Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Апоптоз, индуцируемый растворимыми олигомерами ацетил-амилоидного полипептида, нейтрализуется связанными с диабетом специфическими антителами

Apoptosis induced by islet amyloid polypeptide soluble oligomers is neutralized by diabetes-associated specific antibodies
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3940978/

Растворимые олигомерные сборки амилоидных белков, по-видимому, действуют как основные патологические агенты при нескольких дегенеративных расстройствах. Выделение и характеризация этих олигомеров является ключевым шагом на пути к определению их патологической значимости. Здесь мы описываем выделение растворимых цитотоксических олигомеров с тиреоидным рецептором типа 2 с амилоидным полипептидом; эти олигомеры индуцировали апоптоз в культивируемых клетках поджелудочной железы, пронизывали модельные липидные везикулы и взаимодействовали с клеточными мембранами после полной интернализации. Более того, антитела, которые специфически распознавали эти сборки, но не мономеры или амилоидные фибриллы, были исключительно идентифицированы у пациентов с диабетом и показали, что они нейтрализуют апоптотический эффект, вызванный этими олигомерами. Наши результаты подтверждают, что пептид IAPP человека может образовывать высокотоксичные олигомеры. Наличие антител, идентифицированных в сыворотке пациентов с диабетом, подтверждает патологическую значимость олигомеров. Кроме того, вновь выявленные структурные эпитопы также могут обеспечить новые механистические идеи и молекулярную мишень для будущей терапии.

Переход белков и пептидов в высокоупорядоченные амилоидные фибрилярные структуры связан с основными расстройствами человека, включая болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона, нарушения Прион и диабет типа 2 (T2DM) 1. С момента первого наблюдения амилоидных агрегатов более века назад было высказано предположение, что нерастворимые амилоидные отложения служат основными патологическими агентами при этих расстройствах. Это было основано на гистологических наблюдениях, указывающих на совместную локализацию дегенерации тканей и накопление амилоидов. Более того, дальнейшие генетические данные демонстрируют связь между образованием амилоидной фибриллы и дегенеративными заболеваниями, поскольку мутации, повышающие агрегацию в амилоидогенных белках и полипептидах, были связаны с семейными патологиями раннего начала234. Тем не менее, «амилоидная догма» в последние годы оспаривается несколькими исследованиями, в которых подчеркивается несоответствие между количеством амилоидных отложений и серьезностью заболевания567. В случае болезни Альцгеймера ряд исследований дали дополнительные доказательства того, что связанные с ними пептидные амилоидные β (Aβ) олигомеры на самом деле значительно более цитотоксичны, чем зрелые амилоидные фибриллы 891011. В 2006 году Ashe и коллеги продемонстрировали четкую корреляцию между когнитивным восстановлением и появлением олигомеров A k56a 56 kDa, которые были названы A56 * у модели мыши Alzheimer11. Кроме того, очистка Aβ56 * и его внутричерепное повторное введение в мозг крыс дикого типа приводили к серьезному ухудшению памяти. Ratnesh и коллеги показали, что различные амилоидогенные полипептиды подвергаются супрамолекулярным конформационным изменениям в восстановленных мембранах и образуют ионно-каналоподобные структуры с аналогичной морфологией12. Это привело к гипотезе, предполагающей, что амилоидные олигомеры повышают липидную двухслойную проводимость независимо от их последовательности, тогда как фибриллы и растворимые низкомолекулярные частицы не оказывают заметного влияния на мембраны13. Рамаморти и коллеги показали, что Aβ-пептид разрушает биологическую мембрану двухступенчатым механизмом. Сначала образуются зарядо-селективные поры, а во второй фазе эта селективность прекращается, и на мембране наблюдается диффузия как положительно, так и отрицательно заряженных молекул. Это согласуется с полной потерей физической целостности мембраны14. Эти исследования подчеркивают общий структурный мотив, наблюдаемый во всех типах амилоидных олигомеров. Учитывая структурное сходство между олигомерами и наблюдаемой общей токсичностью клеток, предполагается, что аналогичный токсический путь распространен в амилоидных олигомерах15.

В 1901 году два независимых исследователя описали феномен, называемый «гиалинизация островков» 1617, который произошел в сочетании с сахарным диабетом (ДМ), особенно у пожилых людей. Однако клиническая значимость этих наблюдений не была общепринята, поскольку это явление не наблюдалось у всех пациентов с диабетом1819. В 1986 году, спустя 85 лет после первого наблюдения, осажденный материал был успешно очищен. Амино-концевая аминокислотная последовательность выявила новое сходство последовательности пептидного обмена с семейством полипептидов кальцитонина20. Дальнейшие характеристики пептида из происхождения человека и кошки оказались полипептидом на 37 аминокислот (а.а.), обозначенным диабетом-ассоциированным пептидом (DAP) 21, ацетил-полипептидом островков (IAPP) 22 или амилином23. Связь между процессом агрегации IAPP и началом диабета типа 2 (T2DM) не совсем понятна. Тем не менее за несколько лет несколько исследований связали агрегацию IAPP с прогрессированием болезни. Стало ясно, что островковый амилоидоз может поражать менее 1% или до 80% островков диабетического индивидуума24. Возникновение островковых амилоидных отложений у недиабетических субъектов низкое, менее 15% у лиц без диабета, но относительно высокое у более чем 90% диабетических субъектов при вскрытии25. Гистологические разделы пациентов T2DM показали положительную корреляцию между амилоидными агрегатами и уменьшением массы β-клеток островков поджелудочной железы26. Более того, миссенс-мутация в гене IAPP была идентифицирована у азиатского населения и была связана с ранним наступлением и серьезностью T2DM27.

Цитотоксичность ex-vivo hIAPP была впервые описана почти 20 лет назад28. Человеческий IAPP (hIAPP), но не крысиный IAPP (rIAPP) индуцированный β-клеточный апоптоз. Более того, клеточные мембраны были украшены агрегатами hIAPP, и по причинности авторы пришли к выводу, что фибриллы hIAPP индуцируют апоптоз. Однако последующие исследования оспаривали это наблюдение и склонны к растворимым олигомерам в качестве первичных токсичных видов. Остроконечные амилоиды наблюдались также у лиц без диабета, особенно у пожилых людей29, и отсутствуют во всех островках у пациентов с T2DM30. Это также наблюдалось на диабетических моделях животных, поскольку гомозиготные трансгенные мыши hIAPP развивали тяжелый диабет из-за высокой скорости апоптоза β-клеток уже в возрасте 10 недель31. Однако внеклеточный островковый амилоид еще не наблюдался у этих мышей во время быстрой потери β-клетки в возрасте от 5 до 10 недель. У тучных гемозиготных мышей hIAPP, у которых развивается диабет в возрасте примерно 20 недель, происходит обширное образование амилоидов островков, но существует плохая корреляция между степенью амилоидов и частотой апоптоза β-клеток32. Исследования ex-vivo показали, что добавление фибриларных агрегатов hIAPP не увеличивает процент апоптозных клеток. Напротив, образцы свежевыпеченного растворенного пептида, добавленные к апоптозу клеток, индуцировали апоптоз33. Было также установлено, что у пациентов с диабетом повышенные уровни провоспалительных цитокинов, особенно интерлейкина 1β (IL-1β), который оказывает глубокое влияние на функцию клеток34. Более того, олигомеры hIAPP, но не фибриллы, были обнаружены как причина активации воспаления NLRP3, которая представляет собой белковый комплекс, который, как известно, активирует IL-1β35.

Все эти данные указывают на важную роль олигомеров IAPP в T2DM в целом и в отношении β-клеток, в частности. Идентификация и выделение растворимых олигомеров IAPP, которые участвуют в патологии заболевания, имеет решающее значение для механистического понимания индуцированного IAPP дегенеративного процесса, а также для разработки новых терапевтических агентов, которые нацелены на образование таких сборок ,

Идентификация и характеристика различных конформеров процесса самосборки является важным шагом на пути к пониманию связи между агрегационным каскадом и наблюдаемой патологией при различных связанных с амилоидами заболеваниях. Несмотря на обширную клиническую значимость процесса самосборки hIAPP в T2DM, ранние стадии ассоциации до сих пор не полностью поняты, а растворимые олигомеры не стабилизировались как отличительные сущности. Мы стремились характеризовать патологически релевантные растворимые сборки hIAPP и их связь с потерей массы β-клеток в T2DM. Как описано выше, мы искали экспериментальную установку, которая позволит наблюдать за ограниченным начальным продуктом самосборки до появления крупных амилоидных фибрилярных структур в течение значительного периода времени.

Лиофилизированный пептид hIAPP растворяли в 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле (HFIP) для устранения любых существующих супрамолекулярных структур. После выпаривания пептид ресуспендировали в 0,2 мкМ NaOH и дополнительно разбавляли в фосфатном буфере, содержащем 1% додецилсульфата натрия (SDS). SDS обычно используется как хаотропный агент; однако его можно использовать для стабилизации амилоидных олигомеров путем создания мембраноподобной среды. ЯМР-структура hIAPP, связанная с мицеллами SDS, показала преобладающую α-спиральную структуру, а не отличительный амилоидный фибриллярный β-лист36. Рамаморти и коллеги также показали, что hIAPP имеет общий перекрученный спиральный мотив, связанный с мицеллами SDS в физиологическом pH, с остатками 7-17 и 21-28 в спиральной конформации, а также спиралью 310 от остатков 33-3537, несколько группы независимо продемонстрировали, что при взаимодействии с мембранами hIAPP претерпевает переход от своего естественного разупорядоченного мономерного состояния к α-спиральной структуре. Кроме того, исследование рентгеновской кристаллографии показало, что в кристаллической структуре сплава MBP-IAPP IAPP принимает упорядоченную спиральную конформацию40. Все эти данные свидетельствуют о том, что SDS можно использовать для стабилизации растворимых подлинных конформаций hIAPP. Пептид далее разбавляли в ультрачистой воде и осаждали ледяным раствором метанола / уксусной кислоты для удаления SDS, после чего осадок ресуспендировали с помощью PBS-буфера.

Чтобы определить точный характер сформированных сборок, мы проанализировали полученные пептидные виды с использованием нескольких дополнительных методов. Во-первых, используя анализ SDS-PAGE, мы наблюдали три основных вида сборки: мономеры ~ 3,9 кДа, димеры ~ 8 кДа и тримеры ~ 12 кДа (рис. 1А). В качестве отрицательного контроля мы обработали IAPP крысы (rIAPP), который отличается шестью остатками и не самоорганизуется для образования амилоидных структур41. Действительно, как и ожидалось, мы наблюдали только мономерную конформацию в случае rIAPP (рис. 1A). Кроме того, распределение по размерам сборников hIAPP анализировали в более «нативных» условиях с использованием аналитически-быстрой жидкостной хроматографии (FPLC), выполняемой при физиологически-подобной ионной силе и рН (PBS pH 7,4). Образцы загружали в колонку исключения по размеру, а распределение по размерам вида определяли с использованием калибровочной кривой. Здесь мы снова заметили три вида, ранее обнаруженные в анализе гел, а также дополнительный вид ~ 90 кДа. Этот дополнительный конформер, вероятно, нестабилен в SDS-PAGE и разбирается с меньшими мультимерами. Хроматография не выявила доказательств для больших сборок, предполагающих, что амилоидные фибриллы или большие надмолекулярные структуры не образуются (рис. 1С). Рамаморти и коллеги продемонстрировали в исследовании DOSY NMR, что hIAPP, но не rIAPP, образует крупные олигомеры, которые не вызывают зародышеобразующую агрегацию IAPP при 4 ° C, что может отражать промежуточное промежуточное звено, как здесь показано42.

Затем олигомерные структуры hIAPP, однажды собранные, исследовали с использованием анализа связывания Тиофлавина T (ThT) для оценки их стабильности и сравнивали с hIAPP, солюбилизированным буфером PBS. IAPP-олигомеры не проявляли увеличения ThT-флуоресцентного сигнала в течение более десяти часов, что указывает на относительно стабильные конформеры, в то время как контрольная группа обнаруживала лаг-фазу около четырех часов с последующим экспоненциальным увеличением флуоресцентного сигнала (рис. 1B).

Морфологию олигомеров исследовали с использованием атомно-силовой микроскопии (АФМ) (рис. 1D). В этих экспериментальных условиях только более крупные олигомеры могли быть обнаружены, скорее всего, представляющие сборки 90 кДа, наблюдаемые в анализе исключения размера. Эксперименты AFM показали, что фибриллярные агрегаты не присутствуют, и олигомеры обладают сферической морфологией.

Анализ вторичной структуры проводили с использованием спектроскопии кругового дихроизма (CD) в дальнем УФ (200-250 нм) (рис. 1Е). Анализ CD показал преобладающую α-спиральную структуру с двумя отрицательными пиками при 222 и 208 нм. RIAPP, обработанный в идентичных условиях, показал значительное более низкое α-спиральное содержание и более высокие структуры случайной катушки. Важно отметить, что спектр CD показал, что преобладающая структура является α-спиральной, а не β-листом, что указывает на образование амилоидного волокна, появляющееся в CD-спектрах положительным пиком около 195 нм и отрицательным пиком между 215-220 нм. Несколько исследований показали, что hIAPP использует α-спиральную структуру при ее взаимодействии с биологическими мембранами3738, что указывает на важную роль этой конформации во взаимодействии с β-клетками поджелудочной железы.

Наши данные показывают, что идентифицированные растворимые конформаторы IAPP относительно стабильны и обладают уникальными физическими и структурными свойствами, которые отличает их от зрелых амилоидных фибрилл. Тем не менее, необходимо было оценить связь с этиологией болезни. Степень цитотоксичности олигомеров hIAPP в разных концентрациях в отношении клеток РИН-м поджелудочной железы оценивали путем измерения активности митохондриальной сукцинатдегидрогеназы (рис. 2А). Эксперименты по жизнеспособности клеток проводились в диапазоне концентраций 100 нМ-10 мкМ, что отражает локальную концентрацию, в которой hIAPP секретируется из гранул (~ 400 мкМ). Мы предполагаем, что этот диапазон двух порядков имеет значение для фактической концентрации посева hIAPP.

При добавлении олигомеров hIAPP (100 нМ-10 мкМ) ферментативная активность значительно снижалась. Добавление 100 нМ олигомеров hIAPP приводило к уменьшению на 40% в жизнеспособности клеток, а более высокие концентрации дополнительно приводили к зависящим от дозы уменьшению жизнеспособности клеток. Важно отметить, что добавление rIAPP при аналогичных концентрациях не приводило к значительному снижению жизнеспособности клеток.

Для дальнейшей проверки природы цитотоксической активности апоптотические и некротические маркеры анализировали с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Наблюдалось, что клетки поджелудочной железы, обработанные олигомерами hIAPP в различных концентрациях, были в основном на ранних и поздних апоптотических фазах (рис. 2C). Наблюдалась явная и сильная отрицательная корреляция между концентрацией олигомеров и жизнеспособностью клеток и положительной корреляцией с процентом апоптотических клеток в культуре (рисунок 2D).

hIAPP-олигомеры считаются токсичными в отношении клеток поджелудочной железы и, как было показано, индуцируют пермеабилизацию мембраны4344. Чтобы проверить, являются ли вновь идентифицированные конформеры токсичными, мы использовали несколько дополнительных методов. Как упоминалось выше, предыдущие исследования показали, что токсичность различных амилоидных олигомеров связана с образованием дискретных поры в биологических мембранах134445. Чтобы проверить, действуют ли олигомеры hIAPP аналогичным образом, мы использовали липосомальную систему в качестве модели клеточной мембраны. Липосомы упаковывали раствором концентрированного кальцеинового флуоресцентного красителя и инкубировали с олигомерами hIAPP (10 мкМ, 37 ° C) или rIAPP в качестве отрицательного контроля, а флуоресценцию контролировали с течением времени. Действительно, олигомеры hIAPP быстро пермеабилизировали липосомную мембрану, что привело к высвобождению флуоресцентного красителя в среду, тогда как rIAPP не проявлял никаких способностей к повреждению мембраны (рисунок 2B). Эти результаты показывают, что образование амилоидного волокна не является необходимым для разрушения мембраны с помощью hIAPP и предполагает непосредственную роль вновь идентифицированных олигомеров в качестве токсичных видов.

Флуоресцентно меченный hIAPP использовался для установления физического взаимодействия между олигомерами и β-клетками. Меченый полипептид подвергали тому же протоколу, который описан выше, в результате чего образуются идентичные олигомеры в качестве немеченого hIAPP (данные не показаны). Собранные меченые олигомеры инкубировали в течение разных периодов времени с клетками поджелудочной железы и анализировали с помощью конфокальной микроскопии (фиг. 3). Через 1-2 часа была обнаружена локализация олигомеров на клеточной мембране. За этим последовала интернализация олигомеров в цитоплазму, которая была легко обнаружена через четыре часа. Это также сопровождалось массовым снижением числа клеток. Изменения клеточной морфологии проявились через шесть-восемь часов. Эти результаты еще более подчеркивают цитотоксический эффект олигомеров и их специфическое взаимодействие и интернализацию клеток поджелудочной железы.

Чтобы исследовать клеточную локализацию олигомеров, проводили анализ изображений на живой клетке. Как показано на рисунке 4, мы наблюдали совместную локализацию некоторых олигомеров в лизосоме, в то время как другие олигомеры проявляют нелокализованное диффузионное окрашивание вдоль клеток. Это наблюдение согласуется с работой Серпелла и коллег, которые изучали локализацию олигомеров Aβ46. Аналогично между клеточной локализацией олигомера Aβ и IAPP также поддерживается общий механизм цитотоксичности для различных олигомерных агрегатов.

Затем мы рассмотрели актуальность вновь идентифицированных олигомерных структур для этиологии заболевания. Для этого мы проверили, можно ли идентифицировать специфические антитела, которые распознают сборки hIAPP, из сывороток пациентов T2DM. С этой целью антитела очищали от трех пациентов T2DM и трех здоровых лиц и сравнивали их способность обнаруживать олигомеры hIAPP. Мы использовали Dot-Blot анализ для оценки сродства очищенных сывороточных антител к олигомерам (фиг. 5A). Антитела от пациентов T2DM проявляют связывающую активность по отношению к олигомерам при более низких концентрациях по сравнению с очищенными антителами из сыворотки здоровых лиц. При концентрации 20 мкг / мл антитела, очищенные от пациентов с Т2Д, проявляли более высокую связывающую активность, чем те, которые были очищены от здоровых субъектов. Более низкие концентрации антител показали олигомеры hIAPP, связывающиеся только антителами, выделенными у пациентов с T2D, подчеркивая их специфичность (рисунок 5A). Чтобы дополнительно подтвердить эти результаты, были очищены антитела от новых образцов, десять пациентов T2DM и десять здоровых лиц (пять женщин и пять мужчин в каждой группе, таблица S1). Распознавание антител оценивали с помощью анализа на иммуноферментное пятно (ELISPOT), связанного с ферментами (фиг. 5B). Результат наглядно демонстрирует наличие антител, которые связывают растворимые конъюгаты IAPP у пациентов с диабетом, но не у здоровых людей.

Чтобы проверить, являются ли конформаторы hIAPP, распознаваемые антителами из пациентов T2DM, действительно олигомерными, анализ ELISA использовался для оценки распознавания различных состояний hIAPP (мономеров, олигомеров и фибрилярных структур). Гомогенные мономеры достигали растворением hIAPP в 0,2 мкМ NaOH после обработки HFIP и разбавлением 8 М раствором гуанидиния гидрохлорида (конечная концентрация гидрохлорида гуанидиния 7 М). Олигомеры получали по описанному выше протоколу. Фибрилярные структуры были сформированы в буфере PBS, подтвержденном с помощью ТТ-анализа и микроскопии ТЕА, и центрифугировали 60 * 103 г в течение одного часа, чтобы убедиться, что присутствует только большой агрегат. Осадок ресуспендировали в буфере PBS, количественно определяли и загружали в пластину ELISA. Как показано на фиг.5D, олигомерные виды были распознаны антителами, значительно превышающими по сравнению с другими конформерами. Эти результаты показывают, что олигомеры hIAPP встречаются in vivo во время развития T2DM. Вместе с описанными выше экспериментами они сильно влияют на основную причинную роль олигомеров hIAPP в этиологии этого заболевания.

Кроме того, мы тестировали, способны ли T2DM-ассоциированные антитела снизить цитотоксический эффект олигомеров. Примечательно, что клетки, инкубированные как с олигомерами hIAPP, так и с антителами, полученными из пациентов, показали увеличение жизнеспособности клеток дозозависимым образом; было измерено до 65% жизнеспособности клеток по сравнению с только 35% жизнеспособности клеток, которая была измерена просто с олигомерами. Отрицательный контроль с здоровыми индивидуумами, полученными антителами, не обнаружил значительных изменений в жизнеспособности клеток (рис. 5C). Эти результаты далее предполагают, что полученные T2DM антитела специфически распознают олигомеры и способны снижать токсичность вследствие физического взаимодействия с токсическими олигомерами.

В последние годы «амилоидная гипотеза» оспаривается доказательствами, связывающими ранние растворимые олигомеры с патологией, связанной с амилоидом. Соответственно, исследование растворимых амилоидных агрегатов имеет важное значение как для механистического понимания, так и для разработки новых методов лечения. Тем не менее, исследование таких конформеров является сложным, поскольку каскад амилоидных самосборных соединений представляет собой сложную сеть межмолекулярных событий, приводящую к образованию псевдостабильных конформеров с переменными размерами47.

Здесь мы представляем подход для получения растворимых олигомеров hIAPP; эти олигомеры оставались стабильными в течение значительного периода времени, тогда как hIAPP, который был солюбилизирован в стандартном протоколе, быстро агрегировался, что было продемонстрировано методом ThT. Для характеристики биофизических свойств олигомеров были применены несколько дополнительных анализов. Было обнаружено, что конформация олигомеров преимущественно α-спирально с двумя отрицательными пиками при 222 и 208 нм. Анализ распределения распределения показал четыре основных популяции: мономеры, димеры, тримеры и олигомеры ~ 90 кДа; морфология этих структур оказалась в основном сферической, без фибриллярных агрегатов. Сферическая морфология, которую используют hIAPP-олигомеры, напоминает глобулярные или кольцевые проявления, которые ранее сообщались для нескольких олигомеров амилоидных полипептидов, с образованием структур поры или кольцеобразной формы14454849. Интересно, что сферические олигомеры, а не кольцевые олигомеры, как было показано, увеличивают проводимость мембраны и индуцируют апоптоз в клеточной культуре50.

Кроме того, предыдущие сообщения показывают, что hIAPP использует спиральную структуру при ее взаимодействии с биологическими мембранами51. Гафни и коллеги сообщили, что фрагмент hIAPP 1-19, подобный пептиду полной длины; принять α-спиральную конформацию при связывании с липидными мембранами. В отличие от последовательности дикого типа, фрагмент hIAPP1-19 не образует амилоидные фибриллы даже при высоких концентрациях; при этих концентрациях фрагмент демонстрирует больший разрыв мембраны по сравнению с пептидом полной длины39. Недавно Миранкер и его коллеги изучили вариант hIAPP (L12N / N14L), который имеет тенденцию образовывать волокна β-листа, а не α-спиральные структуры. Интригующе, вариант hIAPP значительно менее токсичен по сравнению с последовательностью дикого типа51. Эти исследования подчеркивают важность изучения олигомерного альфа-спирального состояния hIAPP и его последствий для повреждения мембран и клеточной цитотоксичности. Представленные здесь олигомеры демонстрируют высокую цитотоксичность в отношении линии клеток поджелудочной железы; зависимое от дозы снижение активности клеточной митохондриальной редуктазы и повышенные апоптотические маркеры наблюдались после воздействия олигомеров. Кроме того, с использованием флуоресцентно меченных олигомеров мы наблюдали локализацию олигомеров на клеточной мембране через 1-2 часа с последующей интернализацией через ~ 4 часа. Более длительный период инкубации проявляется в изменении морфологии клеток и уменьшении жизнеспособных клеток. Взаимодействие между олигомерами и биологическими мембранами проверяли с использованием липосомного модельного анализа. Олигомеры индуцировали быструю мембранную пермеабилизацию, тогда как неагрессивный пептид rIAPP не оказывал никакого эффекта. Наши результаты подтверждают предыдущие сообщения, демонстрирующие, что амилоидные соединения взаимодействуют с клеточными мембранами, вызывая ионный поток через искусственные и клеточные липидные мембраны52. Кроме того, Glabe и коллеги показали, что амилоидные олигомеры имеют структурную и функциональную гомологию с порообразующими белками, такими как альфа-гемолизин из бактерий Staphylococcus aureus, а также перфорин человека из цитотоксических Т-лимфоцитов53.

Чтобы подтвердить патологическую значимость полученных конформеров, мы скринировали на антитела, которые распознают сборки hIAPP. Ранее обнаруженные аутоантитела были обнаружены для мишеней амилоида β54 и α-синуклеина5556. Несмотря на идентификацию антител, наблюдаются также клинические признаки заболеваний. Скорее всего, дегенеративный процесс происходит одновременно с образованием антител, что затрудняет изучение двух явлений отдельно. Производство антител, в начале прогрессирования таких многофакторных заболеваний, может указывать на то, что лучшее направление для клинического вмешательства должно быть на ранних стадиях заболеваний до того, как будет наблюдаться постоянное повреждение тканей и органов.

В целом мы исследовали 13 образцов пациентов с T2DM и 13 образцов здоровых людей. Во-первых, мы использовали точечный анализ с применением серийных разведений антител. При концентрации олигомеров hIAPP 10 мкг / мл T2DM-антитела проявляют ~ 4-кратное более высокое связывание по сравнению с антителами здоровых индивидуумов, тогда как при концентрации олигомеров hIAPP 5 мкг / мл мы наблюдали только связывание T2DM. Анализ ELISPOT проводили для точного количественного определения уровней связывания антител. В соответствии с методом точечного блоттинга антитела, полученные из T2DM, проявляли гораздо более высокие связывающие свойства, чем антитела здоровых индивидуумов.

Анализ ELISPOT также проводили с различными конформаторами hIAPP (мономеры, олигомеры и фибриларные агрегаты). Олигомеры проявляли значительно более высокую антигенную тенденцию по сравнению с другими конформерами. Наконец, мы исследовали, ослабляют ли антитела токсичность олигомеров. Действительно, антитела повышают жизнеспособность клеток дозозависимым образом, практически удваивая жизнеспособность клеток, обработанных олигомерами hIAPP, после добавления 15 мкМ антител. Специфичность T2DM-антител к олигомерным видам hIAPP и способность антител к снижению цитотоксичности hIAPP свидетельствуют о том, что олигомерные конформеры являются основным токсическим элементом, ответственным за клеточный апоптоз, наблюдаемый в поджелудочной железе во время самосборки IAPP.

Мы пытались разнообразить тестируемые образцы, насколько это было возможно, половина мужчин и половина женщин, в здоровой группе младшая — 22, а самая старая — 48, в группе T2DM — от 40 до 74 (таблица S1). Время диагностики также варьировалось с 1998 по 2010 год, мы наблюдали дисперсию между образцами, в этот момент мы не можем связать какую-либо переменную с титрами антител, необходим обширный экран для изучения корреляции между появлением антител и прогрессией заболевания, а также для определения различных факторов, влияющих на титр антител.

Наши результаты дают ясные доказательства роли олигомерных видов, а не мономерной формы IAPP, в патологическом каскаде, что приводит к гибели клеток и к потере панкреатической β-клеточной массы. Было продемонстрировано, что олигомерные сборки индуцируют апоптозную гибель клеток, вероятно, путем их взаимодействия с клеточной мембраной. Способность антител от человеческих пациентов взаимодействовать специфически с олигомерами hIAPP предполагает, что сформированные сборки, как описано здесь, представляют собой действительные эпитопы, присутствующие у пациентов с диабетом. Кроме того, способность этих антител аннулировать токсическую активность олигомерного вида открывает путь для новых терапевтических подходов для лечения потери массы β-клеток на продвинутой стадии T2DM. Недавно выделенные и охарактеризованные виды могут служить эпитопами для развития иммунного ответа при активной или пассивной иммунизации. Кроме того, эти виды могут служить в качестве простой платформы для скрининга и оптимизации соединений, которые могут влиять на токсический эффект олигомерных видов.

Синтетический пептид IAPP (Human, H-7905, Bachem, Bubendorf, Switzerland, Rat, 74-5-10A, американский пептид, Калифорния, США) растворяли в 100% HFIP, 1 мг / мл и инкубировали для полной солюбилизации при встряхивании ( 100 об / мин) при 37 ° С в течение 2 часов. HFIP удаляли аппаратом Speedvac (Эппендорф, Германия), пептид ресуспендировали в 0,2 мкМ NaOH до конечной концентрации 5 мМ и обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут в предварительно охлажденной ванне для обработки ультразвуком для обеспечения полной солюбилизации. Препарат пептида разводили в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, 10 мМ, рН 7,4), 1% SDS до конечной концентрации 600 мкМ и инкубировали в течение 4-7 часов при 37 ° С. Препарат пептида далее разбавляли в ультрачистой H2O до конечной концентрации 200 мкМ и инкубировали в течение 12 часов при 37 ° С. Продукты самосборки IAPP были проанализированы на 15% Tris-tricine PAGE и окрашены имперским белковым пятном. Олигомеры осаждали девятикратным избытком (об. / Об.) Ледяного раствора метанола / уксусной кислоты (33% метанола, 4% уксусной кислоты) в течение 1 часа при 4 ° С. Затем олигомеры гранулировали (10 мин при 16200 г), ресуспендировали в буфере PBS (10 мМ, рН 7,4). Чтобы убедиться, что SDS полностью удалена, образцы диализовали против буфера PBS в течение ночи при 4 ° C. IAPP-олигомеры были исследованы после обработки с помощью анализа PAGE и эксклюзионной хроматографии и не показали изменений в распределении по размеру.

IAPP-олигомеры получали, как указано выше (0,1 мг, 200 мкМ), загружали на колонку Superdex 75 10/300 (Amersham Biosciences, Sweden), 0,5 мл / мин, буфер PBS. Размер определяли с использованием калибровочной кривой, рассчитанной на 5 белковых стандартах (Bio-Rad. USA). Пик Deconvolution был рассчитан программным обеспечением PeakFit (SYSTAT software Inc.).

IAPP-олигомеры получали, как указано выше, после осаждения ледяным раствором метанола / уксусной кислоты и диализом против буфера PBS, сопоставление олигомеров сравнивали с пептидом hIAPP, растворенным в 0,2 мкМ NaOH (5 мМ) и дополнительно разбавляли в PBS-буфере (10 мМ рН 7,4, концентрация пептида 10 мкМ). ThT (Sigma) растворяли в PBS-буфере и фильтровали с помощью фильтра 0,22 мкМ. ThT (1 мкМ) добавляли к каждому образцу (10 мкМ), а агрегацию контролировали с течением времени с помощью считывателя Biotek Synergy (Biotek) для каждой точки данных с интервалом 5 мин, 37 ° C.

АФМ-анализ генерировали путем осаждения аликвоты в 40 мкл (концентрация 200 мкМ) на свежеотделившейся поверхности слюды. Образцы были исследованы с помощью цифрового инструмента (DI) MultiMode ™ NanoScope IV AFM с использованием кантилевера Mikromasch NSC15 / Si3N4 (резонансная частота f = 325 кГц, постоянная пружины k = 40 Н / м) в режиме нарезания резьбы.

Спектры CD были получены с использованием спектрополяриметра AVIV 202, оборудованного держателем образцов с контролируемой температурой и кюветой длиной 10 мм. Все эксперименты проводили в PBS, pH 7,4, концентрации пептидов 5 мкМ. Для экспериментов по исследованию длины волны каждый спектр представляет собой среднее значение трех сканирований. Оценка композиции вторичной структуры, полученной из спектров ультра-УФ-CD, облегчалась с использованием программного обеспечения K2d и CDNN.

Фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и фосфатидилхолин (Avanti, США) растворяли в хлороформе в концентрации 20 мг / мл в молярном соотношении 5: 3: 2 соответственно. Растворитель удаляли из образца путем выпаривания хлороформа в потоке газообразного азота в аппарате для пара ротора для осаждения тонкой липидной пленки на стенки стеклянной пробирки. Затем сухую липидную пленку регидратировали в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 40 мМ натрий кальцеина, для получения многослойных везикул (MLVs) в концентрации 40 мг / мл. Затем MLV подвергали нескольким циклам обработки ультразвуком для уравновешивания везикул буфером. Неинкапсулированный кальцеин удаляли из пузырьков через эксклюзионную хроматографию с использованием колонки HiPrep 16/60 sephacryl S-100 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Пакетированные везикулы с кальцеином были подтверждены флуоресцентными измерениями до и после добавления 1% тритона x- 100. Образцы инкубировали при 37 ° С, а за скоростью повреждения мембраны следовал анализ флуоресценции (возбуждение при разрешении 495 нм, 2,5 нм и эмиссия при 520 нм, разрез 5 нм). Измерения проводили с использованием флуориметра Jobin Yvon Horiba Fluoromax-3 (Гориба, Япония). Каждая точка представляет собой среднее значение трех независимых измерений.

Клетки Rin-m (2 × 105 клеток / мл) культивировали в 96-луночных микропланшетах (100 мкл / лунку) и инкубировали в течение ночи при 37 ° С. Человеческие олигомеры и IAPP крысы добавляли в каждую лунку при различных концентрациях и инкубировали в течение 6 часов при 37 ° С. После оценки жизнеспособности инкубационной клетки использовали анализ 3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ). Вкратце, 20 мкл 5 мг / мл МТТ, растворенного в PBS, добавляли в каждую лунку. Через 4 часа инкубации при 37 ° С в каждую лунку добавляли 100 мкл экстракционного буфера (20% SDS, растворенного в растворе 50% диметилформамида и 50% DDW (рН 4,7)], и планшеты инкубировали снова в течение ночи при 37 ° С. Наконец, интенсивность цвета измеряли с использованием считывателя пластин ELISA при 570 нм и вычитания фона при 650 нм.

Клетки Rin-m (5 × 105 клеток / мл) культивировали в течение 4 часов при 37 ° С, инкубировали с олигомерами IAPP человека (конечная концентрация 0,5 мкМ, 1 мкМ и 5 мкМ). Образцы промывали PBS-буфером и ресуспендировали с помощью 500 мкл связывающего буфера. Образцы были добавлены 5 мкл Annexin V-FITC и 10 мкл иодида пропидия (комплект для обнаружения апоптоза при приеме приекиса V-FITC, MBL). После 10 минут инкубации в темноте при комнатной температуре образцы анализировали с использованием FACS Sort (Beckton Dickinson) и результаты анализировали с использованием программы CellQuest (Beckton Dickinson). Каждое измерение повторяли три раза. FL1-H представляет собой флуоресценцию аннексина V-FITC и FL2-H представляет собой флуоресценцию йодида пропидия.

Клетки Rin-m культивировали на стеклянном покрытии, помещенном в 24-луночные микропластинки, затем инкубировали в разные периоды с флуоресцентными мечеными олигомерами hIAPP (5 мкМ) при 37 ° C, как описано в разделе экспериментов по клеточной цитотоксичности. hIAPP был помечен Lys (Hilytefluor 488) -NH2 на C-конце (Anaspec, США). После инкубации клетки промывали PBS-буфером и фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 5 минут и промывали PBS-буфером. Клетки обрабатывали 1% Triton x-100 в PBS и окрашивали 50 мкг / мл Phothoidin Tetramethyl-rhodamine B isothiocyanate (Sigma-Aldrich) в PBS, 40 минут при комнатной температуре с последующей интенсивной промывкой с помощью PBS-буфера. Клетки были отображены с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss Jena, Germany). В эксперименте с визуализацией клеток в клетке клетки Rin-m культивировали на чашке для культивирования клеток со стеклянным дном (35 мм, греоно-био-один) и инкубировали с олигомерами hIAPP-Hilytefluor 488 в течение 3 часов, митохондрии окрашивали MitoTracker® Red реагента (молекулярные зонды) в соответствии с инструкциями по изготовлению в течение 1 часа (100 нМ). Лизосомы клеток окрашивали с использованием LysoTracker® Red DND-99 (молекулярные зонды) в соответствии с инструкциями по изготовлению в течение 1 часа (50 нМ). Изображения были получены с использованием LSM 510 Meta конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Carl Zeiss Jena, Германия).

Антитела от здоровой и сыворотки пациентов с сахарным диабетом 2 типа (Bioreclamation, США) очищались колонкой с белком A (здравоохранение GE). 1 мл сыворотки человека разбавляли 1:20 загрузочным буфером (20 мМ Na2HPO4, 2 мМ NaH2PO4, pH 7) и загружали в колонку с белком A-5 мл, поток кишки собирали и повторно загружали 3 раза. Связанное антитело элюировали 0,1 М лимонной кислоты (рН 3,0) и нейтрализовали 1 М Трис-HCl (pH 9,0) для 1 мл элюата. 200 мкл Трис-буфера добавляли. Протеинсодержащие фракции объединяли, диализовали против 2-литрового буфера PBS (16 ч, 4 ° С). Концентрацию антител определяли с использованием реактива Брэдфорда (Sigma-Aldrich). Чистота антител оценивали с помощью SDS-страницы.

Признание антител оценивали методом Dot-blot и ELISA. Для Dot-blot экспериментов олигомеры hIAPP (5 мкг) были замечены на нитроцеллюлозной мембране через вакуумный коллектор. После блокирования мембраны 5% обезжиренным молоком в TBS-T (50 мМ трис, 150 мМ NaCl, pH 7,5, 0,3% твин 20) в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембрану кратковременно промывали TBS и инкубировали с очищенными антителами при нескольких концентрациях в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем мембрану промывали кратковременно TBS-T и инкубировали с HRP-конъюгированным осле-античеловеческим HRP-антителом (лаборатории Jackson immunoResearch, США). Мембрана была разработана с использованием реагентов ECL (NEN, США) в соответствии с инструкциями поставщика. Положительный контроль с кроличьим анти-IAPP-антителом (Santa Cruz Biotechnology, USA) был предварительно сформирован. Анализ ELISPOT проводили путем адсорбции олигомеров hIAPP (5 мкг) на лунки 96-луночного планшета BioTrace PVDF (PALL, США), 3 часа комнатной температуры. Скважины блокировали 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в TBS-T в течение 1 часа при комнатной температуре, планшет промывали кратковременно TBS и инкубировали с очищенными антителами (10 мкг / мл) в течение 2 часов при комнатной температуре. Пластину интенсивно промывали TBS-T и инкубировали с HRP-конъюгированным осликом против человеческого HRP-антитела (лаборатории Jackson immunoResearch, США). Связывание количественно определяли с помощью 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидинового реагента (TMB, Pierce) в соответствии с инструкцией по изготовлению.

Чтобы исследовать, какие из ассемблерных антител распознают антитела T2DM. Анализ ELISA также использовался для сравнения распознавания антител T2DM (10 мкг / мл) к различным конформаторам hIAPP, как объяснялось выше, фибриллярные структуры были образованы путем растворения hIAPP в 0,2 мкМ NaOH после обработки HFIP и разбавления буфером PBS (концентрация пептида 10 мкМ) , пептид инкубировали в течение 48 часов при 37 ° С, центрифугировали 60 000 г в течение 1 часа для подтверждения наличия только большого заполнителя. Осадок ресуспендировали в буфере PBS и количественно определяли реактивом Брэдфорда (Sigma-Aldrich), гомогенные мономеры достигали растворением hIAPP в 0,2 мкМ NaOH после обработки HFIP и разбавлением раствором 8 М раствора гуанидиния хлорида (конечная концентрация хлорида гуанидиния 7 М, пептид концентрация 10 мкМ).

Клетки Rin-m (2 × 105 клеток / мл) культивировали в 96-луночных микропланшетах (100 мкл / лунку) и инкубировали в течение ночи при 37 ° С. Человеческие олигомеры (5 мкМ) с антителами или без них добавляли в каждую лунку при различных концентрациях. Каждое измерение повторялось четыре раза; также было проведено контрольное измерение только с антителами в самой высокой концентрации, чтобы опровергнуть любое действие антител на жизнеспособность клеток. После инкубации в течение 6 часов при 37 ° C жизнеспособность клеток оценивали с использованием анализа 3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ), как описано выше.

Количественные результаты показаны как средства ± SD. Статистический анализ проводился по критерию Стьюдента между контрольными и тестируемыми группами. Значение P ≤ 0,05 считалось значительным. *, Pv ≤ 0,05, **, Pv ≤ 0,005 и ***, Pv ≤ 0,005.

Концепция и дизайн исследования: E.G., Y.B., S.G. и A.F.M. Приобретение данных: Ю. Б., И. Ю., А. А., Н. А. и Р. С. Составление рукописи и критического пересмотра: E.G., Y.B., A.F.M. и R.S. Все авторы утвердили окончательный вариант статьи.

Вспомогательная информация

Эта работа была поддержана Научным фондом Израиля (ISF), 449/11 и Программой Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP). Мы благодарим профессора Даниэля Сигала, Айялу Лампель, Авиада Левина и доктора Лихи Адлера-Абрамовича за их полезную информацию и пересмотр рукописи. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить лаборатории Gazit и Segal за полезные обсуждения и комментарии.

(а) анализ вестерн-блоттингом в невосстанавливающих условиях олигомеров IAPP человека и отрицательный контроль неамилоидогенного крысиного IAPP. (b) Анализ стабильности олигомеров, олигомеры hIAPP осаждали диализом против буфера PBS и инкубировали при 37 ° C ассоциацию олигомеров контролируется ThT-анализом и сравнивается с hIAPP, растворенным в PBS-буфере. (c) Эксклюзионная хроматография (Superdex 75 10/300, буфер PBS, pH 7,4) олигомеров hIAPP; I-мономер, I-димер, III-тример и олигомер IV-90 кДа. (d) Изображения атомной силовой микроскопии (AFM) олигомеров ~ 90 кДа, шкала AFM 600 нм. (д) CD-спектроскопия hIAPP и rIAPP, концентрация белка 5 мкМ. Каждый спектр представляет собой среднее значение трех измерений.

(а) Rin-m-клетки, обработанные олигомерами hIAPP (серые) или с rIAPP (черный) в различных концентрациях. Жизнеспособность клеток оценивали по методу восстановления MTT (* P <0,05, ** P <0,005). (b) Утечка красителя из кальцеина, содержащего липосомы. 1 мкМ олигомеров hIAPP (зеленый прямоугольник) или rIAPP (синий ромб) инкубировали с липосомами, а повреждение мембраны оценивали с помощью повышенной флуоресценции (возбуждение: 495, эмиссия: 520) и сравнивали с контрольной группой (красный квадрат). (c) Результаты FACS инкубации клеток Rin-m с олигомерами hIAPP в разных концентрациях. Для обнаружения апоптозных клеток использовался набор для обнаружения апоптоза приюта V-FITC. FL1-H представляет собой флуоресценцию V-FITC, а FL2-H представляет собой флуоресценцию V-PE в пристройке. I-клетки в некротическом состоянии, II-концевое апоптотическое состояние, III-раннее апоптотическое состояние и IV-жизнеспособные клетки (d) Диаграмма представления дисперсии состояния клеток из трех анализов анализа FACS, как представлено на рисунке 2C, темно-серая колонка представляет жизнеспособные клетки , светло-серая колонка представляет собой ранние и поздние апоптотические клетки, а черный столб - некротические клетки.

Конфокальные микроскопические изображения клеток Rin-m, инкубированных с 5 мкМ олигомеров hIAPP-Hiytelfluor 488, клетки окрашивали фаллоидином-тетраметилдородом. Инкубацию готовили в течение одного часа (I), два часа (II), четыре часа (IV) и восемь часов (VIII). Через час наблюдали локализацию олигомеров hIAPP к мембране клеток с последующим введением в клеточную цитоплазму и изменением морфологии клеток при более длительных временах инкубации.

Живые конфокальные микроскопии изображений клеток Rin-m инкубировали 5 мкМ олигомеров hIAPP-Hiytelfluor 488 в течение 3 часов (зеленый), Lysosome окрашивали с использованием реагента LysoTracker (красный), митохондрии окрашивали с использованием MitoTracker (красный). Как показано, некоторые олигомеры наблюдались для локализации в лизосоме (белый), в то время как другие показали диффузионный рисунок вдоль клетки.

(а) Очищенные антитела из сыворотки пациентов с диабетом типа 2 и здоровых людей (N = 3) сравнивали с распознаванием олигомеров hIAPP (5 мкг) методом точечного блоттинга с помощью серийных разведений очищенных антител. (б) Очищенные антитела из сыворотки диабета типа 2 (оранжевые колонки) и здоровые люди (серые столбцы, N = 10) распознавание олигомеров hIAPP (5 мкг) сравнивали с помощью ELISPOT-анализа. (c) Клетки Rin-m, обработанные олигомерами hIAPP (серые) с или без диабета типа 2 (оранжевый) или здоровые (синие) очищенные антитела в различной концентрации, были исследованы на жизнеспособность методом МТТ-восстановления и сравнивали с необработанными клетками , Бокс-графики, показывающие статистические распределения жизнеспособности клеток после лечения (размер коробки представляет собой SD, черные круги — среднее значение, горизонтальная линия — средняя, ​​а верхняя и нижняя звездочки — 99 и 1 процентиль соответственно) *** P < 0,0001. (d) Признание антител к диабету типа 2 различных конформаторов hIAPP было исследовано с помощью анализа ELISPOT (фибриллы в синих колонках, мономеры в красных колонках и олигомеры в зеленых колонках).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *