Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Вирусные нагрузки и регионы региона E2 / NS1 вируса гепатита C при гепатоцеллюлярной карциноме и окружающей печени

Viral Loads and E2/NS1 Region Sequences of Hepatitis C Virus in Hepatocellular Carcinoma and Surrounding Liver
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4531967/

Многочисленные эпидемиологические данные подтвердили, что хроническая инфекция вирусом гепатита С (ВГС) является основным фактором риска развития гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Но молекулярный механизм, лежащий в основе этих сильных эпидемиологических ассоциаций между HCV и HCC, не выяснен. Мы наблюдали изменения HCV в HCC для исследования ассоциации HCV с HCC.

Мы использовали конкурентную и количественную полимеразную цепную реакцию и метод прекращения дидеоксинуклеотидной цепи для сравнения титров HCV и последовательностей гипервариабельной области E2 / NS1 области из четырех изолятов из HCC и окружающих цирротических тканей печени у двух пациентов с положительным анти-HCV.

Число копий HCV-РНК составляло 1 × 106 и 4 × 106 / г влажного веса HCC и 8 × 107 и 3,2 × 108 / г влажной массы цирротических тканей печени у пациентов 1 и -2. Различия в последовательности между РНК HCV в HCC и в цирротической печени были двумя и пятью нуклеотидами у пациента-1 и у пациента-2 соответственно. Аминокислотные последовательности были изменены на одном и двух сайтах у каждого пациента.

Эти данные могут указывать на возможную этиологическую роль HCV в канцерогенезе HCC, но полный анализ последовательности HCV, включая множественные изоляты у одного и того же пациента, должен выполняться во многих случаях.

Гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований во всем мире1), и связанный с этим цирроз является основным фактором риска для этой опухоли2). Вирус гепатита С (HCV) является основным патогенным агентом хронического гепатита, который часто приводит к циррозу и HCC3). Неясно, повышает ли вирусная инфекция риск развития ГЦК только через связанный с ним цирроз или же некоторые штаммы HCV являются непосредственно канцерогенными.

После обнаружения HCV и развития серологического диагноза4,5) было известно, что около 1% населения в целом заражено вирусом, и многие эпидемиологические исследования демонстрируют тесную связь между хронической инфекцией HCV и развитием HCC6). Но молекулярные механизмы, лежащие в основе этих сильных эпидемиологических ассоциаций между HCV и HCC, не были выяснены. Недавно сообщалось, что геномная РНК HCV существовала в HCC и в окружающих цирротических тканях печени и что последовательности, полученные из каждой ткани, были разными и демонстрировали несколько мутаций у одного и того же пациента. Для дальнейшего изучения значимости изменений HCV в HCC и цирротических тканях печени мы количественно определили титры РНК HCV в HCC и окружающей цирротической ткани и секвенировали относительно длинный сегмент, включая гипервариабельный участок (HVR) гена E2 / NS1 из каждого образца в двух пациентов.

Для этого исследования были отобраны два пациента с положительным результатом против HCV (56 и 57 лет) с циррозом печени и HCC. РНК HCV были обнаружены в сыворотке этих двух пациентов. Все серологические маркеры вируса гепатита B (HBV) были отрицательными. Образцы печени были получены у двух пациентов в хирургии для ГЦК и были разделены только на цирротическую печень и только ГЦК путем гистологического исследования замороженных секций с особыми мерами предосторожности для получения РНК и сразу же хранили при -80 ° С.

Всего РНК из цирротических тканей и ГЦК пациентов были экстрагированы методом изоциатиоцианата гуанидиния7).

Аликвоты экстрагированной РНК смешивали с двукратными серийными разведениями внутренней контрольной РНК (10 мкг / мкл), синтезированной из 5′-нетранслируемой области HCV-L125). Затем РНК смешивали с праймером KL70 в 10 мкл объема 1х буфера обратной транскриптазы (50 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 3 мМ MgCl2, 75 мМ KCl, 10 мМ DTT, 250 мМ dNTPs) и нагревали до 70 ° С в течение 5 минут. После быстрого охлаждения добавляли 20 единиц ингибитора РНКазы и 100 единиц обратимой транскриптазы вируса молочной железы лейкемии Moloney (BRL, США) и смесь инкубировали в течение 60 минут при 37 ° С и затем 5 минут при 100 ° С. К реакционной смеси ПЦР добавляли одну десятую кДНК, содержащую 5 ммоль праймеров KL70 и QC1, в конечном объеме 20 мкл [10 мМ Трис-HCl (pH 9,0), 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,1% Triton X- 100, 0,3 ед. ДНК-полимеразы Taq, 0,2 мМ dNTPs]. Смесь амплифицировали в термоциклере ДНК (Perkin-Elmer / Cetus, USA, Gene Amp PCR 9600 System) в течение 40 циклов (950 ° С в течение 1 мин, 55 ° С в течение 1 мин, 72 ° С в течение 2 мин). Одна десятая части первого продукта ПЦР добавляли ко второй ПЦР-реакционной смеси, содержащей вложенные ПЦР-праймеры QC 1 и QC 2 и амплифицировали в течение 25 циклов, как указано выше. Поскольку РНК внутреннего контроля содержит 79 базовых делеций, продукт ПЦР, полученный из РНК внутреннего контроля, можно отделить от РНК HCV с помощью гель-электрофореза. Сравнивая эти два продукта ПЦР, мы смогли определить количество РНК HCV.

Для анализа вариации последовательности в цирротических тканях и HCC мы провели синтез первой нити кДНК следующим образом; 500 г РНК, выделенной из каждой ткани печени, смешивали с 10 мкл 1-кратным буфером обратной транскриптазы (50 мМ Трис-HCl (pH 8,3), 3 мМ MgCl2, 75 мМ KCl, 10 мМ DTT, 250 мМ dNTP), содержащим 5 пмоль случайного гексамера (5-NNNNNN-3 , N представляет собой G, A, T или C) и реакцию обратной транскриптазы проводили, как указано выше. К реакционной смеси ПЦР, содержащей 5 пмоль праймеров HVS1 и HVS2 (фиг.2), добавляли одну десятую кДНК в конечном объеме 100 мкл [10 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,1% Triton X-100, 0,3 ед. ДНК-полимеразы Taq, 0,2 мМ dNTP). Смесь амплифицировали в течение 40 циклов (95 ° С в течение 1 мин, 55 ° С в течение 1 мин, 72 ° С в течение 2 мин). Первый продукт ПЦР (1 мкл) переносили во вторую реакционную ПЦР-реакционную смесь, содержащую праймеры HVN1 и HVN2 (фиг.2), и тот же буфер, что и в ПЦР первого круга, и амплифицировали в течение 25 циклов, как описано выше. После второй амплификации продукт ПЦР отделяли электрофорезом на 2% -ном агарозном геле и вырезали часть геля, что соответствовало положению продуктов ПЦР с ожидаемым размером. ДНК элюировали из нее и обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 и полинуклеотид-киназой Т4 (New England Biolabs, U.S.A.). 5-фосфорилированные ПЦР-продукты клонировали в фазовый вектор M13mp18 или -mp19 и секвенировали в обоих направлениях методом прекращения дидеоксинуклеотидной цепи8) с использованием Sequenase версии 2.0 (United States Biochemicals). Для друг друга по меньшей мере три независимых клона были секвенированы.

Был сопоставлен титр HCV-РНК в HCC и цирротических тканях, измеренный QC-PCR. У пациента-1 количество копий HCV-РНК составляло 1 × 106 / г влажного веса HCC и 8 × 107 / г влажной массы цирротической ткани. У пациента-2 число копий HCV-РНК составляло 4 × 106 / г влажного веса HCC и 3,2 × 108 / г влажной массы цирротической ткани. В целом, титр HCV-РНК в HCC составлял около 10-10, когда мы сравнивали его с титром HCV-РНК в цирротической ткани.

Нуклеотидную и аминокислотную последовательности гипервариабельной области в ГЦК сравнивали с нуклеотидной и аминокислотной последовательностями гипервариабельной области при HVR при циррозе пациентов-1 и -2. Описанная здесь область соответствует нуклеотидам от -1289 до -1798 у пациентов-1 и -1363 до -1589 у пациента-2. У пациента-1 две нуклеотидные и одна аминокислотная последовательности в ГЦК были отличны от таковой при циррозе. У пациентов-2 в ГЦК были изменены пять нуклеотидов и две последовательности аминокислот (фиг.3 и 4). Последовательности, полученные из двух независимых амплификаций того же образца, были идентичны.

HCC является восьмым наиболее часто встречающимся злокачественным заболеванием во всем мире1), несмотря на поразительные географические и расовые различия в его распространенности. Связь между HBV и HCC была четко документирована у пациентов с HBsAg-позитивным состоянием2,9,10). Хроническая инфекция HCV теперь стала еще одним потенциально важным фактором рака печени6).

Распространенность инфекции HCV варьируется в разных географических зонах, и она колеблется от 0,1% 11) — 5,2% 12). По имеющимся оценкам, до 300 миллионов человек во всем мире были инфицированы HCV и HCV или инфицированы HCV, что приводит к хронической инфекции у 50-80% инфицированных и может в конечном итоге привести к тяжелым заболеваниям печени, циррозу и HCC13). Но молекулярные основания для более высокой скорости развития HCC у пациентов с хронической инфекцией HCV не были выяснены.

Чтобы подтвердить тот факт, что определенный вирус вызывает человеческую злокачественность, вирус следует обнаружить и подтвердить в раковой ткани. Мы обнаружили геномную РНК HCV в опухолевых и непухотных тканях у двух пациентов с положительным результатом против HCV. Возможность заражения опухоли частицами HCV сыворотки или непухотными клетками была определенно устранена путем сравнения титров и последовательностей РНК HCV из каждого образца после обнаружения РНК HCV. Из каждого образца полученные копии и полученные последовательности были разными и воспроизводимыми в трех независимых амплификациях. Копии номеров РНК HCV в тканях HCC у двух пациентов были намного ниже, чем у РНК HCV в окружающих цирротических тканях печени (около 10-10), но мы не исследовали, присутствуют ли геномы HCV при низком количестве копий на клетку или только ограниченное количество опухолевых клеток содержало вирусную РНК. Более низкое количество копий вирусного генома в ГЦК может указывать на возможную роль так называемого «механизма попадания и запуска», поскольку он широко наблюдался и предлагался в других опухолях14-18). Изменения вирусных структур и способности репликации в опухоли, т.е. может быть предложена новая и другая среда из окружающей ткани, но неясно, произошли ли эти изменения вируса в уже развитой опухоли или произошли до развития опухоли.

HVR у гена E2 / NS1 HCV сильно расходится между различными вариантами HCV19-21) и показывает наивысшую скорость изменения последовательности со временем у пациентов с устойчивой инфекцией22,23). Поскольку эти белки, вероятно, будут находиться снаружи от вируса, они станут основными мишенями гуморального иммунного ответа на HCV. Было высказано предположение, что эти белки участвуют в взаимодействиях вирус-клеточный рецептор, которые, следовательно, наиболее восприимчивы к нейтрализации и под большим давлением, чтобы мутировать 24,25). Поэтому мы выбрали часть этой области для анализа последовательности и сравнения геномов HCV, выделенных одновременно из ткани HCC и окружающей цирротической печени у тех же пациентов. Мы проанализировали относительно длинные последовательности (около 600 нуклеотидов), включая HVR из четырех изолятов от двух пациентов.

Последовательности, полученные из HCC и цирротической ткани у тех же пациентов, продемонстрировали некоторые изменения нуклеотидов и аминокислотных последовательностей. Эти различия могут быть причиной или результатом разработки HCC, т.е. и вирусные изменения могут быть связаны с развитием рака или наоборот, вирус изменился в новой среде после развития рака. Поскольку мы не изолировали множественный геном от каждого образца, мы не могли исключить возможность сосуществования квазивирусов вируса у одного и того же пациента. Но полный анализ последовательности HCV, включая множественные изоляты у одного и того же пациента, должен выполняться во многих случаях, потому что минимальное изменение (ы) вируса может вызвать злокачественную трансформацию.

Схематическая иллюстрация количественного конкурентного ПЦР-анализа и использованных олигонуклеотидов.

Олигонуклеотиды использовали для усиления гипервариабельной области.

Нуклеотидные последовательности гипервариабельной области в тканях цирроза печени (LC) и гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) у двух пациентов. Сплошная линия обозначает пропущенные идентичные последовательности в LC и HCC. Пунктирная линия обозначает те же последовательности, что и выше.

Аминокислотные последовательности гипервариабельной области у двух пациентов.

Последовательности цирроза печени (LC) по сравнению с гепатоцеллюлярной карциномой (HCC) у каждого пациента.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *