Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Вырождение ганглиозных клеток сетчатки у диабетических собак и мышей: связь с гликемическим контролем и дегенерацией капилляров сетчатки

Degeneration of retinal ganglion cells in diabetic dogs and mice: Relationship to glycemic control and retinal capillary degeneration
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3695756/

Последние два автора внесли одинаковый вклад в эту работу

Цель этого исследования состояла в том, чтобы исследовать (i) влияние диабета на гибель клеток сетчатки у диабетических собак и мышей, (ii) влияние длительного гликемического контроля на вызванную диабетом гибель клеток ганглиона сетчатки, (iii) гибель ганглиозных клеток при диабете связана с дегенерацией капилляров сетчатки и (iv) влиянием диеты на индуцированную диабетом дегенерацию клеток ганглиона сетчатки у мышей.

Диабет был вызван у собак с использованием стрептозотоцина, а уровни гликемического контроля (хорошие, умеренные и бедные) поддерживались в течение 5 лет. Диабет изучался в двух моделях мыши (диабет, индуцированный у мышей C57Bl / 6J с использованием стрептозотоцина и спонтанно диабетических мышей Ins2Akita). Гистологическую гибель клеток сетчатки исследовали путем подсчета количества аксонов из ганглиозных клеток в зрительном нерве и с концевой трансферазной дезоксиуридинтрифосфатной меченой маркировкой и аннексина V, окрашивающегося на мышах.

Как сообщалось ранее, развитие и тяжесть сосудистых поражений диабетической ретинопатии у диабетических собак были сильно связаны с гликемическим контролем. Потеря ганглиозных клеток сетчатки была обширной у собак, содержащихся в плохом гликемическом контроле, и была существенно предотвращена у диабетических собак, содержащихся в хорошем гликемическом контроле за 5 лет обучения. Напротив, «умеренный» гликемический контроль (промежуточный между слабым и хорошим гликемическим контролем) вызывал значительное увеличение сосудистой патологии, но не вызывал потери аксонов сетчатки в зрительном нерве. Используя этот валидированный метод подсчета аксонов зрительного нерва, две мышиные модели диабетической ретинопатии были изучены для оценки гибели ганглиозных клеток. Несмотря на 10-месячный диабет (продолжительность, которая, как было показано, вызывает дегенерацию капилляров сетчатки в обеих моделях), ни одна из моделей мыши не показала потерю аксонов зрительного нерва (таким образом, предполагая отсутствие потери ганглиозных клеток сетчатки). Аналогичным образом, другие параметры клеточной гибели (терминальная трансфераза дезоксиуридинтрифосфат-ник-концевая маркировка и аннексин V-маркировка) не предполагали гибели клеток ганглия у мышей с диабетом C57Bl / 6J, а гибель ганглиозной клетки не увеличивалась с помощью другой коммерческой диеты.

Гибель клеток сетчатки у диабетических собак значительно ингибируется хорошим или даже умеренным гликемическим контролем. Вывод о том, что диабетические собаки при умеренном гликемическом контроле имели заметное сосудистое заболевание без явной дегенерации клеток ганглия сетчатки, не подтверждают постулата о том, что нейронная дегенерация вызывает сосудистую патологию. Исследования диабетических мышей в нашей колонии снова не могут найти доказательства гибели клеток ганглия из-за длительного диабета у этого вида.

Диабет уже давно признан повреждающим сосудистой сетчаткой, но теперь признано участие нейронов сетчатки. Имеются данные о том, что по меньшей мере некоторые ганглиозные клетки сетчатки (RGCs) теряются у пациентов с диабетом (обобщены в [1]), а доказательства, подтверждающие потерю RGC во время диабета, сильны в моделях с диабетическими крысами [2-13]. Сообщалось, что дегенерация RGC начинается в начале после начала диабета у крыс, и поскольку эта нейродегенерация, по-видимому, предшествует дегенерации капилляров сетчатки при диабете, предположили, что нейродегенерация способствует капиллярной дегенерации [5]. Эта постулированная связь между нейронными и сосудистыми поражениями диабетической ретинопатии еще не проверена до настоящего времени.

Было показано, что улучшенный гликемический контроль препятствует развитию сосудистых нарушений, которые используются для характеристики клинической ретинопатии, и для ингибирования прогрессирования к угрожающей видению ретинопатии [14-18]. Влияние улучшенного гликемического контроля на нейродегенерацию при диабетической ретинопатии ранее не оценивалось.

Не менее ясна ли нейродегенерация в РГК мышей. Сообщалось о дегенерации RGC у мышей C57Bl / 6 с химически индуцированным диабетом и спонтанным диабетом [19-24], но другие не смогли подтвердить эти данные [9,25-29].

Поскольку каждый РГК имеет один аксон в оптическом нерве, количественное определение количества аксонов в зрительном нерве использовалось для количественного определения количества РГК в нескольких исследованиях. В образцах от диабетиков собак в течение 5 лет мы используем этот метод для оценки (i) влияния гликемического контроля на дегенерацию РГК и (ii) возможной зависимости между дегенеративными поражениями в нервных и сосудистых клетках при диабетической ретинопатии. Кроме того, мы используем тот же метод подсчета аксонов (а также другие методы) для дальнейшего изучения того, приводит ли диабет к потере RGC у мышей.

Экспериментальных животных лечили в соответствии с заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.

Молодым взрослым собакам (1,5-2,5 года) случайным образом назначали диабетик с аллоксаном или оставаться в качестве необработанных контрольных животных. Диабет был вызван у голодных собак путем внутривенной инъекции моногидрата аллоксана (50-60 мг / кг), которые случайным образом были назначены на одну из трех проспективно идентифицированных диабетических групп (плохой гликемический контроль, умеренный гликемический контроль, хороший гликемический контроль) или остаться как недиабетический контроль. У животных с плохим контролем было дано достаточно всего инсулина, чтобы свести к минимуму потерю веса, но недостаточно для предотвращения хронической гипергликемии, тогда как животным, назначенным для хорошего контроля, давали достаточное количество инсулина (два раза в день) для нормализации уровня глюкозы в крови. Уровни гипергликемии в умеренной гликемической контрольной группе умышленно поддерживались между слабым и хорошим гликемическим контролем. Эти животные были частью исследований по диабетической ретинопатии, ранее опубликованной в сотрудничестве с Р. Л. Энгерманом [15,30,31]. Методы, по которым достигались и поддерживались различные уровни гликемии, были опубликованы в этих предыдущих отчетах, но включали пищу и инсулин (собаки в хорошей гликемической контрольной группе получали только количество пищи, которую недиабетические собаки ели, плюс адекватный инсулин для нормализации уровня сахара в крови, собак в бедной гликемической контрольной группе получали пищу ad libitum и субнормальные количества инсулина, собаки в умеренной гликемической контрольной группе получали пищу ad libitum плюс такое же количество инсулина, что и собаки в хорошем гликемическом контроле). Гемоглобин A1c суммируется в долгосрочном средстве гликемического контроля. Сосудистая патология у этих животных (сообщенная ранее) воспроизводится здесь для сравнения с новыми данными о нейродегенерации сетчатки. В настоящий отчет включены четыре собаки на экспериментальную группу, и все собаки были убиты (анестезированы 1 мл / кг массы тела внутривенного Нембутала с последующим удалением сердца) после пяти лет исследования.

Изучались две модели грызунов диабета (диабет, вызванный стрептозотоцином, и спонтанный диабет у мышей Ins2Akita). Диабет был индуцирован у 8-недельных самцов мышей C57BL / 6J (число штаммов 000664, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, n = 5) с пятью серийными интраперитонеальными инъекциями стрептозотоцина (STZ, 55 мг на кг веса тела, растворенными в цитратный буфер). Через 1-2 недели диабет был подтвержден тремя измерениями уровня глюкозы в крови натощак> 275 мг / дл. Для мышей Ins2Akita (C57BL / 6-Ins2Akita / J (штамм 003,548), Лаборатория Джексона) диабет развился спонтанно у самцов мышей (n = 11) из-за мутантного гена инсулина 2 (JAX Communication, No. 5, Mar 9, 2000). Модель STZ относится к диабету типа 1, тогда как модель Ins2Akita показывает резистентность к инсулину, характерную для диабета 2 типа [32]. Вес тела контролировали два раза в неделю, а мышам вводили инсулин, если была обнаружена какая-либо потеря веса. Глицидный гемоглобин (GHb) и уровень глюкозы в крови регулярно измерялись на протяжении всего периода исследования. Всех животных кормили диету Harlan TekLad 7004, за исключением группы диабетиков и их контролей, которые получали диету (№ 8604), которые использовались другими исследователями [33], которые обнаружили значительную гибель RGC у мышей с диабетом C57Bl / 6J. В качестве контролей служили недиабетические мыши C57BL / 6J (n = 9). Некоторые животные были убиты (обезболиваются 1 мл / кг массы тела внутривенного Нембутала с последующим удалением сердца) через 10 ± 1 месяца диабета, а другие (для исследований диеты) после 2 месяцев диабета.

После удаления зрительные нервы собаки и мыши фиксировали в течение ночи в изотоническом растворе 20% параформальдегида и 2,5% глутаральдегида. После полоскания обработка продолжалась с использованием 3% ферроцианида калия и 2% водного раствора тетраоксида осмия в течение 2 часов. После обезвоживания в градуированной серии спиртов и оксида пропилена в EPON были встроены нервы. Затем срезы толщиной в один микрон разрезали на ультрамикротом Ultracut E microtome (Reichert-Jung, Depew, NY) около 4 мм в глубине земного шара и окрашивали 1% фенилендиамина в метанольном растворе для окрашивания миелиновых оболочек нервов , что позволяет их последующей визуализации. Для электронного микроскопического анализа были созданы тонкие срезы.

Слайды просматривались на микроскопе Olympus BX-60 (Olympus, Токио, Япония, с использованием 40-100 × NA 0,75 целей и оптики DIC для увеличения контраста). Калиброванные изображения были собраны с помощью камеры SPOT RT Slider (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). Приблизительно 100 изображений были необходимы для покрытия области всего зрительного нерва собаки. Отдельные изображения были сшиты вместе в Adobe Photoshop, используя функцию автосекретаря для создания составного изображения всего поперечного сечения зрительного нерва. Затем это составное изображение было проанализировано с использованием программного обеспечения для обработки изображений MetaMorph (Molecular Devices, Downington, PA). Сначала была рассчитана площадь всего зрительного нерва. Из-за большого количества аксонов в собачьего зрительного нерва использовали отбор проб, и 35% -45% от общего количества аксонов в каждом нерве систематически собирались и количественно определялись. Для мышей подсчитаны все аксоны. Диаметры и плотность Axon определяли с использованием программного анализа расширенных нервов, окрашенных фенилендиамином. Программное обеспечение идентифицировало аксоны, подсчитало площади аксонов и подсчитало количество и плотность аксонов.

Электронные микрофотографии были захвачены на просвечивающем электронном микроскопе JEOL-JEM 1200 TEM (JEOL, Tokyo, Japan) с разрешением 1200 ×. Полученные негативы были сканированы на сканере Techtronic для планшетов, чтобы оцифровать их. После оцифровки изображения обрабатывались аналогично оптическим изображениям выше.

Сечения сетчатки (фиксированные в 10% забуференном формалине, внедренные в парафин и секционные) окрашивались для реакции концевой трансферазной дезоксиуридинтрифосфатной никелевой маркировки (TUNEL) (набор для определения смертности in situ Cell, флуоресцеин, Roche, Mannheim, Germany ). Для каждого анализа один участок обрабатывали ДНКазой (50 U / 100 мкл) в течение 10 мин, чтобы фрагментировать ДНК в качестве положительного контроля. Количество TUNEL-положительных ядер подсчитывалось в ретинальном разрезе. Количество TUNEL-положительных клеток в диабетических группах сравнивали с количеством в контроле с недиабетическим возрастом. Анализ TUNEL проводился в двух разных случаях (каждый из них давал аналогичные выводы), а также на задней сетчатке и средней сетчатке.

Этот метод основан на методе, о котором сообщалось ранее [34]. Анестезированных мышей интравитреалировали 1 мкл аннексина V, конъюгированного с Alexa-флюором 488 в обоих глазах. Через час после инъекции мышей подвергали эвтаназии, как описано выше, и глаза собирали для анализа. Для положительного контроля была проведена окулярная ишемия (1 час) с последующей реперфузией (24 ч) для индуцирования апоптоза в клетках ганглиона сетчатки [35]. Ретины были отображены в трехмерных графиках, полученных с помощью конфокальной микроскопии спиннинга.

Сеть сосудистого канала сетчатки от мышей диабетика в течение 10 месяцев была выделена из фиксированной формалином ткани с использованием методики переваривания трипсина [27,29,36]. Аллельные капилляры определяли количественно в четырех-семи областях поля средней сетчатки (увеличение 200X) в масках. Ацеллюлярные капилляры были идентифицированы как трубки сосудов капиллярного размера, не имеющие ядер по всей их длине, и сообщалось на квадратный миллиметр площади сетчатки.

Все результаты выражаются как среднее ± стандартное отклонение (SD). Группы сравнивались с помощью анализа дисперсии (ANOVA), а затем после Focore-теста. Различия считались статистически значимыми при p <0,05.

Как сообщалось ранее, диабетические собаки поддерживались на перспективных уровнях гликемического контроля в течение 5 лет. Капиллярная гистопатология (микроаневризмы, капиллярная дегенерация, потеря перицита) была пропорциональна гликемическому контролю, а животные с плохим гликемическим контролем проявляли значительно большую патологию, чем другие группы. Напротив, хороший гликемический контроль оказал явное положительное влияние на тяжесть вызванного диабетом сосудистого заболевания сетчатки. В таблице 1 приведены ранее опубликованные клинические данные и параметры сосудистого заболевания (перициты призраков и микроаневризмы) у этих собак, а на рисунке 1 (слева) суммируется капиллярная дегенерация у тех же животных. Эти ранее опубликованные данные о гликемии и сосудистой патологии были объединены из нескольких публикаций [15,30,31], проанализированы вместе и представлены здесь, чтобы обеспечить легкое сравнение с данными о нейродегенерации.

a Данные в этой таблице и Рисунок 1 представлены ранее опубликованными исследованиями [15,30,31] и были объединены, пересчитаны и переформатированы. Copyright 1987, 1993 и 2001 гг. Из Diabetes®, том 36, 1987; 898-812, том 42, 1993; 820-825 и Vol 50, 2001; 1636-1642. Перепечатано с разрешения Американской ассоциации диабета. * В отличие от недиабетической при р <0,01

Влияние гликемического контроля на дегенерацию капилляров и ганглиозных клеток сетчатки у собак. У собак, страдающих диабетом в течение 5 лет, капиллярная дегенерация прогрессивно повышалась при гликемическом контроле, тогда как дегенерация ганглиозных клеточных аксонов сетчатки в зрительном нерве не наблюдалась. A: вырожденные (бесклеточные) капилляры увеличиваются по мере ухудшения гликемического контроля (данные в этой таблице взяты у животных в ранее опубликованных исследованиях и были объединены и повторно проанализированы [15,30,31]). B: Напротив, дегенерация аксонов в зрительном нерве собаки не коррелирует линейно с гликемическим контролем. Группы: N, недиабетические; D GC, диабетический хороший гликемический контроль; D MC, диабетический умеренный гликемический контроль; D, диабетическое плохое гликемическое управление ». N = 4 на группу. Данные сообщаются как среднее ± SD.

Влияние гликемического контроля на индуцированную диабетом дегенерацию РГК ранее не рассматривалось. Основным параметром, рассмотренным в этом исследовании, была средняя плотность аксонов. Пять лет плохого гликемического контроля привели к значительной потере аксона в зрительном нерве (и, предположительно, также к сетчатке ганглиозных клеток, p <0,01 по сравнению с недиабетической) у диабетических собак (таблица 2 справа и рис. 2). Данные показывают, что 5 лет плохого гликемического контроля привели к потере около 40% всех РГК по сравнению с несогласованными по возрасту собаками. Напротив, хороший гликемический контроль над этим 5-летним исследованием привел к полному сохранению аксонов (р, не значимых по сравнению с недиабетическими животными). Пять лет умеренного гликемического контроля, который, тем не менее, был достаточно серьезным, чтобы вызвать значительное увеличение сосудистой патологии (табл. 1 и рис. 1), не вызывало значительной потери аксонов сетчатки в зрительном нерве. Плотность аксонов в умеренной гликемической контрольной группе существенно не отличалась от недиабетического или хорошего гликемического контроля (p = 0,99 и 0,37 соответственно), но значительно отличалась от плохого гликемического контроля (p = 0,012). Не было отмечено существенных различий в размерах отдельных аксонов (данные не показаны).

* В отличие от недиабетической при p <0,01 † В отличие от диабетиков при плохом гликемическом контроле при ≤0,01

Влияние гликемического контроля на зрительные нервы собаки, как показано с помощью оптической микроскопии. Существует обширная потеря аксонов только у животных с низким гликемическим контролем в течение 5 лет. На панели А изображен репрезентативный образ недиабетической собаки. Изображения B, C и D относятся к представительной собаке с хорошим гликемическим контролем, умеренным гликемическим контролем и плохим гликемическим контролем соответственно. Шкала шкалы = 50 мкм.

Используя морфометрический метод подсчета аксонов, подтвержденный в собачьих исследованиях, мы попытались определить, были ли у акцепторов зрительного нерва (и ганглиозные клетки) потеряны у диабетических мышей. Изучали два штамма мышей: мышей C57Bl / 6J, в которых диабет был индуцирован с использованием токсина В-клеток, стрептозотоцина (STZ) и спонтанно диабетических мышей Ins2Akita. Обе группы диабетических животных были сравнительно гипергликемическими (GHb = 11,0 ± 0,6 и 10,9 ± 0,6 для STZ-диабета и Ins2Akita соответственно, по сравнению с 3,4 ± 0,3 для недиабетических контролей). Продолжительность диабета в обеих моделях составляла 10 месяцев. Диабет продолжительностью 10 месяцев не приводил к потере аксонов зрительного нерва (по оценке плотности аксонов) в модели STZ (таблица 3 и рисунок 3) в соответствии с нашими предыдущими исследованиями мышей с диабетом C57Bl / 6J [26-28]. Аналогичным образом, прямой подсчет аксонов с помощью электронной микроскопии не выявил потери аксонов у мышей диабетиков C57Bl / 6J в течение 10 месяцев. Был исследован размер отдельных аксонов, но существенных различий не было отмечено (не показано).

Диабетические и недиабетические мышиные зрительные нервы. A, B и C показывают электронные микрофотографии диабетических и недиабетических мышечных зрительных нервов. Между группами не наблюдалось различий в плотности аксонов. Экспериментальные группы, упомянутые на этом рисунке: A; Недиабетический (N), B; Диабетическая-STZ (D STZ) и C; Диабетик-Ins2Akita (D Ins2Akita). Шкала шкалы = 10 мкм.

Поскольку другие сообщали о свидетельствах апоптоза RGC, индуцированного диабетом у мышей C57Bl / 6 даже при гораздо более коротких продолжительности диабета [19,23,24], мы также оценивали смерть RGC с использованием двух дополнительных методов. Первый был путем инъекции меченого флуоресцеином изотиоцианата аннексина V в стекловидное тело недиабетических и диабетических мышей C57Bl / 6J [34], а второе — путем подсчета TUNEL-положительных клеток в поперечных сечениях сетчатки [26]. Несмотря на то, что оба метода показали, что повреждение ишемии / реперфузии (положительный контроль) вызвало смерть RGC (показано демонстрацией многочисленных положительно окрашенных РГК у мышей [не показано]), ни одна из этих методик не продемонстрировала никаких различий в количестве клеток апоптоза ганглия между длинными -термические диабетические мыши и недиабетические мыши. Количество V-позитивных клеток аннексина в слое RGC составляло 12,2 ± 11,2 и 10,0 ± 5,4 в диабетической и недиабетической группах соответственно и 0,0 ± 0 и 0,1 ± 0,1 TUNEL-положительных клеток в слое RGC соответственно (7004 диета ). Чтобы оценить возможный эффект диеты на нейродегенерацию, мы также рассмотрели другую диету с более низким уровнем антиоксидантов. Данные для мышей, которым кормили диету 8664 для 2-месячного исследования, также не показали увеличения клеточной смерти у диабетических животных (не показано). Этот очевидный недостаток нейродегенерации в обоих штаммах диабетических мышей контрастирует с вызванным диабетом значительным увеличением дегенерированных капилляров, наблюдаемых в сетчатке животных (рис. 4).

Сравнение влияния тяжелого диабета на дегенерацию капилляров сетчатки и клеток ганглиона сетчатки у диабетических мышей. C57Bl / 6J мышей с диабетом в течение 10 месяцев демонстрируют капиллярную дегенерацию (A), что подтверждается значительным увеличением клеточного капиллярного образования у мышей, сделанных диабетиком со стрептозоцином (D STZ, n = 5) и спонтанно диабетическими мышами Ins2Akita (D Ins2Akita; n = 11) по сравнению к недиабетическим средствам управления (N; n = 9). Никакая потеря аксонов из зрительного нерва не наблюдалась между любыми диабетическими животными по сравнению с недиабетическим контролем, поэтому не было доказательств потери ганглиозных клеток сетчатки (B).

Клинически очевидные изменения в сосудистой сети сетчатки при диабете привели к общему предположению, что ретинопатия является исключительно микрососудистым заболеванием. Было обнаружено, что развитие сосудистых поражений тесно коррелирует с гликемическим контролем с более низким гликемическим контролем, что значительно увеличивает тяжесть и скорость развития сосудистой патологии у животных [14,15,17] и у пациентов [16,18]. Однако эффект гликемического контроля на нейронную анатомию сетчатки при диабете ранее не сообщался. В настоящем исследовании количество аксонов в зрительном нерве было количественно оценено для оценки влияния диабета и гликемического контроля на количество ганглиозных клеток в сетчатке (поскольку каждая ганглиозная клетка имеет один аксон в зрительном нерве). Эти исследования показали, что у собак с самой бедной гликемией (самые высокие уровни глюкозы в крови) было меньше аксонов в зрительном нерве. И наоборот, диабетические собаки, содержащиеся в лучшем гликемическом контроле, были защищены от индуцированной диабетом дегенерации ганглиозных аксонов. Таким образом, потеря аксонов при диабете происходит не из-за «токсического» воздействия химических веществ на индуцирование диабета, так как потеря аксонов может быть ингибирована хорошим гликемическим контролем. Аксоны в зрительном нерве и микрососудах реагируют аналогично гликемии, по крайней мере, на двух крайностях гликемии.

У собак с умеренным гликемическим контролем развилась тяжесть сосудистой патологии, которая была промежуточной между тем, что было обнаружено у собак при хорошем и плохом гликемическом контроле. Удивительно, но умеренная гликемическая контрольная группа не показала потери аксонов, что указывает на нейродегенерацию, хотя диабет вызвал статистически значимое увеличение числа вырожденных капилляров в сетчатке. Фактически, плотность аксонов в зрительном нерве собак с умеренным гликемическим контролем имела плотность аксонов, аналогичную плотности у недиабетических животных. Так как собаки с умеренным гликемическим контролем развивали статистически значимое увеличение капиллярной дегенерации без явной дегенерации RGC, это открытие не подтверждает постулат о том, что нейронная дегенерация вызывает сосудистую патологию. По-видимому, RGC более устойчивы к неблагоприятным последствиям нарушения гликемического контроля, чем клетки сосудистой сети сетчатки, по крайней мере, при умеренных уровнях гипергликемии. Следует ли определять сосудистые и нейронные поражения диабетической ретинопатии различными механизмами, но настоящие исследования повышают это как возможность.

Основываясь на успехе использования метода подсчета аксонов в модели собаки, мы использовали этот метод для пересмотра споров, связанных с потерей RGC у мышей C57Bl / 6J. В предыдущих исследованиях мышей с диабетом C57Bl / 6J не обнаружено обнаруженных потерь RGCs исследователями ранее в поперечном сечении сетчатки, где мыши были диабетическими на срок до 1 года [9,25-29], тогда как другие, использующие один и тот же штамм, сообщали что всего лишь 14 недель диабета было достаточно, чтобы обнаружить значительное снижение количества клеток в слое клеток ганглия по сравнению с таковым у неангулируемых мышей с возрастом [19,23,24]. Используя оптические и электронные микроскопические методы анализа мышечных оптических нервов, мы не смогли увидеть никаких признаков диабета, вызывающих гибель клеток RGC у мышей C57Bl / 6J в настоящем исследовании. Аналогично, у диабетических мышей Ins2Akita также сообщалось о дегенерации RGCs, вызванной диабетом [20,21], что мы не смогли подтвердить в настоящем исследовании диабетиков животных в течение 10 месяцев. Для дальнейшего изучения нашего вывода о том, что диабет не увеличивал смертность RGC у мышей C57Bl / 6J, мы также использовали интравитреальное аннексин V-маркировку и окрашивание TUNEL для обнаружения умирающих клеток в сетчатке. Аналогичным образом, ни один из методов не показал никаких доказательств апоптоза RGC в сетчатке у мышей с диабетом C57Bl / 6J, даже несмотря на то, что контроль реакции четко показал, что методы работают надлежащим образом. Кроме того, мы рассмотрели возможность того, что различия в экспериментальных диетах, подаваемых животными, могут влиять на гибель клеток ганглиона сетчатки, вызванную диабетом. Мы сравнили нашу диету с другой диетой, ранее использовавшейся другими, кто обнаружил индуцированный диабетом апоптоз RGCs [33], но обнаружили, что ни одна диета не увеличивала апоптоз RGC при диабете, что указывает на то, что диета не является причиной споров. Разница в индуцированной диабетом нейродегенерации между лабораториями может быть частично объяснена недавним нахождением мутации, связанной с дегенерацией сетчатки (мутация rd8) в некоторых субстратах мышей C57Bl / 6, но не в других [37]. Подструктура, которую мы использовали (C57Bl / 6J), не содержит мутации rd8.

Настоящие результаты показывают различия в эффектах плохого гликемического контроля диабета при потере RGC между собаками и мышами C57Bl / 6J. Диабетические мыши были, по меньшей мере, гипергликемическими, как диабетические собаки, что указывает на то, что кажущееся отсутствие нейродегенерации у мышей не было связано с различиями в степени тяжести гипергликемии. Наиболее очевидным различием между исследованиями мышей и собак является продолжительность диабета. Взаимодействие между степенью тяжести и продолжительностью гипергликемии было признано для развития диабетических осложнений в течение нескольких десятилетий. Однако, кроме того, информация о молекулярных различиях в РГК между собаками и мышами недостаточна для дальнейшего изучения этого вопроса в настоящее время.

Настоящие исследования были ограничены нейродегенерацией, но диабет-индуцированная дисфункция нейронов сетчатки, вероятно, предшествует дегенерации и может в значительной степени способствовать зрительной дисфункции, которая развивается у некоторых пациентов с диабетом. Таким образом, фокус, относящийся к РГК при диабете, не должен ограничиваться дегенерацией.

В заключение наши данные у диабетических собак демонстрируют положительное влияние гликемического контроля на сохранение аксонов зрительного нерва (и, предположительно, RGCs), но также показывают явную диссоциацию между восприимчивостью сосудистой сети сетчатки и нейронами к дегенерации при уровнях гликемии между белыми гликемии и хорошего гликемического контроля. Будет информативным, чтобы определить, изменяется ли нейрососудистая связь относительно функции при диабете. Подсчет аксонов в зрительном нерве не указывает на вызванную диабетом потерю RGCs у мышей C57Bl / 6J с химически индуцированным диабетом или спонтанно диабетическими мышами Ins2Akita.

Эта работа финансировалась грантами NLW и TSK из Исследовательского фонда по делам несовершеннолетних (JDRF), NLW (NIH R01AR055508, R01AR063437, R01AR039750) и TSK (NIH R01EY00300). Эта работа была поддержана также Исследовательскими центрами Университета Визуальных Наук (VSRC) и Кожных заболеваний (SDRC) Case Western Reserve (P30-EY11373 и P30-AR039750). Авторы хотели бы поблагодарить г-жу Эрику Кинан за техническую помощь, г-жа Жанетт Киллиус в NEOUCOM за руководство с EM и медицинскую лабораторию Университета Case Western Reserve EM Core за их вклад и технический опыт.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *