Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Активация рецептора печени X от Agonist TO901317 повышает устойчивость к печеночному инсулину посредством подавления реактивных видов кислорода и пути JNK

Activation of the Liver X Receptor by Agonist TO901317 Improves Hepatic Insulin Resistance via Suppressing Reactive Oxygen Species and JNK Pathway
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4409387/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: YD XL WL. Провели эксперименты: YD GG HF SL. Проанализированы данные: YD GG XL. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: XL SL. Написал бумагу: YD XL.

‡ Эти авторы являются совместными старшими авторами по этой работе.

Активация рецепторов печени (LXR), ключевых транскрипционных регуляторов метаболизма глюкозы, нормализует гликемию и улучшает чувствительность к инсулину в моделях грызунов с резистентностью к инсулину. Однако молекулярный механизм неясен. Это исследование направлено на выяснение механизма метаболической регуляции глюкозы печени, опосредованной LXR in vitro и in vivo. Мыши Db / db использовали в качестве модели in vivo диабета; palmitate (PA) -тимированные клетки HepG2 использовали в качестве модели клеток in vitro с нарушением передачи сигналов инсулина. В качестве агониста LXR был выбран TO901317 (TO). Мы продемонстрировали, что лечение TO в течение 14 дней эффективно улучшает метаболизм глюкозы в печени у мышей db / db, включая уровень глюкозы в крови натощак, уровень инсулина натощак и HOMA-IR. TO не влияло на метаболизм глюкозы у обычных мышей WT. TO-опосредованная активация печеночных LXR приводила к сильному ингибированию продукции ROS, сопровождающейся инактивацией пути JNK и повторной активацией пути Akt. TO также подавляло экспрессию глюконеогенных генов, таких как PEPCK и G-6-pase у мышей db / db, но не у мышей WT. В клетках HepG2 TO почти полностью восстановила ИА-активацию, индуцированную ПА, и подавляла РО-продуцируемую РОС-активацию и активацию JNK. Интересно, что базальный уровень ROS также ингибировался TO в клетках HepG2. Для значительного ингибирования PA-стимулированных выражений глюконеогенных генов. Наконец, мы обнаружили, что антиоксидативные гены, такие как Nrf2, были активированы после активации LXR посредством TO. Эти результаты полностью подтверждают мнение о том, что активация LXR имеет решающее значение для подавления глюконеогенеза печени и улучшения чувствительности к инсулину у пациентов с диабетом. На молекулярных уровнях способ действия, по-видимому, является молодым: при диабетическом состоянии увеличивается производство ROS, активируется JNK и активность Akt ингибируется; TO-опосредованная активация LXR эффективно ингибирует продукцию ROS, увеличивает антиоксидантные экспрессии генов, подавляет активацию JNK и восстанавливает активность Akt. Наши данные дают новые доказательства для поддержки LXR в качестве перспективных терапевтических целей для разработки антидиабетических препаратов.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации.

Инсулинорезистентность является характерной чертой диабета 2 типа и играет важную роль в патогенезе заболевания. Он играет центральную роль в развитии многих метаболических аномалий и заболеваний, включая ожирение, дислипидемию и сердечно-сосудистые заболевания [1]. Несмотря на значительные успехи в нашем понимании молекулярных механизмов, связанных с резистентностью к инсулину, многие вопросы остаются [2].

Как главный чувствительный к инсулину орган, печень играет ключевую роль в гомеостазе глюкозы. Сопротивление инсулину печени в конечном итоге приведет к изменению экспрессии метаболического гена и нарушению гликоматолизма. Рецепторы печени X (LXR) являются членами надсемейства ядерных рецепторов активированных лигандом факторов транскрипции, которые включают почти все биологические процессы, включая метаболизм, воспаление и пролиферацию [3-5]. Существует две изоформы LXRs, LXRα и LXRβ с различными профилями экспрессии у взрослых грызунов: LXRα в основном выражается в печени, жировой ткани, кишечнике, почках и макрофагах, тогда как LXRβ широко экспрессируется [6]. Каждая изоформа имеет свою специфическую транскрипционную регуляцию в определенной ткани [7-9].

В прошлом в большинстве исследований основное внимание уделялось роли LXR в регуляции метаболизма холестерина и липидов. Однако новые данные, использующие специфический агонист TO901317, показывают, что LXR также играют критическую роль в метаболизме глюкозы [5]. Было продемонстрировано, что TO901317 является высокоспецифическим активатором для LXRα и LXRβ, с 2,3-кратной активностью до LXR, чем LXRβ, и он не влияет на другие 12 ядерных рецепторов [10]. Было показано, что TO901317 улучшает метаболизм глюкозы в различных моделях резистентности к инсулину на животных, включая как мышей (ob / ob, так и db / db) и крыс (ZDF и fa / fa) [11-13]. Тем не менее, TO901317 не влияет на уровни глюкозы у мышей db / + [13] или у мышей с нормальной мышей WT [11,12,14], что указывает на то, что эффекты LXR, модулирующие глюкозу, коррелируют с резистентностью к инсулину.

Считается, что свободные жирные кислоты (FFA) играют роль в модулировании резистентности к инсулину как in vivo, так и in vitro [15,16], но задействованный механизм неясен [17]. Недавно окислительный стресс был предложен как связь между FFA и резистентностью к инсулину [18]. Перегруженный FFA является одним из исходных субстратов, которые приводят к дисфункции митохондрий и увеличению количества активных форм кислорода (ROS) при метаболических заболеваниях. Сообщалось, что увеличение ROS и окислительного повреждения происходило до развития резистентности к инсулину, что наводит на мысль о причинной роли превышения продукции ROS при резистентности к инсулину [19,20]. Используя культивируемые адипоциты 3T3-L1, Houstis и коллеги показали, что производство ROS предшествовало резистентности к инсулину, а очистка ROS спасает чувствительность к инсулину [21]. Эти исследования подтверждают, что ROS является основной причиной резистентности к инсулину. Активация чувствительных к стрессу Ser / Thr киназ вызывает ингибирующее фосфорилирование пути передачи сигналов инсулина. Накопление ROS ингибирует активность фосфатазы и, таким образом, способствует активности стресс-киназы, обеспечивая потенциальный механизм индуцированной ROS резистентности к инсулину. В этом процессе участвует N-терминальная киназа C-Jun (JNK). Мыши, дефицитные для JNK1, защищены от индуцированной диетой резистентности к инсулину [22]. Снижение активности печени JNK1 улучшает чувствительность к печеночному инсулину [23,24]. Кроме того, сообщалось, что эндотелиальные клетки-предшественники (EPC), выделенные у пациентов с диабетом, имели значительно более высокий уровень ROS, чем у здоровых контролей [25]. TO901317 проявил защитный эффект на функции EPC при высокой глюкозе путем ингибирования ROS при активации AMPK [26]. Принимая во внимание, в этих отчетах указывались потенциальные перекрестные переговоры между LXR, FFA, ROS и JNK в регулировании пути передачи сигналов инсулина и метаболизма глюкозы.

В этом отчете мы исследовали потенциальные молекулярные механизмы действия LXR на индуцированную FFA резистентность к инсулину как in vitro, так и in vivo. Мы обнаружили, что агонист LXR TO901317 эффективно инвертирует индуцированную пальмитатом резистентность к инсулину, уменьшая продукцию ROS и подавляя активацию пути JNK через LXR в печени.

Мышей db / db (C57BL / KsJ) мышей (8-wk old) и их совпадающих по возрасту мышей дикого типа (C57BL / 6) покупали в Исследовательском центре модельных животных Университета Нанкина. Мыши были размещены в контролируемой температуре (20-24 ° C) и контролируемой влажностью (45-55%) комнате, ежедневно освещенной с 7:00 до 19:00 (12-часовой свет, 12-часовой темный цикл), со свободным доступом вода и стандартная лабораторная чау. Мышей адаптировали в течение 1 недели до начала экспериментов. мышей db / db и мышей WT (контрольные) были разделены на две группы (10-15 на группу), контрольные / обработанные [диметилсульфоксид (DMSO)) и TO901317 обработанные соответственно. TO901317 (TO) агонистом LXR (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, 30 мг / кг / сут, растворенным в ДМСО) или равным объемом ДМСО (контроль / носитель) вводили ежедневно внутрибрюшинно (IP) в течение 2 недель. Потребление пищи и вес тела измерялись каждый день с момента начала лечения до последнего дня экспериментов. Чтобы принести в жертву животных, мышей сначала анестезировали изофлураном, а затем вывих шейки матки. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Шанхае [SYXK (Шанхай 2009-0069)] и проводились в соответствии с Руководством Национального совета по уходу и использованию лабораторных животных (SCXK (Shanghai 2007-0005) )].

Кровь собирали сразу же после 15 минут инсулиновой инъекции (Humulin R, Eli Lilly, 0,75U / кг для WT и 1,5U / кг для db / db), сыворотку выделяли и хранили при -80 ° C до анализа. Уровни инсулина и FFA определяли ферментативно с помощью набора для анализа пластин на 96 лунок Millipore Rat / mouse инсулина и набора для анализа свободных жирных кислот BioAssay Systems EnzychormTM соответственно. Расчет модели гомеостаза резистентности к инсулину (HOMA-IR) был рассчитан, как описано ранее [27]: HOMA-IR = глюкоза натощак (ммоль / л) × натощак инсулина (мкУ / мл) / 22,5. Плазменный и печеночный малоносный альдегид (MDA) измеряли с помощью набора для анализа MDA в соответствии с инструкциями изготовителя (Нанкинский институт биоинженерии по биотехнологии Наньцзин, Китай) [28].

Ткани печени собирали немедленно и хранили для экстракции и анализа белка и мРНК, гистологии и измерения образования реактивных окислительных видов. Часть печени от каждой мыши также фиксировалась в 10% формалине для введения парафинов и окрашивания H & E.

В первый день перед лечением наркотиками и на 14-й день (последний день лечения) мышей db / db и WT голодали в течение ночи в течение 12 часов. Образцы крови собирали из хвостовой вены для определения исходных значений глюкозы (0 минут) перед инъекцией инсулина (0,75 ед / кг для WT и 1,5 ед / кг для дБ / дБ). Дополнительные образцы крови собирали через регулярные промежутки времени (15, 30, 60, 90 и 120 минут) для измерения уровня глюкозы. Концентрацию глюкозы в крови определяли с помощью глюкометра (Accu-Chek Performa, Roche Diagnostics).

Человеческие гепатокарциномы HepG2 клетки были получены из клеточного банка Китайской академии наук (Шанхай, Китай) и культивировали в среде минимального Eagle (Gibco), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (Gibco), 100 единиц / мл пенициллина (Invitrogen) , и 0,1 мг / мл стрептомицина (Invitrogen) при 37 ° С с увлажненным воздухом и СО2 (5%). Все исследования проводились с использованием 80-90% конфлюэнтных клеток, которые обрабатывались либо сингулярно, либо в комбинации с TO901317 (TO; Sigma), Palmitate (PA; Sigma, Cat #: P9767), инсулин (INS; Eli Lilly) и N-ацетилцистеин (NAC, Sigma) после лишения FBS в течение ночи. Процедуры подготовки и обработки реагентов были обобщены следующим образом: PA и TO растворяли в ДМСО при концентрациях 30 мМ и 10 мМ соответственно в качестве запасов. NAC растворяли в стерильном PBS (с рН до 7,4) при концентрации 1 М в качестве запаса. Активные реагенты TO, PA и NAC разбавляли в культивированную среду при желаемой концентрации либо по одному реагенту за один раз, либо в комбинации, а затем инкубировали клетки HepG2 для разных временных курсов, как указано. Если использовали два или более реагентов, их одновременно добавляли в среду. Конечные концентрации каждого реагента составляли 100, 250, 500 и 750 мкМ для ПА; 1,0 мкМ для TO; 2,5, 5 и 10 мМ для NAC. Инсулин добавляли в среду в различных концентрациях (1, 10 и 100 нМ) за 15 минут до сбора клеток.

Генерацию реактивных видов кислорода (ROS) в печени измеряли конфокальным микроскопом с пятном in situ DHE. Секции (10 мкм) внедренных тканей, содержащих OCT, инкубировали с 2 мкМ DHE (Sigma) при 37 ° C в течение 30 минут в увлажненной камере, защищенной от света, с последующим 5-минутным промыванием в PBS для удаления неинтеркалированного этидия бромида. Изображения были получены и проанализированы с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica (Leica TCS SP5 II, Leica Microsystems).

2,7-Дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (DCFH-DA, Sigma) использовали в качестве захвата ROS в клетках. Он расщепляется внутриклеточно неспецифическими эстеразами с образованием 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина (DCFH), который далее окисляется ROS и становится высоко флуоресцентным соединением 2,7-дихлорфлуоресцеин (DCF). В настоящем исследовании клетки HepG2 подвергались воздействию различных лекарств в указанные моменты времени. DCFH-DA при 10 мкМ инкубировали с клетками в течение 20 минут. После однократного промывания ледяным PBS клетки собирали и хранили на льду для немедленного обнаружения с помощью проточной цитометрии (Becton Dickson). Средняя интенсивность DCF означает внутриклеточные уровни ROS.

Общая РНК была экстрагирована с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), и комплементарная ДНК была синтезирована в соответствии с инструкциями производителя (Takara, Shiga, Japan). Анализы количественного ПЦР в реальном времени (SYBR Green) проводили с использованием SYBR Premix Ex TaqTM (Takara, Shiga, Japan) в детекторе последовательности Applied Biosystems 7300 (Roche, Indianapolis, IN). Праймеры, используемые в ПЦР в реальном времени, были показаны в таблице 1. Уровни мРНК всех генов были нормированы с использованием β-актина (для мышей) или GAPDH (для человека) в качестве внутреннего контроля.

Ткани печени гомогенизировали в ледяном радиоиммунопреципитационном анализе (RIPA P0013C, Beyotime, Китай) с коктейлем ингибитора протеазы и коктейлем ингибитора фосфатазы (Complete, Mini, EDTA-free, PhosSTOP, Roche Applied Science, Germany). Гомогенат центрифугировали при 4 ° С при 10000 × g в течение 10 мин и собирали супернатант (общий белковый экстракт). Концентрацию белка измеряли с помощью анализа Брэдфорда (набор для анализа белка, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Для клеток HepG2 клетки трижды промывали ледяным PBS и гомогенизировали в ледяном буфере для лизиса [50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 200 мкМ ортованадата натрия, 1% Triton X -100] с коктейлем ингибитора протеазы и коктейлем ингибитора фосфатазы. Белки отделяли на 8% полиакриламидных гелях SDS и электрофоретически переносили на нитроцеллюлозные мембраны Hybond-C (Amersham Biosciences, UK). Затем мембраны блокировали блокирующим раствором (5% обезжиренного молока в PBS, содержащем 0,05% Твин 20), а затем инкубировали с различными первичными антителами. Каждое связанное первичное антитело визуализировали с помощью соответствующего вторичного HRP-конъюгированного антитела (Jackson Lab) с использованием ECL (Thermo scientific) и системы получения изображений (LAS-4000 Mini, GE). Первичные антитела против Akt, фосфо-Akt (p-Akt на Ser473), IRS1, фосфо-IRS1 (p-IRS1 в Ser307), JNK, фосфо-JNK (p-JNK на Thr183 / Tyr185), были приобретены из Cell Signaling ; антиактин-антитело было приобретено у Abcam.

Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS 12.0 с t-критерием Стьюдента. Статистическая значимость была установлена ​​при p <0,05. Все результаты представлены как среднее ± SD.

Чтобы выяснить, улучшает ли активация LXR чувствительность к инсулину и метаболизм глюкозы, мышам db / db 9-wk-old и мышам WT C57 / B6 с возрастом вводили ежедневную внутрибрюшинную инъекцию агониста LXR TO901317 (TO) или ДМСО (контроль) в течение двух недель. Мыши Db / db проявляют характерные особенности диабетических метаболических нарушений типа 2, включая ожирение, гипергликемию и резистентность к инсулину (рис. 1А и 1В). Двухнедельное лечение TO эффективно уменьшало уровень глюкозы в крови натощак, инсулина и HOMA-IR у мышей db / db, но не у мышей WT (рис. 1C и 1D). Интересно, что лечение TO не влияет на уровни FFA в сыворотке и массу тела в любой экспериментальной группе (рис. 1E и 1F). Кроме того, потребление пищи было сходным между группой, обработанной ТО-обработкой, и контролем, обработанным DMSO (S1 Fig).

Мышам WT и db / db вводили стандартную лабораторную диету в течение 9 недель. Измеряли массу тела и глюкозу натощак на базальном уровне (А), кривые интраперитонеального теста на дозу инсулина (IPITT) до лечения (В). Затем мышам вводили ежедневную внутрибрюшинную инъекцию ТО или ДМСО соответственно. Эффект TO и DMSO на уровень глюкозы натощак (C), натощак инсулина и уровень HOMA-IR (D), массу тела (E) и постфакты FFA (F) измеряли после 2 недель лечения. Результаты представлены как среднее ± SD, *, #P <0,05. В каждой группе использовали 10-15 мышей.

В состоянии голодания уровень глюкозы в крови является отражением продуцирования глюкозы в печени, и, следовательно, HOMA-IR отражает прежде всего резистентность к инсулину печени. Таким образом, IPITT проводили для исследования влияния TO на гипогликемический ответ на инсулин, чтобы еще раз подтвердить, может ли улучшаться все тело IR. Как показано на фиг.2А и 2В, двухнедельная терапия с помощью ТО приводила к значительно более низким уровням глюкозы у мышей db / db, но не у мышей WT, в каждый момент времени IPITT по сравнению с уровнями глюкозы в контроле группа.

IPITT проводили на мышах WT и db / db после 14 дней лечения TO или DMSO (контроль). Через 5 часов после последней инъекции TO утром 14-го дня мышей, уже голодавших в течение 12 часов, подвергали внутрибрюшинной инсулиновой пробы (0,75 U / кг для WT и 1,5 U / кг для db / db). Кривые IPITT показали существенные различия между TO и DMSO-обработанными мышами db / db (A), но никаких существенных различий между TO и DMSO-обработанными мышами WT (B). H & E-окрашивание печени показало, что обработка TO повышала накопление липидов по сравнению с контролем ДМСО у мышей db / db (C), но значимых различий у мышей WT (D) не наблюдалось. Результаты в (A) и (B) представлены как среднее ± SD, * P <0,05. В каждой группе использовали 10-15 мышей.

В качестве характеристики ожирения и диабетической модели у мышей db / db проявлялся замечательный стеатоз печени, который ухудшался после лечения TO (рис. 2C и 2D). Точно так же лечение TO также усугубляло уровни печеночных TG и FFA (S2 Fig). Никаких изменений в печеночном стеатозе, TG или FFA не наблюдалось у мышей, обработанных TO. Эти результаты свидетельствуют о том, что TO улучшает толерантность к глюкозе и чувствительность к инсулину только у мышей db / db, но не у мышей WT.

Печеночный глюконеогенез является одним из наиболее важных процессов регулирования метаболизма глюкозы. Известно, что повышенный печеночный глюконеогенез обусловлен избыточной экспрессией фосфоенолпируваткарбоксикиназы (PEPCK) и глюкозо-6-фосфатазы (G-6-pase), двух ключевых глюконеогенных ферментов. При оценке потенциальных механизмов, лежащих в основе такого очевидного улучшения метаболизма глюкозы и чувствительности к инсулину у мышей db / db, были исследованы экспрессии мРНК PEPCK и G-6-pase в печени. Мы обнаружили, что PEPCK и G-6-pase-выражения значительно ингибируются у обработанных TO-обработанных мышей db / db по сравнению с DMSO-обработанными мышами db / db (фиг. 3A и 3B). В качестве положительного контроля в том же эксперименте SREBP-1c, как известный ген прямой мишени LXR, был значительно увеличен у мышей, обработанных TO (db / db и WT), по сравнению с мышами, обработанными DMSO (фиг.3C) , Кроме того, стимулированное инсулином фосфорилирование Akt (P-Akt) было значительно увеличено у обработанных TO обработанных мышей db / db, тогда как общий уровень белка Akt оставался неизменным (рис. 3D). Напротив, фосфорилирование и общий белок IRS1 не изменялись у мышей db / db. Между тем, фосфорилирование и общий белок ни Akt, ни IRS1 не были изменены у мышей WT.

(A & B). Выражения PEPCK (A) и G-6-Pase (B) были значительно снижены у обработанных TO-обработанных мышей db / db по сравнению с контрольными DMSO-контролем, но никаких значительных различий между мышами WT, обработанными TO и DMSO , (C) Экспрессия SREBP-1c была значительно увеличена как у мышей с Db / db, так и с обработанными TO и по сравнению с соответствующими контрольными DMSO. (D) Инсулин-стимулированное фосфорилирование Akt было значительно увеличено у обработанных TO обработанных мышей db / db, тогда как общий уровень белка Akt оставался неизменным, но не было никаких изменений ни в фосфорилировании, ни в общем белке IRS1, по сравнению с контрольными DMSO-контролем , TO не влияло на фосфорилирование и общий белок Akt или IRS1 у мышей WT. Результаты в (A), (B) и (C) представлены как среднее ± SD, * P <0,05. В каждой группе использовали 10-15 мышей.

Чтобы выяснить механизм участия LXR в процессе глюконеогенеза и почему это явление происходит только в диабетических моделях с резистентностью к инсулину (не в WT), мы дополнительно исследовали взаимосвязь между пути инсулина и LXR. Сообщалось, что окислительный стресс играет ключевую роль в резистентности к инсулину [29]. Затухание избыточной генерации ROS может восстановить чувствительность к инсулину, частично за счет подавления активации JNK [21]. Таким образом, мы предположили, что TO может облегчить резистентность к инсулину, подавляя продукцию ROS и активацию JNK. Действительно, производство ROS резко снижалось в печени обработанных TO обработанных мышей db / db по сравнению с обработкой, обработанной DMSO (рис. 4A, левая панель). Уровень ROS был очень низким (едва заметным) в печени мышей WT, либо с обработкой DMSO, либо с TO (рис. 4A, правая панель). MDA, надежная мера перекисного окисления липидов [30], также анализировалась как из тканей крови, так и печени с помощью анализов тиаборбитуровой кислоты (TBARS) (рис. 4B). Как плазменный, так и печеночный уровни MDA повышались у мышей db / db по сравнению с мышами WT, и эта повышенная MDA у мышей db / db значительно снижалась после TO-лечения. TO не влияло на уровни MDA у мышей WT (рис. 4B).

(A) Через 2 недели лечения TO или DMSO (контроль) продукцию ROS в печени оценивали конфокальным микроскопом с окрашиванием in situ DHE. Генерация ROS была резко снижена у обработанных TO обработанных мышей db / db, по сравнению с мышами DMSO. Но между мышами WT не было никакой разницы. (B) Для лечения (2 недели) значительно снижались уровни MDA как в плазме, так и в печени мышей db / db, но не мышей WT. (C) После 2-недельного лечения TO или DMSO мышей печени мыши собирали для анализа WB JNK. JNK-фосфорилирование было значительно снижено у мышей db / db при лечении TO, по сравнению с контролем ДМСО, тогда как уровни общего белка JNK не изменялись. Никаких существенных изменений не наблюдалось ни по фосфорилированию, ни по полному уровню белка JNK у мышей WT. Результаты в (B) представлены как среднее ± SD, * P <0,05. Были показаны представители 10-15 мышей в каждой группе.

Кроме того, фосфорилирование JNK было значительно снижено у мышей db / db при лечении TO, по сравнению с контролем в DMSO, в то время как уровни общего белка JNK не изменялись (рис. 4C, левая панель). Никаких существенных изменений не наблюдалось ни в фосфорилированном, ни в общем объеме белка JNK у мышей WT независимо от лечения (рис. 4C, правая панель). Эти результаты свидетельствуют о том, что ингибирование окислительного стресса с помощью ТО приводит к подавлению активации JNK, что может быть одним из механизмов, ведущих к улучшению глюкозы в крови и резистентности к инсулину у мышей db / db.

Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов, как FFA участвует в регулировании передачи сигналов инсулина, мы выбрали клетки HepG2, одну из наиболее широко используемых линий клеток печени, в качестве модели клеточной культуры. Palmitate (PA), известный FFA, широко используемый в исследованиях резистентности к инсулину, использовался для лечения клеток HepG2. Во-первых, мы продемонстрировали, что инсулин активировал Akt в клетках HepG2, измеряемый как фосфорилирование Akt, дозозависимым образом (фиг.5A, левая панель). Инсулино-стимулированная активация Akt эффективно подавлялась PA в зависимости от дозы, почти полностью подавляясь при 750 мкМ (рис. 5A, правая панель). Далее мы рассмотрели вопрос о том, влияет ли PA на транскрипционные выражения PEPCK и G-6-Pase. Как показано на фиг. 5B, обработка PA увеличивала экспрессии PEPCK и G-6-Pase постепенно в течение нескольких часов и достигла максимума в 16 часов, в тот же момент времени, когда PA максимально подавляло стимулированное инсулином фосфорилирование Akt. Не наблюдалось изменений в экспрессии двух генов в присутствии 1,0 мкМ ТО, как показано на фиг. 5В. Эти результаты показывают, что ПА нарушает путь передачи сигналов инсулина и подавляет экспрессии PEPCK и G-6-Pase, что может в конечном итоге привести к аномальному метаболизму глюкозы. Чтобы определить, может ли ТРОО отменить эффекты стимуляции ПА в клетках HepG2, TO (1,0 мкМ) совместно инкубировали с PA (500 мкМ) в течение 16 часов. Как показано на фиг.5C, TO сильно подавляет экспрессию PEPCK и G-6-Pase, стимулированных PA. Кроме того, TO обратило PA-подавленное фосфорилирование Akt, не влияя на выражение Akt (рис. 5D). Наши данные in vitro с моделью клеток HepG2 согласуются с тем, что мы наблюдали in vivo у мышей в том, что активация LXR с помощью TO может эффективно улучшать резистентность к инсулину и метаболизм глюкозы.

(A) HepG2-клетки инкубировали в присутствии или в отсутствие пальмитата (PA) [0 (контроль), 100, 250, 500, 750 мкМ] в течение 16 ч до 15 мин стимуляции инсулином (0, 1, 10, 100 нМ). Общее количество лизатов клеток собирали для анализа ВБ. Инсулин-активированное фосфорилирование Akt в клетках HepG2 с дозозависимым образом, но оно эффективно подавлялось PA в зависимости от дозы, при почти полном подавлении при 750 мкМ. (B) клетки HepG2 инкубировали с TO (1,0 мкМ) или PA (500 мкМ) в течение различных периодов времени (0, 4, 8, 12, 16, 24 часа) соответственно. Общее количество лизатов клеток собирали для ПЦР в реальном времени. PA постепенно увеличивали экспрессии PEPCK и G-6-Pase с течением времени и достигали максимума в 16 часов, в то время как значительных изменений в TO-обработанных клетках не наблюдалось. (C & D) HepG2-клетки инкубировали в присутствии или в отсутствие PA (500 мкМ) или PA (500 мкМ) + TO (1,0 мкМ) в течение 16 часов. Общее количество лизатов клеток собирали для анализа ПЦР в реальном времени и анализа ВБ. К сильно подавляемой PA-стимулированной экспрессии PEPCK и G-6-Pase (C). Кроме того, TO восстанавливает PA-подавленную активацию Akt / фосфорилирование, не влияя на полное выражение Akt (D). Результаты в (B) и (C) представлены как среднее ± SD, *, #P <0,05. В каждой группе использовали 10-15 мышей.

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между LXR, ROS и JNK-каналом мы протестировали эффекты TO на PA-стимулированное ROS-продуцирование и активацию JNK в клетках HepG2. При отсутствии ТО обработка PA увеличивала производство ROS как остро (15-60 мин), так и хронически (8 часов), в зависимости от дозы, с пиком при 500 мкМ (рис. 6А, левая панель). Мы дополнительно тестировали, если PA (500 мкМ) имеет еще более длительные эффекты за 8 часов (в 16, 24, 32 часа). Действительно, в то время как хронически стимулированный ROS по PA достиг максимума в 16 часов, он поддерживался до 32 часов (рис. 6A, правая панель). Поскольку PA при 500 мкМ наиболее эффективен в индуцировании продукции ROS (рис. 6A, левая панель), 500 мкМ ПА в 16 ч инкубационного времени были выбраны для большинства наших исследований с использованием клеток HepG2. NAC, классический антиоксидант, был выбран в качестве положительного контроля для подавления ROS. В присутствии возрастающих концентраций NAC в течение 16 часов производство ROS снижалось зависимым от концентрации образом, при максимальном эффекте NAC при 5 мМ [более высокая концентрация (10 мМ) имела аналогичный эффект, как 5 мМ] (рис. 6В). Поэтому для последующих экспериментов был выбран 5 мМ NAC. Сравнивая эффекты TO и NAC в установившемся режиме (рис. 6C, левая панель), TO уменьшало производство ROS в ~ 5 раз по сравнению с контролем, почти в 3 раза более мощным, чем NAC (подавление только ROS ~ 40%), и продолжался до 32 часов. Кроме того, TO также эффективно подавлял продукцию ROS с имитацией ПА с аналогичной эффективностью NAC (рис. 6C, правая панель). Эти результаты показывают, что антиокислительный эффект TO901317 является как мощным, так и стойким.

(A) Левая панель: клетки HepG2 инкубировали с пальмитатом (PA) в различных дозах [100, 250, 500 и 750 мкМ; (без лечения)] для разных периодов времени (15, 30, 60 минут и 8 часов), соответственно. Внутриклеточное производство ROS определяли количественно с использованием флуоресцентного зонда DCFH-DA. PA-обработка увеличивала продукцию ROS дозозависимым образом при концентрации 500 мкМ или ниже; и это возвышение поддерживалось до 8 часов. Правая панель: поскольку 500 мкМ ПА было наиболее эффективным в индуцировании продукции ROS, как показано на левой панели, мы дополнительно тестировали, если PA (500 мкМ) имеет длительные эффекты (в моменты времени 8, 16, 24, 32 часа). Действительно, ПА стимулировал РОС, поддерживаемый до 32 часов. (B) клетки HepG2 инкубировали в течение 16 ч с увеличением концентрации NAC (0, 2,5, 5, 10 мМ), положительным контролем для подавления ROS. Обработка NAC уменьшала производство ROS зависимым от концентрации образом. (C) клетки HepG2 либо инкубировали с TO (1,0 мкМ) в течение 8, 16, 32 часов или с 5 мМ NAC в течение 16 часов (левая панель); (500 мкМ) + TO (1,0 мкМ) и PA (500 мкМ) + NAC (5 мМ) соответственно (правая панель). В базовом (несимулированном состоянии) (левая панель) TO заметно подавляло производство ROS, мощность которого выше, чем NAC. Под воздействием PA-стимуляции (правая панель) обработка TO (в течение 16 часов) имела аналогичную активность, как NAC (16 часов) для подавления производства ROS. (D) Активацию JNK анализировали с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. И TO (левая панель), и NAC (правая панель) подавили активацию / фосфорилирование JNK, вызванную PA, в клетках HepG2. Результаты в (A), (B) и (C) представлены как среднее ± SD, * P <0,05 по сравнению с контролем, & P <0,05 NAC по сравнению с TO, #P <0,05 по сравнению с PA.

Чтобы подтвердить корреляцию между подавлением ROS-опосредованного ROS и инактивацией JNK, мы идентифицировали у мышей db / db (рис. 4), эффекты TO на фосфорилирование JNK были протестированы в клетках HepG2. Как и ожидалось, фосфорилирование JNK заметно усиливалось PA, и это усиление уменьшалось в присутствии TO (рис. 6D, левая панель). Далее мы определили, был ли NAC, как антиоксидант, аналогичным эффектом, как ТО для активации / фосфорилирования JNK в клетках HepG2. 5 мМ NAC инкубировали с клетками HepG2 в течение 16 ч, в отсутствие или в присутствии 500 мкМ ПА. Как мы и ожидали, NAC имел такой же эффект, как и для фосфорилирования JNK (сравните рис. 6D, левую и правую панели).

Поскольку TO эффективно подавляет как продукцию ROS in vivo (мышей db / db, рис. 4), так и in vitro (клетки HepG2, рис. 6), мы также определяем, влияет ли лечение TO на антиоксидативные гены как у мышей db / db, так и на клетки HepG2. Как показано на S4A Fig, Nrf2, Mn-SOD, два из 8 основных антиокислительных генов, были повышено у обработанных TO обработанных мышей db / db по сравнению с мышами, обработанными DMSO db / db. Экспрессия Nrf2 также увеличивалась в TO-обработанных клетках HepG2 по сравнению с контролем (S4B Fig).

Настоящее исследование было разработано для изучения механизма антидиабетического действия LXR. Мы продемонстрировали, что TO901317, высокоспецифический агонист LXRs, эффективно улучшает метаболизм глюкозы в печени путем активации пути передачи сигналов Akt. Мы также показали, что активация печеночных LXR приводит к ингибированию образования ROS и инактивации JNK-пути. Наши данные сильно поддерживают полезную роль активации LXR в повышении резистентности к инсулину и предлагают LXR в качестве потенциальной терапевтической цели для лечения диабета типа 2.

Ожирение связано с растущим риском развития резистентности к инсулину и диабетом типа 2 [31]. В этом исследовании мышей db / db выбирали как индуцированную ожирением резистентность к инсулину и диабетическую мышь. Во-первых, у мышей db / db мы обнаружили, что агонист LXR TO сильно подавил очевидные диабетические фенотипы, включая снижение уровня глюкозы натощак, инсулина натощак и HOMA-IR. Наши данные IPITT также указывали на значительное улучшение чувствительности к инсулину у обработанных TO обработанных мышей db / db без риска гипогликемии. Интересным аспектом LXR-опосредованной регуляции глюкозы и инсулина является то, что эта регуляция происходит только у мышей db / db, но не у мышей WT. В отличие от мышей db / db мышей WT не наблюдалось значительного изменения уровня глюкозы в плазме, уровня инсулина, HOMA-IR и IPITT после лечения TO. Подобное явление сообщалось ранее в различных моделях грызунов [5, 11-14]. Также не было статистической разницы в среднем потреблении пищи между животными, обработанными ТО, и контрольными группами (S1 Fig). Это предполагает, что метаболическое улучшение глюкозы, опосредованное ТО, не было связано с его воздействием на потребление пищи или вес тела. Эти данные показывают, что эффективное улучшение чувствительности к глюкозе и инсулину с помощью агониста LXR происходит только у пациентов с ожирением у IR, а не у нормальных мышей.

Предыдущие исследования показали, что активация LXR может вызывать печеночный липогенез посредством прямой активации транскрипции, связывающей стволовые клетки-связывающие белки-1c (SREBP-1c) [32,33]. В нашем исследовании TO-обработанные мыши db / db проявляли более обширный печеночный стеатоз, чем контрольная группа, скорее всего, из-за опосредованной SREBP-1c восходящей регуляции липогенетических генов, таких как SCD-1 и FAS и т. Д. [32]. Печеночный стеатоз обычно приводил к обострению ИР. Интересно, однако, что это явление не произошло на наших мышах, обработанных TO-db / db. Вместо этого мыши, обработанные TO-db / db, продемонстрировали значительное улучшение уровня глюкозы в крови и инсулина, а также IR. Недавно группа Gustafsson сообщила, что GW3965, еще один агонист LXR, увеличил уровень внутрипеченочного TG, но снизил уровень TG в сыворотке за счет активации активности липазы в сыворотке у мышей, питающихся диетами, с 5 недель лечения [34]. Существуют также примеры стеатоза, не связанные с резистентностью к печеночной инсулину; стеатоз возникает даже тогда, когда чувствительность к инсулину значительно улучшается [35,36]. Аналогичные результаты наблюдались в модели ожирения с высоким содержанием жиров с мышами WT. Гао и Лю [37] продемонстрировали, что 10-недельное лечение TO может защитить мышей WT от ожирения с высоким содержанием жиров и ожирения, связанных с инсулинорезистентностью и нарушениями глюкозы, в то время как вывод TO может обратить вспять стеатоз в печени. Таким образом, хотя активация LXR увеличивает липогенез, он не влияет на его роль в улучшении гипергликемии и чувствительности к инсулину.

Инсулин проявляет два основных действия в печени: глюконеогенез и липогенез. Эти процессы объясняются, по меньшей мере частично, индуцированным инсулином фосфорилированием сигнальных молекул вниз по потоку и регуляцией связанных генов. В инфракрасном состоянии инсулин не способен ингибировать глюконеогенез, но сохраняет свою способность усиливать липогенез, что называется «селективной резистентностью к инсулину» [38]. Из-за невосстановленного глюконеогенеза часть избыточного глюкозы в крови может использоваться в качестве субстрата, участвующего в липогенезе печени, что еще больше усугубит ИР и приведет к порочному циклу при метаболизме глюкозы и липидов. Однако такой порочный круг, казалось, прерывался активированными LXR. В печени обработанных TO-обработанных мышей db / db транскрипционная репрессия PEPCK и G-6-Pase составляла более 85% и 60% соответственно с заметно повышенной активацией (фосфорилированием) Akt. Улучшенное фосфорилирование Akt через LXR может быть конечной причиной улучшенного диабетического фенотипа у обработанных TO обработанных мышей db / db, даже когда стеатоз печени был увеличен. Наши данные сильно указывают, что активированные ТО-LXR действуют аналогично инсулину: продвигают путь передачи сигналов инсулина и подавляют глюконеогенетические гены. Точный механизм такого драматического ингибирования этих двух основных генов глюконеогенеза не был известен, поскольку Stulnig сообщил, что PEPCK и G-6-Pase не являются прямыми генами-мишенями LXR [39]. Мы предлагаем новый вывод о том, что активация LXR с помощью TO приводит к активации Akt, что приводит к улучшению чувствительности к инсулину у мышей db / db. С другой стороны, активация LXR не влияет на активацию IRS1, другого ключевого белка, участвующего в пути инсулина, предполагая, что LXR либо обходятся IRS, либо непосредственно активируют путь передачи сигналов инсулина, либо только частично регулируют путь передачи сигналов инсулина. Тот факт, что TO не влияет на глюконеогенез и активацию Akt у мышей WT, указывает на то, что печеночная активация LXR регулирует путь передачи сигналов инсулина только в условиях IR, а повышенная регуляция экспрессии SREBP-1c не вызывает липогенеза в печени мышей WT. Причина противоположных эффектов ТО на стеатоз печени и ИР не полностью понята и нуждается в дальнейшем исследовании.

Следует отметить, что, поскольку активация LXR, как известно, стимулирует липогенез, как мы упоминали ранее, мы не можем исключить потенциальную возможность того, что TO-обработка может способствовать превращению дополнительной глюкозы в липид и хранить в виде триглицерида (TG) в печени , тем самым в качестве одного из механизмов, способствующих уменьшению гипергликемии у мышей db / db.

Механизм действия активированными LXR был дополнительно исследован в клеточной модели с использованием клеток HepG2. Так как мыши db / db имели высокий уровень FFA с IR, мы рассматривали, что FFA могут быть одним из основных факторов, вызывающих ИК. Плазменные FFA состоят из пальмитата насыщенных жирных кислот (около 30-35%) и олеата мононенасыщенных жирных кислот (около 40-50%). Ряд недавних клинических исследований показал, что резистентность к инсулину и диабет типа 2 тесно связаны с относительно высоким потреблением насыщенных жиров (например, пальмитиновой кислоты) [40]. Поэтому мы выбрали Palmitate (PA) в качестве индуктора для определения модели ИК-ячейки. Основываясь на данных по клеточной токсичности нашего (S3 Fig) и других [41, 42], PA-обработка при 500 мкМ в течение 16 часов могла потенциально индуцировать ИК через специфическое нарушение пути передачи сигналов инсулина при незначительной цитотоксичности. В клетках HepG2, в то время как активация Akt, опосредованная инсулином, ингибировалась PA дозозависимым образом, выражения PEPCK и G-6-Pase были значительно увеличены PA после 8-часового лечения и продолжались до 24 часов. Эти результаты показали, что сигнализация инсулина была нарушена в PA-стимулированных клетках HepG2. Эффекты PA на Akt, PEPCK и G-6-Pase были эффективно отменены TO. Эти данные in vitro были согласуются с тем, что мы обнаружили у мышей db / db. Нарушение передачи сигналов инсулина может быть отменено активацией LXR, что приводит к активации Akt и подавлению глюконеогенеза, что произошло только в инфракрасном состоянии.

Было высказано предположение, что повышенные уровни реакционноспособных видов кислорода (ROS) являются важным триггером для резистентности к инсулину [43]. Кроме того, окислительный стресс был предложен как связь между FFA и печеночной резистентностью к инсулину [44,45]. В последнее время серия клинических исследований показала, что пациенты с нарушениями обмена веществ могут получать антиоксидантное лечение путем мониторинга некоторых биомаркеров окислительного стресса в крови и тканях [46,47]. Таким образом, мы исследовали изменения уровней ROS в нашей модели мышей. По сравнению с мышами WT у мышей db / db был значительно более высокий уровень печеночной ROS и окислительной продукции (MDA) как в крови, так и в печени. К методу лечения подавляли продукцию ROS и уровень MDA у мышей db / db, сопровождающуюся резким ингибированием активации JNK и активацией Akt, но не оказывали влияния на мышей WT. Подобные результаты исследований ROS также наблюдались в нашей модели клеток HepG2: обработка PA увеличивала продукцию ROS и фосфорилирование JNK при уменьшенной активации Akt, что указывает на то, что при наличии избытка ROS был активирован JNK-путь и активирована активация Akt. Эти эффекты ПА могут быть сильно изменены путем активации LXR с использованием TO.

Чтобы определить, является ли ТО-опосредованная активация Akt и подавление JNK прямым следствием антиокислительных эффектов, мы протестировали, если N-ацетилцистеин (NAC), классический антиоксидант и широко используемый для снижения окислительного стресса [48], оказал аналогичный эффект на JNK и Akt как TO. Обработка NAC привела к эффективному подавлению продукции ROS и активации JNK, что было похоже на эффекты TO901317. Интересно отметить, что при сравнении антиокислительных эффектов TO901317 с NAC мы обнаружили, что TO901317 был более сильным. Эти результаты дополнительно подтвердили, что антиоксидантное лечение может улучшить ИР.

Как TO оказывает антиоксидантное действие? До сих пор нет отчета о том, что TO имеет любую способность или свойство напрямую воздействовать на ROS, хотя мы не можем исключить возможность того, что TO может непосредственно индуцировать антиоксидантный ген, такой как Nrf2. Основываясь на текущей литературе, мы предположили, что TO901317 может подавлять образование ROS посредством активации LXR, что регулирует экспрессию антиоксидативных генов. Действительно, мы обнаружили повышенную экспрессию двух антиоксидативных генов у обработанных TO-обработанных мышей db / db, включая Mn-SOD (Mn-супероксиддисмутазу) и связанный с NF-E2 фактор 2 (Nrf2), по сравнению с мышами контроля db / db (S4 Fig, левая панель). Повышенная экспрессия Nrf2 также наблюдалась в обработанных TO-клетках HepG2 (S4 Fig, правая панель). Поэтому вполне вероятно, что Nrf2 является одним из целевых генов активации, опосредуемой ТО-активацией LXR, что приводит к усиленной очистке ROS, хотя основной механизм еще предстоит изучить.

Nrf2, ядерный транскрипционный фактор, функционирует в транскрипционной активации нескольких антиоксидантных защитных генов, таких как HO-1, Prx I и SOD, путем связывания с их последовательностями антиоксидантного ответа (ARE). Показано, что путь Nrf2 играет критическую роль в антиоксидантном стрессе [49, 50]. Поскольку окислительный стресс является одним из основных индукторов резистентности к инсулину, можно предположить, что Nrf2 может играть регуляторную роль в пути передачи сигналов инсулина. Показано, что активация Nrf2-пути или индуцированная экспрессия Nrf2 оказывают значительное влияние на улучшение гомеостаза глюкозы и чувствительности к инсулину in vivo и in vitro [51,52]. Насколько нам известно, нет отчета о взаимосвязи между ТО и регуляцией антиоксидантных генов в печени, прямо или косвенно. Тем не менее, существуют исследования функции LXR в антиоксидантном стрессе в других органах. В одном из сообщений было показано, что мыши LXRα-KI (knock-in) индуцировали повышенную экспрессию нескольких антиоксидантных ферментов и снижение продукции ROS в легких [53]. В другом отчете показано, что активация LXRs облегчает индуцированный глюкозой окислительный стресс в клетках эндотелиальных предшественников через путь AMPK [26]. Совсем недавно было продемонстрировано, что активация LXR GW3965 (другим агонистом LXR) ослабляла сердечные дисфункции мышей db / db и редокс-расстройство у мышей с повреждением ишемии миокарда / реперфузии, частично путем снятия окислительного стресса посредством регулирования другого ключа антиоксидазы gp91phox [54, 55]. Все эти данные хотя бы частично подтверждают нашу гипотезу. С другой стороны, поскольку известно, что LXR ингибируют воспалительные реакции, мы не можем исключить возможность того, что LXR-опосредованная регуляция экспрессии цитокинов косвенно участвует в регуляции антиоксидантных генов. Поэтому, хотя наши данные могут обеспечить предварительную основу для потенциально новых терапевтических стратегий путем манипулирования активацией LXR, точная причинно-следственная связь между LXR и антиоксидантными генами заслуживает дальнейшего изучения.

Таким образом, мы представляем новый молекулярный механизм, связанный с LXR-опосредованным метаболизмом глюкозы. Наши данные демонстрируют новую роль активации LXR в регуляции реакции окислительного стресса, которые приводят к снижению гипергликемии и улучшенной резистентности к инсулину через, по меньшей мере, частично подавление образования ROS и пути JNK и активацию Akt. В нашем исследовании представлены новые свидетельства и новый молекулярный механизм для поддержки LXR в качестве перспективных терапевтических целей для развития лекарств при лечении ожирения, диабета, связанных с резистентностью к инсулину, и последующих метаболических заболеваний.

Был проанализирован средний ежедневный прием пищи каждой мыши в течение 14 дней. Между группами TO и DMSO нет изменений ни у WT, ни у db / db мышей, хотя мыши db / db потребляют в два раза больше продуктов, чем мыши WT.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Липидную панель печени измеряли как у мышей db / db, так и WT с обработкой TO или без нее с использованием набора для анализа в соответствии с инструкциями производителя (Нанкин Jiancheng научно-исследовательский институт биоинженерии, Китай). К лечению приводили к увеличению уровней печеночной ТГ и FFA у мышей db / db, но не мышей WT, по сравнению с контролем ДМСО. TO не влияло на уровни ТС у мышей WT или db / db. Результаты представлены как среднее ± SD, * P <0,05. Использовали по меньшей мере 10 мышей в каждой группе.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

PA при 750 мкМ вызывали значительное ингибирование жизнеспособности клеток через 12 часов, при этом не наблюдалось значительного изменения жизнеспособности клеток при 500 мкМ ПА до 24 часов. PA при 250 мкМ не влияли на жизнеспособность клеток в любой момент времени. Клетки HepG2 высевали в 96-луночный планшет (1 × 104 клеток / лунку), а затем инкубировали с различными концентрациями ПА (0, 250, 500, 750 мкМ) и в разные периоды времени (8, 12, 16, 24 часа). Раствор МТТ (Sigma) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 4 часов при 37 ° С. ДМСО добавляли в лунки (100 мкл / лунку) и полученный продукт формазана измеряли при 490 нм с использованием считывателя микропланшетов VersaMax ELISA (Molecular Devices). Каждый образец был трижды, и эксперименты повторяли три раза. Результаты представлены как среднее ± SD, * P <0,05 против контролей.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Выражения нескольких хорошо охарактеризованных антиоксидативных генов, как меченых, анализировали в печени мышей db / db через 2 недели до лечения (лечение ДМСО в качестве контроля) или в обработанных TO-клетках HepG2 (1,0 мкМ ТО в течение 16 часов) , Выражения Nrf2 и Mn-SOD были увеличены обработкой TO у мышей db / db (A), тогда как Nrf2, но не Mn-SOD, был усилен в клетках HepG2, обработанных пальмитатом (B). Результаты представлены как среднее ± SD, * P <0,05. Праймеры, используемые в ПЦР в реальном времени, были показаны в таблице S1.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *