Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Изменения концентрации цитокинов в сыворотке: морфологическое исследование цирроза печени, индуцированное обвалами общего желчного протока у крыс

Changes in Serum Cytokine Concentration : A Morphological Study of Liver Cirrhosis Induced by Common Bile Duct Ligation in Rats
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4531599/

Цирроз печени — диффузный фиброз печени и образование конкреций. Трансформирующий фактор роста-β1 (TGF-β1) и интерлейкин-10 (IL-10) являются очень важными цитокинами при фиброгенезе печени. Целью этого исследования было изучение взаимосвязи между изменениями цитокинов в сыворотке и морфологическими изменениями после общего лигирования желчных протоков у экспериментальных крыс.

Общие желчные протоки пятидесяти самцов крыс Sprague-Dawley были лигированы, а семь самцов крыс были отложены в качестве контроля. Пять крыс каждый жертвовали в 1, 2, 4, 6, 8 и 10 экспериментальных неделях. Световые микроскопические исследования и тесты функции печени проводились в течение вышеуказанных экспериментальных недель. Уровни сывороточного TGF-β1 и IL-10 анализировали с помощью ELISA. Кроме того, были выполнены иммуногистохимические окраски альфа-гладкомышечных актинов (α-SMA).

На восьмой неделе после общего лигирования желчных протоков большинство печеночных дольчатых областей были заменены пролиферированными желчными протоками и волокнистой тканью (типичный билиарный цирроз). Уровни TGF-β в сыворотке между контрольной группой и общей группой лигирования желчных протоков показали статистически значимые изменения. Α-SMA окрашивали в пролиферированные желчные протоки. Эти данные были сопоставлены друг с другом.

Таким образом, этот эксперимент может прояснить наше понимание механизма фиброгенеза печени. Также указано, что необходимо исследовать терапевтический потенциал этих цитокинов в качестве антифибротических агентов.

Цирроз печени — хроническое заболевание печени, вызванное вирусами, алкоголем, различными лекарственными средствами и врожденными заболеваниями. Осложнения этого заболевания включают желудочно-кишечные кровотечения, асцит, печеночную недостаточность и гепатоцеллюлярную карциному. Однако нет определенного лечения этого заболевания. До 1980 года в Корее гепатит В являлся важной причиной цирроза печени, но частота снижалась из-за изменений в жизни и вакцинации, особенно для молодых людей1). Однако алкогольный цирроз увеличился2). Гепатоцеллюлярная карцинома, связанная с циррозом печени, является важной причиной смерти в Корее3). Поэтому понимание патогенеза цирроза печени и фиброза является важной задачей в борьбе с гепатоцеллюлярной карциномой.

Фиброз печени вызывает образование рубцов независимо от различных причин, и этот процесс аналогичен в других органах. Фиброз печени увеличивается во внеклеточном матриксе и приводит к потере паренхиматозных клеток печени. Различные факторы, такие как клеточный и внеклеточный матрикс и цитокины, известны в процессе фиброза печени. Гепатические звездчатые клетки (клетка Ито или липоцит) являются важными клетками, которые выделяют внеклеточный матрикс. Эти клетки обычно находятся в состоянии покоя, но активируются при цитокинах или окислительном стрессе. Активированные печеночные звездчатые клетки увеличивают секрецию и накопление внеклеточной матрицы, окружающей пространство Disse4, 5).

Цитокины, которые активируют гепатические звездообразные клетки, представляют собой трансформирующий фактор роста — 1 (TGF-β1), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF) и эндотелин-1 (ET-1). TGF-β1 является ключевым цитокином, который инициирует и прекращает восстановление тканей и развитие фиброза печени6). На самом деле TGF-β1 является наиболее мощным медиатором фиброгенного механизма. TGF-β1 играет важную роль в выделении внеклеточного матрикса и предотвращении деградации внеклеточных белков за счет усиления продуцирования фибронектина и коллагена в печени. Чрезмерное или устойчивое продуцирование TGF-β1 является важным медиатором фиброза печени7, 8).

Интерлейкин-10 является мощным противовоспалительным и противогрибковым цитокином. Этот цитокин увеличивается на ранней стадии активации гепатоцеллюлярной клетки, а отсутствие этого приводит к усиленному фиброгенезу [9, 10].

В этом отчете мы демонстрируем взаимосвязь между морфологическими изменениями и цитокинами сыворотки в циррозе печени, вызванными лигированием общих желчных протоков у крыс.

Использовали четырехнедельных взрослых крыс Sprague -Dawley, около 200 г (любезно предоставлено Biogenomics Co, Charles River Technology License). Экспериментальная группа (группа холестатической травмы печени по общему лигированию желчных протоков) насчитывала пятьдесят крыс, а контрольной группой было семь крыс. Все животные получали гуманную помощь в соответствии с Руководством по «уходу и использованию лабораторных животных», подготовленным Институтом естественного здоровья (публикация NIH № 85-23, пересмотренная в 1996 году).

Холестатическое повреждение печени было индуцировано у самцов крыс путем лигирования и перерезки общего желчного протока. Эти животные умерщвляли в течение 12 недель. Пять крыс приносили в жертву каждые две недели. Образцы крови получали из сердечных проколов под кетамином с помощью ксилазина (Rumpun, Seoul, Korea) и центрифугировали при 10000 g в течение 5 минут после 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10 экспериментальной недели. Сыворотку хранили при -70 ° С. Испытания функции печени проводились на каждой экспериментальной неделе (общий белок, альбумин, аспартат-аминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, гамма-глутамилтранспептидаза); и концентрация трансмутирующего фактора роста в росте-β1 (TGF-β1) и интерлейкина-10 (IL-10) анализировали с использованием набора для иммуноферментного анализа с ферментным связыванием (Quantikine, R & D System).

Процедуры анализа TGF-β1 были следующими. Подготовьте все реагенты, рабочие стандарты и активированные образцы в соответствии с инструкциями. Добавьте 200 мкл стандартного или активированного образца в каждую лунку и инкубируйте в течение 3 часов. Аспирируйте и промойте 3 раза. Добавьте 200 мкл конъюгата в каждую лунку и инкубируйте в течение 1,5 часов. Аспирируйте и промойте 3 раза. Добавьте 200 мкл раствора субстрата в каждую лунку и инкубируйте в течение 20 минут. Добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и прочитайте при 450 нм в течение 30 минут. Анализ концентрации IL-10 в сыворотке крови был следующим. Добавить 50 мкл анализирующего агента в центр каждой лунки. Добавьте 50 мкл стандарта, контроль или образец в центр каждой лунки и инкубируйте в течение 2 часов. Аспирируйте и промывайте каждую лунку 5 раз. Добавить 100 мкл. конъюгируют с каждой лункой и инкубируют в течение 2 часов. Аспирируйте и промывайте каждую лунку 5 раз. Добавьте 100 мкл раствора субстрата в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 минут. Добавьте 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку и прочитайте оптическую плотность при 450 нм.

Образцы печени экспериментальных крыс получали и регулярно фиксировали в 10% формалине и вставляли в парафиновые блоки. Используя тонкую секцию ткани, проводили тромховые пятна гематоксилин-эозин (HE) и Массона. Альфа-гладкомышечный актин широко используется для обнаружения активации звездчатых клеток. Инкубируйте с моноклональными антителами к альфа-гладкомышечному актину (анти-SMA) (Nichirei Co., Tokyo, Japan). После полоскания ткани инкубировали с биотинилированным кроличьим антителом IgG F (ab ‘) фрагментом (DAKO Japan, Kyoto, Japan). После этого секции инкубировали в комплексе авидин-биотинового комплекса (ABC) (Vectastatin, Burlingame, CA, USA) 11).

Результаты были представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистические корреляции проверялись непарным тестом T и критерием Ки-квадрат с использованием SPSS 10 для программы Windows.

В течение экспериментальных периодов погибло 11 крыс. Причиной смерти был перитонит в общей группе лигирования желчных протоков. Смертельных случаев в контрольной группе не было.

Асциты появились после четвертой недели в общей группе лигирования желчных протоков, а масса тела увеличилась. Кисты желчного протока были заметны, а некоторые кисты разрывались (табл. 1, рис. 1).

Между контрольной группой и лигированной группой общего желчного протока статистически значимые изменения ферментов печени в сыворотке были обнаружены в альбумине, АСТ, АЛТ и щелочной фосфатазе (таблица 2).

Уровни TGF-β1 в сыворотке между контрольной группой и общей группой лигирования желчных протоков показали статистически значимые изменения (p <0,05). Уровни TGF-β1 в сыворотке показали высокие значения с шестой экспериментальной недели до восьмой экспериментальной недели. Уровни IL-10 в сыворотке группы лигирования контрольного и желчного протоков не показали статистически значимых изменений (таблица 3).

Морфологические изменения общей группы лигирования желчных протоков включают пролиферацию желчных протоков и дилатацию и инфильтрацию инфляционных клеток. На восьмую неделю после общего лигирования желчных протоков большинство печеночных дольчатых областей были заменены пролиферированными желчными протоками и волокнистой тканью (типичный билиарный цирроз). Что касается иммуногистохимических пятен, большинство печеночных дольчатых областей заменяются пролиферативными желчными протоками, а α-SMA окрашиваются после восьмой экспериментальной недели. Эти данные коррелируют друг с другом.

Цирроз печени определяется как заболевание печени конечной стадии и как необратимое состояние, характеризующееся регенерирующим образованием конкреций и диффузным фиброзным изменением12, 13). Причины цирроза разнообразны и включают вирусную инфекцию, алкоголь и химические вещества и ошибку метаболизма новорожденных, но конечные результаты одинаковы. Осложнениями цирроза являются асцит, варикозное кровотечение, печеночная энцефалопатия и гепатоцеллюлярная карцинома. Очень важно понять фиброз печени при циррозе печени. Гепатические звездчатые клетки (ранее называемые клетками Ито, жировые или перисинусоидальные клетки) являются жиросодержащими перисинусоидальными клетками и являются импактамированными клетками при фиброзе печени. Стероидные клетки печени активируются во время повреждения клеток печени, включая острую и хроническую болезнь печени, а затем хемоаттрактант белых кровяных клеток выделяет различные цитокины и свободные от кислорода радикалы. Кроме того, активированные звездообразные клетки обеспечивают коллаген типа I и внеклеточный матрикс, и эти материалы накапливаются в пространстве Disse. Эти процессы являются началом фиброза печени14-17).

Трансформирующий фактор роста β1 (TGF-β1) является наиболее сильным фиброгенным цитокином и играет важную роль в активации и регуляции клеток звездчатой ​​печени. Известно, что TGF-β1 является регуляторным цитокином в росте и дифференциации клеток и играет ключевую роль в процессе заживления ран и фиброгенеза. TGF-β1 секретируется из различных клеток, включая клетки Купфера, активированные клетки звезд и гепатоцитов и связан с синтезом фибронектина, коллагена I типа. TGF-β1 увеличивается в продвинутом фиброзе, но не выражается в нормальной ткани печени18-20).

Это исследование показывает, что уровень TGF-β1 в сыворотке крови был выше в общей группе лигирования желчных протоков, чем в контрольной группе. Симмильная, экспрессия TGF-β1 увеличивается при индуцированном CCL4 острой печеночной травме21).

В результатах биопсии печени желчные протоки размножаются после лигирования желчных протоков, а максимальная пролиферация наблюдается на восьмой экспериментальной неделе. Изменения сывороточных цитокинов сравнивались с микроскопическими данными. Альфа-гладкомышечный актин присутствует в гладкомышечных клетках вблизи желчной структуры и представляет собой окрашенную цитоскелетную структуру в печеночной звездчатой ​​клетке. Степень окрашивания α-SMA является косвенным продолжением фиброза. В нашем исследовании уровень TGF-β1 коррелировал со степенью α-SMA-окраски.

IL-10 является мощным противовоспалительным цитокином, который ингибирует синтез провоспалительных цитокинов, и он снижает регуляцию супероксида22, 23). IL-10 увеличивается на ранней стадии активации звездчатых клеток9). Экспрессия IL-10 в воспалительной ткани связана с улучшением воспаления. IL-10 снижает регуляцию экспрессии коллагеновых генов типа 1 и улучшает матриксную металлопротеиназу-1 (интерстициальная коллагеназа) и матрикс-коллагеназа-3 (стромелизин-1) 24). В последнее время было обнаружено, что у несовершеннолетних с выбитыми мышами ИЛ-10 больше инфильтрации нейтрофилов и сильного фиброза после различных повреждений печени25-28). Таким образом, IL-10 играет важную роль в фиброзе печени как противогрибковый агент. Недавнее исследование на животных показало, что экспрессия мРНК IL-10 увеличивается в ранний период у крыс лигирования желчных протоков29). В этом исследовании концентрация IL-10 в сыворотке наиболее высока в первые и вторые экспериментальные недели. После этого концентрация IL-10 в сыворотке уменьшается. Мы предположили, что IL-10 играет ключевую роль в фиброзе как противогрибковый агент и что можно ожидать терапевтического использования этого цитокина. В заключение наши результаты были долгосрочными исследованиями по сравнению с предыдущим внепеченочным холестатическим исследованием у крыс, и было задействовано несколько цитокинов, включая TGF-β1, IL-6. В частности, IL-10 может участвовать в антифиброгенезе.

Изменение концентрации TGF-β в сыворотке. Уровни TGF-β1 сыворотки в группе контроля (G-I) и общей группы липинга желчных протоков (G-II) показывают статистически значимые изменения.

Изменение концентрации интерлейкина-10 в сыворотке. Уровни интерлейкина в сыворотке в контрольной группе (G-I) и группе лигирования общего желчного протока (G-II) в ранние экспериментальные недели показывают статистически значимые изменения.

Асциты и значительные кисты были обнаружены на четвертой неделе после общей перевалки желчных протоков, общих данных.

Области портала содержат несколько желчных протоков и сосудов (ветви венковой и печеночной артерии) и хорошо демаркированы, первая неделя, контрольная группа, пятно H & E, × 100.

Увеличение пролиферации желчных протоков было заметно по сравнению с первой неделей, второй неделе после общего лигирования желчных протоков, окрашиванием Массон-трихрома, × 100.

Искаженные печеночные дольки из-за увеличения пролиферированных желчных протоков с воспалительной клеточной инфильтрацией, через четвертую неделю после общего лигирования желчных протоков, пятна H & E, × 100.

Портално-портальные или портально-центральные районы соединены пролиферированными желчными протоками, а печеночные лобулярные структуры искажены, через 6 недель после общего лигирования желчных протоков, маслен-трихромного пятна, × 40.

Большинство печеночных дольчатых областей заменяются пролиферированными желчными протоками и фиброзными тканями (особенностью вторичного билиарного цирроза), маслен-трихромным пятном, через 8 недель после общего лигирования желчных протоков, × 100.

Нормальные области портала сохранились. Печеночная артерия, желчный протоки и портальная вена были окрашены альфа-гладкомышечным актином. Контрольная группа, альфа-гладкомышечная актин-иммуногистохимическая окраска.

Фокальная некротическая область в печеночной доле была обнаружена, а окраска актина с альфа-гладкомышечной мышцей была положительной в некоторых областях, на второй неделе после общего лигирования желчных протоков, альфа-гладкомышечных актин-иммуногистохимических пятен.

Нормальные участки легочной области печени заменяются пролиферированными желчными протоками. Области положительного пятна с актином альфа-гладкой мускулатуры были заметны по сравнению с четвертой неделей, через шестую неделю после общего лигирования желчных протоков, иммуногистохимическим красителем альфа-гладкой мускулатуры.

Большинство печеночных дольчатых областей заменены пролиферативными желчными протоками и волокнистой тканью. Альфа-гладкомышечный актин окрашивали в пролиферативные перидукулярные области, через восьмую неделю после общего лигирования желчных протоков, иммуногистохимическое окрашивание альфа-гладкой мускулатуры.

Характеристики экспериментальных крыс (среднее ± SD)

I, контрольная группа; II, группа лигирования общих желчных протоков; Вес., Вес (грамм).

Изменения показателей фермента сыворотки

I, контрольная группа; II, группа лигирования общих желчных протоков; АСТ, аспартатаминотрансфераза; ALT, аланинаминотрансфераза; ALP, щелочная фосфатаза; ТБ, общий билирубин; GGT, гамма-глутамилтранспептидаза

Изменение значений цитокинов в сыворотке (среднее ± SD)

I, контрольная группа; II, группа лигирования общих желчных протоков; IL-10, интерлейкин-10; TGF-β1, Трансформирующий фактор роста β1.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *