Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Адено-ассоциированный вирус, опосредованный вирусом доставки генома HBV, индуцирует хронический вирусный гепатит B и фиброз печени у мышей

Adeno-Associated Virus Vector Mediated Delivery of the HBV Genome Induces Chronic Hepatitis B Virus Infection and Liver Fibrosis in Mice
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4468063/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: WL RJS LY. Выполняли эксперименты: LY. Проанализированы данные: WL LY. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: RJS LZ HY WL ZL. Написал документ: WL CL MLH RJS LY.

Цирроз печени и гепатоцеллюлярные карциномы являются серьезными проблемами со здоровьем при хронической инфекции вируса гепатита В (HBV). На сегодняшний день редкая модель воспроизводила фиброз печени, связанный с длительной инфекцией HBV, которая, в свою очередь, препятствовала как пониманию биологии HBV, так и разработке новых вариантов лечения. Здесь, используя опосредованную адено-ассоциированным вирусом серотип 8 (AAV8) доставку гена HBV 1,2 kb, мы успешно создали хроническую модель инфекционной мыши HBV, которая представляет ассоциированный фиброз печени, наблюдаемый после инфицирования человека. После введения вектора AAV8 / HBV1.2 мыши продемонстрировали эффективную репликацию HBV и транскрипцию, что привело к экспрессии HBV-антигена и виремии в течение 6 месяцев. Несмотря на отсутствие очевидного острого воспалительного ответа, у этих мышей все еще развивались хронические заболевания печени и фиброгенез печени, что было продемонстрировано с помощью увеличенных гель-стекловидных гепатоцитов, увеличивая тенденцию к осаждению коллагена и маркерам с повышенным уровнем фиброза, включая коллаген типа I, коллаген типа III, ткань ингибитор металлопротеиназы (ТИМП) и трансформирующий фактор роста-β1 (TGF-β1). Взятые вместе, AAV-опосредованная доставка гена HBV в печень мыши, индуцированная персистирующая инфекция HBV, сопровождающаяся фиброзом печени, которая может служить моделью для исследования точных механизмов, лежащих в основе фиброза печени после хронической инфекции HBV, а также для потенциального развития новых терапевтических средств ,

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации.

Приблизительно 240 миллионов человек во всем мире хронически инфицированы вирусом гепатита B (HBV), и большая часть хронических инфекций развивается в гепатоцеллюлярную карциному или цирроз [1]. Эти осложнения часто приводят к печеночной недостаточности, и ежегодно сообщается о более чем 1 000 смертей [2-4]. Таким образом, заболевания, связанные с ВГВ, остаются главной проблемой общественного здравоохранения. Хронически инфицированных пациентов можно лечить несколькими препаратами, включая ИФН-α и нуклеозидные аналоги, такие как ламивудин или адефовир. IFN-α регулирует иммунный ответ путем увеличения вирусного клиренса, тогда как аналоги нуклеозидов влияют на репликацию вирусной ДНК. Однако эффективность этих препаратов ограничена. И проблемы остаются с точки зрения их клинического применения, включая низкую эффективность, нежелательные побочные эффекты и устойчивые мутации HBV [5-9]. Таким образом, необходимо разработать как новые терапевтические реагенты, которые ингибируют репликацию HBV, так и репрезентативные модели животных HBV для оценки новых терапевтических стратегий.

Ключевой характеристикой hepadnaviruses является их высокая степень видоспецифичности и печеночного тропизма, таких как отсутствие специфических рецепторов и клеточных факторов, которые необходимы при вирусном проникновении и торговле, которые могли бы сделать мышей устойчивыми к инфекции HBV [10-13]. На сегодняшний день шимпанзе являются единственными разрешительными животными, которые полностью инфицированы вирусом гепатита В, и при инокуляции с положительной сывороткой HBV развиваются острые инфекции и гепатит; однако эти животные не включают хроническое заболевание печени, но развивают клеточный иммунный ответ, подобный тому, который продемонстрирован у человека при острой инфекции [14, 15]. Однако некоторые ограничения, включая большой размер, этические проблемы и высокие затраты, ограничивают их использование для проведения фундаментальных исследований и терапевтического скрининга лекарств. Деревообрабатывающая машина (Tupaia belangeri) является белковоподобным разрешительным мелким животным HBV, но инфекция HBV приводит только к легкой и преходящей инфекции [16]. Трансгенные мыши HBV используются для уточнения механизма репликации HBV и специфической функции онкогенов [17-20]. Однако из-за генов HBV, интегрированных в геном хозяина и выраженных как само-белки, и, таким образом, мыши устойчивы к этим иммунологическим антигенам и не вызывают заболевания печени. Модели мыши с использованием рекомбинантных вирусных векторов или путем гидродинамической инъекции обнаженной ДНК генома HBV в гепатоциты использовали для исследования иммунной толерантности к антигенам HBV и для изучения механизмов вирусного клиренса [21-24]. Однако острая, но не хроническая инфекция HBV часто индуцируется. В двух последних исследованиях использовался AAV для доставки ДНК генома HBV в печень мыши и индуцированной персистирующей инфекции HBV и иммунной толерантности к HBV [25, 26]. Обе статьи пытались выяснить иммунный механизм персистирующей инфекции HBV. В другом исследовании выяснены механизмы хронической инфекции HBV и иммунопатогенеза в модели гуманизированной мыши [27]. Таким образом, существует потребность в разработке новой мышиной модели стойкой инфекции HBV для исследования вирусного патогенеза и для скрининга новых противовирусных препаратов.

В настоящем исследовании была разработана модель выживаемости HBV мыши с использованием вектора AAV для переноса генома вируса гепатита B (HBV1.2) в клетки печени мыши, которые инициировали образование вируса гепатита B, что привело к стойкой виремии и индукции фиброза печени , Эта модель мыши может быть использована для выяснения биологического процесса, лежащего в основе патогенеза HBV, и для скрининга небольших молекул, которые могут быть эффективны для лечения хронической инфекции HBV и фиброза печени.

Клетки HEK 293T и клетки Huh7.5.1 поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Eagle (Sigma, St Louis, MO), дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой и пенициллин-стрептомицином (100 ед / мл). Клетки выдерживали при 37 ° С в атмосфере с 5% СО2.

Для генерации HBV-фрагмента использовали плазмиду pHBV1.2, содержащую 1,2 копии генома HBV (генотип D). Этот фрагмент клонировали в вектор pSSV9 (который содержал инвертированный терминальный повтор AAV типа 2 на обоих концах, потому что были заменены гены rep и cap) для генерации pSSV9-1,2HBV. Вкратце, p-SSV9 расщепляли Xbal для генерации линейного вектора, а pHBV1.2 расщепляли SacI и HindIII для получения вставленного фрагмента. Линеаризованный каркас p-SSV9 и фрагмент HBV затупляли с использованием Klenow I, а затем лигировали с использованием T4-лигазы. Псевдотипированные векторы AAV8 продуцировали в клетках 293Т с использованием протокола трансфекции тройной плазмиды и очищали градиентами CsCl [28]. Титры векторов определяли с помощью количественной ПЦР (qPCR).

Ячейки Huh7.5.1 высевали в 6-луночный планшет при 4 × 105 на лунку и культивировали при 37 ° С в атмосфере 5% СО2. ДНК pSSV9-1.2HBV (3 мкг) трансфицировали в клетки Huh7.5.1 каждой лунки с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. PBS использовали в качестве контроля. Супернатант и трансфицированные клетки собирали через 72 часа после трансфекции и подвергали экстракции нуклеиновой кислотой с использованием набора для выделения вирусной ДНК (QIANGEN) и затем расщепляли DpnI. Восстановленную вирусную ДНК HBV измеряли с помощью qPCR. В параллельном анализе супернатант собирали каждый день в течение семи дней и заменяли таким же количеством среды для определения совокупного количества HBsAg и HBeAg с помощью ELISA. В то же время pSSV9-1,2HBV (10 мкг) трансфицировали в клетку Huh7.5 (ячейка 2 × 106) в чашке 100 мм. Южно-блот-анализ полной ДНК, экстрагированной из трансфицированных клеток Huh7.5.1 и ДНК, экстрагированных из клетки HepG2.2.15 и клетки Huh7.5.1 в качестве положительного контроля и отрицательного контроля соответственно. Все образцы ДНК расщепляли с помощью или без выбранных рестрикционных ферментов (EcoRI или HindIII) и обрабатывали Rnase A до 1,2% гель-электрофореза. Фильтры гибридизовали с DIG-меченым 3,2 кб HBV-специфическим зондом.

Обычные мыши C57BL / 6 (в возрасте 6-8 недель, Сычуаньский университет, Сычуань, Китай) выращивались и поддерживались в Лабораторном заведении животных Института переливания крови, Китайской академии медицинских наук, Чэнду. Уход за животными и процедуры проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, которое было одобрено Комитетом по удержанию и использованию животных в Китайской академии медицинских наук (номер разрешения: ILAS-PG-2014-001) , Все усилия были направлены на минимизацию страданий. Мышам вводили вектор AAV [2 × 1011 векторных эквивалентов генома (vg)] в 200 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) через хвостовую вену. Сыворотку для ELISA получали из хвостового кровотечения, которое собирали в гепаринизированных капиллярных трубах стандартными методами. После разбавления PBS концентрации HBsAg и HBeAg в сыворотке измеряли с использованием набора ELISA для моноклональной диагностики Auszyme (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Уровни аланин аминотрансферазы в сыворотке (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) анализировали с использованием коммерчески доступных колориметрических анализов (Teco Diagnostics, Anaheim, CA). Чтобы собрать печень для анализа иммуногистохимических и нуклеиновых кислот, мышей анестезировали с использованием 2,5% авертина и перфузировали транскрипционно с помощью холодного PBS (рН 7,4), а затем 4% параформальдегида в фосфатном буфере (0,1 моль / л pH 7,4). Интрапептидные HBcAg и HBsAg визуализировали иммуногистохимическим окрашиванием тканей, покрытых OCT, с использованием антител против HBc и анти-HBs кроликов (Dako, Carpinteria, CA) соответственно и системы Envision HRP (диаминобензидин) (Dako, Carpinteria, CA). Для каждого слайда было выбрано десять случайных полей, а процент HBsAg- и HBcAg-положительных гепатоцитов был определен количественно с использованием программного обеспечения Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD). Секции печени также были исследованы с помощью световой микроскопии после стандартного гематоксилинового и эозинового (H & E) и окрашивания трихрома Массон [29, 30]. Вирусное окрашивание секретов печени наблюдалось с помощью поляризационного микроскопа.

Чтобы измерить уровни ДНК HBV и вектора AAV, нуклеиновые кислоты экстрагировали с использованием наборов крови и тканевых комплексов DNeasy (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями производителя и хранили при -80 ° C перед анализом ПЦР. Стандартную кривую qPCR генерировали с использованием 10-кратных разведений плазмиды SSV9-1,2HBV (1,0 × 103-1,0 × 109 копий / мл). Для измерения уровней мРНК HBV, Timp-1 и Tgf-β1 общую РНК выделяли с использованием набора NucleoSpinRNA II (Macherey Nagal, GmbH & Co. KG, Германия) и обратной транскрипции с использованием набора для синтеза кДНК First Strand (Toyobo , Япония). Все реакции qPCR проводили в трех повторностях в 96-луночных оптических реакционных планшетах с использованием системы обнаружения последовательности ABI 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA) и SYRR Green I PCR mix (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), как описано ранее [ 31]. Последовательности праймеров показаны в таблице S1.

Уровни коллагена I и III в образцах печени и сыворотки определяли с использованием коммерчески доступных наборов ELISA (набор ELISA для мыши Collagentype I (Col I) и набор ELISA для мыши Collagentype III (Col III)); (R & D Systems, Миннеаполис, MN). Уровни сыворотки TIMP-1 и TGF-β1 также определяли с использованием коммерчески доступных наборов ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN). Для приготовления образцов печени до 100 мг ткани гомогенизировали в 200 мкл PBS и центрифугировали при 2000-3000 г в течение 20 мин. Супернатант собирали и анализировали с использованием набора ELISA.

Репликативные ДНК-интермедиаты HBV и вирусная РНК были обнаружены с помощью Южного и Нозерн-блот-анализа общей геномной ДНК и РНК печени соответственно с DIG High Prime DNA Labelling and Detection Starter Kit II и DIG Northern Starter Kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). 3.2kb HBV-геном был помечен DIG как южный пятнистый зонд. Для северного блоттинга ПЦР-продукты использовались для маркировки и синтезированной DIG-меченной РНК в качестве зондов для северного блоттинга. Последовательность гена GAPDH (house keep gene) из homo sapiens и rattus амплифицировали с помощью RT-PCR и использовали для нормализации количества РНК, связанного с мембраной.

Данные выражали как среднее ± SD. Статистический анализ проводился с использованием двухстороннего дисперсионного анализа (ANOVA, Graphpad prism 5) для определения статистически значимых различий между группами. P <0,05 считалось статистически значимым.

Геномы HBV были доставлены в печени мышей посредством гидродинамической инъекции и с использованием аденовирусного вектора; однако эти методы могут привести к быстрому очистке геномов HBV. Альтернативно, HBV-трансгенные мыши использовали для моделирования HBV-инфекций, однако эти мыши являются толерантными к вирусным антигенам, и стойкая экспрессия само-антигенов ограничивает их использование для оценки противовирусных препаратов. Чтобы преодолеть эти ограничения, в настоящем исследовании была предпринята попытка создать модель мыши, которая точно имитирует хроническую инфекцию HBV у людей. Поскольку мыши не могут быть непосредственно инфицированы HBV из-за отсутствия рецептора HBV, необходимого для поглощения вируса, мышам вводили вектор AAV, содержащий геномную ДНК HBV1.2, которая ранее использовалась для индуцирования репликации HBV как в мышиных гепатоцитах, так и в человеческих HepG2 [32, 33]. AAV8 является высокоэффективным для трансдукции мышиной печени, поэтому этот серотип использовался для опосредования переноса гена HBV в настоящей модели мыши. Как показано на фиг.1а, фрагмент, который содержит 1,2 копии HBV (геном D), был клонирован в вектор p-SSV9, который содержал ITR AAV типа 2 с обоих концов. Чтобы проверить продукцию HBV и экспрессию гена конструкции, pSSV9-1.2HBV трансфицировали в Huh7.5.1 и оценивали количество ДНК вирусного генома и HBsAg и HBeAg. Как показано на фиг.1b, ДНК вируса гена вируса гепатита B была получена как в супернатанте, так и в клетках через три дня после трансфекции (рис. 1b). Однако содержание внутриклеточной вирусной ДНК было примерно в 300 раз выше, чем в супернатанте (рис. 1b). Как показано на фиг.1с, HBsAg и HBeAg продуцировали с увеличением времени сверхурочной работы и секретировали в супернатант трансфицированной клетки. В то же время, южный блот-анализ полной ДНК, выделенной из трансфицированной клетки Huh7.5.1, показал ДНК с нарушенной окружностью (rc), ДНК ds и ssDNA (рис. 2a). Рестрикционный фермент EcoRI (рестрикционный сайт рестрикции фермента, включенный в геном HBV) и рестрикционный фермент HindIII (сайт рестрикции фермента не был включен в геном HBV) были выбраны для переваривания образцов, чтобы вырезать высокомолекулярные нити ДНК на более мелкие фрагменты. Саузерн-блот-анализ необработанного общего образца ДНК был похож на обработанный HindIII образец, но отличается от образца, обработанного EcoRI. ДНК HBV с ослабленным кругом (rc) и ДНК ds расщепляли в образце, обработанном EcoRI. Эти данные подтвердили, что pITR2-1.2HBV индуцирует репликацию HBV и экспрессию генов в клетке Huh7.5.1.

(а) Фрагмент, содержащий 1,2 копии генома HBV (генотип D), был получен из плазмиды pHBV1.2 и клонирован в вектор p-SSV9, который содержал ITR AAV типа 2 с обоих концов путем замены rep и cap гены (см. Материалы и методы). Указаны праймеры q-PCR. (b, c). Плазмиду pSSV9-1,2HBV (3 мкг) трансфицировали в клетку Huh7.5.1 и определяли содержание вирусных геномов HBV и / или кумулятивную экспрессию HBsA и HBeAg в клетке и / или супернатанте, соответственно, Q- ПЦР и ИФА. Данные представляют среднее значение ± SD (n = 4).

(a) Обнаружение реплицируемых промежуточных продуктов ДНК HBV через 7 дней после pSSV9-1,2HBV, трансфицированных в клетку Huh7.5.1. (б) Промежуточные средства репликации ДНК HBV через 1, 3, 6 месяцев после инъекции AAV8-1,2HBV. Были указаны релаксационно-кольцевые (RC), двухцепочечные линейные (DS) и одноцепочечные (SS) ДНК. (C) Нозерн-блоттинг для обнаружения 3,5 гб прегеномических, 2,4 кб и 2,1 кб мРНК в пост-инъекции печени. Количество РНК, связанное с мембраной, было нормировано геном домашней работы (GAPDH). HBV (-) мышей, PBS вводили мыши.

После проверки вектора плазмиды in vitro векторы AAV8, которые содержат геном 1,2HBV, были получены в клетках 293T, как описано ранее [28]. Затем мышам вводили внутривенно вектор AAV8-1,2HBV (2 × 1011 мкг). Через два дня после инъекции (p.i.) более 90% ДНК HBV было распределено в печени (рис. 3a). Через 6 месяцев p.i. уровни ДНК HBV в печени увеличились на 40% по сравнению с двумя днями p.i., тогда как уровни были заметно снижены во всех других исследованных тканях (мышцы, почки, кишечник, сердце и легкие). Это говорит о том, что геном HBV реплицируется в печени мыши. Две пары праймеров qPCR (таблица S1) использовались для количественной оценки номера копии генома HBV. Первая пара, которая включала прямой праймер, расположенный в AAV2 ITR, и обратный праймер, расположенный в области HBV X, использовали для количественной оценки векторной ДНК AAV. Вторая пара прямых и обратных праймеров, нацеленных в область HBV S, была использована для количественной оценки генома HBV (включая вектор AAV, реплицированный HBV и HBV-упакованный вирус). Во-первых, количество копий генома HBV было исследовано в сыворотке через 0-6 месяцев p.i. Уровни вирусного генома достигли пика через 2 недели p.i., прежде чем быстро уменьшаться по мере их удаления из сыворотки (рис. 3b). За этим последовало медленное снижение численности генома через 2 месяца. В 2-недельный момент времени уровни HBV-генома и AAV-вектора, обнаруженные двумя наборами праймеров, были приблизительно равны; однако в более поздних временных точках (рис. 3b) наблюдалась разница в 2-5 раз, что указывало на то, что вирус HBV секретировался в сыворотке. Содержание генома HBV в печени мыши также измерялось с использованием тех же праймерных пар. В 1, 3 и 6-месячные временные точки общее содержание генома ВГВ было значительно выше, чем у AAV-вектора (рис. 3c). В первые три месяца также наблюдалась тенденция к росту, что предполагало, что геном HBV реплицируется в печени мыши. В течение 1-6 месяцев после введения AAV8-1,2HBV интермедиаты репликации HBV (ДНК rc, ДНК ds и ss) наблюдались также у мышей C57BL / 6 по Саузерн-блот-анализу (рис. 2b), но ковалентно замкнутая кольцевая ДНК не была обнаружена , Эти результаты показали, что была создана инкапсулированная вирусная ДНК HBV и что физиологически значимая виремия присутствует в модели мыши. Транскрипцию HBV в печени мыши также исследовали с помощью RT-qPCR и нозерн-блоттинга. По сравнению с 1-месячной временной точкой (3,65 × 107 копий / г) количество вирусной кДНК было в 200 раз выше в 3 месяца p.i., достигнув 1,01 × 1010 копий / г через 6 месяцев p.i. (Рис. 3d). И северный блот-анализ общей печеночной РНК, экстрагированной из инъецированных мышей, 3,5 кб, 2,4 кб и 2,1 кб HBV-транскриптов был обнаружен, коррелированный с экспрессией HBsAg в сыворотке (фиг. 2c). Это подтвердило, что транскрипционная транскрипция происходила после доставки вектора AAV-1.2HBV.

Мышам вводили внутривенно с помощью вектора AAV-HBV (2 × 1011 вирусных эквивалентов генома (vg)), а затем кровоточили или пожертвовали в указанные моменты времени. (а) вирусные геномы HBV в отдельных тканях через 2 дня и 6 месяцев после инъекции. (b, c) Уровни AAV-вектора и цельного генома HBV в образцах сыворотки (b) и печени (c). Виремия HBV выражается как разница между целым содержанием генома HBV и содержанием генома вектора AAV. (d) Количественный ПЦР-анализ обратной транскрипции содержания кДНК HBV в печени. Статистический анализ проводился с использованием двухстороннего дисперсионного анализа. Данные представляют среднее значение ± SD (n = 4).

Вирусная репликация и виремия были обнаружены у инфицированных AAV-1,2HBV мышей, но этого было недостаточно для адекватной экспериментальной модели инфекции HBV. Таким образом, AAV-опосредованную трансдукцию гена в сыворотке и печени анализировали с помощью ELISA и иммуногистохимического окрашивания для антигена HBV, соответственно. Результаты показали, что инъекция AAV8-1,2HBV приводила к стойкой инфекции, которая характеризовалась присутствием HBsAg и HBeAg или HBcAg в сыворотке мыши и / или печени в течение 6 месяцев. Секреция вирусных антигенов в кровь контролировалась с течением времени. Поверхностный антиген HBV обнаруживали через 2 недели p.i., достигнув пика при 4,85 × 102 нг / мл через 2 месяца. После этого уровень HBsAg в сыворотке медленно снижался и достигал концентрации плато 4,0 × 102 нг / мл через 6 месяцев p.i. (Фиг. 4а). Профиль экспрессии HBeAg показал сходную тенденцию, за исключением того, что она достигла максимума в 1 месяц p.i. (Фиг. 4b). Интересно, что уровень HBsAg в сыворотке оставался относительно стабильным в течение 6 месяцев и отсутствовала сероконверсия в анти-HB (как IgM, так и IgG). Иммуногистохимическое окрашивание использовали для определения экспрессии HBsAg и HBcAg в печени мышей, обработанных AAV8-HBV1.2. Как показано на фиг. 4с, аналогично профилю экспрессии сыворотки, HBsAg-положительные гепатоциты распределяли случайным образом по всей печени через 1 месяц p.i. и большинство визуальных полей не содержало окрашенных клеток, хотя некоторые редкие гепатоциты проявляли легкое окрашивание цитоплазмы. Однако экспрессия HBsAg проявляла тенденцию к увеличению в течение 6 месяцев, что, возможно, отражало кумулятивный эффект. Выражение HBcAg происходило быстро, что было очевидно во всей печени в течение 1 месяца p.i. и значительно увеличивалось через 3 месяца p.i. прежде чем они останутся относительно стабильными. Напротив, клетки из группы HBV (-) не окрашивали. Эти результаты показывают, что AAV-вектор опосредовал производство трансгена HBV.

(а) Сывороточный HBsAg измеряли в количественном ELISA, и средняя сыворотка ng / ml была нанесена на график в указанные моменты времени p.i. Данные представляют среднее ± SEM. (б) Сыворотку HBeAg измеряли в количественном ELISA, и среднюю сыворотку NCU / мл наносили на график в указанные моменты времени p.i. Данные представляют среднее значение ± SEM. (c) Иммуногистохимическое окрашивание HBsAg и HBcAg в секциях печени. Окрашивание проводили в срезах тканей от четырех животных на группу. Показаны репрезентативные разделы. (d) Количественная оценка иммуногистохимических данных, показанных в подпункте с). В качестве статистического результата были выбраны случайные поля, а процентные значения HBsAg- и HBcAg-положительных гепатоцитов были определены количественно с использованием Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD). Статистический анализ проводился с использованием дисперсии двухстороннего анализа. HBV (-) мышей, PBS вводили мыши.

ALT и AST являются ферментами, расположенными в клетках печени, которые высвобождаются в кровообращение некротическими гепатоцитами. Поэтому мы контролировали эти концентрации трансаминаз в сыворотке для оценки токсичности после введения AAV8-1,2HBV вектора. По сравнению с мышами HBV (-) инфекция AAV8-1.2HBV не увеличивала уровни ALT в сыворотке в течение 6 месяцев (рис. 5a), тогда как уровень АА в сыворотке умеренно снижался через 1 и 2 месяца p.i .; однако эта разница не была статистически значимой. Животные, получавшие AAV8-1.2HBV, не проявляли других симптомов системной токсичности (данные не показаны). Повышенный уровень АСТ в 1 и 2 месяца п.и. возможно, были связаны с экспрессией трансгена HBV. Эти результаты показывают, что после инъекции AAV8-1.2HBV не было очевидного острого воспалительного ответа.

Образцы сыворотки и печени собирали у мышей HBV (+) и HBV (-) в указанные моменты времени. (а) уровни АЛТ и АСТ. (b) Образцы печени, окрашенные гематоксилином и эозином, для обнаружения воспалительных реакций, а также пятна Массона и красное пятно Sirus для обнаружения осаждения коллагена. Черные стрелы, воспалительная клеточная инфильтрация; синие стрелки, жировые вакуоли; желтые и белые стрелки, осаждение коллагена. HBV (-) мышей, PBS вводили мыши.

Предыдущие исследования показывают, что хроническое воспаление, связанное с инфекцией HBV, способствовало фиброзу печени у пациентов с людьми [34, 35]. Чтобы выяснить, присутствуют ли фиброз печени и хроническое повреждение печени после трансдукции AAV81.2HBV, гистопатологические изменения в участках печени анализировались сверхурочно с помощью H & E, окрашивания Массона и красного пятна Sirus. Как показано на фиг.5b, были указаны мягкое воспаление и некроз печени. Инфильтрация мягких воспалительных клеток, окружающая область портала (черная стрелка), была показана окрашиванием H & E в течение 1, 3 и 6 месяцев pi, и большая часть гепатоцитов была нормальной до 3 месяцев пи. Однако через 6 месяцев pi печеночная дольковая структура была отмечена повреждением, и были показаны почвенные стеклянные гепатоциты, также наблюдалась макровезикулярная дегенерация стеатоза (синяя стрелка), и сосудистая и порталная области были явно расширены. Коллаген (окрашенный в синий цвет окрашиванием Массона и красным красным пятном Сируса, желтая и белая стрелка), осаждение наблюдалось в связи с ростом тенденции в течение периода исследования (рис. 5b). Пролиферированные волокна окрашивались синим в печени пятном Массона, а пролиферированные волокна коллагена I окрашивались красным пятном Sirus Red в печени (рис. 5b). Определены уровни коллагена I и III в сыворотке и печени модельных мышей, которые способствуют количественной оценке основных белков внеклеточного матрикса. По сравнению с обычными мышами в течение 1 месяца p.i., модельные мыши показали увеличение на 20-45% коллагена I (рис. 6a) и увеличение на 90-70% коллагена III (рис. 6b) в сыворотке и печени соответственно. ELISA и RT-qPCR затем использовали для исследования экспрессии связанных с фиброзом белков и генов соответственно. Уровни белка TGF-β1 и TIMP-1 (фиг. 6c) и мРНК (фиг. 6d) были значительно выше у мышей HBV (+), чем у мышей HBV (-). Эти результаты свидетельствуют о том, что инъекция AAV-HBV не вызывала серьезного острого воспалительного ответа, тогда как она вызывала фиброз и хроническую травму печени.

(a, b) Измерения ELISA уровней коллагена I (a) и III (b) в образцах сыворотки и печени. (c) Измерения ELISA уровней белка TGF-β1 и TIMP-1 в сыворотке. (d) Количественные ПЦР с обратной транскрипцией для измерения уровней мРНК Tgf-β1 и Timp-1 в печени. Статистический анализ проводился с использованием двухстороннего дисперсионного анализа. Данные представляют среднее значение ± SD (n = 4). HBV (-) мышей, PBS вводили мыши.

В настоящем исследовании было исследовано использование вектора AAV для переноса генома HBV в клетки печени мыши. Мышам вводили вектор AAV8-1.2HBV через хвостовую вену, которая инициировала продукцию HBV с персистирующей антигеном, виремией и фиброзом печени без очевидного острого воспаления. Репликация HBV, транскрипция и экспрессия сохранялись более 6 месяцев. Уровень виремии был аналогичен уровню, описанному ранее для мышиной модели, опосредованной аденовирусом [20, 21], и модели трансфекционной мыши, установленной посредством гидродинамической инъекции голой ДНК [22]. Модель небольшого животного желательна для оценки эффектов противовирусного лечения и имеет ряд преимуществ перед другими моделями мыши. Например, в модели HBV-трансгенных мышей геном HBV не может быть исключен из-за интеграции в геном хозяина. В другой работе были успешно установлены аденовирусные векторы, несущие 1,3-кратный геном HBV в печень мыши и репликацию HBV, и виремия HBV была обнаружена в сыворотке; однако персистирующая инфекция с использованием AdHBV-векторов сильно ограничена иммунным ответом на капсид-векторы [21]. В модели гидродинамической мыши было трансформировано лишь небольшое отношение гепатоцитов мыши, и скорость репликации вируса сохранялась на низком уровне. Уровни репликации HBV также снижались через 7 дней у иммунокомпетентных мышей, а спустя неделю после этого HBV уже был удален из крови [22].

В настоящем исследовании инфекция AAV8-1.2HBV успешно построила модель стойкой инфекции HBV (длительная виремия высокого уровня и антигенэмия). Острая инфекция или воспаление печени были незначительными или отсутствовали, о чем свидетельствуют нормальные уровни трансаминаз и низкий уровень инфильтрации лимфоцитов (рис. 5b); однако у мышей развилось хроническое заболевание печени, что было подтверждено наличием таких же гепатоцитов, как и у хронически инфицированных пациентов [36-38]. Это очень похоже на патогенез у взрослых; у пациентов развивается персистирующая инфекция HBV после острой инфекции и развивается хроническая инфекция с разной степенью тяжести [39, 40]. Как правило, заболевания печени обычно считаются следствием иммунного ответа против вирусных антигенов, но не самого вируса [40, 41]. Не было прямого цитопатического воздействия на гепатоциты инфекцией HBV наличием множества бессимптомных хронических носителей HBV без признаков поражения печени [42]. Предыдущие исследования выявили дефекты иммунного ответа у пациентов с хроническим поражением HBV, включая снижение HBV-специфических антител [43, 44], задержку миграции лимфоцитов и увеличение супрессорных лимфоцитов [45]. Циркулирующий HBsAg, вероятно, является механизмом дефектного иммунного ответа у носителей HBV [43, 46]. Дальнейшие исследования необходимы для выявления иммунологических факторов, которые отвечают за развитие патогенеза во время стойкой инфекции HBV в этой модели мыши, и для выявления корреляции между фиброзом печени и иммунным ответом.

Фиброз печени является максимальным путем к большинству хронических заболеваний печени и эволюции вследствие повреждения печени, вызванного вирусными, паразитарными, токсическими, метаболическими и / или аутоиммунными расстройствами [47]. Типичным признаком фиброза печени является увеличение степени и состава внеклеточного матрикса, что приводит к осаждению коллагена I. Стероидные клетки печени играют важную роль в фиброгенезе печени [48-50]. Несколько факторов могут стимулировать покоящиеся звездчатые клетки печени к активному типу фиброгенных клеток. Активированные печеночные звездчатые клетки генерируют фиброзные компоненты, включая коллагеновый тип I, ингибиторы деградации матрицы, такие как TIMP-1, и другие факторы роста (TGF-β1 и т. Д.) [51]. Новая модель мыши, описанная здесь, показала повышенную регуляцию фиброзных маркеров, таких как коллаген типа I и коллаген типа III, в печени и сыворотке. ТИМП-1 является критическим фактором, который считается фиброгенезом и может запрещать деградацию внеклеточного матрикса, и его экспрессия приводит к осаждению внеклеточного матрикса в моделях фиброза печени [52]. ТИМП-1 также значительно увеличился в сыворотке модельных мышей в настоящем исследовании. TGF-β1 играет важную роль в гомеостазе процессов фиброгенеза, и его экспрессия регулируется и поддерживается в течение всего фиброзного процесса в настоящем исследовании.

Таким образом, мы разработали модель стойкой инфекции HBV, которая индуцировала фиброз печени у иммунокомпетентных мышей, что похоже на то, что у пациентов с хронической инфекцией HBV. Хотя в предыдущих исследованиях были установлены мышиные модели фиброза печени [53-55], ни одна из существующих моделей животных не имитирует фиброз печени при длительной инфекции HBV у иммунокомпетентных мышей. Поэтому эта новая модель может быть полезна для исследования точных механизмов, которые лежат в основе фиброза печени при хронической инфекции HBV, и может способствовать развитию новых терапевтических средств.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Авторы благодарят доктора Ян Вэй, который дал критический взгляд на данные иммуногистохимического окрашивания.

Это исследование было поддержано Пекинский союзный медицинский колледж, окончил студенческий инновационный фонд (2011-1001-033) и основной грант Института биологии патогенов Китайской академии медицинских наук (грант №: 2011IPB106).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *