Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Экстракт этанола из Lonicera japonica Thunb. Регрессирует безалкогольный стеатогепатит в моделировании метионина и холин-дефицитной диеты

The Ethanol Extract from Lonicera japonica Thunb. Regresses Nonalcoholic Steatohepatitis in a Methionine- and Choline-Deficient Diet-Fed Animal Model
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4632443/

Безалкогольный стеатогепатит (NASH) характеризуется как накопление жира в печеночной ткани, связанной с различными уровнями воспаления и прогрессирующим фиброзом. Сильные противовоспалительные и этнофармакологические свойства Lonicera japonica Thunb. (Caprifoliaceae) делают его отличным источником новых лекарственных целей для лечения NASH. Цель исследования состояла в том, чтобы исследовать влияние экстракта этанола L. japonica (LJEE) на NASH у мышей. Мышей C57BL / 6J кормили диетой с дефицитом метионин-холин (MCDD) в течение восьми недель для содействия развитию NASH. После разработки модели мышам вводили LJEE один раз в день через пероральный зонд в дозах 100, 200 или 300 мг / кг в течение еще четырех недель. Одновременное лечение с помощью LJEE (300 мг / кг / день) приводило к выраженным улучшениям в стеатозе печени, дегенерации баллона и воспалению. LJEE предотвращал индуцированный MCDD уровень плазмы в аспартатаминотрансферазе и аланинаминотрансферазе. LJEE значительно уменьшал уровень малонового уровня альдегида печени и улучшал воспаление печени и фиброз у мышей, которым кормили MCDD, которые были связаны с понижением регуляции подавления цитохрома P450 2E1 нескольких провоспалительных и профибротических генов. LJEE может предотвратить печеночный стеатоз, уменьшая экспрессию печеночного пероксисома ацил-CoA: диацилглицерол ацилтрансферазы 2, а также путем индуцирования экспрессии рецептора, активированного пролифератором. Кроме того, лечение LJEE вызывало значительное снижение фосфорилированной формы Jun N-концевой киназы наряду с увеличением фосфорилированного уровня дополнительной клеточной сигнальной киназы 1/2. Наше исследование продемонстрировало защитную роль LJEE в улучшении питания стеатогепатита.

Безалкогольная жирная болезнь печени (NAFLD) является условием, при котором избыточный жир накапливается в печени пациента, у которого нет истории злоупотребления алкоголем [1]. NAFLD подразделяется на две категории: простой стеатоз, в котором наблюдается только стеатоз, и неалкогольный стеатогепатит (NASH), в котором, помимо стеатоза, наблюдаются лобулярное воспаление и повреждение клеток печени. Хотя лежащие в основе механизмы прогрессирования заболевания остаются недостаточно понятными, гипотеза «двух хитов» описала патофизиологию NASH [2]. Стеатоз (первичное оскорбление) может сенсибилизировать печень до вторичных серьезных оскорблений, включая реактивные виды кислорода / азота, эндотоксины, полученные из кишечника, провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухолей-альфа (TNFα), что приводит к развитию NASH [3]. NASH может развиться в цирроз печени или гепатоцеллюлярную карциному [4]. Доступные варианты лечения для NASH включают в себя снижение веса, диетические изменения и изменения образа жизни, использование сенсибилизации инсулина и препараты, снижающие уровень липидов [5]. Кроме того, комбинации этих подходов были также опробованы для управления NASH [5]. Поскольку NASH является многофакторным заболеванием, терапия на основе одной цели имеет ограниченные последствия.

Lonicera japonica Thunb. (Caprifoliaceae), также известный как японская жимолость, «Джин Инь Хуа» или «Рен Донг», уроженец Восточной Азии, признан съедобной и лекарственной пищей [6]. Съедобные почки и цветы могут быть превращены в ликер и чай в народную диету [6]. В то же время его можно использовать в качестве медикаментов, косметики, декоративных обложек и т. Д. [6]. Составляющие этого растения ранее исследовались и показали, что они содержат иридоидные глюкозиды и полифенольные соединения [7]. Основными полифенольными компонентами в L. japonica являются хлорогеновая кислота, кофейная кислота, флавоадоринин-B, метилхлорогенат и протокатехиновая кислота, вносят большой вклад в ее особые виды деятельности [7]. В современной китайской фармакопее [8] хлорогеновая кислота была официально использована в качестве индикаторного соединения для характеристики качества этой травы. Современные фармакологические исследования показали, что L.
japonica имела широкие фармакологические действия, такие как антибактериальные, противовоспалительные, противовирусные, антиэндотоксиновые, жаропонижающие и другие виды активности [6]. С 1995 года Lonicera japonica была включена в Фармакопею Китайской Народной Республики [9] и была сделана в некоторых препаратах для лечения хронического энтерита, пневмонии, острого тонзиллита, нефрита, острого мастита, лептоспироза в клинике. L. japonica также широко используется для профилактики и лечения некоторых серьезных вирусных заболеваний человека и ветеринарии, таких как коронавирус SARS, вирус гриппа H1N1 (свиньи) [10]. В китайской фармакопее только цветы и цветочные почки были официально использованы в качестве активных частей для лечения заболеваний [8].

Фармакологические исследования показали, что L.
japonica обладает антифибротическим эффектом у крыс с фиброзом, индуцированным диметилнитрозамином [11]. Сообщалось также, что травяная формула, состоящая из L.
japonica ослабляет повреждение тетрахлорметана у крыс [12]; гепатопротекторный потенциал этого растения можно было бы рассмотреть. Однако, вероятность того, что L.
japonica может оказаться полезной в улучшении NASH, ранее не изучалась. Использование диеты с дефицитом незаменимых аминокислот, таких как метионин и холин, является хорошо принятой моделью для индуцирования NASH, которая отражает многие особенности этого заболевания у людей, включая гистологическую картину, которая имитирует то, что наблюдается при связанных с фиброзными расстройствами человека с накоплением печеночных липидов и наличием воспаления и окислительного стресса [13]. Для поддержки применения L.
japonica при лечении NASH-подобных расстройств, исследование исследовало гепатотерапевтический эффект L.
japonica в животной модели метаболизма, вызванного метионином и холиновым дефицитом (MCDD), и для выяснения основного механизма.

Ципрофибрат, производное волокнистой кислоты, является коммерчески доступным лекарственным средством при лечении гиперлипидемии [14]. Было зарегистрировано, что ципрофибрат при ежедневной пероральной дозе 10 мг / кг эффективен для улучшения гиперлипидемии у мышей с гипертриглицеридемией [14]. В настоящем исследовании ципрофибрат, таким образом, использовался в качестве положительного контроля для сравнения эффектов L.
japonica на мелиорации NASH.

Цветковые воздушные части L.
japonica были собраны в Ligang Township (Pingtung County, Taiwan) в ноябре 2014 года. Для подтверждения подлинности поставляемого растительного материала использовали макроскопические и микроскопические исследования, тонкослойную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) (этот анализ был в исполнении доктора Тан-Яо Хонга, кафедры биотехнологий, коллажей фармации и здравоохранения, Университета Тайдена). Образец ваучера (лот № LJ 20141121) сохранен в нашей лаборатории для дальнейшего использования. Цветковые воздушные части L.
japonica высушивали на воздухе, измельчали ​​до грубого порошка в механической мельнице и пропускали через сито 40 меш для получения порошкообразных образцов. Порошкообразные образцы (5 кг) экстрагировали при комнатной температуре трижды 10 л 95% -ного этанола в течение 48 ч на орбитальном шейкере, чтобы получить этанольные экстракты. Экстракт этанола L. japonica (LJEE) выпаривали досуха при пониженном давлении, чтобы полностью удалить спирт и лиофилизировали, получая приблизительно 582 г сухого остатка (вес. / Вес. Выход: 11,3%). LJEE хранили при -20 ° C до использования и суспендировали в дистиллированной воде. Затем содержание хлорогеновой кислоты в образцах анализировали с использованием системы HPLC Agilent 1100 (Agilent Technologies, Inc., Санта-Клара, Калифорния, США). Калибровочное уравнение площади пика по отношению к концентрации хлорогеновой кислоты составляло y = 6832,3 × + 117,2 (R2 = 0,9998). Содержание хлорогеновой кислоты в LJEE составляло 68,2 ± 0,3 мкг / г сухого экстракта.

Мышей C57BL / 6 шестинедельных мужчин C57BL / 6 получали из Национального центра лабораторных животных (Тайбэй, Тайвань). Их поддерживали в помещении с контролируемой температурой (25 ± 1 ° C) в 12h: 12h светло-темном цикле (свет в 06:00) в нашем центре для животных. Еда и вода были предоставлены ad libitum. MCDD и диетическое соотношение метионина и холина (MCSD) были приобретены у Dyets Inc. (№ 518810 и № 518754 соответственно, Вифлеем, Пенсильвания, Пенсильвания, США). Обе диеты содержали аналогичные питательные вещества (14,2% белка, 15% жиров, 3.09% золы и 5% волокна), за исключением того, что метионин и холин не были включены в MCDD, тогда как 1,70 г / кг метионина и 14,48 г / кг холинового битартата были предоставленный в MCSD. Все процедуры для животных выполнялись в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных национальных институтов здоровья, а также руководящими принципами Закона о благосостоянии животных. Эти исследования проводились с одобрения Комитета по институциональному уходу и использованию животных (IACUC) в Университете Tajen (IACUC 103-14, 12 декабря 2014 года).

После потребления MCDD в течение восьми недель группе из восьми мышей вводили пероральный зонд один раз в день либо с дозами LJEE 100, 200, либо 300 мг / кг в объеме 1,5 мл / кг дистиллированной воды. Режим дозирования был выбран на основе предыдущего отчета, в котором показано, что LJEE при 100 и 200 мг / кг потенциально эффективен для улучшения функции почек у крыс с диабетом [15]. Другую группу мышей, кормящих MCDD (n = 8), перорально вводили ципрофибрат (10 мг / кг / день), растворенный в дистиллированной воде, дозу, основанную на исследовании, которое указывало на то, что длительное лечение улучшало гиперлипидемию у гипертриглицеридемических мышей [14] , Обработанные машиной мыши получали только 1,5 мл / кг дистиллированной воды. Обработанную транспортным средством группу мышей, кормящих MCDD (n = 8), и группу мышей с MCSD (n = 8) обрабатывали 1,5 мл / кг дистиллированной воды только в течение того же периода лечения.

После дальнейшей четырехнедельной обработки животных взвешивали, голодали в течение 12 ч и приносили в жертву при внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (20 мг / кг). Образцы крови из нижней полой вены были собраны в гепаринизированный шприц (15 единиц / мл крови). Левую долю печени удаляли, промывали физиологическим раствором и хранили непосредственно при -80 ° С в жидком азоте до анализа. Правая доля печени была зафиксирована в 10% нейтрализованном формалине для гистологии. Относительный вес печени был вес печени, деленный на массу тела.

Образцы крови центрифугировали при 2000 × g в течение 10 мин при 4 ° С. Плазму удаляли и помещали в аликвоты для анализа. Диагностические наборы для определения уровня общего холестерина в плазме (TC, № 10007640) и триглицеридов (ТГ, кат. № 10010303) были приобретены у Cayman Chemical Company (Энн-Арбор, Мичиган, США). Наборы для определения концентрации аланин аминотрансферазы в плазме (ALT, EC 2.6.1.2, кат. A524-780TM) и аспартатаминотрансферазы (AST, EC 2.6.1.1, Cat. A559-780TM) были приобретены у Teco Diagnostics (Anaheim , Калифорния, США). Все экспериментальные анализы проводились в соответствии с инструкциями производителей; все образцы анализировали в трех повторностях.

Содержание печеночных липидов определяли из свежих образцов печени. Печень (1,25 г) гомогенизировали хлороформом / метанолом (1: 2, 3,75 мл) и хорошо перемешивали с хлороформом (1,25 мл) и дистиллированной водой (1,25 мл). После центрифугирования в течение 10 мин при 1500 × g нижнюю прозрачную органическую фазу переносили в новую стеклянную трубку и затем лиофилизировали. Лиофилизированный порошок растворяли в хлороформе / метаноле (1: 2) и хранили при -20 ° C менее чем за три дня [16]. Уровни холестерина в печени и уровни ТГ в липидных экстрактах анализировали с использованием тех же диагностических наборов, которые использовались для анализа плазмы.

Уровни малонового альдегида (MDA) печени, как показатель перекисного окисления липидов, определялись методом двойного нагрева [17]. Метод основан на спектрофотометрическом измерении пурпурного цвета, генерируемого реакцией тиобарбитуриновой кислоты (TBA) с MDA. Каждую ткань печени гомогенизировали (10% мас. / Об.) В 25 ммоль / л Tris-HCl, рН 7,4, и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 15 мин. Аликвоты супернатанта хранили при -70 ° С до анализа. Для MDA-анализа 2,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты (10%) добавляли к 0,5 мл супернатанта с последующим нагреванием в кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения до комнатной температуры образцы центрифугировали при 3000 об / мин в течение 10 мин, а затем 2 мл реакционной смеси переносили в пробирку, содержащую 1 мл раствора ТБА (0,67%). Затем каждую пробирку помещали в кипящую водяную баню в течение 15 мин. После охлаждения до комнатной температуры поглощение измеряли при 532 нм. Концентрация MDA рассчитывалась на основе коэффициента поглощения комплекса TBA-MDA.

Для микроскопического анализа слайды фрагментов печени окрашивали гематоксилином и эозином (H & E), а затем оценивали один патологоанатом, который не знал об экспериментальных группах. Гистопатологические особенности стеатогепатита оценивались полуколичественно в соответствии с утвержденной системой гистологического скоринга, рекомендованной Комитетом по патологии Сети клинических исследований NASH, следующим образом: степень стеатоза (0-3; 0: <5%, 1: 5% 33%, 2: 33% -66% и 3:> 66%), лобулярное воспаление (0-3; 0: отсутствие очагов, 1: <2 фокуса на 200 × поле, 2: 2-4 фокуса на 200 × поле и 3:> 4 фокуса на поле 200 ×), вспучивание гепатоцитов (0-2; 0: нет, 1: несколько баллонных клеток и 2: много клеток / заметное вспенивание) [18]. Все измерения проводились под легким микроскопом с прикрепленной цифровой камерой (C3040-AD6, Olympus, Tokyo, Japan) опытным патологом.

Образцы печени гомогенизировали в течение 30 мин в буфере для лизиса ледяной радиоиммунной защиты (50 ммоль / л Tris, pH 7,4, 150 ммоль / л NaCl, 1% Triton X-100, 1% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия, 1 мг / мл лейпептина, 50 ммоль / л фторида натрия, 1 ммоль / л ортованадата натрия и 1 ммоль / л фенилметилсульфонилфторида). Гомогенаты печени затем центрифугировали при 12000 об / мин в течение 30 мин при 4 ° С и определяли концентрации белка с использованием метода Брэдфорда. Равные количества белка (50 мкг) разделяли электрофорезом на полиакриламидном геле додецилсульфата натрия и подвергали электропереносу на мембранах из поливинилидендифторида, которые затем блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином и зондировали первичными антителами против дополнительной клеточной сигнальной киназы 1/2 (ERK 1/2, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), фосфо-ERK 1/2 (Thr202 / Tyr204) (Санта-Крус, Калифорния, США), Jun N-терминальная киназа (JNK, Santa Cruz Biotechnology) , фосфо-JNK (Thr183 / Tyr185) (Santa Cruz Biotechnology), митоген-активированной протеинкиназы p38 (p38, технология клеточной сигнализации, Beverly, MA, USA), фосфо-p38 (Thr180 / Tyr182) (p-p38, Cell Signaling Технология) или β-актин (Santa Cruz Biotechnology). Уровень β-актина оценивался для равной загрузки образца. Мембраны трижды промывали трис-буферным солевым раствором Tween 20 (TBST) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. После трех дополнительных промывок TBST иммунореактивные полосы визуализировали с помощью улучшенной хемилюминесценции (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) в соответствии с инструкциями производителя. Плотность плотностей определяли с использованием программного обеспечения ATTO Densitograph (корпорация ATTO, Токио, Япония). Во всех экспериментах равные нагрузки белка были подтверждены содержанием β-актина.

Чтобы проанализировать экспрессию генов, общую РНК экстрагировали из 100 мг замороженных образцов печени с использованием реактива Trizol (Invitrogen, Boston, MA, USA). РНК количественно определяли с помощью A260 и ее целостность проверяли электрофорезом в агарозном геле с использованием бромида этидия для визуализации. Для реакции обратной транскриптазы 1 мкг общей РНК на образец и 8,5 мкг / мкл случайных гексамерных праймеров нагревали до 65 ° С в течение 5 мин и затем гасили на льду. Эту смесь объединяли с 500 мкмоль / л каждого из dATP, dTTP, dCTP и dGTP, 10 ммоль / л DTT, 20 ммоль / л Tris-HCl (pH 8,4), 50 ммоль / л KCl, 5 ммоль / л MgCl2, 40 единиц рекомбинантного ингибитора рибонуклеазы RNaseOUT (Invitrogen) и 100 единиц обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen). Образцы обрабатывали ДНКазой (Promega, Madison, WI, USA) в течение 20 мин при 37 ° C в термическом циклере GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, California, CA, USA), а затем выдерживали при 4 ° C. После того, как аликвоты были взяты для немедленного использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР), оставшуюся часть кДНК хранили при -20 ° С. Экспрессию мессианной РНК (мРНК) измеряли количественной цепной реакцией обратной транскрипционной полимеразы реального времени (RT-PCR) в флуоресцентной температуре Lightcycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Праймеры для амплификации каждого гена перечислены в таблице 1. Высокоспецифическое измерение мРНК проводили для цитохрома P450 (CYP) 2E1, фактора некроза опухоли (TNF) α, трансформирующего фактора роста (TGF) -β, α-гладкой мускулатуры актин (SMA), коллаген I типа (коллаген I), матриксная металлопротеиназа (MMP) 2 и MMP9, пероксисом ацил-CoA: диацилглицерол-ацилтрансфераза 2 (DGAT2), активированный пролифератором рецептор (PPAR) α и β-актин с использованием LightCycler системы (Bio-Rad). Каждый образец запускали и анализировали в двух экземплярах. Праймеры были разработаны с использованием Primer Express Software версии 2.0 System (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA). Реакцию ПЦР проводили, используя следующий протокол циклирования: 95 ° С в течение 5 мин, 45 циклов 95 ° С в течение 5 с, 58 ° С в течение 15 с и 72 ° С в течение 20 с. Кривые диссоциации проводили после амплификации для идентификации конкретных продуктов ПЦР. Все уровни мРНК были нормализованы к значениям мРНК β-актина, а результаты были выражены как изменения складки значения порогового цикла (Ct) относительно контролей с использованием метода дельта-дельта Ct [19]. Для обеспечения специфичности амплификации во время RT-PCR амплифицированные продукты подвергали электрофорезу в агарозном геле, чтобы визуально подтвердить наличие единственного ампликона ожидаемого размера.

Последовательности праймеров, используемых для анализа RT-PCR в реальном времени в этом исследовании.

FP, передний праймер; RP, обратный праймер.

Данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводился с использованием одностороннего дисперсионного анализа. Для определения источника существенных различий, когда это необходимо, использовались последовательные сравнения Даннетта. Для статистического анализа использовалась программа SigmaPlot (версия 12.0) (Systat Software, San Jose, CA). Значения p <0,05 считались статистически значимыми.

MCDD заметно уменьшило вес тела мыши и печени по сравнению с MCSD (таблица 2). Лечение мышей с MCDD с LJEE (300 мг / кг / день) не приводило к каким-либо значительным воздействиям на массу тела, абсолютную массу печени и относительную массу печени (таблица 2). Аналогичные результаты были получены для мышей, которым кормили MCDD, которые получали ципрофибрат (таблица 2).

Уровни плазмы TC и TG были ниже у мышей, которым кормили MCDD, чем у животных с MCSD. Лечение мышей с MCDD с помощью LJEE или ципрофибрата не оказывало существенного влияния на TC и TG плазмы (таблица 2).

Уровни холестерина в печени и TG были значительно выше у мышей, которым мы получали MCDD, по сравнению с мышами из группы, получавшей MCSD. Лечение MCDD-кормящих мышей с помощью LJEE (300 мг / кг / сут) приводило к снижению уровней холестерина в печени и ТГ на 30,9% и 29,2% соответственно по сравнению с уровнями у мышей, получавших MCDD, обработанных транспортным средством (таблица 2). Печеночные уровни холестерина и TG у мышей, получавших MCDD, получавших лечение ципрофибратом, были снижены на 33,6% и 40,5% соответственно по сравнению с уровнями мышей, получавших MCDD, обработанных транспортным средством (таблица 2).

Активность плазмы ALT и АСТ у мышей с MCDD была выше, чем в группе, получавшей MCSD (таблица 2). Активность плазмы ALT и АСТ заметно снижалась у мышей, кормящих MCDD, в течение четырех недель с использованием 300 мг / кг / день LJEE (таблица 2). Обработка ципрофибратом также значительно ослабляла изменения активности ALT в плазме и активности АМТ у мышей с диетическим питанием MCD (таблица 2).

Секции печени из группы MCSD, окрашенной H & E, показали нормальные печеночные клетки и гистоархитектуру (рис. 1A). MCDD индуцировал измеряемый печеночный стеатоз (главным образом с преобладающей макровезикулярной картиной) у мышей, и это прогрессировало до воспаления и фиброза (рис. 1А). Печеночный стеатоз, лобулярное воспаление и вспучивание гепатоцитов были значительно снижены в группе LJEE (300 мг / кг / день) и ципрофибрата в сравнении с группой, получавшей только MCDD (рисунок 1A). Гистологию печени оценивали с использованием оценки NASH (рисунок 1B).

Влияние на биохимию крови и параметры печени у MCSD- или MCDD-кормовых мышей, получавших четыре недели лечения.

Транспортное средство (дистиллированная вода), используемое для приготовления испытуемого лекарственного раствора, давали в том же объеме. Значения (среднее ± SD) были получены из каждой группы из восьми животных в каждой группе после четырех недель экспериментального периода.
p <0,05 и b p <0,01 по сравнению со значениями мышей, получавших MCDD, обработанных транспортным средством, в каждой группе соответственно.

Эффекты лечения гистологии печени. (A) Репрезентативные изображения окрашенных гематоксилином и эозином печенью из мышей, содержащих метионин и холин-достаточную диету (MCSD), и мышей с дефицитом метионин-холин (MCDD) после четырех недель лечения LJEE или ципрофибрата. Транспортное средство (дистиллированная вода), используемое для приготовления растворов для тестовых лекарств, давали в том же объеме. Микрофотографии (оригинальное увеличение, 200 ×) печени, выделенных от мышей, обработанных MCSD, обработанных транспортным средством (MCSD +), обработанных машиной MCDD-носителей (машина MCDD +), 100 мг / кг / день (MCDD + L. japonica экстракт этанола (LJEE) 100), 200 мг / кг / день (MCDD + LJEE 200) и 300 мг / кг / день (MCDD + LJEE 300), обработанные LJEE, мышами MCDD. Другой группе мышей, которым вводили MCDD, вводили перорально 10 мг / кг / день ципрофибрата (MCDD + ципрофибрат); (B) Разделы оценивались патологоанатом слепым способом, а метод оценки был назначен, как описано в экспериментальных методах оценки NASH. Значения (среднее ± стандартное отклонение (SD)) были получены из каждой группы из восьми животных.
p <0,05 и b p <0,01 по сравнению со значениями мышей, получавших MCDD, обработанных транспортным средством, в каждой группе соответственно.

Печеночный уровень MDA у мышей с MCDD был значительно выше, чем в группе, получавшей MCSD (таблица 2). Лечение LJEE ослабляло уровни MDA в печени у мышей, которым кормили MCDD дозозависимым образом (таблица 2). Уровни МПД печени у мышей с MCDD также уменьшались при лечении ципрофибратом (таблица 2).

Уровни экспрессии печеночной мРНК CYP2E1, TNFα и TGF-β1 у мышей, получавших MCDD, были увеличены соответственно в 2,7, 3,2 и 2,3 раза по сравнению с уровнями в группе, получавшей MCSD (таблица 3). Однако мышам, получавшим MCDD с LJEE (300 мг / кг / день), снижалась экспрессия мРНК печени CYP2E1 (0,6 раза), TNFα (0,7 раза) и TGF-β1 (в 0,7 раза) относительно уровней экспрессии в обработанных транспортным средством MCDD-мышах (таблица 3). Лечение MCDD-кормящих мышей ципрофибратом уменьшало экспрессию мРНК печени CYP2E1 (0,7 раза), TNFα (0,7 раза) и TGF-β1 (0,6 раза) по сравнению с мышами, обработанными MCDD, обработанными транспортным средством (таблица 3 ).

По сравнению с группой, получавшей MCSD, уровни мРНК печени α-SMA, коллагена I, MMP2 и MMP9 у мышей с MCDD повышались, очевидно, соответственно (3,1, 3,3, 2,7 и 3,2 раза), таблица 3) , которые были снижены при лечении LJEE (300 мг / кг / день) (30,8, 38,3, 25,8 и 34,2% соответственно); Таблица 3). Уровень печеночной мРНК α-SMA, коллагена I, MMP2 и MMP9 у мышей, получавших MCDD, получавших лечение ципрофибратом, снижался до 71,8, 59,2, 70,5 и 60,8% по сравнению с уровнями экспрессии в обработанных автомобилем аналогах соответственно (таблица 3).

Уровни печеночной мРНК DGAT2 были значительно снижены (на 51,7%) в LJEE (300 мг / кг / день), обработанных MCDD, по сравнению с обработанными носителем аналогами (таблица 3). Ципрофибрат подавлял индуцированную MCDD стимуляцию в уровнях мРНК печени DGAT2 до 58,6% по сравнению с теми, что были у их обработанных носителем аналогов (таблица 3).

Уровни мРНК PPARα в печени мышей, кормящих MCDD, были ниже, чем 47,6% от группы, получавшей MSCD (таблица 3). Уровень печеночной мРНК PPARα повышался с помощью терапии LJEE (300 мг / кг / день) или ципрофибрата с увеличением 57,4 и 65,9% по сравнению с теми, которые наблюдались у обработанных носителем аналогов (таблица 3).

Никаких существенных изменений в фосфорилированной форме ERK среди мышей, получавших MCDD, по сравнению с группой, получавшей MCSD. Лечение MCDD-кормящих мышей с помощью LJEE привело к значительному увеличению степени фосфорилирования ERK (рис. 2). Аналогичные результаты были получены в группе, получавшей ципрофибрат MCDD (фиг. 2).

Фосфорилирование JNK было значительно больше в печени MCDD-кормленных мышей по сравнению с группой, получавшей MCSD (рисунок 2). LJEE (300 мг / кг / сут), обработанные MCDD-мышами, на 32,8% ниже фосфорилирования JNK в печени, чем у их обработанных носителем аналогов (рисунок 2). Ципрофибрат подавлял печеночное JNK-фосфорилирование мышей, которым кормили MCDD, на 29,8% по сравнению с их обработанными ими аналогами (рисунок 2).

Никаких изменений в фосфорилировании p38 в печени MCDD-кормов не наблюдалось по сравнению с группой, получавшей MCSD (рисунок 2). Лечение MCDD-кормящих мышей с LJEE или ципрофибратом не влияло на фосфорилирование р38 в печени (рисунок 2).

Никаких изменений в общем содержании печеночных ERK, JNK и / или p38 не произошло среди разных групп (рисунок 2).

Эффекты на экспрессию мРНК печени специфических генов, связанных с НАСГ, у мышей с MCSD- или MCDD, получавших четыре недели лечения.

Транспортное средство (дистиллированная вода), используемое для приготовления испытуемого лекарственного раствора, давали в том же объеме. Значения (среднее ± SD) были получены из каждой группы из восьми животных в каждой группе после четырех недель экспериментального периода.
p <0,05 и b p <0,01 по сравнению со значениями мышей, получавших MCDD, обработанных транспортным средством, в каждой группе соответственно.

Эффекты лечения сигнальных путей митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) в печени мышей. Репрезентативная структура вестерн-блоттинга активации печеночной MAPK у мышей, получавших MCSD- и MCDD, после четырех недель лечения LJEE или ципрофибрата. Мышам, которым вводили MCDD, вводили пероральный желудочный зонд один раз в день в течение четырех недель с помощью LJEE при 100 (LJEE 100), 200 (LJEE 200) или 300 мг / кг / день (LJEE 300). Другой группе мышей, получавших MCDD, вводили перорально 10 мг / кг / день ципрофибрата (ципрофибрат). Мышам с MCSD- или MCDD, получающим обработку автомобиля, давали одинаковый объем носителя (дистиллированной воды), используемого для приготовления тестируемых лекарственных средств. Соотношения p-ERK / ERK, p-JNK / JNK или p-p38 / p38, выраженные как среднее с SD (n = 8 на группу) в каждом столбце, показаны на нижней панели.
p <0,05 и b p <0,01 по сравнению со значениями мышей, получавших MCDD, обработанных транспортным средством, в каждой группе соответственно.

Гистопатологические особенности NASH включают признаки стеатоза, повреждения клеток печени, смешанного воспалительного долькового инфильтрата и различных степеней фиброза [2]. MCDD — это хорошо зарекомендовавшая себя и широко используемая модель питания стеатогепатита, которая вызывает печеночный стеатоз и воспаление, которые имитируют NAFLD у людей [13]. В этом исследовании мыши последовательно развивали стеатоз, травму надувания и воспалительную клеточную инфильтрацию после приема MCDD, что соответствует предыдущим сообщениям об этой пищевой модели NASH [20]. Гистопатологические данные в печени у мышей, кормящих MCDD, значительно улучшались при лечении LJEE. Мы также обнаружили, что активность ALT и АСТ была заметно снижена у мышей, кормящих MCDD, обработанных LJEE. АСТ и АЛТ считаются чувствительными показателями гепатоцеллюлярного повреждения, и в пределах могут обеспечить количественную оценку степени повреждения печени [21]. Эти результаты свидетельствуют о том, что LJEE ослабляет повреждение печени в модели животных NASH, индуцированной MCDD.

Накопление жира в печени можно признать «первым попаданием» в патогенез NASH. Мы обнаружили, что LJEE оказывает фармацевтическое воздействие на уровень холестерина в печени и TG. В нескольких исследованиях было высказано предположение о том, что печеночный липогенез увеличивается при стеатозе печени, что может быть вызвано либо усилением синтеза ТГ, либо уменьшением окисления жирных кислот, что приводит к увеличению содержания ТГ в печени [22]. DGAT2 представляет собой микросомальный фермент, который соединяет ацил-CoA с 1,2-диацилглицерином и, таким образом, представляет собой заключительную стадию биосинтеза TG [23]. Хотя MCDD способствует внутрипеченочному накоплению липидов за счет нарушения секреции липопротеинов очень низкой плотности (VLDL) [24,25], гены, кодирующие мРНК, связанные с липогенезом, такие как DGAT2, были подавлены у мышей, которым вводили MCDD [26,27], что согласуется с нашими выводами. Наши результаты показали, что экспрессия DGAT2 у мышей, кормящих MCDD, также уменьшалась в группе, получавшей LJEE. Эти результаты продемонстрировали, что LJEE индуцирует понижающую регуляцию генов, связанных с липогенезом, для ингибирования накопления печеночных липидных капель путем снижения синтеза TG у мышей, питающихся MCDD. Микросомальный белок переноса TG (MTTP) отвечает за сборку VLDL и экспорт из печени, что, вероятно, способствует нарушению метаболизма триглицеридов [28]. Однако уменьшенная экспрессия MTTP была обнаружена в различных моделях мыши NASH [29,30]. Дальнейшие прямые исследования необходимы для оценки того, достаточно ли изменений LJEE для исправления дефекта. Кроме того, уровень мРНК PPARα был значительно увеличен у обработанных LJEE MCDD-мышей. PPARα играет центральную роль в поглощении и β-окислении жирных кислот, особенно в печени, и, как сообщается, защищает от MCDD или с высоким содержанием жиров NASH у грызунов [31,32]. Благотворное влияние LJEE на лечение стеатоза печени может быть частично вызвано окислением жирных кислот в печени.

Стеатоз печени повышает восприимчивость печени к более серьезным оскорблениям, таким как воспаление и повышенный окислительный стресс, особенно в присутствии окисляемых ненасыщенных жирных кислот в стеатотических печеньх. Окисление ненасыщенных жирных кислот может увеличить перекисное окисление липидов, которое может активировать клетки стеарата печени, тем самым ускоряя развитие фиброза [33]. CYP2E1, член семейства цитохромов оксидоредуктазы, может окислять различные мелкие молекулярные субстраты, включая ксенобиотики, этанол и жирные кислоты [34]. Экспрессия и активность CYP2E1 в печени повышаются у людей и на животных моделях NAFLD, что считается критическим «ударом» при переходе от доброкачественного стеатоза к стеатогепатиту [34]. В этой работе лечение LJEE подавляло экспрессию CYP2E1 и уменьшало уровень печеночной MDA, маркер перекисного окисления липидов у мышей, которым кормили MCDD, что указывает на то, что лечение LJEE может уменьшить вызванный MCDD окислительный стресс в печени.

Согласно теории «двух хитов» для патогенеза NASH, реактивные кислородные продукты, которые увеличиваются при «втором ударе», вызывают накопление продуктов перекисного окисления липидов, митохондриальную дисфункцию и повышенную секрецию провоспалительных цитокинов, таких как TNFα [35 ]. TNFα является воспалительным цитокином, который играет важную роль в развитии от стеатоза к NASH и вызывает секрецию различных других цитокинов и хемокинов [36]. Среди этих секретируемых цитокинов наиболее важным является TGF-β, который играет ключевую роль в фиброгенезе печени через активацию гепатоцеллюлозы (HSC) [37]. HSC-активация TNFα и TGF-β приводит к экспрессии и осаждению α-SMA и коллагена [38]. TNFα также модулирует несколько матричных металлопротеиназ, которые участвуют в травме печени, ремонте и ремоделировании, причем MMP1 и MMP9 являются наиболее важными MMP в отношении заболевания печени [39]. Настоящее исследование демонстрирует, что LJEE снижает уровень мРНК печеночных TNFα и TGFβ, которые в противном случае выше после кормления MCDD. Повышенная экспрессия α-SMA и различных факторов, связанных с внеклеточным матриксом, таких как коллаген I, MMP2 и MMP9 в печени мышей, кормящих MCDD, также уменьшалась при лечении LJEE. Результаты настоящего исследования предполагают ослабление второго удара LJEE улучшенным воспалением печени и фиброзом, вызванным MCDD.

Активация регуляторной митоген-активированной протеинкиназы (MAPK), такой как JNK и p38, путем фосфорилирования обычно приводит к гибели клеток и воспалению [40, 41]. Сообщается о увеличенном фосфорилировании JNK у мышей модели NASH, тогда как p38-путь оставался неизменным MCDD [42]. Наши данные, в полном согласии с опубликованными отчетами [43], показали, что MCDD привела к более высокому фосфорилированию JNK; лечение LJEE уменьшало фосфорилирование JNK у мышей модели NASH. Хотя ингибирование активации p38 продемонстрировало четкую связь с эффектом пользы LJEE для ослабления почечной дисфункции, связанной с гипергликемией [15], наши данные показали, что активация p38 не влияла ни на MCDD, ни на введение LJEE. Кроме того, было сообщено, что путь ERK MAPK не участвует в индуцированном MCDD NASH, однако сообщается, что его активация уменьшает экспрессию DGAT2; Вероятно, активация ERK необходима для лечения болезни [42,44]. В этом исследовании мы продемонстрировали, что LJEE увеличился в степени фосфорилирования ERK, что может привести к увеличению регенерации печени и восстановлению накопленного жира и воспалению за счет уменьшения экспрессии DGAT2, провоспалительных цитокинов и хемокинов в NASH. Эти результаты показали, что ингибирующее действие LJEE на развитие и прогрессирование NASH, по-видимому, регулируется увеличением активности ERK и ослаблением активации JNK.

Гепато-защитные эффекты LJEE против MCDD-индуцированного NASH, по-видимому, эффективны для тех, которые продуцируются ципрофибратом в указанной дозировке. Более 140 соединений были выделены и идентифицированы у L. japonica до сих пор [6]. Конкретные активные составляющие (ы) LJEE, ответственные за его защитные гепатоэффекты, еще предстоит идентифицировать в будущих исследованиях.

Наши данные свидетельствуют о том, что LJEE может предотвратить печеночный стеатоз, уменьшая экспрессию печеночной DGAT2, а также индуцируя экспрессию PPARα. Кроме того, наши данные свидетельствуют о том, что LJEE ингибирует развитие воспаления печени и фиброза путем подавления нескольких воспалительных молекул. Ингибирующее действие LJEE на NASH обусловлено ингибированием JNK и усилением активации ERK. LJEE может быть вариантом для профилактики и лечения NASH.

Настоящее исследование было поддержано грантом Министерства науки и технологий (102-2320-B-127-001-MY3) Тайваня.

Thing-Fong Tzeng способствовал изучению дизайна, интерпретации данных и написанию рукописей. Ю-Чэн Цзэн и Ю-Джо Ченг провели эксперименты Шоронг-Ши Лиу руководили работой и оценивали данные. I-Min Liu руководил работой, оценивал данные, писал рукопись и получал финансирование. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *