Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Мезенхимальные стволовые клетки и их секретируемые молекулы преимущественно улучшают фульминантную печеночную недостаточность и хронический фиброз печени у мышей соответственно

Mesenchymal stem cells and their secreted molecules predominantly ameliorate fulminant hepatic failure and chronic liver fibrosis in mice respectively
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4746907/

Ортотопическая трансплантация печени является единственным эффективным средством для лечения печеночной недостаточности, но ограничена нехваткой доступных донорских органов. Недавние исследования показывают многообещающие результаты терапии мезенхимальных стволовых клеток (MSC).

Мы систематически исследуем терапевтические эффекты MSC или среды MSC-кондиционера (MSC-CM) в улучшении молниеносной печеночной недостаточности (FHF) и хронического фиброза печени у мышей. Кроме того, для выявления изменения воспалительного состояния применялся обширный проточный цитометрический анализ селезенки с мышей, обработанных транспортным средством и MSC- и MSC-CM.

В модели FHF лечение MSC заметно сократило случаи смерти; анализ валовой гистопатологии показал, что контрольная печень была мягкой и усохшей с обширной экстравазированной кровью, которая постепенно снижалась в более поздние моменты времени, тогда как МРС-обработанные печень проявляли грубые патологические изменения, даже через 24 часа после инфузии MSC, а также окрашивание гематоксилином и эозином драматическая гепатоцеллюлярная смерть с цитоплазматической вакуолизацией, подавленной с помощью MSC; проточный цитометрический анализ общих лимфоцитов показал, что макрофаги (F4 / 80) проникают в контрольные печень больше, чем печень, обработанная MSC; напротив, MSC-CM частично улучшает FHF. В хронической модели повреждения печени, MSC и MSC-CM оба были подавлены фиброгенезом и некровоспалительными, а позже было лучше; активация печеночных звездчатых клеток (α-SMA) ингибировалась; синтез и хранение гликогена (обозначенный периодическим кислотно-Schiff-покрытием); регенерация печени (Ki67) была повышена, в то время как апоптоз печени (TUNEL) был снижен. В in vitro MSC стимулируют апоптоз линии макрофагов RAW264.7, а MSC-CM способствует апоптозу и ингибирует пролиферацию HSC-линии LX-2. Мы также обнаружили, что MSC и MSC-CM могут улучшать селезенку; MSC-CM увеличивал уровни клеток Th2 и Treg и уменьшал уровни клеток Th17, тогда как уровни Th1-клеток не изменялись; Сравнительно, лечение MSC не влияло на клетки Th17 и Treg и лишь незначительно меняло воспалительное состояние; MSC и MSC-CM, как по существу, так и нерегулируемые макрофаги в селезенке.

Оба MSCs и MSC-CM оказывают терапевтический эффект, воздействуя на различные ключевые клетки во время патогенеза FHF и хронического фиброза, стимулируя пролиферацию гепатоцитов и подавляя апоптоз, понижающие регуляцию инфильтрационные макрофаги, превращая систему CD4 + T лимфоцитов в противовоспалительное состояние и облегчая гибель печеночных звездчатых клеток.

В онлайн-версии этой статьи (doi: 10.1186 / s12967-016-0792-1) содержится дополнительный материал, доступный для авторизованных пользователей.

Для большинства животных печень является наиболее важным метаболическим органом, а конечная печеночная недостаточность представляет собой потенциально опасное для жизни состояние, которое часто сопровождается серьезными осложнениями. Дефект печени включает FHF и хронический фиброз печени, который может дополнительно ухудшаться при циррозе и гепатоме. Ортотопическая трансплантация печени в настоящее время является наиболее эффективным методом лечения, но ее использование ограничено из-за нехватки доступных донорских органов, высоких затрат и требований к иммуносупрессии в течение жизни [1, 2]. Поэтому в последних исследованиях основное внимание было уделено терапевтическим эффектам различных типов стволовых клеток, которые могут улучшить функцию печени через различные механизмы [3, 4].

MSCs, специфический тип взрослых стволовых клеток, изолированных из компактной кости, могут дифференцироваться в клетки с несколькими линиями [5]. Более того, MSCs естественно поддерживают гомеостаз путем секреции растворимых факторов, включая трофические молекулы и цитокины, которые косвенно регулируют иммунную систему [6]. Недавние исследования показывают, что MSCs снижают уровень провоспалительных клеток через различные механизмы аутоиммунных заболеваний [7, 8]. То есть различные методы MSC могут облегчить негативные последствия травм и заболеваний посредством либо взаимодействия между MSC и различными клетками-мишенями [9-11], либо MSC-секретируемыми растворимыми факторами [12]. Однако различия между методами MSC для печеночной недостаточности не были полностью изучены.

В настоящем исследовании мы систематически изучали влияние MSCs и MSC-CM, содержащих различные MSC-секретируемые растворимые факторы на FHF и хронический фиброз печени у мышей, фокусируясь на CD4 + T-лимфоцитах, макрофагах и клетках гепатита stellate (HSCs), которые играют важную роль в патогенезе печеночной недостаточности. Мы показали, что лечение MSC и MSC-CM улучшило восстановление после печеночной недостаточности, хотя были различия в их способах действия. То есть, MSC улучшали FHF, взаимодействуя с различными клетками, чувствительными к воспалению, тем самым достигая иммуносупрессии и способствуя выживанию, тогда как MSC-CM улучшал хронический фиброз печени путем снижения регуляции воспалительных реакций и стимулирования апоптоза HSC.

Мышей ICR от двух до трех недель и шести-восьминедельных женщин ICR или C57BL / 6 мышей весом 20-25 г были приобретены в Лабораторном центре животных, Академии военных медицинских наук (Пекин, Китай) и размещались в обычных клетках. Все эксперименты в этом исследовании проводились в соответствии с руководством Академии военных медицинских наук для лабораторных животных.

MSC из мышиной компактной кости были выделены и расширены по культуре, как описано в предыдущем докладе [13]. Проанализированы характеристики фенотипа и мультипотентных стволовых клеток инфузионных MSC (дополнительный файл 1: рисунок S1). Детали помещаются в дополнительный файл 1.

Усредненную среду для выращивания концентрировали в 25 раз с помощью ультрафильтрационных установок (Millipore, Bedford, MA) с отсечкой 3 кДа [14]. Детали помещаются в дополнительный файл 1.

Детали помещаются в дополнительный файл 1.

FHF индуцировали однократной дозой тиоацетамида (TAA, растворенного в 40 мкг / мкл со стерильным PBS), вводимого внутрибрюшинно. Через 5 ч инъекции ТАА в хвостовую вену вводили 200 мкл MSC-CM или 1 × 106 MSC и 200 мкл раствора PBS (контроль транспортного средства).

Чтобы индуцировать фиброз печени, мыши получали 12 последовательных внутрибрюшинных инъекций (1 мкл / г массы тела) CCl4: оливковое масло (1: 1) два раза в неделю в течение 6 недель. 1 × 106 MSCs вводили в хвостовую вену, или 200 мкл MSC-CM вводили в хвостовую вену дважды в неделю в течение трех последовательных недель на шестой неделе инъекций CCl4.

Различают различные иммуногистохимические окраски, как описано в предыдущем отчете [14]. Детали помещаются в дополнительный файл 1.

Результаты выражаются как среднее ± стандартное отклонение. Статистическая значимость определялась двухсторонним тестом Стьюдента. Выживание анализировали с использованием оценки предела продукта Kaplan-Meyer и сравнивали с логарифмическим рангом.

Мышей умерщвляли 24, 48 и 72 ч после внутривенной инфузии MSC (дополнительный файл 1: рисунок S2A). Девять контролей и одна MSC-обработанная мышь умерли до жертвоприношения. Шесть из девяти оставшихся контрольных пела были мягкими и усохшими с обширной экстравазированной кровью, которая постепенно уменьшалась в более поздние моменты времени. Напротив, ни одна из оставшихся шести пациентов, получавших MSC, не обнаруживала серьезных патологических изменений, даже через 24 часа после инфузии MSC (рис.1a). Вливание 1MSC способствует выживанию, улучшает грубую и микроскопическую гистопатологию в индуцированной TAA FHF. обработка MSC значительно улучшала грубый гистопатологический вид стимулированной TAA печени с уменьшением экстравазированной крови. Asterisk отмечает изменения, произошедшие в печени через 24 часа после инфузии MSC. b Анализ выживаемости Kaplan-Meier у мышей с TAH-индуцированной FHF. c Анализ проточной цитометрии макрофагов. d Окрашивание e F4 / 80 иммуногистохимия f CD45 + иммунофлюоресцентное окрашивание секций печени от контрольных и MSC-обработанных мышей продемонстрировало значительное снижение инфильтрации лейкоцитов и макрофагов. Данные показаны как средняя ± стандартная ошибка среднего из 10 случайных мощных полей на мышь. * Р <0,05; ** P <0,01; *** Р <0,001

Гематоксилин и эозин (ОН) -очищенные участки печени у контрольных мышей выявили драматическую гепатоцеллюлярную смерть с цитоплазматической вакуолизацией, панлобулярную мононуклеарную инфильтрацию лейкоцитов с CD45-позитивным (особенно F4 / 80-положительные макрофаги) и сильное искажение структуры ткани печени. Напротив, участки печени у мышей, обработанных MSC, редко проявляли инфильтрацию иммунных клеток в перипортале с отеком и отложением фибрина (рис.1d-f; дополнительный файл 1: рисунок S2C-E). Кроме того, проточный цитометрический анализ полных лимфоцитов показал, что макрофаги проникают в контрольные печень больше, чем печень, обработанная MSC (рис.1c; дополнительный файл 1: рисунок S2B).

В течение 7-дневного периода наблюдения после трансплантации клеток девять из 18 контрольных мышей последовательно умерли, а смертность достигла 50%. Напротив, более высокая выживаемость наблюдалась у мышей, обработанных MSC, и только одна мышь умирала в течение периода наблюдения (рис.1b).

В целом, эти результаты показывают, что MSC ингибирует развитие гистопатологических изменений и инфильтрации иммунных клеток и снижает смертность среди мышей с TAH-индуцированной FHF.

Чтобы наблюдать изменения в фиброзе печени после того, как мышей обрабатывали CCl4 и MSC, участки печени (дополнительный файл 1: рисунок S3) окрашивали сириусом Красным для определения осаждения коллагена. Шесть мышей из нормальных, контрольных и MSC-групп умерщвляли для различных микроскопических оценок через 3 недели после инфузии MSC (дополнительный файл 1: рисунок S4A). Сириус Красные окрашенные участки печени выявили массивное осаждение коллагена в печени от контрольных мышей (рис. 2а, f). Обработка MSC также заметно уменьшала осаждение коллагена у мышей с TAA-индуцированным хроническим фиброзом печени, хотя этот эффект был менее значительным, чем у мышей с хроническим фиброзом печени, индуцированным CCl4 (дополнительный файл 1: рисунок S3). Результаты иммунофлюоресцентного окрашивания коллагена 1 (Col-1) и Collagen3 (Col-3), которые являются основными факторами, способствующими осаждению коллагена, согласуются с результатами окрашивания сириус-красного (дополнительный файл 1: рисунок S4B, C, D, E) , Кроме того, периодическое окисление кислоты-Шифф (PAS) в печени выявило, что обработка MSC улучшает синтез и хранение гликогена (фиг.2c, h). Более того, контроль секций печени вокруг синусового гепатика был достоверно положительным для α-гладкомышечного актина (α-SMA), маркера активированных HSC, тогда как секторы печени, обработанные MSC, продемонстрировали значительное снижение положительности α-SMA (фиг.2d, i ).Инжир. Обработка 2MSC подавляет воспалительную инфильтрацию и снижает уровень активированных HSC, ингибируя осаждение волокон при хроническом фиброзе печени, индуцированном CCl4. сириус красный, b HE и c PAS окрашивание секций печени из контрольных и MSC-обработанных мышей. d α-SMA иммунофлуоресцентное окрашивание секций печени показывает понижающую регуляцию активированных HSC. e F4 / 80 окрашивание иммунофлюоресценции секций печени у нормальных, контрольных и MSC-обработанных мышей. f, g Показатели фиброза и некровоспалительной способности, определяемые с использованием системы оценки Ишака [31]. h, i, j Количественная оценка PAS-положительности, α-SMA-позитивность и F4 / 80-позитивность. Данные показаны как средняя ± стандартная ошибка среднего из 10 случайных мощных полей на мышь. * Р <0,05; ** P <0,01; *** Р <0,001

Микроскопическая оценка участков печени, окрашенных HE, выявила массивную воспалительную инфильтрацию, особенно F4 / 80-положительные макрофаги, в печени от контрольных мышей. В отличие от этого, MSC-обработка заметно понижала F4 / 80-положительную инфильтрацию макрофагов (рис. 2b, e, g, j). В совокупности эти результаты показывают, что MSC-терапия подавляет фиброз печени путем инфильтрации макрофагов с понижающим регулятором и способствует апоптозу HSC или уменьшает активированные HSC.

Чтобы определить, уменьшает ли MSC лечение гепатоцеллюлярного апоптоза, мы исследовали ядра TUNEL-реактивных гепатоцитов в секциях печени. У контрольных мышей с ФХФ и хроническим фиброзом печени было обнаружено много крупных апоптотических ядер гепатоцитов, но лишь немногие такие ядра наблюдались после лечения MSC. Кроме того, экстравазированная кровь, наблюдаемая после стимуляции ТАА, исчезла после инфузии MSC (рис.3a, b). Количественная оценка этих наблюдений подтвердила резкое снижение TUNEL-положительности у мышей, обработанных MSC, с FHF и хроническим фиброзом печени (0,10 ± 0,06 или 0,40 ± 0,05% на поле зрения соответственно) по сравнению с контрольными мышами (1,92 ± 0,40 или 2,83 ± 0,30% на поле зрения) (рис.3e, f), демонстрируя, что MSC эффективно ингибирует гепатоцеллюлярную смерть в моделях отказа печени. 3MSC снижает апоптоз и усиливает пролиферацию гепатоцеллюлярных клеток у мышей с печеночной недостаточностью. Секции печени от стимулированных TAA и b CCl4-стимулированных мышей окрашивали TUNEL (темно-коричневые ядра, большие для гепатоцитов) и контрастировали с метил-зеленым (светло-синий). Ki67-иммунофлюоресцентное окрашивание секций печени с помощью стимулированных ТА и мышей с CCl4-стимуляцией. Проявление TUNEL-положительности в стимулированной TAA и стимулированной f CCl4 печени. Количественная оценка Ki67-положительности в g TAA-стимулированной и h CCl4-стимулированной печени. Данные показаны как средняя ± стандартная ошибка среднего из 10 случайных мощных полей на мышь. * Р <0,05; ** P <0,01; *** Р <0,001

Терапевтический эффект MSCs может положиться на запуск эндогенных программ восстановления. Гепатоциты, положительные для маркера пролиферации Ki67, определяли количественно у мышей с FHF и хроническим фиброзом печени и сравнивали с таковыми у контрольных мышей (фиг.3c, d). В то время как в контрольной печени (0,08 ± 0,04 или 0,20 ± 0,03% на поле зрения) наблюдалось несколько Ki67-положительных гепатоцитов, многие наблюдались в печени, обработанной MSC (2,62 ± 0,50 или 1,62 ± 0,20% на поле зрения) (рис. 3g, h). Эти данные показывают, что лечение MSC ингибирует гепатоцеллюлярный апоптоз и стимулирует программы регенерации печени у мышей с печеночной недостаточностью.

MSCs естественно поддерживают гемопоэз, выделяя несколько трофических молекул, включая растворимые гликопротеины внеклеточного матрикса, хемокины, цитокины и факторы роста. Чтобы определить, играет ли MSC-CM важную роль в улучшении печеночной недостаточности, MSC-CM внутривенно вводили мышам с FHF или хроническим фиброзом печени. Интересно, что терапевтический эффект инфузии MSC-CM был аналогичен введению инфузии MSC, хотя были заметные различия в их курсах действий для FHF. Мыши с FHF умерщвляли 24, 48 или 72 ч после инфузии MSC-CM (фиг.4а). Шесть из восьми пестицидов, контролирующих выживаемость, были мягкими и усохшими с обширной экстравазированной кровью. Микроскопическая оценка отделов печени, окрашенных HE, последовательно выявила массивную гепатоцеллюлярную смерть с цитоплазматической вакуолизацией, кровоизлиянием и воспалительной инфильтрацией. Эти тяжелые патологические изменения наблюдались также в печени 24 и 48 ч, обработанных MSC-CM, после инфузии, хотя терапевтический эффект наблюдался через 72 часа после инфузии MSC-CM (фиг.4d, j, k). Однако лечение MSC-CM существенно не улучшало выживаемость (55,6% для MSC-CM-терапии против 44,5% для контрольной группы) (фиг.4c). Поэтому вполне вероятно, что MSC-CM улучшает систему восстановления печени только на более поздних стадиях самовосстановления. Доставка 4MSC-CM улучшает стимулированный TAA FHF и CCl4-стимулированный фиброз печени. схема, изображающая обработку MSC-CM для FHF. b Схема, иллюстрирующая лечение MSC-CM при хроническом фиброзе печени. c Анализ выживаемости мышей Kaplan-Meier с TAH-индуцированной FHF. d MSC-CM значительно улучшило грубый гистопатологический вид стимулированной TAA печени. e, f Фиброз и показатели некровоспалительной активности были определены с использованием системы подсчета Ишака для стимулированной CCl4 печени. Количественная оценка (g) α-SMA-, (h) Ki67- и (i) TUNEL-позитивность. j Окрашивание секций печени из контрольной и MSC-CM-обработанной TAA-стимулированной печени. k Оценки Некроинфекции, определяемые системой Некроинфекционной оценки Ишака в стимулированной TAA печени. l Сириус красный, m HE, n α-SMA иммунофлюоресценция, o Ki67 иммунофлюоресценция, p TUNEL окрашивание секций печени из CCl4-стимулированной всей группы. Данные показаны как средняя ± стандартная ошибка среднего 10 случайных мощных полей на мышь. * P <0,05; ** P <0,01; *** Р <0,001

Чтобы получить доступ к восстановлению после хронического фиброза печени, шесть из нормальных, контрольных и МСЦ-СМ-групп умерщвляли для различных микроскопических оценок через 3 недели после инфузии MSC-CM (фиг.4b). Сириус Красное окрашивание, окрашивание О-окрашиванием и α-SMA-иммунофлюоресцентное окрашивание секций печени показали, что обработка MSC-CM подавляет осаждение коллагенового волокна, ингибирует воспалительную инфильтрацию и способствует активированному апоптозу HSC (фиг.4e-g, l-n). Кроме того, MSC-CM-обработанные печень проявили меньше TUNEL-позитивности и больше Ki67-положительных ядер гепатоцитов, что указывает на то, что трофические молекулы MSC-CM ингибируют апоптоз гепатоцитов и усиливают регенерацию печени (фиг.4h, i, o, p). В целом, эти результаты показывают, что MSC-CM улучшает хронический фиброз печени, но лишь частично улучшает FHF.

Макрофаги и HSC играют важную роль в патогенезе ФХФ и хронического фиброза печени, соответственно. Чтобы определить, снижают ли MSC понижающие макрофаги и апоптоз HSCs in vivo прямым воздействием самих MSC или косвенным эффектом разрешимых факторов, секретируемых MSC, мы изучили влияние MSC или MSC-CM на апоптоз in vitro и пролиферацию RAW264. 7 или LX-2. После совместной культивирования RAW264.7 и MSC в течение 48 ч наблюдалось двукратное увеличение апоптоза (16,6 ± 2,0% группы совместной культуры против 7,9 ± 1,2% контрольной группы) (рис.5a, d), тогда как MSC и MSC-CM не влияли на распространение RAW264.7, MSC-CM не способствовал апоптозу RAW264.7. 5MSC способствуют апоптозу RAW264.7, а низкая концентрация MSC-CM облегчает апоптоз LX-2 и ингибирует пролиферацию. Co-культура RAW264.7 и MSC индуцировали массивный апоптоз RAW264.7 через 48 часов, показанный с использованием флуоресцентного живого / мертвого анализа. b Низкая концентрация MSC-CM подавляла пролиферацию LX-2 через 48 часов. c Низкая концентрация MSC-CM увеличивала апоптоз LX-2 через 48 часов, показав с использованием флуоресцентного живого / мертвого анализа. d Процент апоптоза для совместной культивирования и только RAW264.7. e Процент апоптоза для совместной культуры и только LX-2. f Подразделение индекса анализа совместной культуры и условий LX-2. Эксперименты проводили в трех повторностях. Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение. * Р <0,05; ** P <0,01; *** Р <0,001

После того, как LX-2 был добавлен 2% MSC-CM в совместной культуре в течение 48 часов, мы наблюдали массивный апоптоз LX-2 (34,5 ± 5,0 в 2% MSC-CM-обработанной группе против 8,3 ± 1,5% контрольной группы ). При 8% MSC-CM не наблюдалось достоверного увеличения апоптоза LX-2 (рис.5c, e). Дополнение 2% MSC-CM также подавляло пролиферацию LX-2 (1,88 ± 0,02 в 2% группе MSC-CM против контрольной группы 2,80 ± 0,06%) (фиг.5b, f). В совокупности эти результаты показывают, что сами MSC непосредственно способствуют апоптозу макрофагов, тогда как апоптоз HSC и ингибирование пролиферации происходят через MSC-CM.

Мы исследовали распределение подмножеств CD4 + T-лимфоцитов в селезенках из контрольных, MSC-обработанных и MSC-CM-обработанных мышей с использованием проточной цитометрии. Основываясь на нашем предыдущем опыте, мы ожидали, что распределение подмножества CD4 + T-лимфоцитов в селезенке не будет изменено обработкой MSC-CM TAA-стимулирующих мышей. Тем не менее, инфузия MSC с нерегулируемым провоспалительным типом T 1 и Th17 (фиг.6c, d; дополнительный файл 1: Рисунок S5A, B) и регулируемые противовоспалительные регуляторные T (Treg) клетки в мышей с FHF (фиг.6f, дополнительный файл 1: рисунок S5D), тогда как распределение противовоспалительных Th2-клеток не было существенно изменено (рис.6e; дополнительный файл 1: рисунок S5C). Последовательно, размер селезенки у мышей из группы лечения MSC-CM был меньше, чем у мышей контрольной группы, что указывает на то, что мыши из группы лечения MSC-CM были в более низком воспалительном состоянии по сравнению с контрольной группой (фиг.6a, b). Таким образом, MSCs непосредственно оказывают иммунодепрессивное действие у мышей с TAA-индуцированным FHF. 6MSC и MSC-CM сглаживают макрофаги и превращают систему CD4 + T-лимфоцитов в противовоспалительное состояние в стимулированных ТАА селезенках. Spleens от контрольных и обработанных MSC мышей, стимулированных TAA, через 72 часа после лечения MSC. b Вес селезенки у MSC-обработанных мышей с FHF. Количественное определение (c) Th1, (d) Th17, (e) Th2, (f) Treg и (g) макрофагов в селезенке

В отличие от этого, как лечение MSC, так и MSC-CM оказывали иммунодепрессанты при хроническом фиброзе печени, индуцированном CCl4, хотя после доставки MSC-CM наблюдались лучшие терапевтические эффекты. MSC-CM увеличивал уровни клеток Th2 и Treg (рис.7c, d, h, i) и уменьшал уровни клеток Th17 (фиг.7b, g), тогда как уровни Th1-клеток не менялись (фиг.6o, j) , Более того, размер селезенки у мышей, получавших MSC-CM, был меньше контрольных мышей (фиг.7k, l). Сравнительно, лечение MSC не влияло на клетки Th17 и Treg и лишь незначительно меняло воспалительное состояние у мышей с хроническим фиброзом печени. Кроме того, MSC и MSC-CM обрабатывали существенно нерегулируемые макрофаги в селезенке мышей с острой и хронической недостаточностью печени (фиг.6g, 7e, j; дополнительный файл 1: рисунок S5E), что согласуется с эффектами, наблюдаемыми в печени. Следовательно, у мышей с хроническим фиброзом печени, индуцированным CCl4, иммунодепрессантные эффекты в основном приписываются MSC-CM. Результаты показывают, что сами MSC оказывают иммунодепрессивное действие у мышей с TAH-индуцированным FHF, тогда как MSC-CM лежит в основе иммуносупрессивного эффекта у мышей с индуцированным CCl4 хроническим фиброзом печени. 7MSC и MSC-CM понижают макрофаги и превращают систему CD4 + T-лимфоцитов в противовоспалительное состояние в стимулированных CCl4 селезенках. Обработка MSC и MSC-CM не оказала существенного влияния на (a) Th1. Значительное снижение (б) Th17 наблюдалось через 3 недели после MSC-CM, но не MSC-лечение. Однако (c) увеличение Th2 и (e) уменьшение макрофагов наблюдалось после обработки MSC и MSC-CM. MSC-CM, но не обработанная MSC обработка (d) Treg. Количественная оценка (f) Th1, (g) Th17, (h) Th2, (i) Treg и (j) макрофагов в селезенке. k Вес селезенки у мышей, обработанных MSC-CM, с хроническим фиброзом печени. l Spleens от контрольных и MSC-CM-обработанных CCl4-стимулированных мышей

В нескольких клинических и экспериментальных исследованиях на животных представлены многообещающие и желательные терапевтические эффекты MSCs в улучшении FHF, хроническом фиброзе печени и даже циррозе [15]. Недавние исследования, посвященные MSC-CM, выявили несколько терапевтических механизмов лечения MSCs [16]. Однако какой механизм действия играет ведущую роль в улучшении ФХФ или хронического фиброза печени, является неубедительным, хотя эта информация важна для будущих исследований. В настоящем исследовании мы систематически изучали эффекты MSC и MSC-CM-терапии на мышиных моделях индуцированного TAA FHF и CCl4-индуцированного хронического фиброза печени с точки зрения усиления регенерации печени, снижения апоптоза гепатоцеллюлярной системы, инфильтрации макрофагов с понижающим регулятором, изменения CD4 + T-система в противовоспалительное состояние и стимулирование апоптоза HSC и ингибирование пролиферации (фиг.8). 8 Схема, изображающая механизмы MSC и MSC-CM терапии. MSCs и MSC-CM, содержащие MSC-секретируемые растворимые факторы, улучшают вызванное TAA острое повреждение печени и индуцированный CCl4 хронический фиброз печени, воздействуя на гепатоциты, макрофаги, CD4 + хелперные Т-лимфоциты и HSC, которые играют важную роль во время патогенеза печени травмы. muMSC: мышиная мезенхимальная стволовая клетка; M0: недифференцированный макрофаг; M1: макрофаг M1; M2: макрофаг M2

Мы обнаружили, что инфузия MSC и MSC-CM одинаково стимулировала регенерацию печени и подавляла гепатоцеллюлярную смерть у мышей с острой и хронической печеночной недостаточностью. Эти результаты согласуются с предыдущим докладом о том, что MSC-CM с малой концентрацией являются достаточными для развития пролиферации гепатоцеллюлярной и ингибирования апоптоза гепатоцитов [14]. Однако более высокие концентрации MSC-CM не принесли лучшего терапевтического эффекта, скорее всего, потому что MSC-CM включает в себя небольшое количество ингибирующих компонентов, таких как TNF- и TGF-β, чьи негативные эффекты при более высоких концентрациях компенсируют терапевтические эффекты трофических факторов.

Еще одна характерная черта между MSC и MSC-CM терапией — существенное сокращение макрофагов в печени и селезенке. Несколько исследований показывают, что различные механизмы MSCs ответственны за понижающую регуляцию провоспалительных макрофагов. Например, MSCs опосредуют переход от провоспалительных макрофагов M1-типа к противовоспалительным макрофагам типа M2 [17, 18]. Кроме того, в другом исследовании показано, что MSC-CM подавляет макрофаги M1-типа у мышей с вызванным эндотоксином острой формой легкого [19]. Однако совместная культура MSC-CM с RAW264.7 не привела к апоптозу RAW264.7 в настоящем исследовании, что можно отчасти объяснить функциональными различиями среди популяций MSC, которые обладают разным спектром секретируемых факторов [20].

Иммуносупрессия является важным терапевтическим механизмом MSC в различных моделях аутоиммунного заболевания [21], и это также относится к MSC-CM [22, 23]. Настоящее исследование дополнительно демонстрирует иммунодепрессивный эффект обработки MSC, превращение организма в противовоспалительное состояние с помощью воспалительных противовоспалительных клеток Treg и снижение провоспалительных Th1 и Th17 клеток в индуцированной TAA FHF и индуцированной CCl4 хронической печенью фиброз (фиг.6, 7), что может частично объяснить положительные эффекты MSC. Поставка MSC-CM также приводила к иммуносупрессивному ответу при хроническом фиброзе печени, хотя иммунодепрессантные эффекты лечения MSC-CM не наблюдались у мышей с TAH-индуцированной FHF. Поэтому мы заключаем, что сами MSC оказывают иммуносупрессивные эффекты в индуцированном TAA FHF, тогда как MSC-секретируемые растворимые факторы доминируют в иммуносупрессивном эффекте лечения MSC при хроническом фиброзе печени, индуцированном CCl4. Более того, установление противовоспалительного состояния после обработки MSC или MSC-CM может происходить косвенным образом посредством регуляции макрофагов M2-типа, которые выделяют различные противовоспалительные факторы, такие как CCL-1 и IL-10, регулируют клетки Th2 и Treg [24].

Основными медиаторами фиброза печени являются HSCs, которые в значительной степени пролиферируют и продуцируют различные внеклеточные матрицы во время патогенеза фиброза печени. Как MSC, так и MSC-CM лечение резко уменьшали активированные HSCs-миофибробласты. Снижение регуляции активированных HSC может быть достигнуто разными путями. Например, волокнистые рубцовые миофибробласты могут вернуться к неактивным фенотипам [25]. Альтернативно, массивный апоптоз и ингибирование пролиферации LX-2, который мы наблюдали во время совместной культивирования MSC-CM и LX-2, могут быть объяснены ранее описанным иммуномодулирующим механизмом [26]. Однако терапевтический эффект лечения MSCs был поставлен под вопрос [27], с недавними исследованиями, показывающими, что инфузия MSC может ускорить развитие фиброза путем конверсии MSC в фиброзные миофибробласты, полученные из рубцов [28-30]. Таким образом, терапевтический эффект инфузии MSC может быть в основном реализован действием MSC-секретируемых факторов, которые опосредуют массивный апоптоз HSCs на основе наших результатов in vivo и LX-2 coculture с MSC-CM in vitro, тем самым противодействуя отрицательным эффектам миофибробластов, полученных из MSC.

Как MSC, так и MSC-CM-терапия улучшали индуцированный TAA FHF и индуцированный CCl4 хронический фиброз, воздействуя на гепатоциты, макрофаги, CD4 + T-лимфоциты и HSC. Однако первичные терапевтические механизмы MSC-терапии различаются между этими двумя моделями печеночной недостаточности. MSC могут добиться заживления травмы двумя различными режимами — прямым взаимодействием с различными клетками-мишенями или секрецией различных растворимых молекул. Для стимулированного ТАА FHF, MSC, но не MSC-CM, значительно улучшенная травма, способствующая пролиферации гепатоцеллюлярной системы и ингибированию апоптоза гепатоцитов, подавлению инфильтрации макрофагов и превращению системы CD4 + T-лимфоцитов в противовоспалительное состояние. MSC-CM также стимулировал регенерацию печени и воспалительную инфильтрацию через 72 часа после родов. Однако, поскольку смерть мышей с ТАА-стимуляцией обычно наблюдалась в течение первых 48 ч после инъекции ТАА, инфузия MSC-CM не уменьшала смертность в течение этого раннего периода времени (44,4% в группе, получавшей MSC-CM, против 55,5% в контрольной группе). Таким образом, MSC сами играют доминирующую терапевтическую роль в MSC-терапии для ФХФ. В нескольких предыдущих исследованиях показано широкое взаимодействие между MSC и различными иммунными клетками, такими как активированные Т-клетки. Иммунодепрессивный результат взаимодействия между MSC и различными иммунными клетками может быть основным механизмом, посредством которого инфузия MSC предотвращает смерть мышей в течение первых 48 часов после инъекции TAA. Напротив, для CSR4-стимулированного хронического фиброза печени MSC-CM играет доминирующую терапевтическую роль, улучшая систему восстановления печени, ингибируя воспалительную инфильтрацию и способствуя апоптозу HSCs, что перевешивает негативные эффекты миофибробластов, полученных из MSC. Следовательно, MSC-секретируемые растворимые факторы являются основным способом действия во время MSC-терапии для индуцированного CCl4 фиброза.

В заключение мы обнаружили, что как MSC, так и MSC-CM индуцируют комплексные терапевтические эффекты на мышах с печеночной недостаточностью, хотя оба метода лечения различаются в их доминирующих терапевтических режимах. В период терапии MSC наши результаты предоставляют клиническому врачу рекомендуемые средства, что лечение MSC более подходит для FHF, тогда как доставка MSC-CM более подходит для хронического фиброза печени.

10.1186 / s12967-016-0792-1 Дополнительные материалы, методы и результаты.

Бяо Хуанг, Сиси Чэн и Хуафэн Ван внесли одинаковый вклад в эту работу

B.H., X.C., H.W., W.H. и Z.G. проводил эксперименты, собирал данные, анализировал данные и писал рукопись. H.W., H.Z., Z.X. выполняли части экспериментов, собирали и анализировали данные. Y.D., N.Z., Y.H. L.Q. и Z.Y. способствовали руководству экспериментами и внесли свой вклад в окончательную рукопись. R.Z. и F.G. разработал и внес вклад в окончательную рукопись. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Эта работа поддерживается Министерством науки и технологий Китая (2012CB932503 и 2011CB933100); Национальный фонд естественных наук Китая (91029705, 81172864 и 81272317). Научно-инновационный проект Китайской академии наук (XDA 01040106). Грант TD12-5025 и 14JCTPJC00487 из города Тяньцзинь.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *