Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Генотипы вируса гепатита C в Корее и их связь с клиническим исходом в типе C Хронические заболевания печени

Hepatitis C Virus Genotypes in Korea and Their Relationship to Clinical Outcome in Type C Chronic Liver Diseases
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4531977/

Отношения между генотипом HCV и развитием более серьезных заболеваний печени не были четко установлены. Это исследование состояло в том, чтобы исследовать структуру распределения генотипов HCV в Корее и их связь с виремическим уровнем и прогрессированием хронического заболевания печени.

Исследовательская популяция составляла 217 пациентов с хроническим заболеванием печени типа С. Они были разделены на 4 группы: 83 пациента с почти нормальным АЛТ (группа 1), 64 пациента с повышенным АЛТ (группа 2), 20 пациентов с декомпенсированным циррозом печени (группа 3) и 50 пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой (группа 4). Геноциты HCV определяли с помощью обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции (RT-PCR) с использованием смешанных наборов праймеров, а затем достоверность генотипирования была подтверждена клонированием и секвенированием. Концентрацию РНК HCV измеряли с помощью количественной конкурентной RT-PCR для 23 пациентов в группе 2.

Генетики могут быть определены у 166 (76%) из 217 пациентов. Тип 1b и тип 2a преобладали над другими типами в несколько одинаковой частоте (соответственно 45% и 51%). Распределение генотипов типов 1b и 2a среди четырех различных групп показало 42% и 54% в группе 1, 49% и 45% в группе 2, 53% и 47% в группе 3 и 41% и 57% в группе 4; таким образом, не было существенной разницы в распределении генотипов среди 4 различных групп болезней. Однако уровни виремии у пациентов с инфекцией генотипа 1b были значительно выше, чем у пациентов с генотипом 2а.

Инфекция генотипа 2a распространена как генотип 1b в Корее, а заражение генотипом 2a может представлять не меньший риск прогрессирования заболевания, несмотря на более низкий уровень репликации, чем инфекция генотипа 1b.

Хронический гепатит С обычно представляет собой медленно прогрессирующее бессимптомное расстройство, которое является карциномой (ГЦК) у некоторых пациентов1). Удивительно высокая доля лиц, остро инфицированных вирусом гепатита С (HCV), хронически инфицирована (примерно 80%), и более 20% этих людей затем развивают цирроз печени и, в конечном итоге, HCC2). Хотя вирус гепатита B является основным этиологическим агентом при хронических заболеваниях печени и HCC в Корее, было обнаружено, что HCV также играет важную роль3,4).

Одной из важнейших характеристик HCV является генетическая гетерогенность его генома. Различные изоляты HCV можно разделить на генетически различные группы в результате накопления мутаций во время эволюции этих вирусов5-7). До настоящего времени было выявлено в общей сложности девять таких основных генетических групп и по меньшей мере 30 подгрупп при анализе полных или частичных геномных последовательностей HCV8,9). Хотя многие генотипы широко распространены во всем мире, в их региональном распределении явно имеются четкие различия8,10). Сообщалось, что преобладающий генотип HCV является типом 1b в Корее11). Однако точность генотипирования не была проверена секвенированием ДНК.

Помимо эпидемиологической значимости, генотипы HCV также имеют важные диагностические и клинические последствия12,13). В последнее время ряд исследований показали свое влияние на прогрессирование заболевания печени и на результат терапии интерфероном у пациентов с HCV-инфицированием. Сообщается, что генотип 1b более распространен у пациентов с циррозом и HCC, чем у пациентов с хроническим гепатитом14-16). Однако результаты этих исследований не рассматривались на фоне преобладающей инфекции типа 1 в странах, где проводились эти исследования. Таким образом, связь между генотипами HCV и развитием более серьезных заболеваний печени еще не установлена. Сейчас, как представляется, достаточно хорошо документировано, что пациенты, инфицированные генотипом 1b, менее эффективно реагируют на интерфероновую терапию, чем те, которые инфицированы генотипами 2a или 2b. Типы HCV могут демонстрировать разные скорости репликации и, следовательно, различные уровни виремии17-19). Следовательно, более низкий ответ на интерферон в типе 1b может быть обусловлен более высокой виремией и приводит к плохим клиническим результатам.

Настоящее исследование состояло в изучении разнообразия генотипов HCV в Корее и его связи с виремическим уровнем и прогрессированием хронического заболевания печени.

Мы последовательно регистрировали 217 пациентов, которые испытывали положительный результат либо для анти-HCV, либо для сывороточной РНК HCV с помощью RT-PCR. Те, у кого одновременно был HBsAg в их сыворотке, были исключены. Пациенты состояли из 200 пациентов с HCV-положительными и 17 HCV-РНК-положительных пациентов из 89 пациентов с отрицательным гепатитом HC с хроническими заболеваниями печени. Среди 200 пациентов, которые положительно оценили анти-HCV, положительность РНК HCV составила 75% (149/200). Средний возраст 217 пациентов составил 56 ± 12 лет (диапазон 13-78 лет) с отношением между мужчинами и женщинами 1,8 (139/78). Они были разделены на четыре группы; 1) группа 1 состояла из 83 пациентов с устойчиво нормальным или почти нормальным уровнем АЛТ. Вблизи нормального уровня АЛТ определялись как случайные флуктуации АЛТ в пределах 5 МЕ выше верхнего предела нормального (40 МЕ / л); 2) группа 2 состояла из 64 пациентов с повышенным АЛТ, но была бессимптомной и не обнаруживала признаков портальной гипертензии. Хотя биопсия печени не проводилась у большинства из этих пациентов, эта группа должна была отражать пациентов с хроническим гепатитом или компенсированным хроническим заболеванием печени; 3) группа 3 состояла из 20 пациентов, которые представили любой клинический признак портальной гипертензии, такой как асцит, варикозное кровотечение или печеночная энцефалопатия. Эта группа пациентов отразила пациентов с декомпенсированным циррозом печени; 4) группа 4 состояла из 50 пациентов с HCC. Диагноз ГЦК был сделан, как описано ранее3). Средний возраст групп 1, 2, 3 и 4 составлял 52, 52, 59 и 64 года соответственно. Средний возраст группы 3 или группы 4 был значительно выше, чем у группы 1 или 2 группы.

Сыворотки, которые были собраны при первом посещении, были протестированы на HBsAg (AUSRIA-II, Abbott Laboratories, Chicago IL) и анти-HCV (HCV-EIA, Abbott Laboratories, North Chicago, IL) с использованием имеющихся в продаже наборов. Аликвоты сывороток хранили при -70 ° С для обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для определения РНК HCV.

Обнаружение и генотипирование РНК ВГС проводили вложенной RT-PCR с использованием типоспецифических праймеров. Экстракция РНК ВГС и обратной транскрипции проводили в соответствии с Romeo et al. 20). ПЦР кДНК HCV выполняли Chayama et al. 21) с некоторыми изменениями. Модификации были следующими: амплификацию кДНК проводили с помощью вложенной ПЦР вместо одностадийного способа, в которой была проведена ПЦР первого раунда с универсальными праймерами (№ 13, № 14) и ПЦР второго раунда с использованием смешанных наборов праймеров (№ 6 и № 7) 21). № 6 были эквимолярными смесями антисмыслового праймера № 14 и смысловыми праймерами № 121, № 61, № 59, № Tr7 и № 111, каждая концентрация которых составляла 10 мкмоль / л соответственно. № 7 были эквимолярными смесями антисмыслового праймера № 14 и смысловыми праймерами № 57, № 117, № 113, # Tr7 и # 111. Каждый из амплификатов состоял из денатурации при 94 ° С в течение 3 мин и растяжения при 72 ° С в течение 7 мин, а затем 35 циклов денатурации при 94 ° С в течение 30 секунд, отжига при 57 ° С в течение 30 секунд и растяжения при 72 ° C в течение 30 секунд и, наконец, удлинение при 72 ° C в течение 5 мин, соответственно. Каждый генотип определялся его характерным размером ДНК21).

Превосходство генотипирования было подтверждено двумя способами. Во-первых, 50 случайных образцов сыворотки, генотипы которых были протестированы в нашей лаборатории, были отправлены в другую лабораторию в Японии (Центр крови Красного Креста Осаки). Генотипы определяли там, используя типоспецифические праймеры, полученные из области ядра HCV, отличные от наших, которые были получены из области NS5. Во-вторых, генотипы из 20 случайных образцов определялись путем клонирования и секвенирования области NS5.

Образцы сыворотки от 23 пациентов, которые состояли из 14 типов 1b и 9 типа 2a, случайно выбранных в группе 2, были измерены для концентраций РНК HCV. Количественное определение проводили с помощью конкурентной RT-PCR с использованием вложенных праймеров. Внешними праймерами были JR12 и JR19, а внутренними праймерами были JR13 и JR1420). Размер внутренней контрольной РНК HCV был больше, чем нативная РНК HCV на 71 пар оснований. После экстракции РНК из 60 мкл сыворотки 1:10 объемы РНК смешивали с серийными разведениями внутренней контрольной РНК. Образцы амплифицировали так же, как и для определения генотипа20).

Для статистического анализа были рассмотрены только виремические пациенты, у которых был обнаружен генотип HCV. X2 тест был использован, как подходящий для анализа распределения генотипов в разных группах. Сравнение концентраций РНК ВГС (логарифм копий / мл) проводили по суммарному тесту на ранжирование по Вилкоксону.

Среди 50 образцов сыворотки, генотипы которых были повторно протестированы в больнице Красного Креста Осаки, скорость согласования составляла по меньшей мере 90% (45/50). Среди 20 образцов сыворотки, генотипы которых были подтверждены клонированием и секвенированием, скорость конкорданса составляла 90% (18/20).

РНК HCV была обнаружена, и поэтому генотипы можно было определить у 166 (76%) из 217 пациентов. Распределение генотипов у этих 166 пациентов показано в таблице 1. Тип 1b и тип 2a были преобладающими (45% и 51% соответственно) по сравнению с остальными генотипами (1a, 2b, 3), процентная доля которых была меньше чем 3%. Существенных различий в соотношении между мужчинами и женщинами (1,3 против 2,1) и среднем возрасте (57,6 против 54,3 лет) между пациентами с инфекцией типа 1b и пациентами с инфекцией типа 2а не было.

Положительные показатели РНК ВГС составили 71% (59/83) в группе 1, 83% (53/64) в группе 2, 85% (17/20) в группе 3 и 74% (37/50) в группе 4 , и они не были статистически различны среди разных групп (p = 0,3). В каждой группе преобладали оба типа 1b и тип 2a (табл. 1). Частота основных генотипов (1b и 2a) не была существенно различной среди четырех групп (p = 0,7), хотя частота типа 1b имела тенденцию к увеличению по мере прогрессирования заболевания. Тип 1a, который наиболее распространен в Соединенных Штатах, был обнаружен только у двух (0,8%) пациентов.

Концентрация РНК HCV (логарифм копий / мл) составляла 5,7 ± 1,9 (среднее ± SD) у пациентов с инфекцией генотипа 1b и 4,1 ± 0,6 у пациентов с генотипом 2a-инфекции. Разница была существенно различной (р = 0,01) (рис.1).

Анализ разнообразия генотипа HCV в стране важен для понимания молекулярной основы пути передачи HCV, а также вирусной вирулентности и резистентности к интерферону. RT-PCR является основой определения генотипа HCV, а затем несколькими различными методами; (1) второй раунд амплификации ПЦР с типовыми праймерами; (2) гибридизация с типом специфических зондов; (3) переваривание различными рестрикционными ферментами для определения специфического полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (RFLP) 8); или (4) анализ последовательностей непосредственно или после клонирования. Однако методы, которые не включают анализ последовательности, не являются окончательными.

Наше настоящее исследование показало, что среди корейских пациентов с хроническим заболеванием печени типа C преобладающим генотипом HCV был тип 1b и тип 2a (45% против 51%), а показатели распространенности двух генотипов были сходными. Напротив, предыдущее исследование в Корее, которое не было подтверждено анализом последовательности, показало, что генотип 1b преобладал (75%) на 2а (25%). Это несоответствие может быть результатом различных технических факторов, описанных ранее, или их можно отнести к клиническим факторам. В настоящем исследовании технический фактор потенциально некорректного генотипирования оценивался с помощью анализа последовательности в 20 образцах, что давало коэффициент согласования 90%. Поэтому верность этого исследования может считаться приемлемым. Что касается клинического уклона, количество зарегистрированных пациентов и метод отбора пациентов могут повлиять на результат. Например, распределение генотипов может значительно различаться в разных географических районах одной и той же страны, как это было отмечено в Китае22). Кроме того, наблюдаемое географическое распределение генотипов HCV может варьироваться в зависимости от того, какая группа людей была изучена12,23,24). Было обнаружено, что распределение генотипов отличается у пациентов с хроническим заболеванием печени по сравнению с донорами крови23,24). Кроме того, распределение генотипов различалось среди лиц, злоупотребляющих внутривенно, по сравнению с другими группами инфицированных HCV лиц12). Считается, что результат настоящего исследования более точно отражает распределение генотипов, чем предыдущее, из-за включения большего числа пациентов и включения пациентов с переменными хроническими заболеваниями печени. Эта схема распределения в Корее уникальна среди азиатских стран, поскольку генотип 1b более преобладает в большинстве азиатских стран, чем 2a8). Сообщалось, что доля генотипа 1а и генотипа 2а составляет соответственно 68% и 24% в Китае, 74% и 24% соответственно в Японии и 65% и 30% соответственно на Тайване.

В настоящем исследовании не было существенной разницы в распределении генотипов HCV на разных стадиях хронического заболевания печени, что свидетельствует о том, что прогрессирование хронического заболевания печени типа C до декомпенсированного цирроза печени или развитие HCC не сильно связано с генотипами HCV. Эти данные согласуются с предыдущими докладами из Японии24-26). Напротив, Pozzato и коллеги14) в Италии обнаружили, что заражение изолятами HCV генотипа 1b ассоциировалось с более тяжелыми заболеваниями печени, чем заражение изолятами HCV других генотипов. Существует несколько возможных объяснений этого несоответствия. Во-первых, шаблон распределения фонового генотипа может повлиять на результат; роль генотипа 1b в развитом заболевании печени может быть преувеличена, когда преобладает генотип 1b. Во-вторых, небольшое число зачисленных пациентов или смешающих факторов, таких как возраст и продолжительность вирусной инфекции, могут вызывать клиническое отклонение. Фактически, в исследовании Pozzato et al14) средний возраст пациентов, инфицированных генотипом 1b, был значительно выше, чем у пациентов, инфицированных другими генотипами, и число пациентов было недостаточно большим. В нашем исследовании возрастные и половые различия не наблюдались между генотипом 1b и 2a, хотя продолжительность вирусной инфекции не могла быть оценена, поскольку у большинства пациентов была спорадическая инфекция, приобретенная в сообществе. Перспективные долгосрочные последующие исследования также необходимы для уточнения ассоциации специфического генотипа с большей вероятностью прогрессирования прогрессирующего заболевания печени в различных географических районах, особенно в тех районах, где генотипы, отличные от 1b, распространены как тип 1b.

Концентрации РНК ВГС были значительно ниже у пациентов с типом 2а, чем у пациентов с типом 1b. Результат согласуется с некоторыми предыдущими сообщениями 17-19), но не с другими, которые не наблюдали такой разницы в уровне виремии26-28). Это расхождение может быть связано с различием в дизайне исследования или изменчивостью уровня виремии у пациента с течением времени. Независимо от уровня виремии, похоже, что генотип менее подвержен влиянию долгосрочного клинического результата, поскольку не было существенной разницы в общем клиническом исходе среди генотипов HCV, как показано в этом исследовании. Продольное исследование для определения уровней РНК ВГС в последовательных образцах сыворотки, полученных от большого числа пациентов, может потребоваться для разъяснения этого момента.

Имеются существенные доказательства того, что статус генотипа инфицированных HCV пациентов важен для определения результатов терапии интерфероном. Многофакторный анализ факторов, которые могли бы предсказать результат терапии интерфероном у пациентов, хронически инфицированных HCV, продемонстрировал, что статус генотипа, гистология печени и уровень предварительной терапии виремии являются важными прогностическими факторами 27,29,30). Среди них статус генотипа наиболее эффективно способствовал результату лечения30); инфекция с типом 2a или 2b предсказала более благоприятный ответ на терапию интерфероном, чем инфекция с типом 1b (78% против 9%) 30). Разница в терапевтическом ответе в соответствии с генотипом, а также вывод о том, что виремический уровень может быть различным среди разных генотипов, свидетельствует о том, что существуют определенные группы (например, генотип 2а) пациентов, которые могут получить максимальную пользу от антивирусной терапии.

Таким образом, мы обнаружили, что инфекция HCV типа 2a распространена как 1b в Корее. Несмотря на то, что среди пациентов с различной генотипической инфекцией существует различие в уровне виремии, они, похоже, имеют одинаковый риск развития прогрессирующих заболеваний. Исходя из различий в ответах на противовирусную терапию среди генотипов и более высокой распространенности генотипа 2а в Корее, необходимо выяснить, выше ли показатели ответа хронического вирусного гепатита С на интерферон, чем в других странах, хотя он все еще остается что будет наблюдаться большее увеличение времени выживания в лечении, чем у нелеченных пациентов с прохождением нескольких десятилетий.

Эта работа была поддержана грантом № 02-94-002 из Научно-исследовательского фонда больниц Сеульского национального университета, а также грантом исследовательского фонда «Исследовательский фонд печени» (1995) и предоставила · помощь · для международной научной программы специальных исследований рака из Министерства образования, науки и культуры, Япония

Сравнение концентрации РНК HCV в сыворотке между генотипами HCV. Средние концентрации РНК ВГС в сыворотке крови в случаях с генотипом 1b (среднее ± SD: 5,7 ± 1,9 log копий / мл) значительно превышали, что в случаях с генотипом 2a (среднее ± SD: 4,1 ± 0,6 log копий / мл) (p = 0,01).

Распределение генотипов HCV в разных группах пациентов

Группа 1: пациенты с почти нормальным АЛТ; Группа 2: пациенты с повышенным АЛТ; Группа 3: пациенты с декомпенсированным циррозом печени; Группа 4: пациенты с гепатоцеллюлярной карциномой. Генотип HCV был классифицирован согласно Simmonds et al. 9).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *