Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Сывороточный «сладкий пончик» белка способствует оценке фиброза и оценке терапии у пациентов с вирусным гепатитом

A serum “sweet-doughnut” protein facilitates fibrosis evaluation and therapy assessment in patients with viral hepatitis
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3545220/

Хотя фиброз печени отражает тяжесть заболевания у пациентов с хроническим гепатитом, не было простой и точной системы для оценки терапевтического эффекта, основанного на фиброзе. Мы разработали иммуноанализ на основе гликана, FastLec-Hepa, чтобы заполнить эту неудовлетворенную потребность. FastLec-Hepa автоматически обнаруживает уникальное связанное с фиброзом глико-изменение в сыворотке гипергликозилированного белка, связывающего Mac-2, в течение 20 мин. Сыворотка FastLec-Hepa увеличивается с увеличением фиброза и иллюстрирует значительные различия в медианах между всеми стадиями фиброза. FastLec-Hepa является достаточно чувствительным и количественным для оценки влияния терапии PEG-интерфероном-α / рибавирином в короткий послеоперационный интервал. Полученная степень фиброза эквивалентна -0,30 стадии / год у пациентов с устойчивым вирусологическим ответом и 0,01 стадии в год у рецидивов / неответчиков. Кроме того, долгосрочное наблюдение за тяжело пораженными пациентами показало, что гепатоцеллюлярная карцинома развилась у пациентов после терапии, чьи показатели FastLec-Hepa оставались выше назначенной величины отсечки. FastLec-Hepa является единственным анализом, который в настоящее время доступен для клинически выгодной оценки терапии путем количественного определения тяжести заболевания.

Всемирная организация здравоохранения подсчитала, что распространенность хронических инфекций с вирусом гепатита B (HBV) и вирусом гепатита C (HCV) составляет более 5% от мирового населения. Высокий уровень вирусной передачи во всем мире также привел к взрывному увеличению частоты цирроза печени (LC), поскольку фиброз печени, вызванный персистирующей инфекцией с ВГВ и HCV, необратимо прогрессирует у пациентов с хроническим гепатитом (СН) без эффективного лечения. Поскольку частота гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) увеличивается пропорционально тяжести гепатита и наличию LC, теперь становится ясно, что около 90% случаев HCC происходят от инфекции HBV или HCV. По оценкам, более миллиона пациентов во всем мире умирают от болезней печени, связанных с инфекцией HBV или HCV каждый год. Иммуномодулирующая терапия ПЭГ-интерфероном-и рибавирином является стандартным лечением пациентов с хроническим гепатитом С (ХСН) 1. Недавние исследования в области генома показали, что изменение гена-интерлейкина-28B хозяина может предсказать результат лечения вирусного разминирования234. Такое фармакокинетическое понимание должно обеспечивать более точные протоколы лечения и последующие анализы, чтобы оптимизировать возможность для пациентов достичь устойчивого вирусологического ответа (СВР) 56. Линейные пептидомиметические ингибиторы сериновой протеазы HCV и NS3 / 4A, такие как telaprevir и boceprevir, являются новыми препаратами, которые в сочетании с PEG-интерфероном-α и рибавирином существенно улучшают показатели ответа среди пациентов с инфекцией генотипа 1 HCV1. В качестве альтернативы, подавление декомпенсации печени у пациентов с хроническим гепатитом В с развитым фиброзом и циррозом было оценено при длительном лечении противовирусными агентами, такими как адефовир, ламивудин, энтекавир и тенофовир7. Например, кумулятивная терапия энтекавиром (не менее 3 лет) приводила к существенному гистологическому улучшению и регрессии фиброза или цирроза.

В настоящее время эффективность терапии оценивается путем частого мониторинга «вирусной нагрузки» или «повреждения печени» 5. С точки зрения разработки превентивных стратегий для HCC, наряду с ними следует также оценить риск развития HCC. Для этой цели биопсию печени обычно считают золотым стандартом, в котором фиброз субклассифицируется на 5 этапов тяжести (F0-4). Однако эта процедура является инвазивной и показала, что она вызывает высокую частоту ошибок выборки (около 15% ложных отрицательных значений для цирроза) у пациентов с диффузными паренхиматозными заболеваниями печени. Кроме того, в ретроспективном когортном исследовании9 частота развития фиброза оценивалась примерно -0,28 стадии в год у пациентов с СВР и 0,02 стадии в год у пациентов с неконтролируемым вирусологическим ответом (NVR). Это указывает на то, что биопсия не подходит для оценки эффекта терапии через короткий промежуток времени. Эта процедура имеет следующие недостатки, такие как неточность, осложнения, связанные с биопсией, необходимость госпитализации, время и низкая экономическая эффективность10. Поэтому желательны альтернативные неинвазивные анализы и должны обеспечивать количественное считывание прогрессирования фиброза с использованием метода, который является точным, экономически эффективным и относительно простым.

На сегодняшний день было разработано несколько методов10, в том числе FibroScan, который биомеханически оценивает фиброз печени как жесткость ткани на основе переходной эластографии. FibroScan имеет преимущества быстрого и технически простого; однако на его диагностический уровень успеха влияет умение оператора. Поэтому было высказано предположение, что FibroScan в сочетании с анализом биомаркеров сывороточного фиброза должен улучшить диагностическую точность. FibroTest11 и FibroMeter12, которые считаются наиболее надежными показателями фиброза, были использованы в комбинированном анализе, направленном на устранение потребности в биопсии печени1314. Однако FibroTest и FibroMeter не дополняют FibroScan в разработке быстрой системы диагностики на месте. Это связано с тем, что для каждого требуются как обширные, так и специализированные анализы крови (FibroTest требует α2-макроглобулина, аполипопротеина A1, гаптоглобина, γ-глутамилтрансферазы и общего билирубина, тогда как FibroMeter требует количества тромбоцитов, протромбинового индекса, АСТ, α2-макроглобулина, гиалуроновой кислоты и мочевины). Кроме того, для обоих тестов требуются данные о возрасте, а также о сексе для FibroTest.

Гликаны упоминаются как лицо клеток, которые отражают их статус, например, стадию дифференциации, а не их состояние повреждения, и поэтому они могут быть отличными маркерами для хронического заболевания. В случае гепатита считается, что гликаны отражают более конкретно прогрессирование фиброза, чем вирусную нагрузку. В поисках простого и быстрого метода, который не оказывает заметного влияния на воспаление тканей и флуктуации ALT, появилась возможность гликомических и гликопротеомических методов1516, и есть сообщения о некоторых успешных примерах, применимых для использования в клинических лабораториях171819. Однако для нынешних гликомических методов требуется, по крайней мере, 3 часа подготовки проб для анализа, и это значительно сократило использование комбинации иммуноанализов на основе гликана с помощью FibroScan. В этом отчете мы впервые описываем быстрый и простой иммуноанализ на основе глюкана, FastLec-Hepa, который может количественно определять фиброз точно так же, как FibroTest, а также легко оценить антифибротические эффекты терапии на клиническом сайте (дополнительный рисунок 1 ). Кроме того, мы вводим новый метод рационального выбора лектинов типа «не-фукозасвязывающего типа» и подробно расскажем о том, как эта концепция может быть принята для будущего развития клинически полезных глико-диагностических инструментов.

На основании предыдущих отчетов20212223 мы использовали сывороточный связывающий белок 90 K / Mac-2 (M2BP) в качестве биомаркера гликопротеина для фиброза печени. M2BP секретируется из многих типов клеток, включая гепатоциты (http://www.proteinatlas.org/ENSG00000108679), и было показано, что он модулирует многие процессы, особенно связанные с клеточной адгезией. Например, взаимодействие M2BP с матричным фибронектином может модулировать адгезию, а высокая экспрессия M2BP опухолевыми клетками увеличивает уровень циркуляции пораженных пациентов. Характерной особенностью нативного человеческого M2BP является его олигомеризация в крупные кольцевые структуры20, напоминающие «сахарный порошок», который потенциально покрыт 70-112 N-гликанами (фиг.1а). Чтобы подтвердить сывороточный M2BP в качестве действительного маркера, мы провели анализ с сывороткой (по 2 мкл каждый) из пяти особей в каждой из следующих групп: HCC, LC, CHC или здорового добровольца с нормальной печенью (HV). Несмотря на то, что во всех HV и двух пациентах с CHC были обнаружены две полосы, M2BP от пациентов с относительно тяжелым фиброзом, то есть LC и HCC, мигрировали как одна полоса, мобильность которой была аналогична подвижности нижней полосы для HVs (фиг.1b ). Значительное увеличение интенсивности полосы при чрезмерном размазывании полос наблюдалось у большинства пациентов с ГЦК. Последующее исследование 125 пациентов с ВГС с фиброзом, обусловленным стадией, показало изменение качества и количества M2BP во время прогрессирования фиброза (рис.1c) и кажущееся изменение количества каждой полосы (рис.1d и e), как описано в предыдущих исследованиях2223. Было показано, что M2BP имеет многослойные и сиалилированные N-гликаны. Более того, было высказано предположение, что расширение полилактозамина на M2BP контролирует его связывание с galectin-3, основным партнером по связыванию in vivo. Сиалилирование и расширение полилактозамина влияют на заряд и размер M2BP, и это приводит к изменению электрофоретической миграции. Соответственно, мы предполагаем, что гетерогенность размера M2BP, наблюдаемая на электрофоресе, обусловлена ​​такими изменениями в гликозилировании. Фактически, различие в миграциях полос было устранено обработкой сиалидазой А, а размывание полос в HCC было уменьшено путем обработки N-гликозидазой F (дополнительный рисунок 2). Эти результаты показали, что измененное качество M2BP во время прогрессирования заболевания печени было вызвано изменениями в N-гликозилировании.

Чтобы построить надежный анализ (см. Дополнительный рисунок 3), нам необходимо было идентифицировать зонд лектина, который мог бы наиболее легко различать измененные N-гликаны M2BP и специфически связываться с ними в сыворотке без предварительной обработки. С этой целью мы добавили процесс вычитания в нашу недавно описанную стратегию выбора на основе микрочипов16 (дополнительная фиг.4). Вкратце, мы сначала получили типичный профиль гликана для сывороточных M2BPs путем усреднения гликановых профилей M2BPs, иммунопреципитированных из 125 сывороток пациентов с HCV с помощью микроархива лектина на основе антител161824 (шаг 1). На этом этапе мы выбрали 27 лектинов, связывающихся с M2BP из 45-лектиновой решетки (дополнительный рисунок 5a). Большинство из них связаны не только с M2BP (примерно 10 мкг / мл в сыворотке), но и с другими распространенными гликопротеинами сыворотки, тогда как некоторые из них предполагают довольно специфическое связывание с M2BP. Мы обозначили их как высокошумные лектины или высокие лектины с сигналом к ​​шуму (S / N), соответственно (рис.2а). Затем мы выбрали лектины-кандидаты для анализа путем вычитания высокошумных лектинов из лектинов, связывающих M2BP (стадия 2), с использованием гликанового профиля цельной сыворотки (дополнительный рисунок 5) 25. Сравнивая профили для M2BP и цельной сыворотки (рис.2b), мы быстро идентифицировали 6 лектинов с высоким отношением S / N. Интересно отметить, что все лектины, идентифицирующие модификацию фукозы, которая является наиболее известным глико-изменением в заболеваниях печени (Pisum sativum agglutinin (PSA), линз culinaris agglutinin (LCA), лектин Aspergillus oryzae (AOL) и лектин алюрийской аурантии (AAL) ), были высокошумными лектинами (рис.2, б). После вычитания мы использовали как тест Mann-Whitney U в качестве непараметрического теста, так и анализ приемной характеристики (ROC), чтобы охарактеризовать диагностическую точность кандидатов-лектинов на каждой стадии фиброза: значительный фиброз (F2 / F3 / F4 ), тяжелый фиброз (F3 / F4) и цирроз (F4) (шаг 3). В результате мы обнаружили, что диагностический признак агглютинина Wisteria floribunda (WFA) превосходил другие 5 лектинов на каждой стадии фиброза (фиг.2c и дополнительный рисунок 6).

Мы количественно проанализировали WFA-связывающие M2BPs (WFA + -M2BP) в сыворотке. Сыворотки, предварительно обработанные, как описано в Методах, были сначала подвергнуты аффинному захвату с 20 мкл суспензии покрытого WFA агарозного геля. Элюированную фракцию иммунопреципитировали захватным антителом против M2BP и продукт анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Интенсивность сигнала «размывающей полосы» для WFA + -M2BP постепенно увеличивалась пропорционально тяжести фиброза печени (дополнительная фиг.7), как показано красной линией, показанной на фиг.1е. Затем мы провели сэндвич-иммуноанализ с WFA и антителом против M2BP (см. Дополнительный рисунок 3b). WFA иммобилизуют на поверхности 96-луночного планшета для микротитрования посредством взаимодействия биотин-стрептавидина. Мы провели первый анализ активности WFA-связывания с использованием рекомбинантного человеческого M2BP (rhM2BP). В результате линейный регрессионный анализ выявил линейный диапазон обнаружения от 0,039 до 0,625 мкг / мл (дополнительный рисунок 8а). Впоследствии мы использовали культуральный супернатант клеточной линии гепатобластомы HepG2, который экспрессирует WFA + -M2BP, чтобы проиллюстрировать дозозависимость взаимодействия WFA с M2BP / HepG2. Мы также показали, что термообработка супернатанта культуры устраняет эту связывающую активность (дополнительная фиг.8b). Наконец, мы провели сэндвич-иммуноанализ для прямого измерения WFA + -M2BP в необработанных образцах сыворотки, и результаты хорошо коррелировали с количественным анализом с использованием анализа захвата аффинности и лектина (дополнительная фиг.7 и 9).

Мы адаптировали иммуноанализ WFA-антитела к анализу клинической химии HISCL-2000i18. Мы успешно скорректировали каждое условие реакции во время автоматического анализа HISCL, что составляет примерно 17-минутную манипуляцию. Предварительная обработка сыворотки была предотвращена, чтобы обеспечить как связывающую авидность, так и скорость быстрой ассоциации. Повторяемость оценивали, выполняя 10 независимых анализов по трем образцам, а коэффициент вариации составлял от 2,1 до 2,5% (данные не показаны). Чувствительность определяли путем трехкратного анализа образцов, полученных с помощью 2-кратного серийного разведения 50 мкг / мл rhM2BP. Линейный регрессионный анализ идентифицировал линейный диапазон обнаружения (R2 = 1,00) от 0,025 до 12,5 мкг / мл (фиг.3а, диапазон от 0,025 до 1,6 мкг / мл, также показанный на фиг.3b). Полученный динамический диапазон был в 25 раз выше, чем описанный выше ручной сэндвич-иммуноанализ. Затем мы рассмотрели, согласуются ли измерения HISCL с сывороткой у пациентов с HCV (n = 125) с анализом лечени лектином, и это сравнение приводит к достаточной линейности с коэффициентом определени R2 = 0,848 (фиг.3c). Соответственно, мы могли бы выполнить автоматическое количественное определение сывороточного WFA + -M2BP у 180 пациентов за 1 час, и поэтому мы назвали его FastLec-Hepa.

Для исследования валидации мы получили сыворотку от пациентов с СН в двух местах: больница Университета Нагоя и университетская больница Хоккайдо (дополнительная фиг.10). Постановка этих пациентов (n = 209) по показателю гистологической активности (HAI) проводилась независимо двумя старшими патологами на образцах биопсии печени, основанной на ультрасонографии. F0-F1 назначался в 82 случаях (39,2%), F2 — у 52 (24,9%), F3 — у 40 (19,1%) и F4 (цирроз) у 35 (16,7%). Сыворотка от здоровых добровольцев (без истории инфекций вируса гепатита) была получена для анализа с двух сайтов (n = 48 из Национального института передовых промышленных наук и технологий [AIST]: HV1; n = 70 из Нагояского городского университета: HV2) , Их показатели FastLec-Hepa (дополнительная таблица 1) также изображены на диаграмме с короткими усами в дополнительном рисунке 11, а также в отдельной группе из 1000 здоровых добровольцев (HV3). На основании калибровочной кривой ([FastLec-Hepa counts] / 106 = 1.027 × [rhM2BP] + 0,006 на фиг.3a, b), 75-й процентили HV 64,205-107,617 и 25-й процентиль LC 1 327 596 пациентов (см. а также дополнительную фиг.11), мы оцениваем концентрацию WFA + -M2BP примерно 0,09 мкг / мл в сыворотке пациентов с ВН и> 1,0 мкг / мл у пациентов с LC. Это означает, что линейный диапазон, показанный на фиг.3а, достаточен для точного количественного определения WFA + -M2BP во всех образцах сыворотки. Анализ показал постепенное увеличение с прогрессированием фиброза печени, но оно не коррелировало со степенью активности печени, определенной с помощью оценки HAI (дополнительный рисунок 12).

Затем мы провели статистическое сравнение FastLec-Hepa с другими простыми тестами на предмет фиброза печени: прямой фиброзный маркер гиалуроновой кислоты (HA), индекс косвенного фиброза FIB-426 и индекс фиброза на основе глюкана LecT-Hepa1827. Мы зарегистрировали 160 пациентов (F0-F1 = 66, F2 = 41, F3 = 33 и F4 = 20), чей возраст, количество тромбоцитов, уровни АСТ, ALT и HA были легко доступны (дополнительный рисунок 10 и дополнительные таблицы 1 и 2) , Как показано на фиг.4а, результаты всех тестов хорошо коррелировали со стадией фиброза (Р <0,0001). Однако анализ ROC показал, что FastLec-Hepa обнаружил цирроз с самой высокой диагностической точностью (фиг.4b и таблица 1). Примечательно, что FastLec-Hepa отличается между F3 и F4 с 90% -ной чувствительностью, 85% -ной специфичностью и AUC 0,91. Эти результаты превосходили LecT-Hepa (чувствительность: 95%, специфичность: 70% и AUC: 0,87), FIB-4 (чувствительность: 55%, специфичность: 94% и AUC: 0,76) и HA (чувствительность: 80%, специфичность: 70% и AUC: 0,78).

Чтобы оценить клиническую полезность, мы рассмотрели два типа исследований — оценку с коротким интервалом и долгосрочное наблюдение — оба из которых необходимы для наблюдения за пациентами, получающими терапию ПЭГ-интерфероном и рибавирином. Для первого исследования мы зарегистрировали 41 пациента с ХСН, которые ранее проходили 48 недель терапии в университетской больнице Хоккайдо. Согласно определению, описанному в Методах, 26 и 15 из них были оценены как SVR и NVR / рецидив (не SVR), соответственно. Для каждого пациента мы проводили FastLec-Hepa на образцах сыворотки, которые собирали непосредственно перед лечением (Pre) и в течение короткого периода (12-22 недели) после лечения (Post) (рис.5a). Мы обнаружили заметное снижение от Pre до Post count (P = 0,0061) у пациентов с УВО, но без видимых изменений у пациентов без СВР (P = 0,9780) (рис.5b). В частности, было обнаружено среднее процентное снижение на 31% у пациентов с УВО (медиана Pre-count 161 053 и средний пост-счет 110 739), тогда как уровень для пациентов без СВР был по существу постоянным. Эти результаты показывают, что анализ может оценить эффект терапии в течение короткого периода после лечения. Это важный прогресс, поскольку уровни ALT не-SVR, а также SVR в основном уменьшаются в диапазоне 10-64 МЕ / мл за этот период (рис.5c) 5. Фактически, изменения в подсчетах FastLec-Hepa не коррелировали с подсчетами ALT (дополнительный рисунок 13), тем самым аннулируя ALT-зависимые анализы фиброза, включая FIB-4 (рис.5d).

В подтверждение нашего вывода о том, что подсчеты FastLec-Hepa отлично коррелируют со стадией фиброза, мы обнаружили сильную корреляцию между гистопатологическими оценками и медианой числа log10 [FastLec-Hepa] (рис.5e). Эти корреляции были аппроксимированы двумя линейными уравнениями: y = 0,23x + 4,9 для F0-F3 и y = 0,58x + 3,8 для гистологии F3-F4. Это означает, что FastLec-Hepa может достоверно воспроизвести оценку терапевтических эффектов, которые ранее были взяты из гистопатологического скоринга9. Действительно, медианные изменения фиброза, полученные методом FastLec-Hepa, составляли -0,295 этапов в год для СВР и 0,010 стадий в год для не-СВР (рис.5f). Эти данные согласуются со скоростью развития фиброза и регрессии, определенной Shiratori et al. 9.

Во втором исследовании мы зарегистрировали 6 пациентов с ВГС (SVR = 3 и не SVR = 3) с развитым фиброзом, который завершил 48 недель терапии в больнице Университета Нагоя. Сыворотки собирали перед терапией и через 0, 1, 3 и 5 лет после окончания терапии (см. Фиг.5g). Показатели FastLec-Hepa у пациентов с УВО постепенно снижались и достигали ниже медианы F0 пациентов в течение 3 лет. Тем не менее, у пациентов, не получавших СВР, в течение последующего периода (рис.5ч) оставалось выше медианного для пациентов с F3. Интересно, что HCC развился у двух пациентов без SVR, чьи показатели FastLec-Hepa оставались выше медианы пациентов F4. Другие показатели фиброза, такие как FIB-4 и биохимические параметры (ALT и AST), не проводили различия между SVR и не SVR или, по-видимому, предсказывали это явление (рис.5i-k).

Мы описали разработку и использование полностью автоматизированного иммуноанализа на основе гликана, называемого FastLec-Hepa, для оценки фиброза печени. Высокая степень достоверности количественных аспектов этого метода должна установить его как клинически значимый тест, особенно для выявления и лечения пациентов с высоким риском прогрессирования осложнений печени, таких как ГЦК и связанных с ней опасных для жизни событий. Наиболее поразительным преимуществом FastLec-Hepa является не только его простота, но и его способность обеспечивать показания фиброза, на которые не влияют флуктуации значения ALT или воспаления, оба из которых могут приводить к ложно высоким оценкам в большинстве других тестов на фиброз10 , На самом деле, наше исследование продемонстрировало надежную способность FastLec-Hepa оценивать эффекты антивирусной терапии и последующего прогрессирования заболевания как в краткосрочной, так и в долгосрочной перспективе.

Многие ретроспективные и проспективные исследования продемонстрировали, что достижение СВР через лечение ПЭГ-интерфероном / рибавирином значительно снижает заболеваемость и смертность, связанные с печенью (т. Е. Декомпенсацию печени, ГЦК и смерть, связанную с печенью) 282930. Поскольку эта комбинированная терапия эффективна только у примерно 50% пациентов с генотипом 1 HCV, новые препараты1 и мишени 31 для противовирусного лечения HCV были разработаны для более эффективного получения СВР после терапии. Долгосрочные наблюдения часто показывают, что риск прогрессирования заболевания значительно выше у пациентов с не-СВР после лечения ПЭГ-интерфероном-α / рибавирином. Кроме того, развитие ГЦК у пациентов с УВО остается на значительной кумулятивной скорости (2%) 28303233. По этой причине недавно была разработана новая модель интеллектуального анализа данных с использованием отдельных факторов (возраст, количество тромбоцитов, сывороточный альбумин и АСТ) для выявления пациентов с высоким риском развития HCC34. Это, однако, статистическая процедура для оценки вероятности прогрессирования заболевания, и нет прямой оценки фиброза. В настоящем докладе мы провели долгосрочное ретроспективное исследование с серийно собранными сыворотками пациентов с СВР и не-СВР, в которых мы продемонстрировали потенциальное использование FastLec-Hepa для повышения прогностической точности. Действительно, недавние успехи в развитии антифиброзных агентов заставляют нас ожидать терапевтической ликвидации рисков для здоровья, связанных с ГЦК и декомпенсацией35. Более того, мы ожидаем, что FastLec-Hepa будет доказана для его полезности в быстрой оценке прогрессирования и регрессии фиброза в клинических испытаниях недавно разработанных антифибротических агентов. Следовательно, FastLec-Hepa должен быть очень полезен для скрининга стадии фиброза и оценки прогрессирования заболевания у необработанных лиц или пациентов под или после лечения, а также для оценки недавно разработанных препаратов.

Важно отметить, что FastLec-Hepa имеет много достоинств, включая скорость (возможно, 1000 анализов в день) и полную автоматизацию для измерения серологического гликобиомаркера: эти атрибуты позволят ретроспективные исследования с ценными образцами сыворотки, которые были собраны ранее. Кроме того, наш недавно разработанный калибратор для FastLec-Hepa улучшит отслеживаемость и позволит одновременно анализировать и хранить данные в нескольких диагностических системах. Данные, полученные с помощью разбавленных образцов сыворотки, продемонстрировали высокий уровень воспроизводимости анализа и очень благоприятный диапазон линейного детектирования (дополнительный рисунок 14). Кроме того, мы обнаружили отличное согласие между значениями анализа для сыворотки и плазмы, приготовленных одновременно у одного и того же пациента. В настоящее время у нас имеется около 10 000 сывороток и плазмы с подробными клиническими заметками, собранными в более чем 10 учреждениях в Японии, и проводится серия ретроспективных исследований. В ближайшее время мы завершим лицензирование нашей системы для клинической реализации, основанной главным образом на испытаниях настоящего исследования. В отличие от этого большинство современных неинвазивных методов в настоящее время переходят к физическим измерениям, таким как FibroScan, импульс силы акустического излучения36 и упругая деформация в реальном времени37. Любой анализ на месте большого количества образцов крови должен обеспечивать диагностическую ценность, сравнимую с диагностической величиной FibroTest, и для ее оценки необходимо провести прямое сравнение в одной группе пациентов. Мы отмечаем здесь, что, согласно недавнему методу статистической валидации38, предсказанная AUC диагностического значения FibroTest для обнаружения продвинутого фиброза в нашем наборе образцов (показатель DANA = 1,81) составляла приблизительно 0,77, что было сопоставимо с AUC FastLec-Hepa we (0,79).

FastLec-Hepa приняла новую парадигму для клинической диагностики «глико-диагноз», которая основана на количестве и качестве образцов гликозилирования белка, которые хорошо указывают на прогрессирование заболевания. Чтобы обнаружить такие изменения в гликозилировании обычными способами (например, масс-спектрометрией, жидкостной хроматографией или капиллярным электрофорезом), абсолютно необходимо высвободить представляющие интерес гликаны из их белковых связей151739. Можно использовать альтернативную технологию, основанную на системе иммунодетекции сэндвича лектин-антитела для интактных гликопротеинов, несущих специфические для гликоинфекции заболевания. Такие анализы были использованы для обнаружения изменений в фукозилировании N-связанных гликанов, которые связаны с заболеванием печени. Однако в настоящем исследовании фикоза-связывающие лектины были классифицированы как «высокий уровень шума» (рис. 2b), и, таким образом, обогащение целевого белка было важным процессом в анализе. Обнаружение Лектина-наложения выполняется обычно после обогащения на целевых гликопротеинах иммобилизованным антителом. В таких случаях обнаружение основывается на низкой авидности (высокой скорости диссоциации) между захваченным гликопротеином и наложенным зондом лектина (см. Правую часть фиг.3b). Эти кинетические соображения существенно исключают использование автоматизированного анализатора клинической химии при прикусывании. Несмотря на то, что лецитин, связывающий фукозу, был иммобилизован на шариках (см. Слева от фиг. 3b), он по-прежнему остается проблемой для надежного количественного определения с помощью автоанализатора. Наша предыдущая система LecT-Hepa16181926, которая обнаруживает уровень фукозилированного α1-кислотного гликопротеина, требует обогащения белка перед анализом.

В настоящем исследовании мы разработали стратегию преодоления этих проблем в глико-диагностике, связанную с клинической реализацией, и реализовали быструю систему «диагностики на месте» (17 минут, в течение минимального времени, необходимого для единого анализа HISCL) основанный на анализе гликомаркера (дополнительный рисунок 1). Стратегия выбора наиболее прочного лектина привела нас к WFA и от использования фикоза-связывающих лектинов для прямой измерительной системы (рис.2). Диагностическая утилита M2BP, белка, напоминающего «сладкий пончик» 20, приносила благоприятную плотность и ориентацию связанного с болезнью гликана на гомомультимере. Эти характерные структуры привели к значительному увеличению авидности M2BP для покрытого WFA. Полученное взаимодействие с гликаном-лектином, которое является чрезвычайно сильным и специфичным, позволило разработать быстрый и высокочувствительный анализ (см. Слева от фиг. 3b). Мы считаем, что эта уникальная стратегия революционизирует использование глико-диагностики в клинической медицине и потенциально может служить основой для разработки нового поколения тестов на биомаркер.

Пациенты с хроническим гепатитом были зачислены в больницу Университета Нагоя и больницу Хоккайдо. Здоровые добровольцы в качестве контроля были случайным образом отобраны в больнице университета Нагоя (70 человек) и AIST (48 особей). Институциональные комитеты по этике в больнице Университета Нагоя, Университетской больнице Хоккайдо и АИСТ одобрили это исследование, и информированное согласие на использование их клинических образцов было получено от всех участников до сбора. Кроме того, мы использовали 1000 образцов сыворотки от вирусоотрицательных кавказцев в качестве нормальной популяции, которые были приобретены у Complex Antibodies Inc. (Fort Lauderdale, FL) и собраны в соответствии с протоколами сбора данных, одобренными IRB. Фиброз оценивали у пациентов по показателю гистологической активности (HAI) с использованием биопсии или хирургических образцов. Образцы биопсии классифицировали следующим образом: F0, отсутствие фиброза; F1, портальный фиброз без перегородки; F2, несколько перегородок; F3, многочисленные перегородки без цирроза; и F4, цирроз. Три диагностические цели в этом исследовании были определены как значительный фиброз: F2 + F3 + F4; сильный фиброз: F3 + F4; и цирроз: F4. Печеночное воспаление также оценивалось в соответствии с HAI следующим образом: A0, без активности; A1, умеренная активность; A2, умеренная активность; и A3, тяжелая деятельность. Цирроз был подтвержден ультрасонографией (грубая печеночная структура, узловая поверхность печени и тупые края печени), свидетельство гиперспленизма (спленомегалия на ультрасонографию) и / или количество тромбоцитов <100 000 / мм3. Вирулогические реакции во время терапии ПЭГ-интерфероном и рибавирином определялись следующим образом5: СВР, отсутствие РНК HCV из сыворотки через 24 недели после прекращения терапии; неответчик, неспособность очистить РНК HCV от сыворотки после 24 недель терапии; рецидив, повторное появление РНК HCV в сыворотке после терапии было прекращено. Для всех пациентов был зарегистрирован возраст и пол и проанализированы уровни сыворотки крови: аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), γ-глутамилтрансфераза (ГГТ), общий билирубин, альбумин, холинэстераза, общий холестерин, количество тромбоцитов ( PLT), гиалуроновой кислоты (HA). Индекс FIB-4 рассчитывали следующим образом: [возраст (годы) × AST (U / L)] / [тромбоциты (109 / L) × ALT (U / L) 1/2] 26. Фиброзно-специфическое глико-изменение гликопротеина α1-кислоты определяли с помощью сэндвич-иммуноанализа лектином-антителом с комбинацией трех лектинов (Datura stramonium agglutinin (DSA), лейкоагглютинина Maackia amurensis (MAL) и лектина Aspergillus oryzae (AOL)). Все анализы использовали автоматизированную систему иммуноферментного анализа хемилюминесценции (HISCL-2000i, Sysmex Co., Kobe, Japan) 18.

Для иммунопреципитации M2BP из образцов сыворотки использовали автоматизированную систему очистки белков (ED-01, GP BioSciences Ltd., Йокогама, Япония). Короче говоря, сыворотки (2 мкл) разбавляли в 10 раз PBS / 0,2% (мас. / Об.) SDS, нагревали при 95 ° С в течение 20 мин, смешивали с 10 мкл Triton X-100 в TBS (TBSTx) и вводили в 96-луночный планшет для микротитрования SUMILON (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Токио, Япония). Пластина и рабочие реагенты, включая биотинилированное антитело против M2BP (10 нг / мкл), магнитные шарики, покрытые стрептавидином, промывочный буфер (1% TBSTx) и буфер элюции (TBS, содержащий 0,2% SDS), загружали в систему. Это продуцировало 110 мкл очищенных M2BPs на образец сыворотки (96 образцов за 3,5 часа).

Поликлональное антитело против M2BP человека было приобретено у R & D Systems, Inc. (Миннеаполис, MN) и биотинилировано с помощью набора для маркировки биотина — NH2 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Япония). Очищенные сывороточные M2BPs подвергали электрофорезу в восстановительных условиях на 5-20% полиакриламидных гелях (DRC, Токио, Япония) и переносили в PVDF-мембраны. После обработки блоком Ace® (DS Pharma Biomedical Co., Ltd., Осака, Япония) мембраны инкубировали с биотинилированным анти-M2BP-поликлональным антителом, а затем со стрептовадином с конъюгированным с щелочной фосфатазой (1/5000, разбавленным TBST, ProZyme , Inc., Сан-Леандро, Калифорния). Мембраны инкубировали с стабилизированным субстратом Western Blue для щелочной фосфатазы (Promega, Madison, WI).

Обогащенные M2BPs анализировали с помощью микроматрицы лектина на основе антитела24. Очищенный белок (14 мкл) разбавляли до 60 мкл PBS, содержащим 1% (об. / Об.) Triton X-100 (PBSTx); это было применено к LecChipTM (GP BioSciences Ltd.), который включал три пятна из 45 лектинов в каждой из семи реакционных колодцев. После инкубации в течение 12 ч при 20 ° С к реакционному раствору на каждом чипе добавляли 2 мкл IgG сыворотки человека (10 мг / мл) и инкубировали в течение 30 мин. Затем реакционный раствор отбрасывали, и чип промывали три раза PBSTx. Затем к микросхеме наносят 60 мкл (200 нг) биотинилированного M2BP человека в человеке в PBSTx и инкубируют в течение 1 часа. После трех промывок с PBSTx добавляли 60 мкл (400 нг) меченого Cy3 стрептавидина (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) в PBSTx и инкубировали в течение 30 мин. Чип был ополоснут PBSTx, отсканированный флюоресцентным сканером (GlycoStationTM Reader1200, GP BioSciences Ltd.) и проанализирован с помощью программного пакета Array Pro Analyzer версии 4.5 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD). Чип сканировался с коэффициентом усиления, чтобы зарегистрировать максимальную интенсивность сети <40 000 для наиболее интенсивных точек. Значение чистой интенсивности для каждого пятна рассчитывали путем вычитания значения фона из значения интенсивности сигнала. Относительная интенсивность лектин-положительных образцов определялась по отношению их флуоресценции к флуоресценции лектина внутреннего стандарта, DSA.

Сыворотку предварительно обрабатывали, как описано выше, при обогащении M2BP из сыворотки. Предварительно обработанные образцы (50 мкл) разбавляли равным объемом исходного буфера (0,1% (мас. / Об.) SDS в PBSTx), добавляли к покрытой WFA агарозе в микротрубке (20 мкл суспензии, Vector Lab., Burlingame, UK ) и инкубировали при 4 ° С в течение 5 ч с осторожным встряхиванием. После центрифугирования реакционного раствора при 2000 × g в течение 10 мин супернатант удаляли на новую микротрубку. Осадок суспендируют в 50 мкл исходного буфера, повторно центрифугируют, и этот второй супернатант объединяют с первым (обозначенным как сквозная фракция Т). Осадок затем промывали 200 мкл исходного буфера, а связанные гликопротеины элюировали 60 мкл 200 мМ галактозамина / 0,02% (мас. / Об.) SDS в PBS (обозначенном как фракция элюирования E). M2BP иммунопреципитировали из фракций T и E и исследовали электрофорезом в восстановительных условиях на 5-20% градиентных SDS-полиакриламидных гелях.

Планшеты с плоским дном 96-луночного стрептавидинового микротитровального планшета (Nunc, Int., Tokyo, Japan) обрабатывали биотинилированным WFA (Vector, 250 нг / лунку) в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты инкубировали с разбавленными образцами сыворотки (50 мкл) в PBS, содержащем 0,1% (об. / Об.) Tween20 (PBS-t) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем 50 нг / лунку поликлонального антитела против M2BP человека , в PBS-t в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты интенсивно промывали и затем инкубировали с 50 мкл конъюгата пероксидазы хрена (HRP) -конъюгированного антимышиного IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Philadelphia, PA) в количестве 1: 10000 в PBS-t в течение 1 часа при комнатной температуре. Раствор 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидин (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA) (100 мкл) добавляли в каждую лунку. Ферментную реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 М серной кислоты, а оптическую плотность измеряли при 450 нм.

Фиброзную специфическую форму гликозилированного M2BP измеряли на основе метода сэндвич-иммуноанализа. Гликозилированный M2BP захватывали WFA, иммобилизованным на магнитных гранулах, и связанный продукт анализировали моноклональным антителом против M2BP человека, связанным с щелочной фосфатазой (ALP-αM2BP). Два набора реагентов (блок обнаружения M2BP-WFA и пакет субстрата хемилюминесценции) были загружены в HISCL. Пакет обнаружения состоял из трех реагентов: раствора буферного раствора (R1), раствора магнитных шариков с покрытием WFA (R2) и раствора ALP-αM2BP (R3). Пакет реагентных реагентов для хемилюминесценции содержал раствор субстрата CDP-Star (R4) и останавливающий раствор (R5). Обычно сыворотку (10 мкл) разбавляли до 60 мкл с помощью R1 и затем смешивали с R2 (30 мкл). После реакции связывания к реакционному раствору добавляли R3 (100 мкл). Полученные конъюгаты были магнитно отделены от несвязанных компонентов и хорошо смешивались с R4 (50 мкл) и R5 (100 мкл) перед чтением флуоресценции. Интенсивность хемилюминесценции была получена в течение 17 мин в описанной выше операции. Реакционную камеру выдерживали при 42 ° С на всем протяжении.

Используются статистические анализы и подготовка графиков. Программное обеспечение Dr. SPSS II для Windows (SPSS Co., Токио, Япония), GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) и Windows Excel 2007. Это облегчило выбор оптимального лектина для анализ фиброза и сравнение диагностического значения других маркеров и показателей серологического фиброза. Поскольку распределение данных по каждому параметру было не гауссовым, значения Р определялись непараметрическими тестами, такими как тест Манна-Уитни U и тест на знакомство с Уилкоксоном. Корреляции с фиброзом печени оценивались как значимость различий среди промежуточных групп (F0-1, F2, F3 и F4), определяемых непараметрическим односторонним анализом дисперсии Крускала-Уоллиса. Для оценки эффективности классификации для выявления значимого фиброза, сильного фиброза и цирроза был также проведен анализ кривой активности приемника (ROC) для определения площади под кривой (AUC). Для классификации пациентов использовались значения среза, полученные из индекса Юдена. Точность диагностики была выражена с точки зрения специфичности, чувствительности и AUC.

А.К. задумал и разработал исследование, выполнил большую часть биохимических экспериментов, проанализировал данные и написал статью с комментариями от Y.T., M.M. и H.N .; Y.I. задумал и разработал исследование, провел предварительную обработку образца для анализа и проанализировал данные; Y.T., K.I., M.M. и S.H собрали клинические образцы, разработали исследование валидации и проанализировали данные; Член-корреспондент и С. С. выполнили биохимические эксперименты, включая анализ лещинных микрочипов и проанализированные данные; МИЗ. и M.K. проведена постановка образцов биопсии по показателю гистологической активности (HAI); H.N. задумал и разработал исследование и руководил всеми аспектами работы; и все авторы обсудили результаты и последствия и прокомментировали этот документ.

Дополнительная информация

Эта работа была частично поддержана грантом от Новой организации по развитию энергетики и промышленных технологий Японии. Мы благодарим Х. Озаки, Х. Шимадзаки, С. Унно, К. Сайто, М. Согабе, Ю. Кубо, Ж. Мураками, С. Ширакаву, Т. Фукуду (АИСТ) и Х. Наганума (НКУ) за технические помощь. Мы также благодарим А. Тогаачи, Т. Сато, Х. Каджи, Дж. Хирабаяши, Х. Татено, А. Такахаши (АИСТ) и С. Цуруно, С. Нагаи и Я. Такахаму (Sysmex Co.) за критическую дискуссию.

(a) Уникальная форма человеческого эндогенного сывороточного M2BP. Стрелки и круги представляют собой N-гликановые фрагменты и основной белок соответственно. (б) Вестерн-блот-анализ: M2BPs в 2 мкл сыворотки очищали иммунопреципитацией до SDS-PAGE. HV, здоровый волонтер; CHC, пациент с хроническим гепатитом C; LC, инфицированный HCV пациент с циррозом печени; и HCC, инфицированного HCV пациента с гепатоцеллюлярной карциномой. (c) Число пациентов с одиночным (красным) или двойным (синим) появлением полосы на блоте. Количество полос определялось визуально двумя независимыми аналитиками. Общее число пациентов с ВГС, участвовавших в этом исследовании, составило 125 (F0-F1 [n = 33], F2 [n = 32], F3 [n = 31] и F4 [n = 29]). (d) Типичные изменения интенсивности полос M2BP сыворотки у пациентов с различными показателями фиброза и (e) концентрации на основе предыдущего отчета о количественном определении M2BP сыворотки по Cheung et al. 23. и наши нынешние результаты. Синие полосы на электрограмме и синей линии на графике представляют собой M2BP, секретируемые из нормальной печени. Красные полосы и линия представляют собой измененные M2BP, концентрация которых предлагается увеличить с прогрессированием фиброза. Черная линия представляет собой общую концентрацию M2BP в сыворотке.

(а) Кинетика лектинов, связывающихся с гликопротеинами сыворотки. Лектины, связывающие M2BP, делятся на две категории: лектины с высоким уровнем шума и высокие лектины с сигналом к ​​шуму (S / N). Высокошумящие лектины связываются как с M2BP, так и с богатыми гликопротеинами сыворотки, что вызывает сильное подавление взаимодействия M2BP-лектина (см. Верхнюю панель). С другой стороны, количество связывающих мишеней в сыворотке для высоколегированных лектинов незначительно, что приводит к специфическому взаимодействию с целевым M2BP (см. Нижнюю панель). (b) Классификация лектинов, связывающих M2BP. Высокими лектинами S / N являются те, которые обнаруживают M2BP с по меньшей мере вдвое интенсивностью сигнала, наблюдаемой для других сывороточных гликопротеинов. Стратегия классификации суммируется в дополнительном рисунке 4. (c) Диагностическая эффективность 6 кандидатов-кандидатов. P-значения были определены с использованием непараметрического теста Манна-Уитни U (Excel 2007, Microsoft).

(a) Стандартная кривая для количественного определения WMA-связывающего rhM2BP. Графики для более низкой концентрации rhM2BP альтернативно выделяются в (b). (c) Сравнительный анализ данных WFA + -M2BP, полученных из 125 различных образцов сыворотки, как с помощью HISCL, так и с помощью анализа ручного лектинового микрочипа. Наилучшее соответствие линейного сравнения с его коэффициентом корреляции было рассчитано в Excel 2007 (Microsoft).

(a) Scatterplots данных, полученных с помощью FastLec-Hepa, LecT-Hepa, HA и FIB-4 против показателя фиброза. Красные горизонтальные линии представляют собой медианную. Корреляция данных с прогрессированием фиброза была оценена как существенные различия в медианных показателях по сравнению с показателями фиброза (Р <0,0001) непараметрическим методом, односторонним ANOVA Крускал-Уоллиса. (b) Площадь под характеристиками приемника-эксплуатационной характеристики (AUC-ROCs) FastLec-Hepa, LecT-Hepa, HA и FIB-4 для цирроза печени (F3 против F4 или F0-3 против F4), тяжелый фиброз (F0 -2 против F3-4) и значительным фиброзом (F0-1 против F2-4). FastLec-Hepa, LecT-Hepa, HA и FIB-4 обозначены красной сплошной линией, красной пунктирной линией, черной сплошной линией и черной пунктирной линией соответственно.

(a) Проверка FastLec-Hepa при оценке с коротким интервалом. Числа в круглых скобках представляют число пациентов, участвовавших в этом эксперименте. Стрелки указывают время сбора крови. На неделе 0 кровь собирали непосредственно перед лечением. Черный ящик указывает период терапии ПЭГ-интерфероном и рибавирином. Изменения в показателях FastLec-Hepa (b), ALT (c) и индекса FIB-4 (d) у пациентов с устойчивым вирусологическим ответом (SVR) и рецидивом / неответчиками (не SVR) во время терапии интерфероном. Значение P определялось непараметрическим методом, а критерий соответствия ранговым знаком, установленным Уилкоксоном. (д) Точечное представление показателя гистопатологического фиброза и медианы подсчетов FastLec-Hepa. В Excel 2007 (Microsoft) были рассчитаны наилучшие линейные кривые, позволяющие конвертировать показатели FastLec-Hepa в показатель фиброза. (f) Ежегодные изменения в пересчете на показатель фиброза. Изменения для пациентов с SVR и не-SVR указаны на точечных участках. Красные горизонтальные линии представляют собой медианную. Значение Р определяли с помощью теста Манна-Уитни U. (g) Валидация FastLec-Hepa в долгосрочном контроле. Числа в круглых скобках представляют число пациентов, участвовавших в этом эксперименте. Стрелки указывают время сбора крови. В течение года -1 и 0 кровь собиралась непосредственно до и после лечения, соответственно. Черный ящик указывает период терапии ПЭГ-интерфероном и рибавирином. Ежегодные изменения показателей FastLec-Hepa (h), индекса FIB-4 (i), ALT (j) и AST (k) у отдельных пациентов после терапии. Пять цветных линий в (h) представляют медианные значения, полученные для каждой стадии фиброза (красный, F4, оранжевый, F3, зеленый, F2, голубой, F1, синий, F0). Закрытые и открытые символы указывают данные, полученные от пациентов, не являющихся SVR и SVR, соответственно. * указывает период, когда была обнаружена разработка HCC.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *