Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

H2S ингибирует индуцированную гипергликемией активацию внутричерепной ренин-ангиотензиновой системы за счет ослабления генерации реактивных видов кислорода

H2S Inhibits Hyperglycemia-Induced Intrarenal Renin-Angiotensin System Activation via Attenuation of Reactive Oxygen Species Generation
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3772925/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: HX PY YH CY RW LL. Выполнены эксперименты: HX PY JN CL DS JL YS ZW LZ. Проанализированы данные: HX PY WZ. Написал рукопись: HX PY LL.

Сообщалось о снижении эндогенного сероводорода (H2S) в патогенезе диабетической нефропатии (DN). Данное исследование направлено на изучение взаимосвязи между аномалиями метаболизма H2S, индуцированным гипергликемией окислительным стрессом и активацией внутриреальной системы ренин-ангиотензин (RAS). Для исследований использовались культивированные почечные мезангиальные клетки (MCs) и стрептозотоцин (STZ), индуцированные диабетическими крысами. Выражения ангиотензиногена (АГТ), ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ), рецептора ангиотензина II (Ang II) I типа (АТ1), трансформирующего фактора роста-1 (TGF-β1) и коллагена IV измеряли с помощью ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттинга , Производство реактивных видов кислорода (ROS) оценивали с помощью флуоресцентных зондовых анализов. Пролиферацию клеток анализировали с помощью анализа включения 5′-бром-2′-дезоксиуридина. Концентрацию Ang II измеряли с помощью иммуноферментного анализа. Уровни мРНК рецептора АГТ, АСЕ и АТ1 и концентрация Ang II были увеличены в высокосернистых MCs с высоким содержанием глюкозы (HG), скорость пролиферации клеток и производство TGF-β1 и продукции коллагена IV также были увеличены. Ингибитор NADPH-оксидазы-дифениленхлорид-иодний (DPI) смог отменить индуцированную HG активацию RAS и изменения в пролиферации клеток и синтезе коллагена. Дополнение H2S ослабленных HG-индуцированных возвышений при активации ROS и RAS. Блокада биосинтеза H2S из цистатион-γ-лиазы (CSE) DL-пропаргилглицином (PPG) приводила к эффектам, сходным с эффектом лечения HG. У STZ-индуцированных диабетических крыс изменения в RAS также были отменены добавкой H2S, не влияя на концентрацию глюкозы в крови. Эти данные свидетельствуют о том, что уменьшение H2S при гипергликемическом состоянии приводит к дисбалансу между окислительными и редуктивными видами. Повышенные окислительные виды приводят к активации внутрипочечной RAS, что, в свою очередь, способствует патогенезу почечной дисфункции.

Диабетическая нефропатия (DN) является одним из наиболее серьезных осложнений диабета, а также является основной причиной почечной недостаточности на конечной стадии. Недавние исследования показывают, что более 40% пациентов с почечной недостаточностью, недавно диагностированных на конечной стадии, связаны с DN [1]. DN характеризуется постепенной потерей площади поверхности клубочковой фильтрации и объемами капилляров. Последнее во многом связано с аберрантным расширением, избыточным образованием и осаждением мезангиальной матрицы [2,3]. H2S, давно признанный легковоспламеняющийся и токсичный газ, в настоящее время считается другим газовым передатчиком в теле. Сообщается, что H2S играет свою роль в регуляциях множественных функций и аномалиях в системном метаболизме эндогенной H2S, участвующей в патологических процессах [4-6]. Генерация H2S в основном катализируется тремя пиридоксальными 5′-фосфатно-зависимыми ферментами, цистатионин-синтазой (CBS), цистатионин-γ-лиазой (CSE) и 3-меркаптопираураватсульфуртрансферазой (MST) [7,8]. CBS является преобладающей H2S-синтазой в центральной нервной системе, тогда как CSE высоко экспрессируется в сердечно-сосудистой системе. Почка является еще одной важной мишенью H2S в организме. CSE, CBS и MST идентифицированы как выраженные в почках. H2S участвует в регуляции функций почек. Он увеличивает экскрецию натрия в моче через сосудистые и трубчатые действия в почках [9]. У 5/6 крыс хронической почечной дисфункции, индуцированных нефрэктомией, способность эндогенного производства H2S была снижена [10]. В 2008 году Tripatara P et al сообщил, что донор H2S NaHS ослабляет индуцированную ишемию / реперфузию повреждение почек, а эндогенный H2S, полученный CSE, необходим для защитных эффектов [11]. В нашем предыдущем исследовании мы заметили, что генерация H2S была снижена на ранней стадии диабета у крыс, а уменьшение производства H2S было связано с увеличением количества активных форм кислорода (ROS) [12]. Недавно Ахмад ФУ заметил, что NaHS снижает кровяное давление и ослабляет повреждение почек, вызванное диабетом, у крыс спонтанной гипертензии [13]. Ямамото J также сообщил, что экспрессия CSE заметно снижалась при диабетических условиях, тогда как экспрессия CBS не затрагивалась [14]. В культуральной сосудистой сети почки Sen U et al сообщили, что трансфекции тройных генов CBS, CSE и 3-MST защищают индуцированное гомоцистеином повреждение сосудов, а эффект сочетается с увеличением выработки H2S [15]. Внутривенная инъекция донора H2S ослабляла повреждение ткани в модели почечной ишемии / реперфузионной свиньи, а добавка H2S была связана с подавлениями окислительного стресса, воспаления и нитрозативного стресса [16]. Тем не менее, Francescato HD и др. Недавно сообщили, что ингибирование продуцирования H2S ингибитором CSE DL-пропаргилглицина (PPG) защищает индуцированное гентамицином повреждение почек [17].

Нарушение во внутрипереносной ренин-ангиотензиновой системе (РАН) играет решающую роль в начале и развитии ДН. Сообщалось, что чрезмерная активация внутрипочечного RAS связана с расширением клубочков и вторичным гломерулосклерозом, трубчатым эпителиальным путем с мезенхимным переходом, интерстициальной пролиферацией фибробластов и осаждением внеклеточного матрикса (ECM) [18,19]. В настоящее время ингибиторы RAS, в том числе ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (ACEI) или ангиотензин II (AngII) типа I (AT1) блокаторы (ARB), были использованы в качестве препаратов первой линии при клинической обработке DN. Данные показывают, что существует взаимодействие между перепроизводством ROS и активацией RAS [20-22]. Однако точный механизм не был полностью выяснен. Недавно Лю М и др. Сообщили, что лечение NaHS ингибирует повышение активности ренина и увеличение притупленного кровяного давления у 2-почек 1-клипных гипертензивных крыс [23]. Этот эксперимент направлен на исследование влияния подавления производства H2S при гипергликемическом состоянии на продукцию ROS и активацию внутрипочечной RAS.

В Sigma (St Louis, MO) были приобретены модифицированная порода Дульбекко (DMEM), эмбриональная бычья сыворотка (FBS), стрептозотоцин (STZ), D-глюкоза, маннит, DL-пропаргилглицин (PPG), дифениленхлорид-иодний (DPI) и NaHS ). NaHS использовали в качестве донора H2S, который также широко использовался в предыдущих исследованиях [24-26]. Антитела против коллагена IV были приобретены у Santa Cruz Biotechnology Inc. (Санта-Крус, Калифорния). SYBR Green QRT-PCR Master Mix была из Applied Biosystems (Токио, Япония). Набор для извлечения РНК был из Sangon Co. (Шанхай, Китай). Поливинилидендифторид (PVDF) мембрана была от Amersham (Piscataway, NJ). Kodak X-Omat K фильм был из Kodak Co. (Сямэнь, Китай). Усовершенствованный набор хемилюминесценции (набор для обнаружения ECL) был получен от Pierce Biotechnology Inc. (Rockford, IL). Набор для введения 5′-бром-2′-дезоксиуридина (BrdU) был получен от Roche (Мангейм, Германия). Комплект для анализа ROS был получен от Beyotime (Цзянсу, Китай). Все остальные реагенты, используемые в этом исследовании, были аналитического сорта.

Возрастные мужчины-крысы SD, весом 180-210 г, были предоставлены Шанхайским лабораторией животных. Все процедуры выполнялись в соответствии с критериями Медицинского лабораторного комитета по животноводству в Шанхае и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Университета Фудана и были одобрены Комитетом по этике экспериментальных исследований, Шанхайским медицинским колледжем, Университетом Фудань. Крыс проводили для 3-дневной акклиматизации перед использованием и имели свободный доступ к воде и стандартной чау. Диабет индуцировали одной внутрибрюшинной (внутрибрюшинной) инъекцией STZ (65 мг / кг), растворенной в 0,1 М буфере для цитрата натрия (рН 4,0). Только те крысы с концентрацией глюкозы в плазме> 16,7 мМ через 1 неделю после инъекции СТЗ были завербованы в исследовании. Крыс случайным образом разделяли на четыре группы (n = 6 для каждой группы): (i) контрольные (C) крысы, инъецированные 0,1 М натрий-цитратным буфером, pH 4,0; (ii) диабетическую (D) крысу, инъецированную STZ (65 мг / кг); (iii) диабетических крыс с инъекцией NaHS (D + NaHS) и (iv) недиабетических крыс с инъекцией NaHS (C + NaHS) (50 мкмоль / кг / день, т. пл.) в течение третьей недели. В конце третьей недели крыс приносили в жертву, а плазму и почечную ткань собирали и хранили при -80 ° С до использования.

Уровень глюкозы в образце крови, собранный из брюшной аорты, измеряли с использованием анализов набора глюкозы крови (Jiancheng Bioengineering Company, Nanjing, China).

Линия клубочковой линии крысы (HBZY-1) была приобретена в Центре культуры культуры Китая (Ухань, Китай) и культивировалась в нормальной среде DMEM (5,5 мМ D-глюкозы), дополненной 10% FBS в атмосфере с 5% CO2 при 37oC. Культуральную среду с высокой глюкозой (HG) получали добавлением нормальной среды DMEM дополнительной D-глюкозой для конечной концентрации D-глюкозы при 25 мМ. Осмотическую среду для контроля получали путем добавления нормальных сред с 19,5 мМ маннитом.

Общая РНК культивированных крыс MC или почечная кора была выделена в соответствии с протоколом набора экстракции РНК. Количество выделенной РНК определяли путем измерения удельной абсорбции при 260 нм. Один микрограмм общей РНК использовали для синтеза кДНК в 20 мкл реакционной смеси, которая содержала 1 мкг олиго dT, 10 мМ dNTP, ингибитор 20 Н РНКазы и обратную транскриптазу 200 М M-MLV. Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали 1 мкл аликвоты полученной одноцепочечной кДНК.

SYBR. Зеленый qRT-ПЦР использовали для количественной оценки относительной распространенности целевой мРНК (мРНК) в образцах. Накопленная флуоресценция была обнаружена с использованием системы обнаружения PCR iCycler iQ (Bio-Rad, Hercules, CA). Условия амплификации ПЦР были следующими: предварительная денатурация при 95 ° С в течение 3 мин с последующим 40 циклами амплификаций путем денатурации при 95 ° С в течение 30 с, отжига при 62 ° С (для TGF-β1) или 60 ° C (для ангиотензиногена (AGT), ACE, AT1-рецептора, коллагена IV и глицеральдегида 3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH)) в течение 1 мин, удлинение при 72 ° C в течение 1 мин. После окончательного удлинения при 72 ° С в течение 10 мин амплифицированные продукты подвергали ступенчатому повышению температуры от 55 до 95 ° С для построения кривых диссоциации. Относительное количество каждой мРНК было нормировано на ген для домашнего хозяйства GAPDH. Каждый образец запускали и анализировали в трех повторностях. Среднее относительное количество каждой мРНК в контрольной группе определяется как 1,0. Все последовательности праймеров PCR и характеристики продукта приведены в таблице 1.

F, передний праймер; R, обратный праймер; Tm, температура плавления.

Уровни Ang II в кондиционированных супернатантах анализировали с использованием коммерчески доступного набора для анализа на основе иммуноферментного анализа на основе ферментов (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA). Супернатанты собирали и пропускали через колонку Centricon-10 с отсечкой> 10000 Да (Amicon, Beverly, MA). Фильтрат использовали для измерений Ang II по протоколу производителя. Абсорбцию измеряли при 450 нм с использованием микропланшетного считывателя TECAN Infinite M200 (Salzburg-Umgebung, Salzburg, Australia), а концентрации Ang II в образцах определяли экстраполяцией по стандартной кривой.

В общей сложности 103 клетки / лунку культивировали в 96-луночных планшетах в 10% -ных добавленных FBS средах. Через 24 ч субкультуры клетки подвергали голоданию в течение 24 ч и затем обрабатывали нормальными средами DMEM, культуральными средами с высокой глюкозой, 19,5 мМ маннитом, лозартаном с нормальной средой DMEM, лозартаном с культуральной средой с высоким содержанием глюкозы, DPI с нормальным DMEM или DPI с культуральной средой с высоким содержанием глюкозы. В экспериментах по совместной обработке лозартан или ДОИ добавляли за 30 мин до обработки средой с высокой культурой глюкозы. Через 48 ч клеточную пролиферацию оценивали с помощью тестов на введение BrdU, как описано ранее [9]. Вкратце, в среду добавляли 1 мкМ раствора для маркировки BrdU. После инкубации клеток в течение дополнительных 4 ч при 37 ° С клетки фиксировали, денатурировали и затем инкубировали в анти-BrdU-POD (пероксидаза) антитела в течение еще 90 мин при комнатной температуре. В конце инкубации клетки промывали PBS 3 раза для удаления избыточного антитела; затем в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора субстрата. После еще одного периода инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре поглощение образцов измеряли на считывателе микропланшет TECAN Infinite M200 (Salzburg-Umgebung, Salzburg, Australia) при 370 нм, тогда как поглощение, полученное при 492 нм, служило опорным значением ,

Для среды культивированных почек МС белки с молекулярным весом свыше 30 кД были разделены Amicon Ultra 4 [12]. Затем 30 мкг образца белка подвергали электрофорезу на 8% -ном полиакриламидном SDS-геле и трансблоктовали на PVDF-мембрану при 270 мА в течение 90 мин. Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в забуференном Трисом физиологическом растворе (TBS) и 0,1% Tween (TBS / Tween) в течение 1 часа при комнатной температуре с нежным качанием и затем инкубировали в козьих антираковых антителах коллагена IV (1: 2000) при 4 ° С в течение ночи. После трех промывок TBS / Tween мембраны инкубировали со вторичным антителом против коз (1: 2000) в течение 1 часа при комнатной температуре. Гибридизирующие сигналы были разработаны с использованием набора для обнаружения ECL в соответствии с инструкциями производителя и подвергнуты воздействию рентгеновской пленки. Относительная интенсивность полос, обнажаемых на пленках, определялась количественно с использованием программного обеспечения Smart Viewer (Furi Technology Co, Shanghai, China).

Эксперименты проводили с использованием набора для анализа ROS (Beyotime, Haimen, China) в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, клетки, высеваемые в 96-луночные планшеты, инкубировали с флуоресцентными зондами 10 мМ 2 ‘, 7’-дихлорфлуоресцеин диацетата (DCFH-DA) (100 мкл / лунку) при 37 ° С в течение 30 мин и затем три раза промывали PBS для удаления остаточных зондов. Интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны излучения 525 нм измеряли с использованием люминометра (Tecan, Salzburg, Austria).

Данные выражаются как средние ± стандартные погрешности (SE) среднего для повторений отдельных экспериментов. Данные анализировали однонаправленным ANOVA с использованием теста Стьюден-Ньюман-Кеулс. Значение Р менее 0,05 считалось статистически значимым.

Культивирование клеток в HG в течение 24 ч, результаты ПЦР в реальном времени показали, что уровни мРНК рецептора AGT, ACE и AT1 были значительно увеличены по сравнению с уровнями нормальных клеток, обработанных глюкозой (NG). Между тем, результаты ферментативно-иммуносорбентного серологического анализа (ELISA) показали, что концентрация Ang II в среде HG была повышена. Напротив, маномнит осмотического контроля не оказывал существенного влияния на уровни мРНК рецептора АГТ, АСЕ и АТ1, а также концентрацию Ang II в средах по сравнению с концентрацией группы NG (рисунок 1).

Уровни мРНК AGT (A), ACE (B) и AT1-рецептора (C) измеряли ПЦР в реальном времени. Концентрации Ang II в среде измеряли с помощью иммуноферментного анализа. Данные были выражены как среднее ± SE. * P <0,05 по сравнению с группой NG; ** P <0,01 по сравнению с группой NG, n = 5.

После культивирования клеток в среде HG в течение 48 ч, результаты исследования включения BrdU показали, что скорость пролиферации клеток значительно увеличивалась по сравнению с клетками, обработанными NG. Маннитол не оказывал явного влияния на пролиферацию клеток. Результаты ПЦР в режиме реального времени показали, что уровни ТРФ-β1 и коллагена IV мРНК были значительно увеличены в группах, обработанных HG. Результаты вестерн-блоттинга также показали значительное увеличение уровня белка коллагена IV. Маннит не оказывал явного влияния на уровни TGF-β1 и коллагена IV мРНК или уровень белка коллагена IV. Блокада на AT1-рецепторе лозартаном (1 мкМ) отменила все изменения, вызванные обработкой HG, включая увеличение пролиферации клеток, повышение уровня TGF-β1 и коллагена IV мРНК и уровень белка коллагена IV. Применение лозартана не оказало заметного влияния на клеточную пролиферацию, TGF-β1 и синтез коллагена в клетках, обработанных NG (рисунок 2).

(A). Пролиферацию клеток измеряли с помощью анализа включения BrdU через 48 часов после лечения HG с или без лозартана (1 мкМ). Уровни мРНК TGF-β1 (B) и Collagen IV (C) измеряли с помощью ПЦР в реальном времени в течение 24 часов после лечения HG. Уровни белка коллагена IV (D) измеряли с помощью Вестерн-блоттинга. Данные были выражены как среднее ± SE. * P <0,05 по сравнению с группой NG; ** P <0,01 по сравнению с группой NG; # P <0,05 по сравнению с группой HG; # # P <0,01 по сравнению с группой HG, n = 5.

После культивирования клеток в средах HG в течение 48 часов скорость пролиферации клеток, уровни TGF-β1 и коллагена IV мРНК и уровень белка коллагена IV были значительно увеличены в группах, обработанных HG. Маннитол не оказал заметного влияния ни на одного из них. Блокада никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН) -оксидазы с помощью DPI отменила изменения, вызванные обработкой HG, включая увеличение пролиферации клеток, повышение уровня TGF-β1 и коллагена IV мРНК и увеличение уровня белка белка коллагена IV. Применение DPI не оказало значительного влияния на группу, обработанную NG (рисунок 3).

(A). Пролиферацию клеток измеряли с помощью анализа включения BrdU в течение 48 часов после лечения HG с или без DPI (1 мкМ). Уровни мРНК TGF-β1 (B) и коллагена IV (C) измеряли с помощью ПЦР в реальном времени в течение 24 часов после лечения HG. Уровни белка коллагена IV (D) измеряли с помощью Вестерн-блоттинга. Данные были выражены как среднее ± SE. * P <0,05 по сравнению с группой NG; ** P <0,01 по сравнению с группой NG; # P <0,05 по сравнению с группой HG; # # P <0,01 по сравнению с группой HG, n = 5.

Результаты анализа флуоресцентного зонда DCFH-DA показали, что культивирование клеток в среде HG в течение 24 часов приводило к значительному увеличению генерации ROS по сравнению с клетками, обработанными NG. Mannitol не оказал очевидного влияния на поколение ROS. Применение ингибитора NADPH-оксидазы DPI (1 мкМ) или апоцинина (10 мкМ) отменило индуцированное HG увеличение генерации ROS. Ни один DPI, ни один апоцинин не оказывали явного влияния на генерацию ROS в клетках, культивируемых NG. NaHS (30 мкМ), донор H2S, отменил увеличение генерации ROS, вызванное обработкой HG. Только NaHS не влияли на генерацию ROS в клетках, культивируемых NG. PPG (1 мМ), эндогенный ингибитор CSE синтезирующего фермента H2S, значительно повышал генерацию ROS в клетках, культивируемых NG (рисунок 4).

Уровни ROS измеряли с помощью анализа флуоресцентного зонда DCFH-DA через 24 часа после обработки. Данные были выражены как среднее ± SE. ** P <0,01 по сравнению с группой NG; # # P <0,01 по сравнению с группой HG, n = 8.

Как показано на фиг.5А, уровень мРНК AGT значительно увеличивался после культивирования клеток в HG в течение 24 часов. Применение NaHS отменяет повышение уровня мРНК AGT. NaHS существенно не влияли на уровень мРНК AGT в клетках, культивируемых NG. Аналогичный результат был отмечен при применении ДОИ, который отменил повышение в мРНК AGT, индуцированное обработкой HG. DPI не оказывал явного влияния на уровень мРНК AGT в клетках, культивируемых NG. Применение PPG значительно повысило уровень мРНК AGT в клетках, культивируемых NG. Изменения уровней АПФ (рис. 5Б) и АТ1 (рис. 5С) показали аналогичные изменениям АГТ.

Уровни мРНК измеряли с помощью ПЦР в реальном времени в течение 24 ч после лечения ХГ. Данные были выражены как среднее ± SE. * P <0,05 по сравнению с группой NG; ** P <0,01 по сравнению с группой NG; # P <0,05 по сравнению с группой HG; # # P <0,01 по сравнению с группой HG, n = 5.

Уровень глюкозы в крови значительно повышался у индуцированных STZ диабетических крыс. Обработка NaHS не оказывала явного влияния на концентрации глюкозы в крови как у диабетических, так и у недиабетических животных (рис. 6А). Результаты ПЦР в режиме реального времени показали, что уровень мРНК AGT значительно повышался в почках диабетических крыс. Обработка NaHS (50 мкмоль / кг.d) изменила изменение уровня мРНК AGT. Однако NaHS не проявлял никакого очевидного влияния на уровень мРНК AGT в почках у недиабетических крыс (рис. 6B). Уровни мРНК рецептора АПФ и АТ1, очевидно, снижались в почках диабетических крыс. Обработка NaHS отменила снижение уровня АПФ и АТ1 мРНК у крыс с диабетом, но не показала очевидных влияний у крыс без диабета (рис. 6C и 6D).

Уровень глюкозы в крови (А) измеряли набором для определения глюкозы, а уровни мРНК для АГТ (В), АСЕ (С) и АТ1-рецептора (D) измеряли ПЦР в режиме реального времени через 3 недели после инъекции СТЗ. Данные были выражены как среднее ± SE. * P <0,05 против контрольных крыс; # P <0,05 против диабетических крыс, n = 6.

Результаты PCR в режиме реального времени показали, что применение Ang II (10 нМ) не оказывает очевидного эффекта как на мРНК CSE, так и на CBS (рисунок 7).

Уровни мРНК CSE и CBS измеряли с помощью ПЦР в реальном времени в течение 24 часов после обработки Ang II (10 нМ). Данные были выражены как среднее ± SE, n = 6.

За счет активации внутрипочечного RAS признан решающим фактором в патогенезе DN. Ang II стимулирует индуцированную диабетиком трубчатую эпителиальную клетку к мезенхимному миофибробластному переходу, интерстициальной пролиферации фибробластов и продукции ECM [27]. В почечном клубочках активация в RAS может приводить к апоптозу и потере эндотелиальных клеток и подоцитов, но также может приводить к пролиферации МС [28-30]. MCs важны для поддержания нормальной морфологии и функций клубочков. Обычно MCs продуцируют небольшое количество белков ECM, включая фибронектин и коллаген типа I, IV и т. Д., Чтобы заменить метаболизированный ECM. В патологических условиях, таких как диабет, увеличивалась скорость пролиферации клеток и продуцирование ECM, и эти изменения, в конечном счете, способствовали утолщению клубочковой базальной мембраны и расширению ECM клубочков.

Почечная MC является важной мишенью Ang II и выражением всех элементов в RAS [19]. Было доказано, что Ang II стимулирует синтез ECM с помощью MC [31]. В культивируемых MCs результат показал, что локальная RAS была активирована в условиях высокой глюкозы. Выражения AGT, ACE и AT1-рецептора были увеличены, а концентрация Ang II в культуральной среде была повышена. Повышенная активация RAS была связана с функциональными изменениями MC, включая стимулирование пролиферации клеток, TGF-β и ECM-производств. Блокада АТ1-рецепторов изменила HG-индуцированную пролиферацию клеток и продукцию ECM. Эти результаты согласуются с предыдущими наблюдениями [32,33].

Между тем, производство ROS также было повышено в условиях высокого уровня глюкозы. Окислительный стресс был замечен как патогенный фактор для ДН. В 2002 году Catherwood MA и соавт. Сообщили о том, что стимулированное ROS-продуцирование с высоким уровнем глюкозы в культивируемых почечных мезангиальных клетках и усиление окислительного стресса фибронектина и синтез коллагена IV [34].

В эксперименте DPI, ингибитор NADPH-оксидазы, блокировал увеличение ROS. Этот результат показал, что увеличение ROS в основном достигается с помощью NADPH-оксидазного пути. Применение DPI-ослабленной HG-индуцированной пролиферации клеток и продуцирования ECM показало, что увеличение HOS, индуцированное HG, привело к аналогичному результату при активации RAS.

Было замечено, что существует взаимодействие между RAS и ROS. Ang II стимулирует продукцию ROS путем активации рецептора АТ1. Это явление было отмечено в наших предыдущих исследованиях, а также во многих других исследованиях на сердечно-сосудистых и нервных полях [35-37]. ROS даже рассматривается как нисходящая сигнальная молекула Ang II. В этом эксперименте данные показали, что возвышения ROS и RAS тесно связаны. Однако кажется, что изменения ROS были выше по течению от RAS, поскольку блокада на ROS увеличивается с помощью применения DPI, урезали индуцированные HG upregulations в выражениях элементов RAS, а также пролиферацию клеток и продукцию ECM в MC.

В эксперименте мы также представили доказательства, свидетельствующие о том, что добавление H2S вызвало аналогичные эффекты DPI, которые ослабляли индуцированную HG продукцию ROS и RAS за активацию. С другой стороны, ингибирование эндогенной продуцирования H2S PPG, ингибитором CSE, вызывало подобные эффекты при лечении HG, включая повышение уровня ROS и повышение активности AGT, ACE и AT1-выражений.

H2S — молекула редуктивного газа. В исследовании Fujita K было доказано, что H2S оказывает прямое влияние на очистку ROS [38]. Однако сообщалось, что H2S ингибирует образование ROS через разные пути. В исследовании Muzaffar S долгосрочный защитный эффект H2S на окислительный стресс связан с подавлением оксидазы NADPH [39]. В исследовании Zhong X экзогенные H2S (NaHS) снижали уровень экспрессии митохондриального NOX4 и уменьшали уровни ROS [40]. В исследовании Suzuki гипергликемия привела к переходу от окислительного фосфорилирования к гликолизу, который был частично скорректирован с помощью добавления H2S [41]. Si YF сообщил, что обработка H2S не только улучшала митохондриальную функцию, но и уменьшала образование митохондриальных ROS, но также подавляла экспрессию NOX2 и gp47 phox [42]. В ходе исследования данные показали, что уменьшение H2S вызвало дисбаланс между окислительными и редуктивными видами, что привело к регуляции внутрирежимного RAS. Восстановление баланса может быть достигнуто за счет ингибирования производства ROS или дополнения H2S для предотвращения активации RAS.

Окислительный стресс может проявляться на очень ранней стадии DN. В культивируемых клетках производство ROS увеличивалось в течение часа. Таким образом, мы предполагаем, что высокая стимуляция глюкозы сдвигает баланс между окислительными и редуктивными видами; чрезмерная ROS активирует локальный RAS, и увеличение Ang II стимулирует большее количество ROS путем активации рецептора AT1. Такой патологический порочный круг, в свою очередь, приводит к инициированию пролиферации MC и повышенному производству ECM.

Наблюдения за животными не полностью соответствовали следам исследования клеток. У диабетических крыс экспрессия AGT была увеличена, а выражения ACE и AT1-рецептора были снижены. Эти изменения согласуются с предыдущим исследованием in vivo, включая данные клинических исследований [27,43-45]. Нет четкого ответа на различия между исследованиями in vitro и in vivo, но непоследовательность не уникальна для наблюдения RAS. В эксперименте добавление H2S восстановило повышение АГТ, а также сокращение выражений ACE и AT1. Добавка H2S не влияла на уровень Ang II в плазме, который предполагал, что эффект H2S не достигается путем манипулирования уровнем глюкозы. Из результата, что Ang II не влиял на экспрессию как CSE, так и CBS, мы предполагаем, что действие H2S на регулирование компонента RAS было опосредовано путем манипулирования окислительным состоянием.

Таким образом, гипергликемия или высокая глюкоза подавляют эндогенную продукцию H2S, что приводит к дисбалансу между окислительными и редуктивными видами. Избыточность окислительных видов приводит к более активной активации внутрипочечного RAS, что, в свою очередь, приводит к пролиферации MC и чрезмерному производству ECM. Поскольку чрезмерная активация RAS может стимулировать больше продукции ROS, изменения в H2S могут инициировать порочный круг, который приведет к фазовым изменениям в почках. Восстановление согласования между окислительными и восстановительными видами путем ингибирования NADPH-оксидазы или добавления H2S на ранней стадии диабета может принести пользу попытка прекратить порочный круг.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *