Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Динамика экспрессии трансформирующего сигнала фактора роста-β / Smad в фиброзе печени, экспериментально вызванного Clonorchis sinensis

The expression dynamics of transforming growth factor-β/Smad signaling in the liver fibrosis experimentally caused by Clonorchis sinensis
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4329204/

Фиброз печени является отличительной чертой клонорхиаза, пострадавшего от миллионов людей в странах Восточной Азии. Недавние исследования показали, что активация сигнального пути TGF-β / Smad может эффективно регулировать фиброгенез печени, включая Schistosoma spp. и Echinococcus мультилокулярный фиброз печени. Однако пока мало известно о выражении трансформирующего фактора роста β (TGF-β) и других молекул в сигнальном пути TGF-β / Smad, который может играть важную роль в фиброзе печени, вызванном C. sinensis.

В общей сложности 24 мышам индивидуально инфицировали перорально 45 метацеркариями, обе экспериментальные мыши и мышам-контрольным мышам анестезировали через 4 недели после инфицирования (wk p.i.), 8 wk p.i. и 16 wk p.i., соответственно. Для каждого временного периода печень и сыворотку от каждого животного собирали для анализа гистологических данных и различных фиброзных параметров, включая TGF-β1, TGF-β -рецепторы и нисходящую активацию Smads, а также экспрессию маркеров фиброза.

Результаты показали, что осаждение коллагена, указанное содержанием гидроксипролина и окрашиванием трихрома Массона, постепенно увеличивалось с развитием инфекции. Экспрессия транскриптов мРНК типа α1 (Col1a) коллагенного типа неуклонно возрастала во время всей инфекции. Уровни мРНК Smad2, Smad3, а также белка Smad3 в печени инфицированных C. sinensis мышей были увеличены после 4 недель p.i. (P <0,05 по сравнению с нормальным контролем), тогда как экспрессия мРНК рецептора TGF-β1, TGF-β-типа (TGFβRI) и TGF-β-типа II (TGFβRII) у мышей, инфицированных C. sinensis, была выше, чем у нормальных контрольные мыши после 8 wk pi (P <0,05). Однако экспрессия гена Smad4 и Smad7 достигала максимума в 4 wk p.i. (P <0,05), а затем упали до базального уровня с 8 wk p.i. и 16 wk p.i. соответственно. Концентрации TGF-β1 в сыворотке у инфицированных C. sinensis мышей при 8 wk p.i. и 16 wk p.i (P <0,05) были значительно выше, чем у контрольных мышей.

Результаты настоящего исследования впервые показали, что активация сигнального пути TGF-β / Smad может способствовать синтезу коллагена I типа, что приводит к фиброзу печени, вызванному C. sinensis.

Clonorchis sinensis является пищевым зоонозным паразитом, который является эпидемией в некоторых странах Восточной Азии, включая Китай, Корею, Японию и Вьетнам. У людей предполагается, что около 15-20 миллионов человек страдают от клонорхиаза, тогда как число инфицированных людей в Китае составило 12,5 миллионов человек, согласно докладу, основанному на общенациональном опросе [1,2]. Человек заражается приемом пресноводных рыб, содержащих C. sinensis metacercariae. Метацеркарии развиваются у C. sinensis в двенадцатиперстной кишке путем стимуляции трипсина, а затем быстро перемещаются в внутрипеченочный желчный проток, где ювенильные черви становятся зрелыми и выживают в течение десятилетий [3,4]. C. sinensis-инфекция может вызывать значительный холангит, аденоматозную гиперплазию, механическую обструкцию гепатобилиарного протока и холелитиаза [5]. Кроме того, C. sinensis считается канцерогеном-метазоном группы I, чтобы потенциально индуцировать холангиокарцинома у людей [6]. Хроническая инфекция C. sinensis также может потенциально приводить к фиброзу печени, который характеризуется чрезмерным накоплением компонентов внеклеточного матрикса (ECM) из-за дисбаланса между его синтезом и деградацией [2,7,8]. Более того, некоторые компоненты червей и его экскреторные / секреторные продукты (ESP), которые могут, вероятно, участвовать в развитии фиброза печени, широко исследованы в лаборатории профессора Ю [9-13]. Однако молекулярный механизм, лежащий в основе фиброзных реакций хозяев на эти факторы вирулентности, не полностью выяснен.

Трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) в качестве одного из основных профибротических цитокинов играет решающую роль в организации фиброгенеза, и показано, что активный TGF-β1 мотивирует свой путь передачи сигналов вниз по потоку, что приводит к фосфорилированию Smad2 и Smad3 (также называемого R-Smad), который медитируется рецепторами TGF-β типа I (TGFβRI) и типа II (TGFβRII), фосфорилированным Smad2 и Smad3, быстро объединяется с общим медиатором Smad4 и затем мигрирует в ядро, что приводит к экспрессии массивных фиброзных генов ( таких как коллаген типа I) [14-17]. TGF-β / Smad сигнальный путь был доказан как канонический путь, который может сильно регулировать фиброгенез печени [18,19], и в нескольких исследованиях речь шла об активации сигнализации TGF-β / Smad при фиброгенезе, вызванном паразитарной инфекцией, таких как Schistosoma spp. и Echinococcus multilocularis, который предположил, что сигнализация TGF-β / Smad играет важную роль в развитии фиброза печени [20-22]. Однако, насколько нам известно, мало известно о выражении и потенциальной роли сигнального пути TGF-β / Smad, который может быть вовлечен в процесс фиброза печени, вызванный C. sinensis. В свете этого фона целью настоящего исследования было исследование динамики экспрессии пути TGF-β / Smad и анализ их возможных ролей в развитии фиброза печени у мышей BALB / c, инфицированных C. sinensis.

Pseudorasbora parva, второй промежуточный хозяин, который был, естественно, инфицирован C. sinensis, был собран в Гуансийском автономном районе Китайской Народной Республики. И рыба была доставлена ​​в нашу лабораторию по воздуху. Метацеркарии C. sinensis собирали путем переваривания рыбы пепсином-HCl (0,6%) искусственного желудочного сока. Собранные метацеркарии сохранялись в холодном растворе Альсевера с антибиотиками до использования.

Женские мыши BABL / c (6-8 недель, 22 ± 2 г) были приобретены у Shanghai Laboratory Animal Co., Ltd (SLAC, Шанхай, Китай). Мышей размещали в кондиционированном помещении при температуре 24 ° С с 12-часовым циклом темноты / света и допускали свободный доступ к стандартной лабораторной пище и воде. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Медицинского коллажа Xuzhou. Мышей индивидуально инфицировали перорально 45 метацеркариями. Мок-инфицированные контрольные мыши аналогичным образом вводили с 50 мкл стерильного нормального раствора. Обе экспериментальные мыши (n = 24) и контрольные мыши (n = 15) были разделены на 3 группы и обезболивали через 4 недели после инфицирования (wk p.i.), 8 wk p.i. и 16 wk p.i., соответственно. Для каждого момента времени печень и сыворотку от каждого животного собирали для анализа гистологических данных и различных фиброзных параметров.

Для гистологической оценки все образцы печени фиксировали в формалине, вложенном в парафин. Были подготовлены 4 мкм толстые секции и затем окрашены гематоксилином и эозином (H & E) и трихромом Массон (MT). Эти образцы наблюдались и фотографировались под перевернутым микроскопом. Коллагеновые осадки с 5-8 изображений каждого образца определяли количественно с использованием программного обеспечения Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA).

Коллаген также определяли путем оценки концентрации гидроксипролина (Hyp), аминокислотной характеристики коллагена. Лизаты использовали для измерения содержания гидроксипролина с использованием имеющихся в продаже наборов в соответствии с инструкциями производителя (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China). В этом наборе концентрация гидроксипролина определяли реакцией окисленного гидроксипролина 4- (диметиламино) бензальдегидом (DMAB), который измеряли спектрофотометрически при 560 нм.

Общая РНК извлекалась из тканей печени с использованием реагента TRIzol (TIANGEN Biotech, Beijing, China), как описано изготовителем. РНК транскрибировали с обратной связью с использованием набора для обратной транскрипции (TIANGEN Biotech, Пекин, Китай). Чтобы исследовать экспрессию пути TGF-β / Smad в печени, относительную количественную RT-PCR (qPCR) проводили с использованием LightArcler FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche Applied Science, Мангейм, Германия) в соответствии с протоколом производителей с последовательностями праймеров, показанных в таблице 1. Оптимальными условиями светового цикла были: начальная денатурация при 95 ° С в течение 5 мин, затем 40 циклов с денатурацией при 95 ° С в течение 30 с, отжиг при 60 ° С в течение 30 с и относительное удлинение при 72 ° С в течение 30 с (таблица 1). Количественную оценку экспрессии гена-мишени оценивали в терминах сравнительного порога циклирования (Ct), нормированного β-актином, с помощью метода 2- △△ Ct. Таблица 1
Праймеры, используемые в настоящем исследовании

Общий белок экстрагировали из тканей печени и анализировали с помощью набора для анализа концентрации белка бицинхониновой кислоты (Beyotime Biotech, Beijing, China). Образец белка разделяли электрофорезом в 12% SDS-PAGE с помощью системы электрофореза Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Первичные антитела (кроличье антитело против Smad3, UCallM biotech Co., Ltd, Wuxi, China, разведение 1: 1000) инкубировали при 4 ° C. Соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с хрена-пероксидазой (анти-кроличьи IgG, разведения 1: 5000) инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембрану, содержащую антитело-белковые комплексы, визуализировали с помощью усовершенствованной системы детектирования хемилюминесценции на рентгенограмме. Бренды были отсканированы и проанализированы программным обеспечением Quantity ONE (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Экспрессия белка в каждом образце была нормализована α-Tublin (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

Сыворотка от каждой мыши сразу использовалась для оценки концентрации TGF-β1 с помощью специального набора ELISA (eBiosciences, CA, USA). Вкратце, образцы сначала активировали 1 моль / л HCl, а затем образцы, а также серийные разведения стандартов добавляли к 96-луночным планшетам, предварительно покрытым анти-TGF-β1, и предварительно блокировали PBS, содержащим 10% фетального бычью сыворотку (FBS) после промывки образцов, в течение 30 мин при комнатной температуре добавляли конъюгированный пероксидазу (HRP) -конъюгированный стрептавидин А в PBS, содержащий 10% FBS. После окончательной промывки добавляли субстрат HRP TMB (3,3,5,5-тетраметилбензидин) и измеряли оптическую плотность цветовой реакции при 450 нм. Концентрации цитокина в сыворотке рассчитывали с использованием стандартных кривых в качестве ссылок.

Все значения были выражены как среднее ± SEM. Сравнение между контролем и каждой экспериментальной группой проводилось путем одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) и неспаренного t-теста Стьюдента с использованием статистического пакета SPSS 13.0. Различия считались статистически значимыми при P <0,05.

В нормальной контрольной группе гепатоциты, расположенные плотно, и печеночные дольки наблюдались полностью. Напротив, в группе, инфицированной C. sinensis, фиброзные корды наблюдались в перипортальных областях C.synensis-инфицированных мышей при 4 wk p.i. и 8 wk pi, и по мере развития инфекции коллагеновые волокна были расширены от портальных областей до дольки мыши у мышей в 16 недель, расположение гепатоцитов было разупорядочено, а в этот момент были обнаружены псевдоглобулы в некоторых серьезных случаях (рис. 1A и Фигура 1В). Количество осаждений коллагена постепенно увеличивалось с развитием инфекции, а статистическая разница и значительная разница наблюдались при 8 wk p.i. (P <0,05) и 16 wk p.i. (P <0,05), соответственно, по сравнению с обычными контрольными мышами (рис. 1D). Рисунок 1 Оценка фиброза печени у мышей, вызванная Clonorchis sinensis через 4 недели после заражения (wk p.i.), 8 wk p.i. и 16 wk p.i. (A) Гистологическое исследование тканей печени у инфицированных C. sinensis мышей и мышей с нормальным контролем в разных временных точках, как указано. (B) Отложения коллагена были специально окрашены трихромом Массона в разные моменты времени, как указано. (C) Концентрацию гидроксипролина (Hyp) измеряли в гомогенате печени (0,1 г) в фиброзной или нормальной печени мышей BALB / c в указанные моменты времени. (D) Отложения коллагена из каждого образца были полуколичественны с использованием программного обеспечения Image-Pro Plus. Данные были представлены как среднее ± SEM от 8 C. синесса-инфицированных мышей и 5 нормальных контрольных (NC) мышей в каждый момент времени, * = P <0,05, ** = P <0,01, *** = P <0,001 против контрольных мышей.

Гидроксипролин, который является основным компонентом коллагена, также оценивали как показатель содержания коллагена. По сравнению с обычными контрольными мышами уровни гидроксипролина были значительно увеличены при 4 wk p.i. (P <0,001), а затем резко возрастает при 8 wk p.i. (P <0,001) и 16 wk p.i. (Р <0,001, фиг. 1С).

Результаты qPCR показали, что уровень мРНК альфа-гладкомышечного актина (α-SMA) был резко увеличен с 4 wk p.i. до 16 wk p.i., и были статистические различия для экспрессии мРНК α-SMA между 8 wk p.i. или 16 wk p.i. и контрольных животных (P <0,05, фиг. 2A). Результаты также показали, что уровни мРНК экспрессии коллагена α1 (Col1a) неуклонно возрастали с 4 wk p.i. до 16 wk p.i., и существенные различия были обнаружены при 8 wk p.i. (P <0,05) и 16 wk p.i. (P <0,05), по сравнению с обычными контрольными животными (рисунок 2B). Однако выражение коллагена типа III (Col III) не изменялось при 4 wk p.i., 8 wk p.i. или 16 wk p.i., и не было статистических различий между зараженными C. sinensis животными и нормальными контрольными (Рисунок 2C, P> 0,05). Рисунок 2
Экспрессия мРНК профибротических молекулярных маркеров в печени мышей во время
Clonorchis sinensis
инфекционное заболевание. Мышам было орально инфицировано 45 метацеркарий C. sinensis, печень была собрана у инфицированных и неинфицированных мышей в указанные моменты времени, а уровни мРНК были определены с помощью qPCR (нормализовано к уровням транскрипции бета-актина). (A) α-SMA; (B) Col1a; (C) Col III. Данные были представлены как среднее ± SEM от 8 C. синесса инфицированных мышей и 5 нормальных контрольных мышей в каждый момент времени, * = P <0,05, ** = P <0,01, *** = P <0,001 против контрольных мышей.

Как показано на фиг.3, экспрессия мРНК TGF-β1, TGFβRI, TGFβRII, Smad2 и Smad3 повышалась в печени инфицированных C. sinensis мышей по сравнению с обычными контрольными мышами. И существенные различия наблюдались с 8 wk p.i. до 16 wk p.i. для TGF-β1, TGFβRI, TGFβRII (P <0,05), тогда как уровни экспрессии мРНК Smad2 и Smad3 показали статистические отличия от 4 wk p.i. до 16 wk p.i. по сравнению с обычными контрольными мышами (P <0,05). Однако мРНК Smad4 и Smad7 достигла максимума при 4 wk p.i., после чего уменьшилось на 8 wk p.i. и 16 wk p.i. и была значительная разница между C. synensis-инфицированными мышами и контрольной группой в 4 wk p.i. (P <0,05). Фиг. 3 Экспрессия гена TGF-β / Smad сигнализации в фиброзе печени, вызванная C. sinensis , Мышам было орально инфицировано 45 метацеркарий C. sinensis, печень была собрана у инфицированных и неинфицированных мышей в указанные моменты времени, а уровни мРНК были определены с помощью qPCR (нормализовано к уровням транскрипции бета-актина). (A) Smad3; (B) Smad4; (C) Smad7; (D) TGF-β1; (E) TGF & beta; (F) TGF & beta; (G) Smad2. Данные были представлены как среднее ± SEM от 8 C. синесса инфицированных мышей и 5 нормальных контрольных мышей в каждый момент времени, * = P <0,05, ** = P <0,01, *** = P <0,001 против контрольных мышей.

Белок Smad3 в печени инфицированных C. sinensis мышей резко увеличивался по мере развития инфекции, что соответствовало экспрессии мРНК Smad3. Статистические различия были обнаружены при экспрессии Smad3 во всех инфицированных C. sinensis группах по сравнению с нормальной контрольной группой (фиг. 4A и фиг. 4B, P <0,05). Экспрессия белка Smad3 в печени и динамические изменения серозного TGF-β 1 в сыворотке от C. sinensis -инфицированные и неинфицированные мыши , Мышей орально инфицировали 45 метацеркариями C. sinensis, печени и сыворотки собирали у инфицированных и неинфицированных мышей в указанные моменты времени, а уровни экспрессии белка Smad3 (A & B) в печени и TGF-β1 (C) в сыворотке от мышей определяли с помощью вестерн-блоттинга и ELISA, соответственно. Данные были представлены как среднее ± SEM от 8 C. синесса инфицированных мышей и 5 нормальных контрольных мышей в каждый момент времени, * = P <0,05, ** = P <0,01, *** = P <0,001 против контрольных мышей.

Как показано на фиг.4С, во время всей экспериментальной инфекции концентрация TGF-β1 в сыворотке при 8 wk p.i. и 16 wk p.i. был значительно выше, чем у контрольных мышей (Р <0,05), а уровень TGF-β1 был увеличен с 4 wk p.i. до 16 wk p.i во время развития инфекции.

Предыдущие исследования показали, что фиброз печени был организован сложной сетью сигнальных путей, участвующих в регуляции осаждения внеклеточного матрикса, и этих сигнальных путей, сигнальный путь TGF-β / Smad считается наиболее известным медиатором в ускорении фиброза печени [18 , 23]. Недавно TGF-β, IL-13 и Il-17 были продемонстрированы как другие критические профибротические цитокины при фиброзе печени, например, IL-13 может сильно индуцировать синтез коллагена I и других фиброзных маркеров непосредственно у Schistosoma spp. вызванного фиброзом печени, тогда как IL-17A может способствовать активации HSC и стимулировать экспрессию мРНК IL-6, α-SMA, коллагена, а также TGF-β1 в фиброзе печени, вызванном тетрахлорметаном [24-27]. Однако мало известно о молекулярном механизме, лежащем в основе C. sinensis, вызванного фиброзом печени. В настоящем исследовании мы использовали мышей BALB / c для изучения возможного механизма, лежащего в основе фиброза печени, вызванного C. sinensis. Как и в других исследованиях, мы показали, что у мышей BALB / c может развиться умеренный перидуктивный фиброз при 4 wk p.i. и массивное осаждение внеклеточного матрикса после 8 wk p.i. продемонстрированный окрашиванием HE и MT, что указывает на то, что модель мыши для индуцированного C. sinensis фиброза печени в настоящем исследовании была успешно установлена ​​[7,8].

Биологические функции TGF-β и его роли в регуляции осаждения ECM интенсивно пересматриваются, а белки членов семейства Smads являются важными медиаторами, которые трансдуцируют сигналы, индуцированные TGF-β, конкретным генам-мишеням в ядре, что приводит к выражению -фибротические гены [28,29]. Были также некоторые исследования, в которых предполагалось, что TGF-β1 и его нижестоящие Смады играют центральную роль в индуцированном паразитом фиброзе печени [20,30,31], например, у мыши, инфицированной Schistosoma mansoni, увеличенной экспрессии TGF-β1 и его рецепторы приводили к интенсивному накоплению белков внеклеточного матрикса, а лечение антифибротическими препаратами, такими как празиквантел, могло заметно снижать концентрацию TGF-β и приводило к обратимому фиброзу печени у инфицированных S. mansoni мышей [32,33].

Как и ожидалось, транскрипции печеночной мРНК фиброзных маркеров, таких как коллаген I (Col1a), TGF-β1, α-SMA и содержание гидроксипролина, были увеличены со степенью вызванного C. sinensis печеночного фиброза, что было отмечено окрашиванием MT. Чтобы дополнительно исследовать, активирована ли сигнализация TGF-β / Smad во время фиброза, вызванного C. sinensis, или нет, была проанализирована экспрессия генов и белков в сигнальном пути TGF-β / Smad. В настоящем исследовании экспрессия мРНК TGF-β1, Smad2 / 3, TGFβRI и TGFβRII была значительно сильнее в печени инфицированных C. sinensis мышей, чем у контрольных, и эти изменения были положительно коррелированы со степенями печеночной фиброз (данные не показаны), предполагая, что сигнальный путь TGFβ / Smad может быть вовлечен в развитие фиброза печени из-за инфекции C. sinensis. Тем не менее, наше исследование показало, что Smad4 был обнаружен увеличенным на 4 wk p.i., и его экспрессия уменьшилась с развитием фиброза печени, что предположило, что эффекты Smad4 могут возникать на ранней и средней стадии фиброза печени [34]. Наши результаты также показали, что экспрессия Smad7 повышается только на 4 wk p.i. и экспрессия Smad2 была значительно выше в печени мышей C. sinensis-инфекции, что указывает на то, что Smad7 играет отрицательную роль в тонкой настройке сигналов TGF-β, поскольку увеличенный Smad2 может подавлять экспрессию Smad7 обратно [35,36 ].

В заключение наши результаты настоящего исследования впервые показали, что динамика экспрессии сигнального пути TGF-β / Smad может быть вовлечена в развитие фиброза печени, вызванного C. sinensis. Дальнейшие исследования должны быть обоснованы для выяснения детальной роли сигнального пути TGF-β / Smad в C. sinensis, вызванного фиброзом печени, который может предоставить основную информацию для контроля клонорхиаза.

Чао Янь и Лин Ван внесли одинаковый вклад в эту работу.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Вклад авторов

Задуманные и разработанные эксперименты: KYZ, RXT и CY. Выполняли эксперименты: CY и LW; Проанализированы данные: LW и CY; Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: BZ, BL, BBZ, YHW, JXC и XYL; Написал бумагу: CY. Все авторы прочитали и утвердили окончательный вариант рукописи.

Поддержка проекта была предоставлена, в частности, Национальным фондом естественных наук Китая (гранты № 81171590 и 31302077), Открытыми фондами Государственной ключевой лаборатории ветеринарной этиологической биологии, Институтом ветеринарных исследований Ланьчжоу, Китайской академией сельскохозяйственных наук (грант № SKLVEB2013KFKT005), Программа инновационных инноваций в области науки и технологий провинции Цзянсу, Китай (грант № KYLX14-1448). Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *