Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Экспрессия P53 и HSP70 при хроническом гепатите, циррозе печени и ранних и современных тканях гепатоцеллюлярной карциномы и их диагностическом значении при гепатоцеллюлярной карциноме: иммуногистохимическое исследование

Expression of P53 and HSP70 in Chronic Hepatitis, Liver Cirrhosis, and Early and Advanced Hepatocellular Carcinoma Tissues and Their Diagnostic Value in Hepatocellular Carcinoma: An Immunohistochemical Study
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4622226/

Дизайн исследования

Сбор данных

Статистический анализ

Интерпретация данных

Подготовка рукописи

Поиск литературы

Сбор средств

Опухолевой белок (P53) и белок теплового шока 70 (HSP70) играют ключевую роль при хронических заболеваниях печени. Это исследование предназначалось для характеристики экспрессии P53 и HSP70 при хроническом гепатите (CH), циррозе печени (LC), раннем и расширенном HCC и анализе их диагностической ценности при гепатоцеллюлярной карциноме (HCC).

Иммуногистохимическое окрашивание проводили для оценки экспрессии P53 и HSP70 в 200 образцах ткани печени человека с продвинутым HCC (n = 80), ранним HCC (n = 30), CH (n = 30), LC (n = 30), и управления (n = 30).

Уровни экспрессии P53 были ниже в LC, чем уровни HCC, но оставались наравне с уровнями CH и контролей. Уровни экспрессии HSP70 были выше в HCC, чем уровни LC, CH и Controls. Чувствительность и специфичность для диагностики HCC: 50,9% и 98,9% для P53 и 78,2 и 77,8% для HSP70 соответственно. Чувствительность и специфичность различных комбинаций были: 95,5% и 85,5% при положительном P53 или HSP70, а 33,6% и 98,9%, если оба были положительными. Среди стадий дифференциации, характеризующихся низким, средним и высоким уровнем HCC, положительная скорость P53 была выше на низком уровне, чем в промежуточном, что было выше, чем в высоком. Положительная скорость HSP70 была выше в низком и среднем, чем в высоком, но никаких явных изменений не было обнаружено между низким и промежуточным.

P53 и HSP70 могут быть потенциальными биомаркерами для диагностики HCC, и правильные комбинации этих 2 маркеров могут улучшить диагностическую точность.

Гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований в мире [1]. Многочисленные этиологии связаны с возникновением и развитием HCC, включая хронический вирус гепатита B (HBV) и вирус гепатита C (HCV), потребление алкоголя и цирроз [2,3]. Сообщалось, что половина HCC в Китае происходит из-за высокой распространенности HBV-инфекции [4]. Постоянные воспаления, вызванные ВГВ, способствуют фиброзу / циррозу печени, что приводит к повышенным рискам ГЦК. Высокая заболеваемость и смертность ГЦК в основном объясняются поздней диагностикой; поэтому раннее обнаружение HCC является единственным способом снижения эффекта HCC [5]. Стандартом критерия для диагностики HCC была биопсия печени или хирургические образцы. В настоящее время традиционная патологическая диагностика ограничивается морфологическими изменениями и ограниченными гистохимическими пятнами. Таким образом, необходимы более специфические и чувствительные иммунохимические биомаркеры, чтобы обеспечить больше альтернатив [6].

Стойкие хронические заболевания печени развиваются в цирроз печени и, в конечном итоге, HCC через устойчивый и длительный процесс, называемый «трилогией» развития HCC. Пациенты с хроническими заболеваниями печени, особенно фиброзом печени или циррозом, подвергаются высокому риску ГЦК; поэтому очень важно внимательно следить за развитием заболевания от болезней печени до злокачественного новообразования [7].

HCC имеет ряд молекулярных изменений, таких как связанный с циклазой белок 2 (CAP2), глипикан-3 (GPC3) и IGF-1R, а также семейство тепловых шоков (HSP) и P53. HSP70 и P53 часто представляют молекулы, которые чрезмерно экспрессируются в биопсии HCC, особенно в продвинутой HCC [5]. Оба они считаются предположительными биомаркерами HCC, но связь между экспрессией HSP70 и P53 в процессе хронического гепатита (CH), LC и раннего и расширенного HCC не сообщается [8,9].

HSP70, индуцированный стрессом ген в генезе опухолей, который модулирует апоптоз и пролиферацию клеток, демонстрирует антиапоптозный эффект, который обеспечивает выживание клеток и способствует пролиферации опухолевых клеток [10]. Сообщалось, что как уровень мРНК, так и уровень белка HSP70 значительно увеличиваются в расширенном HCC, чем в раннем HCC [11]. Сыворотка HSP70 регулируется как у пациентов с циррозом печени, так и с HCC [10]. Более того, HSP70 проявляется как в явном, так и в раннем ГЦК и менее вероятно, что он является положительным в регенеративном конкреции в печени цирроза печени, как определено иммунохимическим окрашиванием [12].

P53 является наиболее изученным опухолевым супрессором в горстке рака, включая HCC [13]. Большинство раковых заболеваний человека связаны с аномальной экспрессией и инактивацией Р53 [14]. В качестве белка-супрессора опухоли P53 выполняет функцию репарации ДНК, проапоптоза и остановки клеточного цикла в опухолевых клетках [15,16]. Мутация P53 часто встречается в HCC. Farazi et al. показали, что пониженные уровни Р53 играют важную роль в прогрессировании хронических заболеваний печени в ГЦК, сотрудничая с дисфункцией теломер [14]. Чрезмерная экспрессия P53 в печени, включая как дикого типа, так и его мутации, показывает повышенную предсказуемость в HCC [16]. Из-за роли P53 в прогрессировании CH в HCC уровень экспрессии P53 в процессе хронических заболеваний печени может помочь в мониторинге и идентификации HCC на ранней стадии [17,18].

В этом случае мы одновременно обнаруживали экспрессию HSP70 и P53 в CH, LC и HCC как на ранней, так и на предварительной стадии. Кроме того, мы проанализировали взаимосвязь между как предикторами, так и их клинико-патологическими особенностями в передовых HCC.

Пациенты, патологически диагностированные с расширенным HCC (n = 80), ранние HCC (n = 30), LC (n = 30) и CH (n = 30), и пациенты с только гемангиомой печени (Controls, n = 30, дистальные ткани ), в соответствии с критериями ВОЗ, были получены из Первой аффилированной больницы Синьцзянского медицинского университета в период с 2009 по 2014 год. Клинические характеристики были собраны путем анализа медицинских записей и дат патологий. Все пациенты, включенные в исследование, подписали формы согласия, и исследование было одобрено Комитетом медицинской этики Медицинского университета Синьцзян (№ 20140929-02). Все резецированные хирургические образцы сразу фиксировали в формалине (10%) и вставляли в парафин; Сегменты толщиной 4 мкм разрезали последовательно и окрашивали для P53 и HSP70.

Секции тканей обрабатывали ксилолом (10 мин, 3 раза) и градуированным спиртом для депарафинизации и гидратации, после чего секции нагревали в 0,01 М цитратном буферном растворе (PH9,0) в микроволновой печи в течение 20 мин для извлечения антигена. Секции естественно охлаждали до комнатной температуры (RT) перед обработкой 3% Н2О2 в метаноле в течение 15 мин для блокирования активности эндогенных пероксидаз. Участки инкубировали в течение ночи при 4 ° С с первичными антителами против P53 (1: 100, мышиным моноклональным антителом, Fuzhou Maixin Biotech, CN) и HSP70 (1: 200, мышиным моноклональным антителом, SANTA CRUZ, США), затем они прошли инкубацию 1 раз в течение 30 мин с вторичными антителами (ZSGB, Китай) при 37 ° C и окрашивали раствором DAB. После контрастирования с гематоксилином секции пропускали через градуированный этанол и запечатывали.

Результаты иммуногистохимической обработки для P53 (окрашивание нуклеином) и HSP70 (нуклеоцитоплазматическое окрашивание) были проанализированы слепыми двумя независимыми опытными патологоанатомами. Десять областей были выбраны случайным образом, и рейтинг был выполнен в соответствии с методами, описанными в предыдущих исследованиях [19-21]. Плотность окрашивания была градуирована: 1 (≤25% окрашивания), 2 (26-75% окрашивания) и 3 (≥76% окрашивания). Интенсивность окрашивания оценивали: 1 без положительного окрашивания, 2 для мягкого окрашивания и 3 для интенсивного окрашивания. Затем 2 класса каждого экземпляра умножали и классифицировали на отрицательные (-) для баллов <3 и положительные (+) для оценок ≥3.

Статистический анализ проводился с использованием однонаправленного ANOVA с использованием SPSS версии 17.0 (SPSS, Чикаго, США). Для сопоставления данных по 5 группам и данным между клинико-патологическими параметрами и факторами значение различий оценивали по критерию Писа Пикса или по критерию Фишера. Различия считались статистически значимыми, когда значение Р <0,05, а все значения Р 2-хвоста во всех анализах.

Иммунореактивность P53 и HSP70 контролей, CH, LC и раннего и расширенного HCC оценивали с помощью иммуногистохимического анализа. Экспрессия Р53 проявлялась в форме нуклеонового окрашивания, в то время как экспрессия HSP70 была локализована в ядре и / или цитоплазме (рис. 1). Клинико-патологические характеристики групп приведены в таблице 1.

Как показано в таблице 2, положительная скорость экспрессии P53 в продвинутых тканях HCC составила 60,0% (48/80), что значительно выше, чем в ранних тканях HCC (26,7%, 8/30, P = 0,003), тканях LC (3,3 %, 1/30, Р <0,001), ткани СН и ткани органов управления (0,0%, 0/30, Р <0,001, оба). Положительная скорость экспрессии в ранних тканях HCC составила 26,7% (8/30), что значительно выше, чем в тканях LC (3,3%, 1/30, P = 0,026), тканях СН и тканях органов управления (0,0%, 0 / 30, P = 0,007, оба).

Положительная скорость экспрессии HSP70 в продвинутой HCC (76,3%, 61/80) была значительно выше, чем в тканях LC (43,3%, 13/30, P = 0,003), ткани CH (23,3%, 7/30, P < 0,001) и тканей органов управления (0,0%, 0/30, Р <0,001). Между тем, положительная скорость в ранних тканях HCC (83,3%, 25/30) также была значительно выше, чем в тканях LC (43,3%, 13/30, P <0,001), ткани CH (23,3%, 7/30, P <0,001) и тканей органов управления (0,0%, 0/30, Р <0,001). Однако не было существенной статистической разницы в положительной скорости экспрессии HSP70 в раннем HCC и расширенном HCC (P> 0,5). Кроме того, образцы экспрессии P53 в тканях HCC были значительно коррелированы с образцами HSP70 (r = 0,684, P <0,001).

Точность диагностики и комбинации 2 положительных маркеров суммированы в таблице 3. Чувствительность, специфичность и положительные и отрицательные предсказательные значения для параллельной комбинации составили 95,5%, 85,5%, 89,0% и 93,9%, соответственно, с по меньшей мере 2 маркера были положительными, а чувствительность и отрицательные прогностические значения параллели были сравнительно выше. 4 индикатора для последовательной комбинации были 33,6%, 98,9%, 97,4% и 54,9% соответственно, причем оба маркера были положительными, а удельные и положительные прогностические значения последовательной комбинации были относительно выше. Эти результаты могут указывать на то, что правильные комбинации двух предикторов помогут нам достичь более надежной и точной диагностики HCC, включая ранний и расширенный HCC, по сравнению с использованием только 1 маркера.

Корреляции между клинико-патологическими характеристиками и экспрессией P53 и HSP70 были оценены у пациентов с расширенным HCC с 5 клинико-патологическими параметрами — опухолевым тромбом, размером опухоли, дифференцировкой, возрастом и полом — как показано в настоящем исследовании (таблица 4). Как указано в таблице 4, тест χ² Пирсона или точность Фишера показали, что различия в дифференцировке для P53 и HSP70 были статистически значимыми (P <0,001, оба). Положительные показатели экспрессии P53 и HSP70 были выше у пациентов с более низкой дифференцировкой. В продвинутых тканях HCC положительная экспрессия P53 в тканях с низкой дифференцировкой составила 90,03% (28/31), что значительно выше, чем в умеренно дифференцированных тканях (53,6%, 15/28, P = 0,002) и сильно дифференцированных тканях (23,8 %, 5/21, Р <0,001), а положительная скорость Р53 в умеренно дифференцированных тканях была выше, чем в сильно дифференцированных тканях (Р = 0,036). Кроме того, положительная скорость HSP70 в продвинутых тканях HCC с низкой дифференциацией (96,8%, 30/31) была выше, чем в тканях промежуточной дифференцировки (78,6%, 22/28, P> 0,05), но различия не были статистически значимыми , Скорость низкой дифференцировки была значительно выше, чем в тканях высокой дифференцировки (42,9%, 9/21, Р <0,001). Аналогично, скорость промежуточной дифференциации была выше, чем у высокой дифференциации (P = 0,01). Не было достоверной статистической связи между двумя факторами в отношении опухолевого тромба, размера опухоли, возраста или пола, что свидетельствует о том, что эти 4 переменные не влияют на экспрессию P53 и HSP70 в продвинутой HCC.

HCC является основной причиной смерти при хронических заболеваниях печени, особенно у пациентов с циррозом печени. Предотвращение хронического гепатита и / или цирроза печени от прогрессирования до ГЦК по-прежнему является важной проблемой. Ранняя диагностика — эффективный способ уменьшить частоту ГЦК. Поскольку ГЦК тесно связана с циррозом печени, мониторинг хронических заболеваний печени имеет большое значение. Морфологическое различие HCC среди передовых хронических заболеваний печени и раннего неопластического поражения все еще вызывает ряд проблем. Поэтому требуется больше поддержки при традиционном патологическом обнаружении ГЦК при хронических заболеваниях печени, особенно при повышенном циррозе печени.

В исследовании использовалась иммуноцитохимия для измерения картины экспрессии HSP70 и P53 на разных стадиях хронических заболеваний печени и их корреляции с клинико-патологическими параметрами. Полученные выводы: (1) Р53, очевидно, увеличил свое присутствие в ГЦК больше, чем при хроническом гепатите и циррозе, которые могут быть использованы для выявления HCC на ранней стадии; (2) HSP70 мог четко различать HCC от хронического гепатита / цирроза, но не смог отличить ранний и продвинутый HCC; (3) P53 и HSP70 коррелируют со злокачественными новообразованиями и высоко экспрессируются в слабо дифференцированных опухолях.

Кроме того, наше исследование показало, что параллельная комбинация P53 и HSP70 может повысить чувствительность за счет потери специфичности, что было противоположно комбинации серий. Поэтому правильная комбинация P53 и HSP70, параллельно или последовательно, может одновременно повысить специфичность и чувствительность, что поможет достичь более надежной и точной диагностики HCC, включая ранний и расширенный HCC, а не использовать только 1.

P53 относится к более чем половине случаев рака человека [22]. Мутация и последовательная инактивация P53 являются характеристиками HCC [23]. Наше исследование показало, что уровни экспрессии P53 согласуются с предыдущими сообщениями, а конкретные выражения Р53 в опухолях не проявляют выраженности при хроническом гепатите, 3,3% (1/30) являются положительными в циррозе печени; и 26,7% и 60,0% в раннем и расширенном НСС, соответственно. Существовала значительная разница между ранним и продвинутым HCC, что указывает на то, что P53 достаточно чувствителен, чтобы отличать ранний HCC от других этапов. Наши данные показали, что у Р53 не было очевидных отношений с полом, возрастом, размером опухоли или раком эмбола у пациентов с развитой ГЦК. Более того, Р53 коррелировал с уровнями дифференцировки ГЦК с хорошо дифференцированным НСС, показывающим более низкий уровень Р53.

HSP70 вместе с другими 2 биомаркерами — GPC3 и глутаминсинтетазой (GS) — продемонстрировал полезность при обнаружении раннего и ГЦК 1-го класса в диспластических узлах цирроза [24,25]. Другие исследования также показали высоко выраженные уровни HSP70 в HCC [12]. Было обнаружено, что положительная скорость HSP70 в этом исследовании постепенно возрастает в прогрессировании хронических заболеваний печени: 23,3% (7/30) при гепатите, 43,3% (13/30) при циррозе печени и 83,3% (25/30) на ранней стадии HCC. Не было значительного изменения HSP70 между гепатитом и циррозом (P> 0,05). Ранний и продвинутый HCC (76,3%, 61/80) оба имели более высокий уровень HSP70 (P> 0,05). Подобно P53, между HSP70 и возрастом пациента, возрастом, размером опухоли и раком эмбола не было очевидной связи. Однако он показал значительную корреляцию с дифференцировкой, что указывает на то, что HSP70 является потенциальным прогностическим индикатором злокачественности. Мы обнаружили, что HSP70 более позитивно экспрессируется в низкодифференцированных опухолях.

Диагноз HCC на ранней стадии имеет решающее значение. Ряд опухолевых биомаркеров недавно стал важным диагностическим индикатором для HCC. Наши результаты показали, что P53 высоко экспрессируется в неопластических тканях и почти выражен в HCC, тогда как HSP70 может быть обнаружен как в неопластических (CH и LC), так и в неопластических тканях печени. Kamal et al. сообщил, что путем объединения трех разных биомаркеров (CGP3, HSP70 и GS) точность диагностики может быть увеличена [9]. Кроме того, наше исследование показало, что параллельная комбинация P53 и HSP70 может повысить чувствительность за счет потери специфичности, что было противоположно комбинации серий. Поэтому правильная комбинация P53 и HSP70, параллельно или последовательно, может одновременно повысить специфичность и чувствительность, что поможет достичь более надежной и точной диагностики HCC, включая ранний и расширенный HCC, а не использовать только 1.

В текущем исследовании есть несколько ограничений. Во-первых, мы только зачислили пациентов в район Синьцзян в Китае в 1 центре, что ограничивает возможность заключения о том, что комбинация P53 и HSP70 может улучшить диагностику ГЦК. Во-вторых, размер выборки невелик, и для клинического применения P53 и HSP70 для диагностики HCC должна быть включена когорта с большим количеством случаев из нескольких центров. Во-вторых, мы использовали только окрашивание иммуногистохимии в этом исследовании, но для определения уровней белка следует использовать ELISA и Вестерн-блот. В нашем следующем исследовании будет включено больше пациентов, и мы также будем следить за этими пациентами, чтобы проанализировать взаимосвязь между временем выживания и этими двумя биомаркерами.

В заключение, это исследование показывает, что P53 можно использовать для выделения раннего HCC из передовых HCC, но HSP70 не может. Правильная комбинация этих двух хорошо известных маркеров HCC является более чувствительной и точной альтернативой для мониторинга прогрессирования хронических заболеваний печени и диагностики HCC на ранней стадии путем динамического наблюдения P53 и HSP70 на разных стадиях хронических заболеваний печени.

Источник поддержки: Это исследование поддерживается грантом Специального фонда молодых ученых Бюро здравоохранения Синьцзян-Уйгурского автономного района

Иммуногистохимическое окрашивание P53 или HSP70 в LC, раннем HCC или продвинутом HCC (× 200). (A) P53-негативное окрашивание в ткани LC, (B) P53-положительное окрашивание в ткани LC, (C) отрицательное P53 окрашивание в ранней ткани HCC, (D) P53-положительное окрашивание в ранней ткани HCC, (E) P53 (G) HSP70-отрицательное окрашивание в ткани LC, (H) HSP70-положительное окрашивание в ткани LC, (I) HSP70-негативное окрашивание в (J) HSP70-положительное окрашивание в ранней ткани HCC, (K) HSP70-негативное окрашивание в продвинутой ткани HCC, (L) HSP70-положительное окрашивание в продвинутой ткани HCC.

Клинико-патологические характеристики Контроля, CH, LC, Раннего HCC и Advanced HCC.

Контроль — пациенты с только гемангиомой печени; CH — хронический гепатит; LC — цирроз печени; HCC — гепатоцеллюлярная карцинома; HBs Ag — анти-гепатит B поверхностный антиген; HCV Ab — анти-гепатитное антитело.

Иммуногистохимический для выражений P53 и HSP70 в контроле, CH, LC, раннем HCC и продвинутых тканях HCC.

Контроль — пациенты с только гемангиомой печени; CH — хронический гепатит; LC — цирроз печени; HCC — гепатоцеллюлярная карцинома.

Диагностическая точность определения гепатоцеллюлярной карциномы с использованием одного или двух маркеров.

PPV — положительное прогностическое значение; NPV — отрицательная прогностическая ценность; LR — отношение правдоподобия. Параллельно — не менее 1 положительного. Серийный — оба 2 положительных.

Экспрессия P53 и HSP70 в тканях человека с прогрессирующей гепатоцеллюлярной карциномой с различными клинико-патологическими признаками.

Статистически значимые различия между высокой, умеренной и низкой дифференцировкой в ​​экспрессии P53 (P <0,001) и HSP70 (P <0,001).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *