях [13,16,17]. Хотя IL-13 тесно связан с аллергической астмой и адаптивным иммунитетом, также важно знать, как это может влиять на молекулы и пути врожденного иммунитета при астме.

Мы продемонстрировали, что эпителий астматиков в анамнезе выражает больше SP-D, тогда как неастматические дифференцированные культуры ALI снижаются в выражении SP-D параллельно с уменьшением базальных клеток (через маркер CK-5) и увеличивая количество бокаловидных клеток (через маркер MUC5AC). Лечение IL-13, которое, как известно, индуцирует гиперплазию клеток кубиков, снижает экспрессию SP-D в неастматических эпителиальных культурах дыхательных путей через IL-13Rα1, но не влияет на экспрессию SP-D в астматических эпителиальных культурах дыхательных путей. Это говорит о том, что в дыхательных путях астматиков увеличение производства SP-D в основном обеспечивается менее дифференцированным фенотипом, в то время как увеличенное количество бокаловидных клеток незначительно влияет на выражение SP-D. Кроме того, IL-13-регуляция экспрессии SP-D в астматических дыхательных путях отличалась от неастматических дыхательных путей, что вносит вклад в наблюдаемое несоответствие в выражении SP-D. Астматические пациенты более восприимчивы к вирусным инфекциям, несмотря на то, что их повышенная экспрессия SP-D заставляет сомневаться в том, что молекулы SP-D, вырабатываемые у этих пациентов, менее эффективны в своих оборонительных родах.

Ограничения этого исследования включают отсутствие функциональных данных по SP-D. В то время как уровни экспрессии SP-D изучались здесь, его способность связывать патогены и модулировать иммунный ответ в дыхательных путях не может сравниться между людьми с астмой и без нее. Другое ограничение связано с разрешением иммуногистохимии и невозможностью четко выделить дифференцированные и недифференцированные клетки эпителия дыхательных путей. Визуальный осмотр может предложить только качественные наблюдения за локализацией SP-D. Трудно сравнить вклад SP-D-экспрессии в каждом клеточном типе дыхательных путей или в модель, демонстрирующую псевдослоированный эпителий дыхательных путей.

Передача сигналов IL-13 изучалась в неастматической АЕК на уровне рецептора, и любые ссылки, прямые или косвенные, между этим и экспрессией гена SP-D, еще не найдены. Будущие исследования SP-D могут добавить глубину к молекулярным механизмам как в астматических, так и в неастматических дыхательных путях. Они могут дать представление о роли SP-D в астме и источниках, из-за которых может возникнуть дисрегуляция или дисфункция в отношении врожденного иммунитета.

В целом, это исследование продемонстрировало разницу в выражении SP-D в дыхательных путях астматиков по сравнению с неастматиками. Это может иметь последствия для повышения восприимчивости к инфекциям и изменения воспалительной реакции у пациентов с астмой. Могут быть несколько факторов, способствующих увеличению уровней SP-D, наблюдаемых в эпителии дыхательных путей астматиков, и для выяснения лежащих в его основе механизмов необходимы дальнейшие исследования. Повышенная регуляция экспрессии SP-D при астме может быть в ответ на хроническую воспалительную среду дыхательных путей. Возможно также, что молекулы SP-D, продуцируемые астматиками, не обладают полной функциональностью, поэтому не могут опосредовать воспаление или явные патогены, и поэтому производство продолжается по мере воспаления или инфекции. Другим потенциальным фактором может быть клеточный тип и различия дифференциации между эпителием дыхательных путей астматиков и неастматиков. Наконец, измененные регуляторные пути, через которые влияет экспрессия SP-D, например IL-13, в астматическом эпителии дыхательных путей могут приводить к различиям в ремоделировании дыхательных путей.

Дополнительный файл 1:
              
                
Это включает данные, полученные на монослойных культурах, выращенных из неастматических доноров, обработанных IL-4, IL-6 или IL-13.

Графическое представление уровней SP-D в монослойных культурах, выращенных из неастматических доноров, обработанных либо IL-4, либо IL-6 или IL-13.

Конкурирующие интересы

Мы хотели бы заявить, что нет никаких конкурирующих интересов личного или финансового типа с любым лицом или организацией в отношении работы, проделанной для этой рукописи.

Вклад авторов

DRD задумал идею этого проекта. JX, GKS и DRD участвовали в экспериментальном проектировании, координации и выполнении экспериментов и подготовке рукописи. JX и GKS участвовали в экспериментах и ​​выборке in vitro. JX способствовал сбору данных (IHC), Вестерн-блоттинга и ПЦР-исследований, анализу и интерпретации данных. JX, GKS, DRD дали окончательное разрешение на представление.

Эта работа была поддержана действующими грантами Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR, MOP-97755) (DRD) и AllerGen-National Centers of Excellence (AllerGen-NCE # 09B9) (DRD). JX является лауреатом Премии AllerGen CAIDATI (2011) и Премией программы студенческих исследований факультета медицины UBC, предоставленной CIHR Health Professional Student Research Award и Исследовательским институтом здравоохранения штата Провиденс (2011-2014). DRD получил личные награды поддержки от стипендии Паркера Б Фрэнсиса в исследованиях легочной артерии, Фонда Майкла Смита для исследований в области здравоохранения (старший научный сотрудник) и Канадского института исследований в области здравоохранения. Авторы благодарны С. Ясемине Ян за интеллектуальный вклад и критическое чтение рукописи.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *