Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

miR-21 абляция и обетихолевая кислота улучшают безалкогольный стеатогепатит у мышей

miR-21 ablation and obeticholic acid ameliorate nonalcoholic steatohepatitis in mice
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477590/

Эти авторы разделяют старшее авторство.

Недавно были предложены микроРНК для внесения вклада в патогенез неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), болезни, не имеющей специфических фармакологических методов лечения. В связи с этим, ядерные рецепторы возникают как ключевые молекулярные мишени для лечения неалкогольного стеатогепатита (NASH). Здесь мы показываем, что в типичной модели повреждения печени, связанного с NASH, аблация микроРНК-21 (miR-21) приводит к постепенному снижению стеатоза, воспаления и липоапоптоза с нарушением фиброза. В диете NASH, дополняющей фаст-фуд (FF), имитирующие особенности метаболического синдрома, уровни miR-21 увеличиваются как в печени, так и в мышцах, одновременно с уменьшением экспрессии рецептора активированного пролифератором пероксисом (PPARα), ключевого miR-21 цель. Поразительно, нокаут-мышам miR-21, кормящим диету FF, дополненную агонистом фарнезоидного X-рецептора (FXR), обетихолевая кислота (OCA), проявляет минимальный стеатоз, воспаление, окислительный стресс и накопление холестерина. Кроме того, был восстановлен обмен липопротеинов, включая снижение поглощения жирных кислот и полиненасыщение, а также повышенную чувствительность к печеночному и мышечному инсулину. Наконец, ось miR-21 / PPARα была обнаружена амплифицированной в биопсии печени и мышц, а в сыворотке пациентов с НАФЛ, подтверждая свою роль в развитии метаболического синдрома. Открыв, что аннулирование miR-21, вместе с активацией FXR OCA, значительно улучшает метаболические параметры всего тела в NASH, наши результаты показывают терапевтический потенциал многоцелевых терапий ядерных рецепторов для NAFLD.

Безалкогольная жирная болезнь печени (NAFLD) представляет собой патологическое состояние, обусловленное высоким уровнем циркулирующих свободных жирных кислот (FFA), что приводит к осаждению липидов в гепатоцитах, тем самым вызывая стеатоз. После этого стеатоз может прогрессировать до безалкогольного стеатогепатита (NASH), фиброза, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы, что в конечном итоге приводит к печеночной недостаточности. NAFLD сильно ассоциируется с ожирением и метаболическим синдромом, особенно с диабетом и резистентностью к инсулину всего организма.1,2 Тем не менее, патогенез и прогрессирование NAFLD не совсем понятны, что препятствует развитию столь необходимых эффективных методов лечения.

микроРНК (miRNAs или miRs) действуют как мощные посттранскрипционные регуляторы экспрессии генов.3, 4 miR-21 значительно увеличивается в печени пациентов NASH5 и на животных моделях NASH.6, 7, 8, 9 В гепатоцитах miR -21 индуцируется ненасыщенными жирными кислотами в зависимости от mTOR / NF-κB [10]. Недавно было продемонстрировано, что miR-21 печени играет активную роль в патогенезе NASH посредством ингибирования рецептора активированного пролифератором рецептора пероксисом (PPARα) .6 Тем не менее, неизвестна ли miR-21 особенности метаболического синдрома, особенно липидный обмен и резистентность к инсулину в мышечных и жировых тканях. Интересно отметить, что PPARα не только контролирует катаболизм липидов и гомеостаз, способствуя окислению жирных кислот в печени, но также стимулирует захват глюкозы в мышцах. Таким образом, регулирование PPARα miR-21 в мышцах пациентов NAFLD может быть релевантным событием способствуя развитию и прогрессированию болезни.

Фарнезоидный X-рецептор (FXR) — это еще один ядерный рецептор, имеющий ключевую роль в патогенезе NAFLD и NASH. FXR индуцирует PPARα, тем самым способствуя β-окислению жирных кислот, 12, 13 и обладает противовоспалительными свойствами, главным образом, путем антагонистической передачи сигналов NF-κB. Следует отметить, что у мышей с дефицитом FXR развиваются стеатоз и гипертриглицеридемия.15, 16 Obeticholic acid (OCA ) является мощным агонистом FXR, который в настоящее время одобрен для лечения первичного желчного холангита (PBC) и в фазе 3 клинических испытаний для лечения NASH. Промежуточные результаты проведенного NIH клинического исследования FLINT показали, что ОСА оказывает значительное положительное влияние на вызванное NASH повреждение печени, улучшение стеатоза, воспаления и фиброза. Однако лечение ОСА было связано с большей резистентностью к печеночной инсулину и увеличением частоты и тяжесть зуда, основное неблагоприятное событие, сообщаемое пациентами. У пациентов, получавших ОСА, также наблюдалось увеличение среднего общего холестерина и ЛПНП и снижение среднего ЛВП; было начато перспективное исследование для изучения влияния комбинированной ОСА и терапии статинами на липидный обмен у пациентов с НАСГ.

В этом исследовании мы стремились оценить точный вклад miR-21 в патогенез и прогрессию NASH и оценить терапевтический потенциал одновременной активации PPARα в результате абляции miR-21 и FXR путем введения OCA.

Недавние данные показали, что miR-21 увеличивается в печени пациентов NASH и что его ингибирование у мышей предотвращает развитие NASH.6. Чтобы выяснить роль miR-21 в инициировании и прогрессировании NAFLD, дикого типа (WT) и miR- 21 нокаут (KO) вводили либо контрольную, либо метионин-и холин-дефицитную (MCD) диету в течение 2 и 8 недель. miR-21 уровни печени были значительно увеличены у мышей WT после 2 и 8 недель кормления MCD (P <0,05) (рис. 1а слева), оставаясь неопределяемым у мышей miR-21 KO. Напротив, уровни белка PPARα, прямая цель miR-21, способствующая повреждению клеток, воспалению и фиброзу, 6 постепенно снижались у мышей, питавшихся WM MCD, по сравнению с мышами с контрольным контролем (P <0,05). Кроме того, мыши MIR с диетическим питанием MIR-21 KO продемонстрировали значительное увеличение уровней белка PPARα по сравнению с мышами WT, особенно через 8 недель (P <0,05) (рис. 1а справа).

После 2 и 8 недель кормления печени печени от мышей, получавших MCD, наблюдались типичные признаки стеатогепатита. Через 2 недели мышей WT уже показали умеренный или умеренный стеатоз (P <0,001; рисунок 1b, таблица 1). Через 8 недель мышей WT наблюдали увеличение степени тяжести стеатоза, представляя умеренную и тяжелую вакуоляцию гепатоцитов (Р <0,001), накопление крупных липидных капель и выраженную гепатоцеллюлярную гипертрофию (Р <0,05). Поразительно, что мыши miR-21 KO продемонстрировали заметно уменьшенный стеатоз, причем большинство животных, представляющих только легкую и умеренную гепатоцеллюлярную вакуоляцию, с меньшими и рассеянными липидными каплями, а также устойчивое снижение гипертрофии клеток (рис. 1б, таблица 1).

У мышей, получавших WT MCD, воспаление и повреждение печени прогрессивно увеличивались с развитием NASH, как показывают уровни мРНК TNF-α и IL-1β (рис. 1c, P <0,05) и уровни ALT в сыворотке (рис. 1d, P <0,05) , Умеренное и тяжелое воспаление было дополнительно подтверждено гистологическим анализом (P <0,05) (таблица 1). Эти изменения были почти отменены у мышей miR-21 KO (P <0,01).

FFA-индуцированный апоптоз гепатоцитов является отличительной чертой NASH.18, 19, 20, 21. Процент концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP-концевой метки (TUNEL) -положительные клетки в печени MCD-питаемых мышей WT увеличился до ~ 40% после 2 и 8 недель (P <0,001) по сравнению с ~ 10% в контроле, тогда как мыши miR-21 KO отображали только ~ 20% TUNEL-положительных клеток (рис. 1e). Каспаза-2 заметно повышается у пациентов и животных моделей NASH, что способствует липоапоптозу и прогрессированию липид-индуцированного фиброза печени.22, 23 В согласии, активная каспаза-2 постепенно возрастает в ~ 2- и 3-кратном в печени 2 и 8 недель мышей WT MCD, соответственно (P <0,05), по сравнению с контрольными. Напротив, мыши miR-21 KO показали значительно более низкие уровни активной каспазы-2 (рис. 1f). Гистологический анализ также выявил наличие умеренного и тяжелого некроза в печени 8-недельных мышей с ТБО с диетическим питанием (P <0,05), тогда как у мышей miR-21 KO наблюдалось лишь небольшое увеличение (табл. 1). Кроме того, 8-недельные мыши WT с MCD подтвердили отложение коллагена вблизи синусоидов, связанное с инфильтрацией мононуклеарных клеток в паренхиме печени, что подтвердило развитие слабого или умеренного фиброза. Мыши miR-21 KO были защищены от фиброза, о чем свидетельствует снижение экспрессии мРНК коллагена-1α1 и TGF-β (по крайней мере, P <0,05, фиг. 1g, слева). Соответственно, осаждение коллагена у MCD-кормовых мышей miR-21 KO было минимальным, и почти все животные были защищены от индуцированного NASH фиброза (рис. 1g, справа, таблица 1). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что miR-21 может способствовать развитию NASH не только посредством ингибирования PPARα, в конечном счете индуцирующего клеточное воспаление и фиброз, но также путем стимулирования стеатоза печени и липоапоптоза.

Несмотря на эффективное моделирование тяжелого NASH с фиброзом, 24 диеты MCD у мышей приводят к потере веса и неспособны развивать резистентность к инсулину. Таким образом, мы использовали следующую комплементарную модель NASH, которая тесно связана с метаболическими и гистопатологическими особенностями человеческого НАСГ 25, представляя собой полезную модель для оценки эффективности предполагаемых новых методов лечения. В связи с этим OCA успешно исследовали в клинических испытаниях II фазы с пациентами NASH (исследование FLINT, NCT01265498). Учитывая плейотропный спектр действий FXR, мы предположили, что множественное нацеливание ядерных рецепторов может повысить эффективность и уменьшить потенциальные побочные эффекты этого возможного терапевтического подхода. Мышей WT и miR-21 KO получали либо стандартные (SD), либо диеты быстрого питания (FF), дополненные или без ОСА в течение 25 недель. Было показано, что подача OCA активирует FXR, что иллюстрируется увеличением уровней мРНК SHP и снижением уровней Cyp7a1 и Srebp-1c (дополнительный рисунок S1).

После 25 недель кормления животные, получавшие WT FF, получили ~ 50% от их первоначального веса (рис. 2а слева). miR-21 KO FF отображали более низкие приращения веса в течение всего времени, эффект, который был еще более выражен у животных miR-21 KO FF + OCA, с увеличением массы тела, как и у мышей WT, получавших SD. Кроме того, у животных WT FF развилась гепатомегалия, при значительном увеличении печени до общего соотношения массы тела (P <0,05 по сравнению с собаками, питающимися SD). Следует отметить, что несмотря на то, что отсутствие miR-21 или активация FXR только OCA не способствовали подавлению гепатомегалии, животные miR-21 KO FF + OCA отображали показатели массы тела и печени, сходные с мышами, получавшими SD (рис. 2а справа). Экспрессия печени miR-21 достоверно повышалась диетой FF (P <0,01), одновременно со сниженным уровнем белка PPARα (P <0,05). Хотя это и не было значительным, OCA слегка уменьшала экспрессию miR-21 и увеличивала уровни PPARα как в диетах, так и в генетическом фоне. Уровни PPARα достоверно повышались у мышей, получавших miR-21 KO FF + OCA, по сравнению с животными WT (P <0,01; рис. 2b).

У животных, получавших WF FF, развился макровезикулярный стеатоз, который показал средний показатель липидоза 3,67 (P <0,001). Несмотря на то, что аблация miR-21 или добавка OCA приводили к умеренному снижению стеатоза, двойная активация PPARα и FXR приводила к значительному снижению накопления липидов, диффузному микровезикулярному стеатозу и показателю липидоза 2,33 (P <0,05; рисунки 2c и d top ). Кроме того, содержание холестерина в печени у животных, получавших WT FF, увеличилось на ~ 50% по сравнению с контрольными животными (P <0,05), тогда как мыши, получавшие miR-21 KO FF + OCA, продемонстрировали устойчивое снижение накопления холестерина в печени ( Рисунок 2d внизу). Гистологический анализ дополнительно выявил увеличение провоспалительных инфильтратов в печени мышей, получавших WT FF, и сопутствующее увеличение уровней мРНК провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β, IL-6 и TLR4 (по крайней мере, P < 0,05). Хотя аннулирование miR-21 или введение OCA приводило к уменьшению экспрессии этих воспалительных маркеров, этот эффект еще больше усиливался у животных, которым кормили miR-21 KO FF + OCA, причем выражение цитокинов возвращалось к почти контрольным уровням (P <0,05, фиг. 2e).

Параллельно с PPARα мы затем оценивали выражение некоторых из его основных метаболических транскрипционных целей. уровни мРНК Cyp4a14 и генов, вовлеченных в перенос жирных кислот и β-окисление, были значительно снижены у мышей WT, которым была поставлена ​​диета FF (P <0,05), тогда как двойная активация PPARα и FXR приводила к полному возврату к контрольным уровням (P <0,05; фиг. 3а). Для беспристрастного анализа липидных и метаболических профилей мы дополнительно оценивали экспрессию 44 мышиных липид-регулируемых генов с использованием массива TaqMan (таблица 2). У мышей, питающихся WT FF, уровни мРНК генов, кодирующих белки, вовлеченные в холестерин (ABCA1 и ABCG1) и перенос жирных кислот (FABP4, FABP5 и SLC16A6), были сильно индуцированы между 1,3 и 10,6 раза. Напротив, синтез холестерина, который был обнаружен уровнями экспрессии HmgCoA-синтазы и STARD4, был подавлен в 0,5- и 0,8 раза у мышей, обработанных WT FF, соответственно, возможно, отражая отрицательную обратную связь с увеличением поглощения холестерина в печени. Кроме того, биосинтез ненасыщенных жирных кислот был сильно индуцирован диетой FF, о чем свидетельствуют повышенные уровни экспрессии Alox5 (в 20 раз), Alox5ap (5,2 раза), Alox12 (9,2 раза) и FADS3 (в 2,2 раза) наряду с увеличением липазы LPL (7,2 раза) и PLA2 (8,9 раза). Митохондриальное β-окисление было серьезно скомпрометировано у мышей, получавших FF Ft, так как уровни экспрессии ферментов ACAT1, VLCAD и HADHB были значительно снижены. Кроме того, провоспалительные цитокины TNF-α, COX-2, IL-1β и IL-6 были сильно индуцированы (соответственно 6,5, 5,6 и 12,6 раза). Во всех этих настройках, как отсутствие miR-21, так и активация FXR OCA противодействовали эффектам диеты FF. Следует отметить, что почти полная реверсия этих изменений наблюдалась только у мышей miR-21 KO FF + OCA. Результаты массива были подтверждены / подтверждены с помощью независимой RT-PCR в реальном времени отборных генов (дополнительный рисунок S2).

Чрезмерное накопление жирных кислот в гепатоцитах и ​​высокие уровни экспрессии TNF-α приводят к увеличению продуцирования ROS, что приводит к токсичности гепатоцитов, воспалению и фиброзу.26, 27 Действительно, мыши, полученные с помощью WT FF, продемонстрировали поразительное увеличение экспрессии UCP2, митохондриальный расцепляющий белок, который контролирует ROS, получаемый митохондриальным путем, тогда как мыши, получавшие miR-21 KO FF + OCA, продемонстрировали снижение уровня (табл. 2). Одновременно производство ROS увеличилось на ~ 50% у животных, кормящих WT FF (P <0,05), но было полностью отменено у животных miR-21 KO (P <0,05). OCA только немного увеличила производство ROS; однако уровни ROS поддерживались на базальных уровнях у мышей miR-21 KO FF + OCA (рисунок 3b сверху). В ответ на увеличение окислительного стресса у мышей, получавших FF Ft, уровни мРНК печени индуцируемого фермента гема-оксигеназы-1 (HO-1) увеличились почти в два раза (P <0,05 против мышей, получавших SD), тогда как его экспрессия в miR-21 Мышам с KO FF + OCA было похоже на контроль WT (P <0,01 по сравнению с FF-кормящими мышами, рис. 3b).

Печеночная резистентность к инсулину является общей чертой NAFLD, даже у пациентов с непереносимостью28. По существу, мы оценивали уровни белка медиаторов передачи сигналов инсулина в печени у мышей, которым была предложена модель FF. JNK-фосфорилирование было значительно увеличено в ~ 2 раза у мышей WT, оспоренных с диетой FF (P <0,05), тогда как двойная активация FXR и PPARα противодействовала фосфорилированию JNK (рисунок 4a). Любопытно, что общий JNK также был увеличен за счет обезболивающей диеты, что, вероятно, связано с устойчивым увеличением уровней липидов и холестерина, снижением у мышей, получавших OCA-кормили или miR-21 KO-FF. Инсулиновые рецепторы (INSR) и фосфорилирование субстрата 1 рецептора инсулина (IRS-1) были снижены на 70% и 50% соответственно у мышей, получавших WT FF. Дополнение диет с ОСА увеличивало передачу инсулина как в контрольных, так и в обезболивающих диетах, тогда как мыши, получавшие miR-21 KO FF + OCA, отображали полностью восстановленную чувствительность к инсулину в печени (рисунок 4b). В соответствии с INSR и IRS-1, фосфорилирование AKT было значительно снижено (P <0,05) у мышей, питавшихся WT FF, со-обосновывая резистентность к инсулину. Следует отметить, что эти эффекты были полностью аннулированы у мышей miR-21 KO FF + OCA (рисунок 4c), что еще раз подтверждает восстановление чувствительности к инсулину.

Мы ранее показали, что у пациентов с тяжелым ожирением с НАСГ резистентность к инсулину более выражена в мышечной ткани по сравнению с печенью и сильно коррелирует с тяжести заболевания. В свою очередь, резистентность к жировой ткани является очень низкой.23 Интересно, что уровни экспрессии miR-21 как в висцеральной, так и подкожной жировой ткани не модулировались диетой FF (дополнительный рисунок S3). Однако miR-21 увеличился почти в 2 раза в мышце мышей, получавших WT FF (P <0,05), возвращаясь к контрольным уровням у мышей, получавших WT FF + OCA (рис. 5а, слева). Уровни белка PPARα показали обратную картину (рис. 5а, справа). Кроме того, уровни тирозин-фосфорилирования INSR-, Akt- и IRS-1 уменьшались в мышцах мышей, получавших WT FF (P <0,05), тогда как передача сигналов инсулина частично восстанавливалась у мышей, которым вводили miR-21 KO FF + OCA Фиг.5b и c). В целом, двойная активация PPARα и FXR, по-видимому, полностью предотвращает индуцированную FF резистентность к инсулину не только в печени, но и в скелетных мышцах, что еще больше подчеркивает потенциал этого перспективного терапевтического подхода.

Подтверждая результаты, полученные на животных моделях NASH, экспрессия miR-21 в печени пациентов с NAFLD значительно увеличилась от стеатоза до NASH (P <0,01, рис. 6a) с сопутствующим снижением экспрессии PPARα (P <0,01; 6b). miR-21 аналогично модулировался в мышцах, что значительно увеличивалось у пациентов с NASH по сравнению с пациентами с простым стеатозом (P <0,05; фиг. 6c). Наконец, мы также оценили потенциал miR-21 в качестве биомаркера в сыворотке. Мы обнаружили, что уровни miR-21 значительно увеличились от стеатоза до NASH в ~ 3 раза (Р <0,05, рис. 6d), обосновывая значимость этой miRNA в патогенезе NAFLD.

Наряду с другими, мы показали, что miRNAs дерегулируются на животных моделях стеатогепатита и человеческого NASH, тем самым способствуя патогенезу болезни.6, 21, 29, 30, 31 Используя дополнительные животные модели NASH, наше настоящее исследование показывает, что miR-21 абляция значительно снижает стеатоз печени, воспаление и фиброз. Впервые мы продемонстрировали, что гепатоцитарный липоапоптоз, резистентность к инсулину и общий метаболизм липидов и холестерина сильно улучшены у животных miR-21 KO. Эти эффекты в значительной степени могут быть отнесены к PPARα6, хотя возможны прямые и косвенные цели miR-21. Важно отметить, что мы также показали, что путем объединения miR-21-абляции с активацией FXR с помощью OCA развитие NASH полностью ингибируется, с нормализацией нескольких особенностей метаболического синдрома. Мы также продемонстрируем, что miR-21 увеличивается не только в печени, но и в скелетных мышцах мышиного и человеческого NASH, что еще больше подтверждает его участие в патогенезе болезни.

Наши результаты показали, что стеатоз и воспаление постепенно возрастают со временем после кормления MCD, параллельно с постепенным снижением PPARα. Неожиданно miR-21 не увеличивался с 2 до 8 недель питания MCD, обратно пропорционально постепенному снижению PPARα. Таким образом, PPARα не может регулироваться исключительно miR-21 во время прогрессирования заболевания. Например, miR-10b и miR-34a, как было показано, регулируют клеточный стеатоз путем нацеливания на PPARα.32, 33 Тем не менее, удаление miR-21 уменьшает печеночный стеатоз, повреждение клеток печени, воспаление и фиброгенез, особенно в течение 8 недель кормления, что предполагает что miR-21 играет важную роль в прогрессии NAFLD, а не в запуске болезни.

Активный каспаза-2 был обнаружен как в мышином, так и в человеческом НАСГ и имеет важное значение для индукции липоапоптоза 34, тогда как его ингибирование предотвращает стеатоз и фиброз.22 Наши результаты показывают, что впервые антагонизм miR-21 предотвращает каспазу-2 активация и значительно ухудшает липоапоптоз. Недавно мы показали, что окислительный стресс, вызванный дезоксихолевой кислотой, в гепатоцитах приводит к активации каспазы-2 и ингибированию NF-κB / miR-21 с помощью PIDD-зависимого способа.35 Тем не менее, основной эффект удаления miR-21 в предотвращении каспазы -2, апоптоз и фиброз могут быть результатом заметного снижения накопления липидов. Кроме того, гистологический анализ также выявил заметное снижение некротических участков печени в отсутствие miR-21. Учитывая, что недавно сообщалось, что miR-21 индуцирует регулируемый некроз у мышей36, и поскольку мы показали, что некроптоз ассоциируется с развитием NASH и фиброзом, 18 miR-21 может дополнительно способствовать фиброгенезу путем активации некроптоза.

Одновременная активация различных метаболических путей может оказаться ценной стратегией лечения NASH. Например, аблация PLA2 или фармакологическое ингибирование уменьшают индуцированное жиром повреждение печени и фиброз 37, 38, и мы показываем, что FF-индуцированные липазы PLA2 и LPL возвращаются к контрольным уровням при активации обоих ядерных рецепторов. Фишез, связанный с NASH, также является результатом активации клеток Kupfer и звездчатых клеток, после накопления холестерина, 39 и мыши miR-21 KO FF + OCA продемонстрировали полную реверсию содержания холестерина в печени, а также ингибирование экспрессии семейства генов Alox. Фактически, полиненатурация липидов и путь Alox5 ассоциируются с ожирением, резистентностью к инсулину и NAFLD.40 В целом мы показали, что одновременная активация PPARα и FXR эффективно модулирует метаболизм липидов в печени, что приводит к сильному снижению стеатоза и накоплению холестерина за счет снижения содержания жирных кислот поглощение в печени, ухудшение метаболических путей, связанных с полиненасыщением жирных кислот, и восстановление β-окисления до базальных уровней. Важно отметить, что это также коррелирует с уменьшением массы тела и профилактикой ожирения и гепатомегалии, что гораздо более заметно у мышей, которым кормят OCA.

При ожирении жирные кислоты накапливаются в печени и скелетных мышцах, насыщая их окислительную способность, 41, 42 и усугубляя резистентность к инсулину. В согласии, мы показываем, что при обезболивающей диете ось miR-21 / PPARα нарушается не только в печени, но и в скелетных мышцах, что, вероятно, связано с накоплением внутриклеточного липида. Следует отметить, что резистентность к инсулину полностью предотвращалась только у мышей miR-21 KO FF + OCA. Кроме того, FF-индуцированный окислительный стресс, митохондриальная дисфункция и экспрессия HO-1 полностью были аннулированы у мышей miR-21 KO FF + OCA, возможно, в качестве ответа на восстановленный метаболизм липидов. Альтернативно, PPARα может играть роль в регулировании чувствительности к инсулину; недавно было показано, что ингибирование miR-34a улучшает NASH путем нацеливания на путь PPARα / AMPK, регулируя, таким образом, сигнализацию и стеатоз инсулина.33 В целом восстановление митохондриальной функции играет ключевую роль в противодействии метаболической перегрузке и восстановлении передачи сигналов инсулина. Поддерживая это понятие, ингибирование miR-21 улучшает альпортовую нефропатию, стимулируя метаболизм и поддерживая функцию митохондрий 43, тогда как FXR, как было показано, также регулирует митохондриальную функцию и оказывает антиоксидантное действие.44

Наконец, мы показали, что miR-21 увеличивается как в печени, так и в мышцах пациентов с болезненным ожирением НАСГ, одновременно со сниженным уровнем PPARα. Следует отметить, что предыдущие исследования из нашей группы показали, что уровни холестерина и триглицеридов в сыворотке увеличиваются у пациентов с NASH по сравнению с простым стеатозом.23 Поэтому может быть установлена ​​возможная обратная корреляция между этими определениями сыворотки и уровнями PPARα в печени. Кроме того, уровни miR-21 в сыворотке значительно увеличились с тяжести заболевания, подчеркнув его потенциал как неинвазивного биомаркера NASH.29

В настоящее время оценивается несколько терапевтических подходов к NASH, включая агонисты PPARα и FXR.45 Результаты исследования FLINT подсказали OCA как перспективный терапевтический агент в NASH17, а Mudaliar et al.46 зафиксировали его эффективность и безопасность при лечении пациентов с NAFLD и диабет. Тем не менее, лечение ОСА связано с большей резистентностью к печеночной инсулине; увеличение среднего общего холестерина и ЛПНП; и снижение среднего HDL.17 Elafibranor, двойной агонист PPARα / δ, также изучается на животных моделях NASH и, как было показано, улучшает стеатоз, воспаление и фиброз.47 Тем не менее этот агонист в основном действует на печень, мало или вообще не влияет на мышцы 47 и вызывает несколько побочных эффектов.45 Продолжающееся исследование фазы 3 будет важно для определения точных эффектов элафибранора.45 Наконец, резистентность к инсулину гораздо более выражена в мышцах пациентов НАСГ, а не в печени или жировых тканях 23 и сильно способствует патогенезу болезни. Поэтому терапия, нацеленная на различные метаболические органы, пораженные НАФЛ, особенно печень и мышцы, может стать важной вехой в поиске лечения НАСГ. Учитывая современное состояние анти-miR-122 для лечения гепатита С 48 и, несмотря на необходимость выявления любых нежелательных эффектов антагонистической экспрессии miR-21 хроническим образом, применение антагоми R-21 в сочетании с ОСА для лечения НАСГ — интересная терапевтическая стратегия, которая заслуживает дальнейшего изучения.

WT и miR-21 KO 5-месячные самки мышей C57BL / 6N получали либо контрольную диету (n = 5), либо диету MCD (n = 18) (TestDiet, Сент-Луис, Миссури, США) для 2 и 8 недель. Параллельно с 10-недельными мышами C57BL / 6N WT и miR-21 KO в течение 25 недель вводили SD (n = 12) или диету FF25 (n = 12). Шесть животных из каждой группы имели диету, дополненную OCA 10 мг / кг / день (предоставленный Intercept Pharmaceuticals, Inc., Нью-Йорк, Нью-Йорк, США), и как мужчины, так и женщины были включены во все группы. Протоколы животных, гистопатология и анализ сыворотки выполнялись, как описано в дополнительных материалах и методах. Все животные получали гуманную помощь в соответствии с критериями, изложенными в «Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных», подготовленном Национальной академией наук и опубликованном Национальными институтами здравоохранения (публикация NIH 86-23, пересмотренная в 1985 году).

Выделение РНК и анализ qPCR, а также полная экстракция белка и иммуноблоттинг выполнялись, как описано в дополнительных материалах и методах.

Анализ TUNEL проводили в 4 мкМ секциях печени для определения и количественного определения апоптоза с использованием набора ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) в соответствии с инструкциями производителя (дополнительные материалы и методы).

Экспрессия PPARα оценивалась с помощью иммуногистохимии в секциях печени, вложенных в парафин, у пациентов с ожирением с NAFLD, как описано в дополнительных материалах и методах.

2′-7′-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (H2DCFDA, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) использовали в качестве проницаемой для клеток нефлюоресцентной молекулы, которая окисляется ROS с образованием дихлорфлуоресцеина, флуоресцентного соединения, как описанных в дополнительных материалах и методах.

Содержание холестерина в печени измеряли с использованием набора для оценки количественного определения холестерина / холестеринового эфира (ab65359, Abcam plc, Cambridge, UK), следуя инструкциям производителя. Флуоресцентное излучение измеряли с использованием системы GloMax-Multi + Detection (Promega Corp., Мэдисон, штат Висконсин, США).

Для оценки экспрессии генов, регулируемых липидом мыши (№ 4415461, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), был проведен массив qPCR Taqman, содержащий 44 гена, участвующих в метаболизме стеролов и жирных кислот, как описано в дополнительных материалах и методах.

Было обнаружено, что образцы печени NASH (n = 28) и мышцы (n = 28) были получены у пациентов с болезненным ожирением, которые подвергаются бариатрической хирургии, как описано ранее.23 Никаких статистических различий по возрасту и полу между группами пациентов не наблюдалось. Биопсия печени и мышц была обработана для полной изоляции белка и РНК. Секреты ткани печени, вложенные в парафин, у пациентов с NAFLD окрашивались, как описано в дополнительных материалах и методах, и слепо оценивались опытным патологоанатом. Информированное письменное согласие было получено от всех пациентов, и протокол исследования соответствовал Этическим руководящим принципам Хельсинкской декларации 1975 года, которые были отражены в априорном одобрении Комитета по этике в больнице Санта-Мария (Лиссабон, Португалия).

Общая РНК была выделена из 100 мкл сыворотки из пациентов с NAFLD (n = 24) с использованием комплекта изоляции изоляции miRCURY (Exiqon, Woburn, MA, США), следуя инструкциям производителя и обработанных для количественной оценки miRNA, как описано в дополнительных материалах и методах ,

Относительная интенсивность белковых полос анализировалась с использованием программы Densitometric analysis ImageLab Version 5.1 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Статистический анализ был выполнен с использованием GraphPad Prism версии 5.0 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Тест одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) использовался для сравнений при анализе более двух групп и t-теста Стьюдента при анализе двух групп. ANOVA проводили с использованием постходового теста Bonferroni. Значения P <0,05 считались значимыми.

Мы благодарим Intercept Pharmaceuticals, Inc., в частности д-р Luciano Adorini, за предоставление OCA и всех научных материалов. Мы также благодарим профессора Эрика Олсона, UTSouthwestern Medical Center, Department of Molecular Biology, для мышей miR-21 loxP / loxP; Д-р Мария Элиза Алвес, Лаборатория клинического анализа, Фармацевтический факультет Лиссабонского университета, для анализа сыворотки; Мария Мануэла Гашпар, доктор философии и Марта Каридаде, кандидат фармацевтического факультета Лиссабонского университета, за всю помощь в экспериментах на животных; и Tânia Carvalho, лаборатория гистологии и сравнительной патологии, Instituto de Medicina Molecular, для всего гистологического анализа и патологии. Наконец, мы благодарим всех членов лаборатории за проницательные дискуссии. Данное исследование было поддержано Фондом по связям с общественностью (FCT) через грант PTDC / BIM-MEC / 0873/2012 (RC) и стипендии SFRH / BD / 88212/2012 (PR), SFRH / BD / 91119/2012 (MA ), SFRH / BD / 104160/2014 (AS), SFRH / BD / 44237/2008 (CC) и SFRH / BPD / 110174/2015 (AT), а также через UID / DTP / 04138/2013 (iMed.ULisboa ) и PEst-OE / AGR / U10276 / 2014 (CIISA). Эта работа была также поддержана грантами FCT PTDC / CVT / 115703/2009; PTDC / SAU-ONC / 116164/2009 (AD) и PTDC / SAU-ONC / 121742/2010 (AT).

Дополнительная информация сопровождает этот документ на веб-сайте Cell Death and Disease (http://www.nature.com/cddis)

Отредактировано L Galluzzi

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

miR-21 абляция защищает от индуцированного MCD стеатогепатита и развития фиброза. Мышам C57BL / 6 WT и miR-21 KO вводили контроль (n = 5 для каждой временной точки) или диету MCD (n = 8-10 для каждой временной точки и / или генетического фона) в течение 2 и 8 недель. (a) qRT-PCR-анализ miR-21 (слева) и иммуноблоттинг PPARα (справа). Показаны представительские пятна. Блоты нормализуют до эндогенного β-актина. (b) H & E и масло Red-O окрашивание репрезентативных участков печени. Шкала шкалы, 100 мкм. (c) qRT-ПЦР-анализ TNF-α и IL-1β. (d) Уровни АЛТ в сыворотке. (д) окрашивание TUNEL секций ткани печени. Ядра были контрастированы с Hoechst 33258 (синий). Шкала шкалы, 30 мкм. Гистограммы показывают процент TUNEL-положительных клеток (справа). (f) Иммуноблоттинг активной каспазы-2. Показаны представительские пятна. Блоты нормализуют до эндогенного β-актина. (g) qRT-ПЦР-анализ TGF-β и коллагена-1α1 в печени мыши (слева) и репрезентативные изображения секций печени, окрашенных трихромом Массона, из MCD или контрольных диетических мышей в течение 8 недель (справа). Шкала шкалы = 100 мкм. Результаты выражены как среднее ± S.E.M. кратное изменение. * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001 от контроля; † P <0,05, ‡ P <0,01 и φP <0,001 по сравнению с соответствующими WT MCD-питающими мышами

miR-21 и OCA предотвращают ГФ-индуцированную гепатомегалию и сильно улучшают стеатоз, накопление холестерина и воспаление. Мышам C57BL / 6 WT и miR-21 KO вводили диету FF (n = 12) или контрольную диету (SD; n = 12), с добавлением или без добавления OCA (10 мг / кг / день) в течение 25 недель. (a) Вес тела (слева) и мышечной массы (справа). (b) qRT-ПЦР-анализ miR-21 (слева) и иммуноблоттинг PPARα (справа). Показаны представительские пятна. Блоты нормализуют до эндогенного β-актина. (c) Репрезентативный образ секций печени, окрашенных H & E. Шкала шкалы, 100 мкм. (d) Показатель стеатоза в слепом образцах печени (верхний). Стеатоз оценивали по шкале 0-4. Содержание холестерина в печени (снизу). (e) qRT-ПЦР-анализ TNF-α, IL-1β, IL-6 и TLR4. Результаты выражены как среднее ± S.E.M. кратное изменение. * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001 от мышей контроля WT; † P <0,05, ‡ P <0,01 и φP <0,001 по сравнению с мышами, питающимися WT FF. SD; стандартная диета

Экспрессия релевантных метаболизму транскрипционных мишеней PPARα восстанавливается при активации двойного ядерного рецептора. Мышам C57BL / 6 WT и miR-21 KO вводили диету FF (n = 12) или контрольную диету (SD; n = 12), с добавлением или без добавления OCA (10 мг / кг / день) в течение 25 недель. (a) qRT-PCR-анализ Cyp4a14, FAT, ACOX-2 и CPT-1. (b) уровни ROS (верхний) и qRT-ПЦР-анализ HO-1 (внизу). Результаты выражены как среднее ± S.E.M. кратное изменение. * P <0,05 и *** P <0,001 от мышей контроля WT; † P <0,05, ‡ P <0,01 и φP <0,001 по сравнению с мышами, питающимися WT FF. SD, стандартная диета

Печеночная чувствительность к инсулину восстанавливается после активации PPARα и FXR. Мышам C57BL / 6 WT и miR-21 KO вводили диету FF (n = 12) или контрольную диету (SD; n = 12), с добавлением или без добавления OCA (10 мг / кг / день) в течение 25 недель. (a) Иммуноблоттинг p-JNK. Показаны представительские пятна. Кляксы были нормализованы до общего количества JNK. (б) Иммуноблоттинг p-IRS1 (слева) и p-INSR (справа). Показаны представительские пятна. Блоты были нормализованы до суммарного IRS1 и INSR соответственно. (c) Иммуноблоттинг p-AKT. Показаны представительские пятна. Кляксы были нормализованы до общей АКТ. Результаты выражены как среднее ± S.E.M. кратное изменение. * P <0,05 и ** P <0,01 от контрольных мышей WT; † P <0,05 и φP <0,001 по сравнению с мышами, получавшими WT FF. SD, стандартная диета

Ось miR-21 / PPARα модулируется в мышцах мышей с NASH, а мышечная резистентность к инсулину предотвращается при удалении miR-21 и активации FXR. Мышам C57BL / 6 WT и miR-21 KO вводили диету FF (n = 12) или контрольную диету (SD; n = 12), с добавлением или без добавления OCA (10 мг / кг / день) в течение 25 недель. (a) qRT-PCR-анализ miR-21 (слева) и иммуноблоттинг PPARα (справа). Показаны представительские пятна. Блоты были нормализованы к эндогенному тубулину. (б) Иммуноблоттинг p-IRS1 (слева) и p-INSR (справа). Показаны представительские пятна. Блоты были нормализованы до общего количества IRS1 и INSR, соответственно. (c) Иммуноблоттинг p-AKT. Показаны представительские пятна. Кляксы были нормализованы до общей АКТ. Результаты выражены как среднее ± S.E.M. кратное изменение. * P <0,05 и ** P <0,01 от контрольных мышей WT; † P <0,05 по сравнению с мышами, получавшими WT FF. SD, стандартная диета

Экспрессия miR-21 увеличивается в печени, мышцах и сыворотке пациентов с NAFLD. (а) qRT-ПЦР-анализ печени miR-21. (b) Репрезентативный PPARα иммуноокрашивающий (красный) в ткани печени от пациентов. Ядра были контрастированы с Hoechst 33258 (синий). Соответствующая гистограмма показывает количественную оценку интенсивности флуоресценции PPARα, как описано в разделе «Материалы и методы». Было использовано не менее пяти изображений на образец печени. Шкала шкалы = 10 мкм. (c) qRT-ПЦР-анализ мышечного miR-21. (d) qRT-ПЦР-анализ сывороточного miR-21. Результаты выражены как среднее ± S.E.M. кратное изменение. * P <0,05 и ** P <0,01 от стеатоза

Гистологические особенности представлены в процентах случаев в каждом классе

* P <0,05 и *** P <0,001 от соответствующих мышей с контрольным контролем WT. ‡ P <0,01 от мышей, питающихся WT MCD

Общая РНК из четырех животных в каждой из групп из FF-модели была объединена и использована в массиве Taqman для оценки экспрессии липид-регулируемых генов. Результаты выражены в смене смены, и наиболее релевантные гены представлены жирным шрифтом. SD, стандартная диета

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *