Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Семь недель западной диеты у мышей с аполипопротеином-E-дефицитом индуцируют метаболический синдром и безалкогольный стеатогепатит с фиброзом печени

Seven weeks of Western diet in apolipoprotein-E-deficient mice induce metabolic syndrome and non-alcoholic steatohepatitis with liver fibrosis
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4531783/

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Безалкогольный стеатогепатит (NASH) характеризуется печеночным стеатозом, воспалением и фиброзом, который может прогрессировать до цирроза. Человеческий NASH связан с метаболическим синдромом (MS). В настоящее время модели грызунов NASH либо не имеют значительного фиброза, либо MS. Мыши ApoE — / — являются MS-моделью, используемой в исследованиях сердечно-сосудистой системы. Целью этой работы было создание и характеристика новой мышиной модели NASH со значительным фиброзом и МС. ApoE — / — и мышей дикого типа (wt) кормили либо западной диетой (WD), метионин-холин-дефицитной диетой (MCD), либо нормальной чау. Гистология печени, RT-ПЦР, содержание гидроксипролина в печени, уровни триглицеридов и холестерина и уровни глюкозы натощак оценивали стеатоз печени, воспаление и фиброз. Кроме того, портальное давление измерялось инвазивно, а патологию почек оценивали по гистологии. ApoE — / — мыши, принимающие WD, проявляли аномальную толерантность к глюкозе, гепатомегалию, прибавку в весе и полный спектр NASH, включая стеатоз печени, фиброз и воспаление, без признаков повреждения почек. MCD-животные показали менее выраженный фиброз печени, но обнаруживали патологические изменения почек, помимо потери веса и неизменной толерантности к глюкозе. В этом исследовании описывается модель мышиного NASH с выраженным стеатозом печени, воспалением и фиброзом, без почечной патологии. ApoE — / — мыши, принимающие WD, представляют собой новую и быструю модель со всеми характерными особенностями NASH и MS, хорошо подходящими для исследований NASH.

Безалкогольная жирная болезнь печени (NAFLD) охватывает широкий спектр заболеваний: от простого стеатоза до безалкогольного стетоатепатита (NASH) с возможным прогрессированием цирроза1. NAFLD характеризуется метаболическим синдромом, дислипидемией, резистентностью к инсулину и ожирением23 и связан с увеличением смертности, связанной с печенью4. Патогенез NAFLD плохо изучен. Помимо «двухтактной» модели, в которой говорится, что после первого повреждения (стеатоза) дальнейшие повреждения, такие как окислительный стресс и последующее воспаление, приводят к NASH5, были опубликованы несколько дополнительных гипотез об инициации и развитии NAFLD, которые в итоге все они характеризуются наличием стеатоза, воспаления и фиброза6789. Хотя разные модели животных демонстрируют особенности NASH, многие модели не имеют ключевых особенностей человеческого NASH, таких как MS (например, в модели MCD) или фиброза печени10. Поэтому необходимы дополнительные животные модели, особенно проявляющие метаболический синдром11.

Аполипопротеин E (ApoE) является важным игроком в метаболизме липопротеинов у людей и мышей. Его отсутствие предрасполагает к гиперхолестеринемии, атеросклерозу и ожирению1213. Кроме того, было опубликовано, что мыши ApoE — / — проявляют спонтанно повышенное воспаление и высокий уровень холестерина по сравнению с мышами с мышей14. В ApoE — / — мышах, питающихся высокожирной диетой (HFD), эти эффекты были еще более выраженными, а MS развивается151617. Долгосрочное кормление западной диеты (WD) у мышей с двойным дефицитом ApoE-LDLR приводит, помимо стеатоза и воспаления, к фиброзу печени, но также к печеночному опухолеобразованию18.

Поскольку дефицит ApoE, по-видимому, играет важную роль в РС и может быть связан с NAFLD, это исследование было нацелено на создание и характеристику быстрой модели NASH у мышей, которая более точно имитирует основные характеристики человеческого НАСГ, включая стеатоз, воспаление и фиброз, чем существующие НАСГ моделей.

Масса тела мышей, питающихся WD, не была значительно увеличена по сравнению с однопометниками, которых кормили обычным чауном (рис.1B). ApoE — / — мышам, которых кормили WD, показали значительное увеличение средней массы тела в течение семи недель диеты по сравнению с мышами ApoE — / -, кормящими нормальной нормой (+ 6,3%). Напротив, обе мыши wt и ApoE — / -, которым кормили диету MCD, показали значительное снижение средней массы тела по сравнению с однопометниками, которых кормили обычным чау, с мышами, которые демонстрировали более выраженную потерю веса в сравнении с ApoE — / -. WD, но не диета MCD, вызвала значительное увеличение отношения печени к массе тела у мышей ApoE — / — (рис.1C).

Уровни глюкозы натощак были значительно увеличены у мышей ApoE — / — по сравнению с мутантами с обычным чау-чау (рис. 2А). Это увеличение было также значительным у мышей, которым вводили WD, однако с более высоким уровнем глюкозы натощак на сыворотке по сравнению с мышами, получавшими нормальную чау. Напротив, мыши, получавшие диету MCD в течение семи недель, показали значительно пониженный уровень сывороточного глюкозы натощак (фиг.2А).

Печеночные триглицериды были увеличены у мышей, получавших WD, по сравнению с мышами, получавшими нормальную чау, с небольшой, но не значимой тенденцией к более высоким уровням у мышей ApoE — / — (фиг.2B). У мышей, получавших диету MCD, измеряли самые высокие уровни триглицеридов в печени (фиг.2B). Профили липопротеинов сыворотки показали глубокие изменения между мышами ApoE — / — и мышами, которые получали WD, с заметным сдвигом в сторону увеличения уровней VLDL у мышей ApoE — / -, питаемых WD (фиг.2C). ApoE — / — мышам, получавшим WD, наблюдалось увеличение уровней общего и свободного холестерина в печени по сравнению со всеми другими наблюдаемыми группами (рис. 2D, E). Компоненты биосинтеза холестерина, показанные на основе общих уровней десмостерола, были значительно увеличены у мышей ApoE — / -, питаемых WD, по сравнению с wt однопометниками (фиг.2F). Согласно этим данным, у мышей ApoE — / — мышей повышали содержание печеночных холестериновых эфиров по сравнению с соответствующими мутантами с высоким содержанием сложных эфиров холестерина в печени у мышей ApoE — / -, которые получали WD (поддерживающий рисунок S1A). MCD, кормили мышами с мышами, также повышали уровни печеночных эфиров холестерина по сравнению с мышами, которые получали нормальную чау, но не смогли достичь уровня ApoE — / — мышей, получавших WD (поддерживая рисунок S1A).

Печеночный стеатоз дополнительно определяли количественно окрашиванием Oil Red O, гистологическим маркером для накопления жира в гепатоцитах (фиг.2G, H). Сравнивая все группы, мышей ApoE — / -, которые вводили с WD, показали наивысшее количество положительного окрашивания Oil Red O (фиг.2G, H). По сравнению с мышами с нормальной чау, мышей, которым кормили диету MCD, было значительно увеличено окрашивание Oil Red O, однако никаких различий между wt и ApoE — / — мышами не было (рис. 2G, H). Интересно отметить, что в ApoE — / — кормили WD микровезикулярным стеатозом, преобладали, тогда как у мышей, которым кормили диету MCD, наблюдался преимущественно макровезикулярный стеатоз (рис. 2G).

Возникновение гепатоцитов, как важная функция для диагностики NASH, наблюдалось у мышей ApoE — / -, получавших WD, и у мышей, которым кормили диету MCD. Интересно, что у ApoE — / — мышей, получавших нормальный чау, и клетки WD были более надутыми, чем у мышей с соответствующей диетой, тогда как не было очевидной разницы в клеточном баллонге у мышей, получавших диету MCD (поддерживая рисунок S1B).

Западная диета значительно увеличивала пролиферацию воспалительных клеток после травмы у мышей ApoE — / — по сравнению с мышами wt, как определено количественно положительным окрашиванием Ki67 (фиг.3A, B). Уровни положительных клеток Ki67 у мышей, которым кормили диету MCD, были незначительно, но не значительно увеличены, что сопоставимо с уровнями мышей ApoE — / -, которым вводили WD. Не было обнаружено разницы между wt и ApoE — / — мышами (рис.3A, B).

Экспрессия провоспалительных маркеров IL1β, TNFα, MCP1 и Emr1 (F4 / 80) была значительно выше у мышей ApoE — / -, которым вводили WD по сравнению с мышами дикого типа, которые либо питались WD, либо диетой MCD (фиг.3C). Кроме того, мыши ApoE — / -, питаемые MCD, показали аномально высокие уровни экспрессии провоспалительных маркеров IL1β и MCP1 (фиг.3C).

Аналогично уровням экспрессии гена Emr1 (F4 / 80), мыши ApoE — / -, вводимые с WD, показали значительно повышенное положительное окрашивание F4 / 80 по сравнению с мышами дикого типа, получавшими диету WD или MCD (рис. 3D, E), что указывает на увеличение вербовка макрофагов. Диета MCD у мышей с мышей показала также значительно увеличенный набор макрофагов по сравнению с мышами, которые получали нормальный чау, но не смогли достичь уровня ApoE — / — мышей, получавших WD (рис. 3D, E).

Фиброз печени оценивали путем осаждения печеночного коллагена (содержание гидроксипролина в печени, мРНК коллагена), экспрессии мРНК TGFβ и красного окрашивания Sirius. Экспрессия гена коллагена I типа (Col1a1) и профибротического маркера TGFβ была увеличена у мышей ApoE — / -, которым вводили WD по сравнению с мышами, которые получали либо с WD, либо с диетой MCD (фиг.4A). Аналогично уровням мРНК провоспалительных маркеров уровни экспрессии коллагена и TGFβ были самыми высокими у мышей ApoE — / -, которым вводили MCD (фиг.4A).

Содержание гидроксипролина в печени было значительно увеличено у мышей ApoE — / -, которым вводили WD, по сравнению с мышами, которые получали либо WD, либо мышам, получавшим диету MCD (фиг.4B). Количественное определение окрашивания сириусом подтвердило вывод о том, что фиброз был значительно увеличен у мышей ApoE — / -, питаемых WD, по сравнению с wt однопометниками (фиг.4C, D). Окрашивание показало фиброз у мышей ApoE — / -, которым вводили WD, что не наблюдалось у мышей, которым кормили нормальную чау и мышей, которым вводили WD (фиг.4С). У мышей, питающихся диетами MCD, пигментное красное положительное окрашивание Sirius было сопоставимо с таковыми у мышей ApoE — / -, которым вводили WD (фиг.4C, D). Анализируя области фиброза отдельно, перипортальный и лобулярный фиброз были более выражены у мышей, кормящих MCD, и у мышей ApoE — / -, которые получали WD (таблица 1).

Активацию печеночных звездчатых клеток оценивали по уровням мРНК и иммуногистохимическому окрашиванию суррогатного маркера αSMA. В ApoE — / — мышах, питающихся WD мРНК, уровни αSMA значительно повышались по сравнению с wt однопометниками (фиг.5A). У мышей, получавших уровни экспрессии гена дикого типа MCD, αSMA существенно не отличались от уровней мыши ApoE — / -, которым вводили WD. В соответствии с уровнями мРНК αSMA положительное окрашивание было значительно увеличено у мышей ApoE — / -, которым вводили WD по сравнению с мышами wt и аналогичными по сравнению с мышами, получавшими диету MCD (фиг.5B, C). У ApoE — / — мышей, питающихся WD, давление порта было увеличено после семи недель диеты по сравнению с мышами ApoE — / -, которые кормили обычным чау и мышам, которым кормили диету MCD. Интересно, что у мышей, получавших диету MCD, наблюдался повышенный фиброз по сравнению с маслом, получаемым с нормальной чау-чау, но не развивал увеличенного портального давления. Напротив, мышей, которым вводили WD и ApoE — / — мышей, кормили диету MCD, показали более высокое портальное давление, чем мыши ApoE — / -, вводимые WD (рис.5D).

Макроскопически, никаких патологических изменений, которые наблюдались в почках, отличались меньшим размером почек от мышей, питающихся диетой MCD (рис.6А). Детальный анализ окрашиваний Периодической кислоты Шиффа (PAS) и Acidic Fuchsin Orange G (AFOG) не выявил каких-либо явных патологических изменений в клубочках (фиг.6B, D), тубулоинтерстития (рис.6C) или сосудов (фиг.6C со звездочками) ,

Никаких патологических инфильтратов положительных клеток F4 / 80 не наблюдалось ни в одной из групп, кроме значительного увеличения положительных клеток F4 / 80 у мышей ApoE — / -, которым кормили диету MCD (таблица 2 и рис.6E). Аналогично, иммуногистохимия коллагена I типа подтвердила результаты гистологии без наблюдаемого фиброза ни в одной из групп, кроме значительно увеличенного осаждения у мышей ApoE — / -, которым кормили диету MCD (табл. 2 и фиг.6F).

Это исследование характеризует новую модель мышиного NASH с явным фенотипом метаболического синдрома. ApoE — / — мышам, питающимся высокожирной западной диетой (WD), обогащенной холестерином, в течение семи недель, развился метаболический синдром и показал: (i) быстрое развитие стеатоза, (ii) вспучивание гепатоцитов, (iii) высокие уровни глюкозы натощак , (iv) воспаление, (v) с выраженным фиброзом, (vi) портальная гипертензия и (vii) отсутствие повреждений почек.

Многие из существующих в настоящее время моделей животных, генетически или диетически индуцированные, не отражают полный спектр человеческого НАС1011. Поскольку дефицит ApoE может быть связан с NAFLD / NASH и, как представляется, играет важную роль в развитии MS121314151617, мы выбрали ApoE — / — мышей, чтобы установить эту новую модель NASH. У этих мышей западный образ жизни был имитирован западной диетой (WD), богатой холестерином и жиром, усиливая эффекты нокаута и приводя к NASH. Мы напрямую сравнивали нашу модель WD у мышей ApoE — / — с WD у мышей wt, а также с хорошо охарактеризованной диетой, содержащей метионин и холин (MCD). Генетически основанные (ob / ob, db / db) и диетические модели (MCD, фруктоза) приводят к развитию стеатоза. Однако ob / ob мышей защищены от фиброза [19]. В отличие от человеческого НАСГ, стеатоз у трансгенных мышей SREBP и некоторых диетических моделей (MCD, фруктоза) не связан с ожирением202122. Более того, метаболический профиль MCD, связанный с уменьшением веса, является противоположным человеческому NASH. Увеличение отношения массы тела к массе у мышей ApoE — / -, вводимых с помощью WD, демонстрирует гепатомегалию, характерную характеристику, которой не было у мышей, получавших диету MCD. MCD не только приводило к уменьшению массы тела, но также уменьшало размер почек, что было более выражено у мышей ApoE — / -, которым кормили MCD. Однако он также присутствовал у мышей, которым кормили диету MCD. Важно отметить, что у ApoE — / — мышей, питающихся диетами MCD, наблюдалось воспаление почек и фиброз.

Мы обнаружили повышенное содержание пептидов в триглицеридах и стеатозе печени вместе с ожирением у мышей ApoE — / -, которым вводили WD, что хорошо согласуется с предыдущим исследованием15. В другом недавнем исследовании использовали двойных нокаутных мышей ApoE / LDL-рецепторов, которым вводили WD в течение 35 недель, чтобы вызвать стеатоз, фиброз и около 30% животных, опухоли печени18. Однако недостаток ApoE, по-видимому, более важен для развития NASH, как показали наши результаты, которые нашли полную картину NASH после семи недель диеты.

По сравнению с часто используемой моделью MCD, после семи недель животных на диете MCD не развивались аномальные концентрации глюкозы натощак, на самом деле они были значительно уменьшены по сравнению с мышами, которых кормили обычным чау. Аномальные уровни глюкозы натощак, отражающие резистентность к инсулину, являются важной патофизиологической характеристикой развития человеческого НАСГ, которые были обнаружены у мышей с дефицитом ApoE после семи недель WD.

Другим интересным нахождением, напоминающим человеческий NASH, было увеличение свободного холестерина в печени и соотношение десмостерол / холестерин, наблюдаемое у мышей ApoE — / — на WD. Увеличение свободного холестерина в печени было описано также в других экспериментальных моделях NASH2324. У людей свободный печеночный холестерин и соотношение печеночных десмостерол / холестерина также увеличиваются у индивидуумов с NASH2425, что указывает на то, что дисрегуляция липидного метаболизма у мышей ApoE — / -, питаемых WD, аналогична НАЗГ человека. У мышей, которым вводили мышей WD и ApoE — / — при нормальной чау, не развивались стеатоз печени и ожирение, тогда как мыши ApoE — / — у WD. Более того, мыши ApoE — / — на WD показали явную дислипидемию, характеризующуюся повышенными концентрациями холестерина VLDL и LDL в сыворотке крови. Интересно, что животные, кормящие MCD, демонстрировали относительно высокие уровни триглицеридов, но низкие уровни общего и свободного холестерина в печени, что было противоположно тому, что наблюдалось у мышей ApoE — / -, которым вводили WD. Это и тип стеатоза, микровезикулярный у мышей, которым вводили WD и макровезикулярно у мышей, кормивших диету MCD, показали, что состав и развитие стеатоза существенно различаются между этими двумя диетами.

Стеатоз и воспаление развиваются в нескольких существующих моделях животных, когда генетическая модель сочетается с определенной диетой11161726. Аналогичным образом, у мышей ApoE — / — развилось воспаление, которое оценивалось повышением уровня мРНК IL1 и рекрутированием макрофагов после богатой высоким содержанием холестерина западной диеты, которая похожа на людей.

Еще одним преимуществом этой новой модели является быстрое развитие NASH в течение семи недель диеты. Напротив, для других диетических моделей NASH требуется минимум 15 недель диеты или даже более продолжительное время индукции2728293031. Поэтому наша модель предлагает приемлемые временные рамки и снижает стоимость животных. Мышам APOE2ki, в сравнении, показывают только острый эффект на воспаление печени и повреждение печени, которое, однако, решает при длительном вскармливании диеты с высоким содержанием жиров2932.

ApoE — / — мыши, питаемые WD, были сопоставимы с установленной моделью MCD в отношении воспаления печени и фиброза печени. Сочетание ApoE — / — мышей и диеты MCD показало сопоставимые результаты в отношении воспаления и фиброза у мышей, кормящих MCD, и мышей ApoE — / -, которым вводили WD, но не обладающих теми же основными характеристиками, что и установленная модель NASH MCD, кормили мышей и далее показали почечные патологии. Это приводит к предположению, что правильная комбинация генетических и диетических факторов отвечает за наблюдаемый фенотип NASH в РС.

Кроме того, мыши ApoE — / -, которым вводили WD, развивали значительный фиброз, что указывалось на повышение уровня мРНК коллагена и цитокинов (TGFβ), увеличение образования печеночного коллагена вместе с активацией клеток стеарата печени. Кроме того, портальное давление было увеличено у мышей ApoE — / -, которым вводили WD по сравнению с мышами ApoE — / -, которые кормили обычными чау и мышами, питающимися диетой MCD, явление, также обнаруженное у людей33. Интересно, что развитие фиброза у мышей, кормящих MCD, было сопоставимо с ApoE — / — мышами, которых кормили WD, но мышей, получавших диету MCD, не наблюдалось увеличения портального давления. Невозможно исключить роль ApoE — / — на сосудистых изменениях после увеличения портальной гипертензии. Однако более выраженный фиброз у мышей ApoE — / -, вводимых WD, предполагает фиброз как основной фактор, ведущий к портальной гипертензии.

В других экспериментальных моделях NASH выраженный фиброз печени развился только после длительного питания диеты, а затем с высокой частотой опухолей печени и HCC1830313435. Возникновение опухолей печени и HCC в мышиных моделях NAFLD / NASH, по-видимому, увеличивается в моделях с долгосрочным кормлением и независимо от состава рациона, содержащего жир и не зависит от генетического фона183435. Поэтому модель NASH с коротким периодом кормления, как описано в этом исследовании, может быть полезна.

Отсутствие фиброза печени является основной слабостью многих существующих моделей NASH11, которые присутствуют в описанной модели текущего исследования. Интересно, что особенно в модели MCD, которая является широко используемой моделью, после семи недель диеты провоспалительные маркеры значительно ниже по весу, чем у мышей ApoE — / — в условиях диеты MCD. Но даже несмотря на то, что диета MCD, по-видимому, является основным провоспалительным агентом в печени, поскольку мыши ApoE — / -, кормящие диету MCD, демонстрируют огромную регуляцию мРНК провоспалительных и профибротических маркеров, эти маркеры были сходны на уровне белка между мышами, питающимися WD и MCD диета.

Таким образом, в настоящем исследовании описана новая, надежная и быстрая мышечная модель NASH с метаболическим синдромом, показывающая основные характеристики человеческого НАСГ, такие как различный стеатоз печени, воспаление, фиброз и увеличение портального давления. В то же время эта новая модель NASH представляет собой экономичную и быструю модель NASH. Эта модель сопоставима с установленной моделью MCD в отношении стеатоза печени, воспаления и фиброза, но имеет дополнительные преимущества, в том числе увеличение массы тела и метаболического синдрома, которых нет в модели MCD. ApoE — / — мыши, питаемые WD, могут стать новым и ценным инструментом в исследованиях NASH.

Использовали мышей с двенадцатью недельными мышами дикого типа (wt, C57BL / 6J background, Charles River, Wilmington, USA) и мышей с нокаутом ApoE (фона ApoE — / -, C57BL / 6J, Charles River, Wilmington, США). Все мыши получали воду и чау в ad libitum. Животных выдерживали при 22 ° С с 12-часовым циклом день / ночь. Мышей кормили обычным чау, диету MCD (Ssniff, Soest, Germany) или диету с высоким содержанием жиров, богатую холестерином (западная диета, WD), содержащая 21% жира (с кокосовым маслом), 19,5% казеина и 1,25% холестерина (Ssniff, Soest, Germany) в течение семи недель (фиг.1A), как описано ранее363738. Никакой разницы в потреблении пищи не было замечено. Все эксперименты проводились в соответствии с «Немецким законом о защите животных» и руководящими принципами подразделения по уходу за животными в нашем университете (Haus für experimentelle Therapie, Бонн, Германия) и одобрены соответствующим государственным агентством Северного Рейна-Вестфалии для природы, Окружающая среда и защита потребителей (LANUV, Германия) в соответствии с файловой ссылкой LANUV84-02.04.2014.A137.

Гемодинамические исследования проводились, как описано ранее39. Вкратце, мышей голодали в течение ночи с бесплатным доступом к воде. Животных анестезировали с использованием кетамина / ксилазина (125 мг кетамина гидрохлорида / кг массы тела и 17 мг ксилазина / кг массы тела с.с.). После медианной лапаротомии катетер PE-50 вводился в небольшую илеологическую вену и продвигался к воротной вене для измерения портального давления. Катетер был подключен к датчику давления (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Германия) для измерений. После введения катетера животным позволено гемодинамически стабилизировать.

После 7 недель диеты мышей анестезировали и проводили лапаротомию для сбора ткани. Печень разрезали на фрагменты. Образцы печени либо замораживали в жидком азоте, либо хранили при -80 ° C или фиксировали в формальдегиде (4%), как описано ранее 404142. Образцы почек фиксировали в растворе метил Карного. Глицид натощак измеряли с помощью Akku-Chek Aviva (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany).

Печеночный гидроксипролин фотографически измеряли в гидролизатах печени, как описано ранее 4042. Аналоговые сегменты (200 мг) быстрозамороженных печей сначала гидролизуют в HCl (6N) при 110 ° C в течение 16 часов, а затем фильтруют и аликвоты. Аликвоты (50 мкл) инкубировали с хлорамином Т (2,5 мМ) в течение 5 минут и затем с реагентом Эрлиха (410 мМ) в течение 30 минут при 60 ° С. Адсорбцию определяли три раза при 558 нм после того, как была составлена ​​стандартная кривая для гидроксипролина. Результаты выражены в мкг / г влажной ткани печени. Содержание триглицеридов в печени определяли из гомогенизированных замерзающих образцов печени с использованием TG Liquicolor mono (Human Diagnostics, Wiesbaden, Germany) в соответствии с инструкциями производителя, как описано ранее38.

Выделение РНК из замороженных образцов печени, обратная транскрипция и детектирование с помощью ОТ-ПЦР выполняли, как описано ранее 4043. Использовали следующие анализы, представленные Applied Biosystems (Фостер-Сити, США): Acta2 (αSMA, Mm00725412_s1), col1a1 (коллаген-1; Mm00801666_g1), Emr1 (F4 / 80; Mm00802529_m1), Il1b (IL1β; Mm01336189_m1), Ccl2 ( MCP1; Mm00441242_m1), Tgfb1 (TGFβ; Mm03024053_m1) и Tnf (TNFα, Mm00443258_m1). 18S рРНК служила эндогенным контролем. Результаты были выражены как 2-ΔΔCt и экспрессируют x-кратное смещение транскрипции гена по сравнению с соответствующей контрольной группой.

Для обнаружения накопления жира в печени были приготовлены 6 мкм толщины срезанных замороженных образцов печени с использованием криостата. Разделы обезвоживали в течение ночи, фиксировали в 10% формалине, промывали 60% изопропиловым спиртом и окрашивали маслом Red O (3%) с последующим контрастированием с гематоксилином, как описано ранее444546. Для обнаружения коллагеновых волокон участки с парафином (2-3 мкм) обрабатывали 0,1% сириус-красного F3B в насыщенной пикриновой кислоте (Chroma, Münster, Germany), как описано ранее 4042. Встраиваемые парафином участки (2-3 мкм) также окрашивали гематоклин-эозин (H & E) для обнаружения клеточного баллона, как описано ранее8. Иммуногистохимические окраски для αSMA, Ki67 и F4 / 80 выполнялись в парафиновых срезах (2-3 мкм). Секции инкубировали с антителом мыши-анти-SMA (клон Actin 1A4, Dako, Hamburg, Germany), кролик-анти-Ki67 (клон SP6, abcam, Cambridge, UK) или крыса-анти-F4 / 80 (клон BM8 , BMA Dianova, Гамбург, Германия). Затем были использованы биотинилированные козьи-антимыши (Дако, Гамбург, Германия), коз-анти-кролик (Дако, Гамбург, Германия) и вторичные антитела кролика-анти-крысы (Biozol, Eching, Germany). Наконец, секреты контрастировали с гематоксилином. Гистологическое окрашивание анализировали в соответствии с оценкой Ишака47 и оцифровывали с использованием Pannoramic MIDI (3DHistech, Будапешт, Венгрия). Для вычислительного анализа (Histoquant, 3DHistech, Budapest, Hungary) большие желчные протоки и сосуды были исключены, следуя принципам вычислительного анализа, как описано ранее4448. Для отличия перипортального и лобулярного фиброза 5-7 перипортальных и дольковых областей анализировали на положительное окрашивание в каждом участке при большом увеличении.

Гистология и непрямая иммуногистохимия образцов почек выполнялись в парафиновых срезах (1 мкм), как описано ранее49. Короче говоря, почечная ткань окрашивалась либо периодической кислотой Шиффа (PAS), Acidic Fuchsin Orange G (AFOG), либо косвенной иммуногистохимией с использованием следующих первичных антител: моноклональной крысиной антимышиной F4 / 80 (Serotec AbD, Oxford, UK) и поликлональной козы анти-человеческий коллаген типа I (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA) перекрестно реагирует с мышиным коллагеном типа I. Вторичные антитела были биотинилированы и очищены аффинностью (Vector, Burlingame, CA, USA) и отрицательные контрольные группы, выполняемые, как ранее описанный49, остался отрицательным (данные не показаны). Гистоморфология была проанализирована опытным нефропатологом (P.B.). Иммуногистохимия оценивали с использованием компьютерной морфометрии положительно окрашенной корковой области для коллагена типа I с использованием программного обеспечения ImageJ v1.48 (http://imagej.nih.gov/ij/) и путем ручного подсчета положительных клеток F4 / 80 в 15 кортикальные мощные поля.

Общий и свободный печеночный холестерин и сложные эфиры холестерина определяли методом газовой хроматографии — детектированием пламенной ионизации. Для определения концентраций липидных хлороформных экстрактов холестериновой ткани, содержащих сложные эфиры холестериновых жирных кислот и свободного холестерина, полностью гидролизуют перед дериватизацией в соответствующие триметилсилиловые эфиры, тогда как свободный холестерин силилируют без щелочного гидролиза липидных экстрактов. Прекурсор десмостерол в качестве суррогатного маркера биосинтеза эндогенного холестерина определяли методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии (выбранный ионный мониторинг) 5051. Профили липопротеинов сыворотки определяли с помощью быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC), как описано ранее52.

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Размер группы составлял по крайней мере n = 5 для каждой группы. Статистический анализ двух групп проводили с тестом Манна-Уитни-У, соответственно, критерием Крускала-Уоллиса с пост-hoc-тестом Данна для сравнения более двух групп с использованием GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). p-значения <0,05 считались статистически значимыми.

Как процитировать эту статью: Schierwagen, R. et al. Семь недель западной диеты у мышей с аполипопротеином-E-дефицитом индуцируют метаболический синдром и безалкогольный стеатогепатит с фиброзом печени. Sci. По донесению
5, 12931; doi: 10.1038 / srep12931 (2015).

Авторы благодарят Гудрун Хэка, Силке Беллингхаузена и Аню Керкесик за отличную техническую помощь.

Авторские вклады Р.С. проводил эксперименты и анализы, разрабатывал исследование, составлял статью и контролировал анализ. Л.М. проводил эксперименты и анализы, составлял статью и контролировал анализ. S.Z. провели эксперименты и анализы и разработали оригинальное исследование. K.H. проводил эксперименты и анализы и был экспертом в патологии печени. C.B. проводил эксперименты и анализы. С.К. провели эксперименты и внесли свой вклад в анализ данных. F.E.U. провели эксперименты и внесли свой вклад в анализ данных. W.R. проводил эксперименты и анализы. P.B. проводил эксперименты и анализы данных, был экспертом в патологии почек, составлял статью и контролировал анализы. Г.Н. оказали административную поддержку и внесли свой вклад в анализ. C.P.S. оказали административную поддержку и внесли свой вклад в анализ. C.T. оказали административную поддержку и внесли свой вклад в анализ. J.P. проводил эксперименты и анализы данных, контролировал анализы и составлял статью. D.L. проводил эксперименты и анализы данных, контролировал анализы и составлял статью. T.S. выполнял административную поддержку и составлял статью. Ф.Т. проводил эксперименты и анализы данных, контролировал анализы и составлял статью. J.T. координировал исследование, разработал исследование, провел эксперименты и анализ данных, контролировал анализы и составлял статью.

(A) Схематический обзор конструкции исследования. wt и ApoE — / — кормили обычным чау, высокоуглеводной западной диетой (WD), богатой холестерином или метионином и диетой с дефицитом холина (MCD) в течение семи недель. (B) Вес тела животных до того, как они были принесены в жертву. ApoE — / — мыши, питающиеся WD, показали значительное увеличение массы тела, в то время как у мышей, питающихся диетами MCD, наблюдалось снижение массы тела. (C) Относительный вес печени (в% от массы тела) у мышей ApoE — / -, которым вводили WD, было увеличено, что указывает на гепатомегалию, тогда как у мышей, получавших диету MCD, не было изменено. Графики выражаются как среднее ± стандартное отклонение. p <0,05 считалось значительным.

(A) Уровни глюкозы натощак. ApoE — / — мышам, которым кормили Western Diet (WD), показали ненормальные уровни глюкозы натощак по сравнению с животными, которых кормили диетами с нормальным питанием чау или метионином и холиновым дефицитом (MCD). (B) Содержание триглицеридов в печени, выраженное в процентах от мышей. Уровни триглицеридов в печени были увеличены у мышей ApoE — / -, которым вводили WD по сравнению с мышами, которых кормили обычным чау, но ниже, чем у мышей, получавших диету MCD. (C) Профили липопротеинов сыворотки мышей, получавших WD. ApoE — / — мышам, которым вводили WD, показывали сдвиг в профиле липопротеинов сыворотки с большим количеством липопротеинов очень низкой плотности (VLDL) по сравнению с мас. Уровни общего (D) и свободного (Е) холестерина печени. ApoE — / — кормили WD, показали повышенные уровни общего и свободного холестерина в печени по сравнению с другими наблюдаемыми группами. (F) Отношение Desmosterol / холестерина было значительно увеличено у мышей ApoE — / — по сравнению с другими наблюдаемыми группами. (G) Репрезентативные участки и (H) количественное определение (% от положительной окраски) гистологического окрашивания Oil Red O, как маркер накопления жира в печени. ApoE — / — мышей, получавших WD, показали значительно более высокое окрашивание Oil Red O, чем мышь. У мышей, которым кормили диету MCD, наблюдалось незначительное снижение окраски Oil Red O. Графики выражаются как среднее ± стандартное отклонение. Шкала составляет 100 мкм. p <0,05 считалось значительным.

(A) Репрезентативные участки и (B) количественное определение (% от положительной окраски) иммуногистохимии Ki67, как маркер пролиферации в печени. Пролиферация была значительно увеличена у мышей ApoE — / -, питающихся западной диетой (WD), по сравнению с однопометниками. В отношении метионина и холин-дефицитного (MCD) рациона питания мышей была немного увеличена по сравнению с ApoE — / — мышами, питающимися WD. (C) уровни мРНК провоспалительных маркеров IL1β, TNFα, MCP и Emr1 (F4 / 80) были увеличены у мышей ApoE — / — по сравнению с мышами, которые получали диету WD или MCD. ApoE — / — мыши, питающиеся диетой MCD, показали заметное повышение провоспалительных маркеров на уровне мРНК. (D) Репрезентативные участки и (E) количественная оценка (% от положительной окраски) иммуногистохимии F4 / 80, как маркер макрофагов и воспаление печени. ApoE — / — мышам, которым вводили WD, показали значительно повышенные уровни положительного окрашивания F4 / 80 по сравнению с мышами, содержащими WD, и мышам, получавшим диету MCD. Графики выражаются как среднее ± стандартное отклонение. Шкала шкалы составляет 50 мкм для Ki67, соответственно 100 мкм для иммуногистохимии F4 / 80. p <0,05 считалось значительным.

(A) Экспрессия гена профибротических маркеров TGFβ и коллагена 1 (Col1A) в качестве маркера отложения коллагена в печени и фиброза печени. Уровни профибротических маркеров были увеличены в ApoE — / — кормили западной диетой (WD) по сравнению с мышами, содержащимися либо с диетой WD, либо с метионином и с дефицитом холина (MCD). ApoE — / — мышам, получающим диету MCD, показали заметное повышение уровня профибротических маркеров на уровне мРНК. (B) Содержание гидроксипролидина в печени в качестве маркера фиброза было значительно увеличено у мышей ApoE — / -, которым вводили WD, по сравнению с мышами с маслом, которые либо питались диетой WD, либо MCD. (C) Репрезентативные участки и (D) количественное определение (% от положительной окраски) красного гистологического окрашивания Sirius. ApoE — / — мыши, питающиеся WD, показали значительно больше положительного окрашивания Sirus, чем у мышей, которым вводили WD. У мышей, которым кормили диету MCD, красное положительное окрашивание Sirius было сопоставимо с ApoE — / — мышами, питающимися WD. Графики выражаются как среднее ± стандартное отклонение. Шкала шкалы составляет 50 мкм, соответственно 20 мкм для увеличения. p <0,05 считалось значительным.

(A) Экспрессия гена αSMA в качестве суррогатного маркера активации активации звездчатой ​​клетки проявляла повышенную экспрессию у мышей ApoE — / -, которым кормили Western Diet (WD) по сравнению с их однопометниками. Уровни экспрессии αSMA у мышей, получавших диету с метионином и холиновым дефицитом (MCD), были сопоставимы с уровнями у мышей ApoE — / -, которым вводили WD. (B) Репрезентативные участки и (C) количественное определение (% от положительной окраски) гистологического окрашивания αSMA. ApoE — / — мышам, которым вводили WD, было значительно больше αSMA-положительного окрашивания, чем у мышей, которым вводили WD. У мышей, получавших диету MCD, αSMA положительное окрашивание было сопоставимо с ApoE — / — мышами, питающимися WD. (D) Инвазивное портальное измерение давления показало увеличенное портальное давление у мышей ApoE — / -, которым вводили WD по сравнению с мышами, содержащимися с диетой MCD. ApoE — / — мышам, питавшим диету MCD, показали аномальное высокое портальное давление. Графики выражаются как среднее ± стандартное отклонение. Шкала масштаба составляет 100 мкм, соответственно 20 мкм для увеличения. p <0,05 считалось значительным.

Морфология почек и подробный анализ окрашиваний (A, B) периодической кислоты Шиффа (PAS) и (C, D) Acidic Fuchsin Orange G (AFOG) не выявили каких-либо явных патологических изменений в клубочках (B, D), тубулоинтерститии (C) или сосудов (астерикс в С). Макроскопических различий не наблюдалось между группами, за исключением меньшего размера почек у мышей, получавших диету MCD. (E) Иммуногистохимия для коллагена I типа в качестве маркера фиброза и (F) F4 / 80 в качестве маркера для почечных моноцитов / макрофагов / дендритных клеток показала нормальные результаты, сопоставимые с мышами дикого типа, которых кормили обычным чау во всех группах, воспаление и фиброз у мышей ApoE — / -, которым кормили диету MCD. Масштабные бруски составляют 2,5 мм для A, 25 мкм для B, D и 50 мкм для C, E, F.

Количественная оценка положительной окрашенной сириусом области, в качестве маркера фиброза печени, в перипортальных и дольковых областях. ApoE — / — мышам, которых кормили западной диетой (WD), и мышам, которым была назначена диета с метионином и холиновым дефицитом (MCD), показали значительно увеличенный перипортальный фиброз по сравнению с мышами, кормящими нормальным чау, и мышам дикого типа (wt), питаемым WD. Кроме того, у мышей с повышенным перипортальным фиброзом наблюдается тенденция к увеличению лобулярного фиброза. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. p <0,05 считалось значительным. a = p <0,05 против wt, b = p <0,05 против ApoE - / -, bb = p <0,01 против ApoE - / -, c = p <0,05 против wt + WD, cc = p <0,01 против. вес + WD.

Количественная оценка положительных клеток F4 / 80 в качестве маркера для моноцитов / макрофагов / дендритных клеток и воспаления и коллагеновой окрашенной области (%), в качестве маркера почечного фиброза, показала сопоставимые значения во всех группах, кроме увеличения воспаления и фиброза в ApoE — / — мышей, которым кормили диету MCD. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *