Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Продвинутые конечные продукты Glycation являются прямыми модуляторами функции β-соты

Advanced Glycation End Products Are Direct Modulators of β-Cell Function
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3178291/

Избыточное накопление передовых конечных продуктов гликирования (AGE) способствует старению и хроническим заболеваниям. Мы стремились получить доказательства того, что воздействие AGE играет роль в развитии диабета 1 типа (T1D).

Эффект AGE был исследован на секрецию инсулина клетками MIN6N8 и островками мыши и in vivo в трех отдельных моделях грызунов: мыши с эмбриональным или высокомолекулярным гелем Sprague-Dawley с аутоиммунным гелем и небезным диабетиком (NODLt). Грызунов также лечили с помощью AGE-понижающего агента alagebrium.

β-клетки, подвергнутые воздействию AGE, проявляли острые глюкозо-стимулированные секреторные дефекты инсулина, аномалии митохондрий, включая избыточную выработку супероксида, снижение содержания АТФ, потерю активности MnSOD, снижение потока кальция и повышенное поглощение глюкозы, все из которых были улучшены при лечении алагбрия или с избыточной экспрессией MnSOD. Изолированные островки мыши, подвергнутые воздействию AGE, уменьшали секрецию инсулина, стимулированную глюкозой, увеличивали продукцию сутоксида митохондрий и истощение содержания АТФ, которые были улучшены с помощью алагбрия или с MnTBAP, миметиком SOD. У крыс временное или хроническое воздействие AGE вызывало прогрессирующие секреторные дефекты инсулина, образование супероксида и гибель β-клеток, улучшались с помощью алагбрия. Мыши NODLt увеличивали циркулирующие AGE в связи с увеличением образования митохондриальной супероксии островков, что было предотвращено алагибрином, что также уменьшало частоту аутоиммунного диабета. Наконец, дети с повышенным риском, которые прогрессировали до T1D, имели более высокие концентрации AGE, чем несогласованные с конкурентами.

Эти данные свидетельствуют о том, что AGEs непосредственно вызывают секреторные дефекты инсулина, скорее всего, нарушая митохондриальную функцию, что может способствовать развитию T1D.

Диабет типа 1 (T1D) характеризуется недостаточностью инсулина, вторичной по отношению к аутоиммунному опосредованному разрушению инсулино-продуцирующих β-клеток в островках поджелудочной железы. Менее 50% семейной кластеризации в T1D можно отнести к известным генотипам (1), и предполагается, что рост заболеваемости в западных обществах (2) отражает изменение условий окружающей среды. Действительно, повышенная частота T1D за последние несколько десятилетий может полностью учитываться субъектами с более низкими рисками HLA-генов (3,4).

Усовершенствованные конечные продукты гликирования (AGE) могут быть факторами окружающей среды, которые способствуют развитию T1D. Когда восстановление сахаров, таких как глюкоза или карбонилы, неанзивно реагирует с аминогруппами, они приводят к гликированным модификациям, таким как HbA1c (5), которые после дальнейших биохимических перегруппировок образуют AGE. Образование AGE происходит как часть нормального процесса старения, а накопление AGE ускоряется гипергликемией. Это объясняет, почему эти сахарзависимые модификации широко изучались как патогенные агенты при осложнениях диабета (6-8). Тем не менее, они также образуются при отсутствии гипергликемии при гомеостатических дисбалансах, таких как редокс-дисбаланс (9), старение (10), с заболеванием почек (11) или с другими аутоиммунными заболеваниями (12).

Помимо эндогенно образованных AGE, экзогенные AGE производятся из пищевых продуктов (например, мяса, молока, кофе, сыра), особенно тех, которые получены или обработаны при высокой температуре, хранятся в течение длительного времени или содержат пищевые добавки. Исследования на животных моделях продемонстрировали, что ограничение приема диетического AGE значительно улучшает чувствительность к инсулину и увеличивает продолжительность жизни в моделях мыши (13,14). Кроме того, мыши с низким уровнем белка, полученные с помощью AGE, показали более низкую передачу аутоиммунного диабета на протяжении трех поколений (15). Кроме того, передаваемые с материнской точки зрения ВОЗ преждевременно повышают концентрации циркулирующих AGE у младенцев до взрослых уровней, тем самым активируя воспалительные пути (16). Недавнее острое исследование показало, что инъекции AGE могут инициировать β-клеточную дисфункцию in vivo (17).

В текущем исследовании мы исследовали прямые эффекты AGE на секреторную функцию островков в культивируемых клетках MIN6N8, изолированных островковых грызунах и здоровых грызунах. Экспозицию путем инъекции или перорального приема у здоровых крыс и бесплодных диабетических (NODLt) мышей использовали для определения того, влияет ли AGE на функцию β-клеток, что в контексте генетической восприимчивости может способствовать развитию T1D. Мы также исследовали влияние вызванной AGE митохондриальной дисфункции на секрецию инсулина, поскольку избыточная генерация супероксида в этих органеллах, как известно, приводит к повреждению β-клеток. Кроме того, концентрации циркулирующих AGE измерялись у детей с повышенным риском, которые впоследствии сопровождались для прогрессирования до T1D.

Дети и подростки, страдающие аутоантителами островков поджелудочной железы, которые были родственниками первой степени у кого-то с T1D, были проспективно прослежены в Мельбурнском исследовании семьи перед диабетом (18). Восемнадцать индивидуумов (средний возраст 13,4 лет) развивали диабет за медианное наблюдение за 4,4 года. Они были сопоставлены как можно ближе к половому признаку, возрасту, статусу гена риска HLA, β-клеточной функции и количеству специфических аутоантител к островку с равным числом, у которых не было развитого диабета в среднем за 6,5 года (19 ). Концентрация AGE в образцах сыворотки, полученных в начале наблюдения в каждой группе, измерялась ретроспективно. Исследование было одобрено Мельбурнским комитетом по этике исследований в области здравоохранения.

Группам крыс Sprague-Dawley (n = 10 / группа) ежедневно вводили внутрибрюшинные инъекции либо модифицированного AGE альбумина сыворотки крови (AGE-RSA), RSA в дозе 20 мг / кг / день, либо физиологического раствора (фиктивный) в течение 4 месяцев в то время как на стандартной крысе чау кормили ad libitum. Дополнительная подгруппа грызунов, инъецированных AGE-RSA (n = 10 / группа), получала лечение с помощью АГ-понижающей терапии alagebrium (4,5-диметил-3- (2-оксо-2-фенилэтил) тиазолийхлорид, Synvista Pharmaceuticals, Ramsey , NJ) (10 мг / кг / день пероральным зобом для продолжительности исследования [AGE-RSA + ALT]).

Во втором исследовании крысы группы здоровых самцов крыс Sprague-Dawley (n = 20 / группа) были рандомизированы, чтобы получать диету с низким содержанием AGE (необожженный AIN-93G, содержащий AGE Nε (карбоксиметил) лизин (CML), 20.09 нмоль / моль лизин / 100 мг, специальные корма, Перт, Австралия); с высоким содержанием AGE (запеченный AIN-93G в течение 1 часа при 165 ° C, 101,9 нмоль / моль лизина / 100 мг ХМЛ) или высоким содержанием декстрозы (глюкоза, 636 г декстрозы на кг, специальные корма) в течение 24 недель (диетический анализ доступный в дополнительной таблице 1). Эти крысы дополнительно рандомизировали для получения фиктивного желудочного сока или 10 мг / кг / день хлорида алагбрия пероральным желудочным зобом для продолжительности исследования (n = 10 / группа).

В третьем исследовании на животных мышей NODLt, которым вводили стандартный мышиный чау, изучали для преддиабеста в возрасте 75 дней (n = 20 / группа) с или без хлорида алагебра (1 мг / кг / день внутрибрюшинного введения), вводили в течение 50-75 дней возраст. Для исследований заболеваемости были изучены дополнительные группы мышей NODLt однопометников (n = 20 / группа) до тех пор, пока диагноз диабета не подтвердился гликозурией в течение трех последовательных дней с последующим глюкозой в крови натощак> 15 ммоль / л или до дня 200 года в отсутствие диабета.

Все крысы и мыши получали доступ к пище и воде ad libitum и поддерживали 12-часовые темные светлые циклы. Потребление пищи контролировалось метаболическим скринингом в течение 24 часов. Уровень глюкозы в крови автоанализатором (отдел биохимии, больница Альфреда, Прахран, Австралия) и гликированный гемоглобин измерялись еженедельно. Концентрации ХМЛ в сыворотке определяли, как описано ранее (20). Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по этике животных Медицинского отдела исследований и образования Альфреда.

Все представленные данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов с n = 3-6 репликами на группу за эксперимент. Клетки MIN6N8, которые представляют собой SV40-трансформированные клетки инсулиномы, полученные из мышей NOD (21), выращивали в модифицированной Дульбекко среде Eagle (DMEM) и 15% фетальной бычьей сыворотке (FBS). Один процент FBS использовали в течение 24 ч до и во время всех экспериментов. Клетки инкубировали в присутствии и отсутствии различных концентраций AGE-BSA (10, 50, 100 или 500 мкг / мл) или контроля BSA (10, 50, 100 или 500 мкг / мл) в течение 28 дней в нормальной глюкозе (5 ммоль / л).

Гемагглютинирующий вирус японской (HVJ) -липосомы и пустые векторные аденовирусы (MnSOD) были сконструированы с помощью векторного ядра переноса генов (University of Iowa, Iowa City, IA). Клетки инфицировали в 1 мкл / миллион клеток в 15 мл DMEM в 75 см2 колбах (1,2 × 1012 единиц образования бляшек [PFU] / мл). HVJ-липосомы вводили в течение 4 ч до лечения 100 мкг / мл AGE-BSA или 100 мкг / мл BSA в течение 7 дней. Эффективность инфицирования определяли с помощью RT-PCR в реальном времени, визуализацией флуоресценции с использованием микроскопии и с использованием анализа активности MnSOD, как описано ниже. Проведены три независимых эксперимента.

Поглощение глюкозы клетками MIN6N8 определяли с использованием 2-дезокси-глюкозы (2DG), как описано ранее (22). Неспецифическое поглощение, измеренное в присутствии цитохалазина-B, вычиталось из суммарного поглощения.

Внутривенные тесты на толерантность к глюкозе (IVGTT) проводили на крысах, как описано ранее (23). Внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе (IPGTT) проводили, как описано ранее (23), за исключением того, что внутрибрюшинно вводили болюс 1 г / кг глюкозы и образцы крови брали в 0, 15, 30, 60 и 120 мин.

Поскольку AGE CML является модификацией исходного аминокислотного лизина, альбумин использовался в качестве источника белка лизина, потому что он является наиболее распространенным белком в кровообращении и также широко употребляется в западных диетах (24). Осажденную жирной кислотой фракцию V с крыс или бычьим сывороточным альбумином (50 мг / мл, Sigma Chemical, St. Louis, MO) инкубировали в присутствии и отсутствии 0,5 моль / л d-глюкозы, как описано ранее (25 ). Затем препараты диализовали, и эндотоксин удаляли. AGE CML определяли количественно путем разведения изотопов, выбранной ионно-контрольной газовой хроматографии-масс-спектрометрии (SIM-GC / MS) (26), где основной модификацией AGE, присутствующей на лизиновых остатках в AGE-RSA и AGE-BSA, был CML (38,2 ± 3,6 и 67,0 ± 1,2 ммоль / моль лизина соответственно). Также были обнаружены низкие уровни AGE-фрагментов, обнаруженных в нативном BSA (CML: 0,5 ммоль / моль лизина) и RSA (0,3 ммоль / моль лизина), что соответствует тем, которые были получены при естественном старении.

Клетки MIN6N8 культивировали на покровных стеклах в различных условиях обработки до слияния. На 7-й день слитые клетки загружали 2 мкмоль / л fura-2 (Molecular Probes) / DMSO в течение 30 мин при 37 ° C в темноте в присутствии 2,8 ммоль / л глюкозы. Клетки вымачивали предварительно нагретым буфером буферов Кребса-Рингера (KRBB), содержащим 2,8 ммоль / л глюкозы, и помещали в микрокамеру на стадии флуоресцентного микроскопа (Ion Optix, Olympus, Japan). Клетки возбуждались при 1 Гц с 340 и 380 нм и регистрировались сигналы излучения при 510 нм. Глюкозу (20 ммоль / л) инъецировали при t = 30 с, в то время как ионодионовый иономицин (открыватель канала Ca2 +) добавляли в конце измерений флуоресценции. 340 (Ca2 + -удобный хелатор), 380 (Ca2 + -free) и сигналы с отношением 340/380 нм регистрировались непрерывно в течение 300 с с помощью видеокамеры с усиленной камерой с зарядовой связью IonOptix. Внутриклеточная концентрация Ca2 + ([Ca2 +] i) выражается как отношение 340/380 нм. Блокатор кальциевых каналов верапамил использовали в качестве контроля (10 мкмоль / л).

Выражение гена для каждой из последовательностей, перечисленных ниже, анализировали с помощью количественной RT-PCR в реальном времени, выполненной с использованием системы TaqMan, основанной на детектировании накопленной флуоресценции в реальном времени (ABI Prism 7700, Perkin-Elmer, Foster City, CA), как описано выше (27). Для проинсулина крысы (NM_019130) прямым праймером был 5′-TGGTTCTCACTTGGTGGAAGCT-3 ‘, обратный праймер 5′-GGACATGGGGTGTGTAGAAGAATCC-3′ и зонд 6-FAM CCCACACACCAGGTAG-MGB. Для мышиного проинсулина (NM_008387) зонд был таким же, как у крысы; однако передним праймером был 5’-TCAAGCAGCACCTTTGTGGTT-3 ‘и обратный праймер 5′-GGGACATGGGGGTGTAGAAGAAG-3’. Для рецептора крысы для AGE (RAGE) (L_33413) зонд был 6-FAM TGTGCCATCTCTGC-MGB, передний праймер был 5′-TCCTGGTGGGACCGTGAC-3 ‘, а обратный праймер был 5′-GGGTGTGCCGCATCTTTTATCCA-3’.

Для иммуногистохимии, как описано ранее (7), использовали модификацию метода мостика фермента иммуноглобулинового комплекса авидин-биотина. Первичные антитела, используемые в этом исследовании, были мышиным антиинсулином / проинсулином (1: 2000, Biogenesis, Poole, UK), кроличьим анти-CML (1: 500) (28), коз-анти-RAGE (1: 500, Chemicon, Temecula, CA) и мышиный анти-ED-1 (моноцит / макрофаги, 1:50, Serotec, Kiddington, Oxford, UK). Количественное определение иммуноокрашивания островков завершалось с помощью компьютерной денситометрии (Optimas 6.2 Video Pro-32, Bedford Park, Австралия), где было подсчитано минимум 20 островков (× 100) для каждого раздела. Результаты были выражены как пропорциональная площадь положительного окрашивания в островках (29).

Островки поджелудочной железы у мышей C57BL / 6J, мышей NODLt или крыс Sprague Dawley выделяли, как описано ранее (30). Островки, полученные из C57BL / 6J, подвергали воздействию 100 мкг / мл AGE-BSA или 100 мкг / мл BSA в присутствии и отсутствии ингибитора AGE, алагбрия (1 мкмоль / л) или миметика MnSOD MnTBAP (20 мкмоль / л, Alexis Biochemicals, Швейцария ).

Клетки MIN6N8 высевали в 12-луночные планшеты и обрабатывали в течение 7 дней. Изолированные островки высевали на 10 островков на лунку. Анализы секреции инсулина выполняли, как описано ранее (23). Содержание инсулина представляет собой сумму инсулина, секретируемого в течение первого и второго периодов стимуляции, и внутриклеточного инсулина, экстрагированного из клеток в конце вызова глюкозы. Глюкоза-стимулированная секреция инсулина (GSIS) в течение первых 10 минут выражалась в процентах от общего содержания инсулина. Количество инсулина в инкубационном буфере и клеточных экстрактах / островках измеряли с использованием набора ELISA для инсулина (Linco Research).

Измерение содержания митохондриального АТФ проводили в трех повторах, как описано выше (31), используя биолиминозный тест для определения АТФ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Митохондрии выделяли из колб 25 мм2 клеток с использованием набора для выделения митохондрий (Pierce, Rockford, IL) непосредственно перед анализом. Для измерений в островки 20 островков были отобраны в 96-луночные планшеты.

Выделение супероксида определяли в изолированных митохондриях, экстрагированных из 75-мм2 колб клеток MIN6N8 с использованием набора для выделения митохондрий (Pierce) или в изолированных островках (n = 30 островков / лунок), как описано ранее (20). Для ответа дозы AGE-BSA в клетках MIN6N8 клетки собирали трипсином, промывали и ресуспендировали с помощью сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) и 5 ​​мкмоль / л MitoSOX Красный индикатор митохондриального супероксида (Molecular Probes, Eugene, OR) в HBSS добавляли , Клетки инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С в темноте, промывали PBS и анализировали на проточном цитометре FACS Calibur (BD Biosciences) с использованием возбуждения при 400 нм с детектированием при 590 нм в канале FL2. Было приобретено не менее 15 000 событий на выборку.

Активность митохондриальной MnSOD измеряли с использованием набора для анализа SOD (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) в соответствии со спецификациями производителя.

Клеточная смерть была идентифицирована 3′-in-end-маркировкой фрагментированной ДНК биотинилированным дезоксиуридин-трифосфатом, как описано ранее (29).

Результаты выражаются как средства ± SD, если не указано иное. Все анализы данных грызунов с более чем двумя группами выполнялись с помощью ANOVA с последующим пост-hoc-анализом с тестом Tukey. Студенческие тесты или тесты Манна-Уитни были использованы для сравнения двух групп, где это необходимо. Тест лог-ранга (Mantel-Cox) использовался для анализа заболеваемости диабетом у мышей NOD. Значение Р <0,05 считалось статистически значимым. Различия в человеческом возрасте, аутоантитела островков и метаболические параметры были проанализированы с помощью теста Манна-Уитни U. Частоты типов HLA оценивались по критерию χ2 для трендов. Статистический анализ был выполнен с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния).

Инкубация клеток MIN6N8 с помощью AGE-BSA 10, 50 или 100 мкг / мл в течение 28 дней приводила к значительному дозозависимому снижению GSIS по сравнению с контрольными BSA (фиг.1А). Воздействие 10, 50 или 100 мкг / мл AGE-BSA увеличивало выработку митохондриальной супероксида (фиг.1B) в клетках MIN6N8 по сравнению с соответствующими контрольными средствами BSA. Обработка AGE-BSA приводила к потере содержания митохондриального АТФ в клетках MIN6N8 (фиг.1C) по сравнению с контролем BSA при той же концентрации. Воздействие AGE-BSA также уменьшало активность MnSOD (рис.1D) в концентрациях 50 или 100 мкг / мл по сравнению с клетками, обработанными только BSA. Эти эксперименты показали нелинейную дозовую реакцию на AGE-BSA в клетках MIN6N8.

ВОЗРАСТЫ вербуют известные пути повреждения β-клеток для индуцирования секреторных дефектов инсулина в клетках MIN6N8. Клетки MIN6N8 выращивали в нормальной глюкозе (5 ммоль / л) в течение 28 дней с различными концентрациями AGE-BSA (10, 50, 100 или 500 мкг / мл) или BSA (10, 50, 100 или 500 мкг / мл ). A: 20 ммоль / л GSIS. B: Производство супероксида митохондрий. C: Содержание митохондриального АТФ. D: Митохондриальная активность MnSOD. Все представленные данные представляют собой два независимых эксперимента (n = 4-6 повторений / групп на эксперимент). * P <0,05 против соответствующего контроля BSA.

Затем мы использовали 100 мкг / мл AGE-BSA, физиологически значимую концентрацию, для дальнейших исследований in vitro в клетках MIN6N8. Как GSIS, так и содержание митохондриального АТФ были снижены с помощью лечения AGE-BSA, и каждый был восстановлен путем лечения с помощью ингибитора AGE-алагбрия (фиг.2А и В). После воздействия AGE-BSA клеточное поглощение глюкозы повышалось до уровня, наблюдаемого в контрольной группе BSA, после совпадения с алагбрийом или с ингибитором транспорта глюкозы цитохалазином B (фиг.2C). Было также продемонстрировано снижение потока кальция (рис. 2D) в клетках, обработанных AGE-BSA, по сравнению с BSA и обработанными alagebrium клетками MIN6N8.

АГП-индуцированные патологические пути нормализуются с помощью АЭГ-понижающей терапии alagebrium в клетках MIN6N8. Клетки MIN6N8 выращивали в нормальной глюкозе (5 ммоль / л) в течение 28 дней со 100 мкг / мл AGE-BSA или 100 мкг / мл BSA с или без 1 мкмоль / л alagebrium. A: 20 ммоль / л GSIS. B: содержание митохондриального АТФ. C: поглощение глюкозы с использованием 2-DG. D: поток кальция с использованием Fura-2. * P <0,001 по сравнению с соответствующим контролем BSA, † P <0,05 против AGE-BSA, ‡ P <0,001 против AGE-BSA. CytB, цитохалазин B; ВЕР, верапамил.

Активность MnSOD в клетках MIN6N8 ингибировалась путем совпадения с AGE, но это было восстановлено путем одновременного введения алагбрия (фиг.3A) или с инфекцией с помощью сверхэкспрессирующего аденовирусного вектора MnSOD (фиг.3B). Аденовирусная избыточная экспрессия MnSOD также предотвращала снижение ВГС (GSE) (рис.3C) и снижение выработки митохондриальной супероксида в ответ на AGE в клетках MIN6N8 (рис. 3D).

Восстановление активности MnSOD предотвращает вызванные ВГЭ секреторные дефекты инсулина. A: клетки MIN6N8 подвергали воздействию AGE-BSA или BSA при 100 мкг / мл в течение 28 дней с или без 1 мкмоль / л alagebrium и определяли активность MnSOD. B-D: клетки MIN6N8, инфицированные аденовирусом MnSOD (AdMnSOD). B: активность MnSOD в аденовируально инфицированных клетках при возрастающих концентрациях вируса. Все титрования аденовируса выполнялись в трех экземплярах. EV, пустой вектор. C: GSIS на 7-й день в клетках MIN6N8, инфицированных аденовирусом в день 1 из 7 (1,2 × 1012 PFU / мл аденовируса MnSOD для сверхэкспрессии MnSOD или пустого аденовирусного вектора). D: Производство супероксида митохондриальных клеток в клетках MIN6N8, инфицированных аденовирусом в день 1 из 7 (1,2 × 1012 PFU / мл аденовируса MnSOD для сверхэкспрессии MnSOD или пустого аденовирусного вектора). Все представленные данные представляют собой три независимых эксперимента (n = 4-6 повторений / групп на эксперимент). E-G: островки поджелудочной железы выделяли из мышей C57BL / 6J в возрасте 8 недель. Оставшиеся островки инкубировали в присутствии и отсутствии AGE-BSA (100 мкг / мл) в DMEM / 10% FCS, содержащей 5 ммоль / л глюкозы в течение 24 часов. Миметик MnSOD MnTBAP также добавляли к некоторым группам (20 мкмоль / л). E: GSIS в изолированных островках. F: Производство супероксида митохондрий. G: содержание АТФ в островковых митохондриях. * P <0,05 по сравнению с BSA; † P <0,05 против AGE-BSA; ‡ P <0,05 против пустого вектора; §P <0,05 против EV + AGE-BSA; ‖P <0,05 против EV + BSA.

В дополнение к исследованиям, проведенным в клетках MIN6N8, мы изолировали островки поджелудочной железы от здоровых мышей и облучали их до 100 мкг / мл AGE-BSA в течение 24 часов. AGE с ослабленным GSIS, который был улучшен либо с помощью alagebrium, либо с MnSOD MimTBAP (рис. 3E). Воздействие AGE также увеличивало выработку митохондриальной супероксида в изолированных остриях мыши (фиг.3F) и пониженное содержание АТФ на островка (фиг.3G), причем оба этих изменения ослабляются либо с помощью адгезии алаббрия, либо с помощью MnTBAP.

Затем проводились исследования in vivo для оценки влияния ВОЗРАЩЕНИЙ на функцию островков поджелудочной железы in situ. Использовались две экспериментальные модели крыс. Первые требуемые внутрибрюшинные инъекции AGE-RSA или RSA в качестве контроля должны ежедневно вводиться здоровым самцам крыс Sprague-Dawley в течение 16 недель. Инъекции AGE привели к временному суточному увеличению циркулирующих AGE (фиг.4A). Ежедневные инъекции AGE-RSA нарушали секрецию инсулина во время IVGTT по сравнению с RSA-инъецированными крысами (фиг.4B). Этот AGE-RSA-зависимый дефект инсулиновой секреции был предотвращен алагебрием (фиг.4B). Однако различий в концентрациях глюкозы в плазме во время IVGTT в инъецированных группах крыс не наблюдалось (фиг.4С). Экспрессия AGE-RSA также уменьшала экспрессию гена препроинсулина островков (0,46 ± 0,26-кратная индукция, n = 4 / группа), которая не наблюдалась у крыс, которым вводили RSA (1,25 ± 0,53, P <0,01 против AGE-RSA) или в Инъекционные крысы, которым вводили AGE-RSA, которые получали терапию алагбрия (1,35 ± 0,37, P <0,01 против AGE-RSA). Хотя были выявлены дефекты секреции инсулина и экспрессии генов, не было изменений глюкозы в плазме натощак, массы тела или гликированного гемоглобина в AGE-RSA по сравнению с группой RSA с инъецированной крысой через 16 недель (таблица 1).

Секреторные дефекты инсулина у здоровых грызунов являются результатом либо повторных ежедневных, либо постоянных возвышений в ВОЗРАСТЕ. Здоровые крысы Sprague-Dawley подвергались воздействию хронической AGE через ежедневную внутрибрюшинную инъекцию (16 недель) или проглатывание диеты с высоким уровнем AGE (24 недели). A-C: крысы с AGE-RSA или RSA на неделе 16 (n = 10 / группа) с некоторыми крысами, рандомизированными для приема АЭГ-понижающей терапии alagebrium (10 мг / кг / день для перорального введения, n = 10 / группа ). A: Уровни плазменного AGE, измеренные как модификация CML, после внутрибрюшинной инъекции. B: концентрации плазменного инсулина во время IVGTT. C: концентрации глюкозы в плазме во время IVGTT. D-I: HighAGE или глюкоза (декстроза) на неделе 24 (n = 10 / группа) с некоторыми крысами, рандомизированными для приема алагбрия (n = 10 / группа). D: Плазменный AGE (CML). E: концентрации плазменного инсулина во время IVGTT. F: концентрации глюкозы в плазме во время IVGTT. G: Концентрация глюкозы в плазме натощак. H: Концентрация инсулина в плазме натощак. I: Глицидный гемоглобин. * P <0,01 по сравнению с RSA или фикцией; † P <0,01 AGE-RSA против RSA; ‡ P <0,01 AGE-RSA против AGE-RSA + ALT; ¶P <0,05 против низкого ВОЗРАСТА; §P <0,05 против низкого ВОЗРАСТА, тест Манна-Уитни; ‖P <0,05 по сравнению с высоким ВПЧ или высокой декстрозой; #P <0,05 против высокого AGE, тест Манна-Уитни.

Физиологические и метаболические параметры у нормальных крыс после инъекций AGE-RSA

Данные — это средства ± SD. Плазменная глюкоза и гликированный гемоглобин включены в качестве мер гликемического контроля через 4 месяца; n = 10 крыс / группа. Также показаны конечная масса тела, концентрации CML в плазме (AGE) и потребление энергии после метаболического склеивания.

* P <0,05 по сравнению с фикцией.

† P <0,05 против. AGE-RSA.

Вторая экспериментальная модель крысы сравнивала низкое и высокое диетическое потребление AGE в течение 24 недель у здоровых крыс Sprague-Dawley в присутствии и отсутствии терапии алагбрия. Крысы с высоким содержанием декстрозы также изучались, поскольку продолжаются дискуссии о том, являются ли эндогенные источники ВОЗ, такие как те, которые генерируются из циркулирующей глюкозы (в данном случае производные от декстрозы), более патогенны, чем те, которые производятся экзогенно посредством пищевой обработки (32). Потребление как высокожировых, так и диет с высоким содержанием декстрозы в течение 24 недель увеличивало циркулирующие концентрации AGE, которые были улучшены с помощью терапии алагбрия (рис.4D). Потребление диеты с высоким уровнем AGE или высокой декстрозой приводило к нарушению секреции инсулина (рис.4E) и более высокой концентрации глюкозы в плазме во время IVGTT (фиг.4F), и эти изменения были предотвращены с помощью терапии алагбрия. Экспрессия препроинсулинового гена в островках крыс также снижалась при хроническом высокоуглеродном или высокорекстрогенезационном введении в течение 24 недель (высокая АГЭ 0,57 ± 0,08-кратная индукция против низкого AGE 1,27 ± 0,26, P <0,01, высокая декстроза 0,09 ± 0,02, P <0,001 против низкого ВОЗРАСТА). Повышенный уровень глюкозы в плазме натощак (фиг.4G) и снижение концентрации натощак инсулина (рис. 4H) были продемонстрированы с высоким потреблением диетического ВОЗ, и эти изменения в глюкозе и инсулине были ослаблены с одновременным введением алагбрия. Не было существенной разницы в уровне глюкозы в плазме натощак, наблюдавшейся с потреблением диеты с высокой декстрозой (фиг.4G), хотя у этих крыс было значительное снижение концентрации инсулина в плазме натощак, которые были отменены с помощью терапии алагбрия. Концентрации гликозилированного гемоглобина не повышались у крыс с высоким содержанием AGE или с высоким содержанием декстрозы, но были значительно снижены с помощью терапии алагбрия (рис.4I), что согласуется с влиянием этого агента на концентрации глюкозы.

Хроническая in vivo подверженность воздействию AGE увеличивала инфильтрацию островковых островков моноцитами и макрофагами (фиг.5A-D) по сравнению с инъецированными RSA или AGE-RSA-крысами, обработанными алагбрий. Содержимое β-клеток AGE (CML) также увеличивалось, как видно из проточной цитометрии у крыс, которым вводили AGE-RSA, по сравнению с крысами RSA и AGE-RSA + ALT (дополнительный рисунок 1). Кроме того, у крыс, которым вводили AGE-RSA, также была избыточная генерация митохондриального супероксида в островках по сравнению с крысами, которые были введены с помощью шам- или BSA (фиг.5Е). Воздействие избыточных AGE также вызывало апоптоз β-клеток, оцененный терминальной опосредованной терминацией дезоксинуклеотидилтрансферазой dUTP (TUNEL) у здоровых крыс (фиг.5F), которая не наблюдалась у крыс, которым вводили BSA, и была предотвращена с помощью алагбрия.

Хроническая экспозиция в условиях ВЭЖ приводит к повреждению островков у здоровых крыс. Здоровые крысы Sprague-Dawley подвергались воздействию хронической AGE через ежедневную внутрибрюшинную инъекцию (16 недель). Ингибированные AGE-RSA или RSA крысы на 16 неделе (n = 10 / группа). A-D: инфильтрация островков-моноцитов / макрофагов (антиген ED-1) иммуногистохимией на 16-й неделе у крыс, которым вводили AGE-RSA (A), крыс, которым вводили RSA (B), и крыс, которым вводили AGE-RSA, обработанных алагбрия ( С). D: Морфометрическое количественное определение ED-1. E: Islet NADH-зависимая генерация супероксида митохондрий у крыс, которым вводили AGE, на неделе 16. F: β-клеточный апоптоз, определенный TUNEL. * P <0,05 против ложного; † P <0,05 против AGE-RSA. (Высококачественное цифровое изображение этой цифры доступно в онлайн-выпуске.)

Поскольку было обнаружено, что AGEs отрицательно влияют на функцию поджелудочной железы у здоровых крыс, влияние AGE на развитие диабета было затем исследовано у мышей NODLt, которые спонтанно развивают аутоиммунный диабет примерно с 100-дневного возраста. Предиабец на 75-й день, концентрация глюкозы в плазме (фиг.6А) и гликированный гемоглобин (фиг.6В) были увеличены по сравнению с 50-м днем ​​у мышей NODLt и были уменьшены при лечении алагбрий. У мышей Prediabetic NODLt также наблюдалось увеличение концентрации ПГ в плазме в возрасте 75 лет, что не наблюдалось у мышей NODLt, получавших alagebrium (фиг.6C). Эти увеличения циркулирующей глюкозы в плазме, гликированного гемоглобина и плазменных AGE в преддиабетическом NODLt сопровождались увеличением продуцирования продуцированного митохондриального супероксида островков, которое было предотвращено с помощью алагбрия (фиг.6D).

Частота аутоиммунного диабета у мышей NOD снижается с помощью терапии с пониженным содержанием кислорода. Мышам Prediabetic NODLt следовало в течение 75 дней (n = 10 мышей / группа). Группу мышей (n = 10 / группа) также обрабатывали с 50-го дня, используя АГ-понижающую терапию хлорид алагбрия (1 мг / кг / день). A: Глицит плазмы натощак. B: Глицидный гемоглобин (Hb). C: Концентрация плазменной AGE (CML). D: Исходная продуцирование продуцированной митохондриальной супероксидом на основе NADH. E: заболеваемость диабетом у мышей NODLt продолжалась до 200 дней (n = 20 / группа). * P <0,05 против NODLt на 50-й день; † P <0,01 против NODLt на 75 день; §P = 0,009, log-rank (Mantel-Cox).

Мышей NODLt также изучали до тех пор, пока диагноз диабета не был подтвержден или до дня 200 года. Одну группу мышей NODLt обрабатывали алагбрийом с 50-летнего возраста. Примерно 50% мышей NODLt развивали диабет к дню 200. Алагбрий уменьшал частоту развития диабета у мышей NODLt примерно до 5% (фиг.6Е).

Мы измерили циркулирующие концентрации AGE в когорте детей и подростков, подверженных риску, с аутоантителами островков в Мельбурнском исследовании семьи перед диабетом (19). Восемнадцать человек, которые прогрессировали до клинического диабета в среднем за 4 года, были максимально близки к возрасту, полу, островковым аутоантителам, типу HLA DR и β-клеточной функции (реакция первого инсулина на внутривенную глюкозу) с еще 18, которые не прогрессирует к диабету за это время (см. таблицу 3 в ссылке 19). Те, кто прогрессировал до диабета во время наблюдения (прогрессисты), имели более высокие концентрации сывороточных AGE (ХМЛ) по сравнению с непрогрессорами (рис.7).

Дети с известной генетической восприимчивостью, которые развиваются до диабета 1-го типа, имеют более высокую циркуляцию AGE (CML). Концентрации сывороточного AGE (ХМЛ) измеряли в HLA II-подобранных предметах, набранных в рамках исследования семейного исследования в Мельбурне. N = 18 / группа. * P <0,01 против непрогрессивных.

В настоящем исследовании приводятся доказательства, подтверждающие гипотезу о том, что воздействие AGE нарушает секрецию инсулина, стимулируя продуцирование супероксида в митохондриях. В соответствии с предыдущими исследованиями (33,34) мы показали, что AGE нарушают секрецию инсулина клетками MIN6N8. Однако, что более важно, мы показали, что нарушение секреции инсулина с помощью ВЭЖ происходит через прерывание ряда критических последовательных стадий, включая изменения в поглощении глюкозы в клетке, изменение клеточного потока кальция и потерю содержания АТФ митохондрий, которые не были ранее идентифицированных. В соответствии со специфичным для ВЭЖ эффектом на секрецию инсулина в клетках MIN6N8 введение AGE-понижающего агента alagebrium предотвратило все эти изменения. Кроме того, мы продемонстрировали, что изолированные островки мыши, подвергнутые воздействию AGE, также нарушали секрецию инсулина в ответ на глюкозу в контексте содержания АТФ нижнего островка, что согласуется с предыдущим исследованием (17). Эти аномалии островков были восстановлены при одновременном воздействии алагбрия.

При хроническом введении AGE здоровым крысам Sprague-Dawley мы наблюдали потерю секреторной функции инсулина, включая снижение секреции инсулина первой фазы в ответ на глюкозу, что характерно для людей, которые развивают диабет, включая T1D (35,36) , Кроме того, у крыс, получавших диету с высоким уровнем AGE, были более низкие концентрации инсулина в плазме натощак, меньшая экспрессия препроинсулина в островках и более высокие концентрации глюкозы в плазме в контексте потери веса, которые часто наблюдаются у детей, которые развивают T1D (35,36) , Интересно, что хотя здоровые крысы, которым вводили декстрозу, увеличивали циркулирующие AGE, подобные тем, которые наблюдались при диете с высоким уровнем AGE, а также потеря секреторной функции инсулина, это не приводило к увеличению концентрации глюкозы в плазме натощак. Инъекции AGE в течение 16 недель также не были связаны с увеличением концентрации глюкозы в плазме. Это говорит о том, что могут быть эффекты избыточных AGE из диетических источников в других местах, таких как кишечник, которые в конечном счете влияют на гомеостаз глюкозы, учитывая, что аномалии β-клеток были самыми продвинутыми у крыс с высоким уровнем AGE. Можно также предположить, что секреторные дефекты инсулина могут предшествовать любому воздействию, вызванному AGE, на чувствительность к инсулину (14,37), учитывая, что не было доказательств резистентности к инсулину у крыс, которым вводили AGE, хотя это не выходило за рамки текущего исследования.

В соответствии с ролью ВОЗ в развитии аутоиммунного диабета у мышей NODLt повышалась концентрация глюкозы в плазме и AGE на 75-й день, предшествующий началу диабета. Кроме того, частота случаев аутоиммунного диабета у мышей NODLt также снижалась в текущем исследовании с помощью AGE-понижающего агента alagebrium. Кроме того, здоровые крысы, хронически вводимые AGE, показали повышенную гибель клеток β-клеток и вторжение островков моноцитами и макрофагами. Поддержка роли ВОЗ в развитии повреждения β-клеток, что может привести к их разрушению, — это предыдущие исследования, предполагающие, что ВОЗ могут иметь иммуномодулирующие роли, скорее всего, через RAGE (38-40). Действительно, мы ранее показали, что изменения в RAGE могут способствовать развитию T1D у восприимчивых детей (41). В текущем исследовании концентрации плазменных AGE повышались у восприимчивых детей, которые прогрессировали до T1D с более ускоренной скоростью, что интересно, учитывая, что эти дети были сопоставлены, в том числе по количеству специфических островковых аутоантител и β-клеточной функции. Вместе с тем, пока неясно, влияют ли AGE на функцию β-клеток прямо или косвенно путем усиления адаптивной (Т-клеточной) иммунитет против β-клеток.

Определив, что ВОЗРАСТЫ могут нарушить секрецию инсулина, мы изучили влияние ВОЗ на окислительный стресс, ранее постулированный путь, способствующий секреторной дисфункции β-клеток как в экспериментальных моделях (42), так и в болезни человека (43). Действительно, пациенты с генетическими аномалиями, вызывающими избыточную генерацию супероксида митохондрий, такие как атаксия Фридрейха, развивают инсулин-необходимый диабет (44). Поэтому в текущем исследовании не удивительно, что избыточная генерация митохондриальной супероксида в сочетании с дефицитом активности MnSOD была идентифицирована после воздействия AGE в клетках и островках и в экспериментальных моделях in vivo в контексте секреторных аномалий инсулина. Действительно, изменения в образовании реактивных кислорода и активность MnSOD были связаны с воздействием AGE в предыдущих исследованиях в клетках INS (17,45) и астроцитах (46). В настоящем исследовании дефекты секреции инсулина и потеря содержания митохондриального АТФ в клетках MIN6N8 и изолированных мышечных островках были предотвращены с аденовирусной сверхэкспрессией MnSOD или путем введения MimSOD MimTBAP, что также предотвращало опосредованное AGE образование супероксида в митохондриях. Эта защитная роль для MnSOD ранее наблюдалась как в β-клетках (47,48), так и в других контекстах (49). Однако еще предстоит определить, является ли реактивное кислородное опосредованное повреждение β-клеток от оскорблений, таких как вызванные AGE, непосредственно ответственным за гибель β-клеток.

В заключение наши исследования показывают, что воздействие избыточных AGE активирует пути повреждения β-клеток, которые посредством генерации митохондриальной супероксида могут нарушать секрецию инсулина. Мы также показываем, что вмешательства, которые уменьшают накопление AGE, снижают частоту аутоиммунного диабета у мышей. Это заставляет нас постулировать, что защита от аутоиммунного диабета может быть обеспечена профилактикой митохондриальной дисфункции. Действительно, будущие исследования необходимы для определения того, как воздействие избыточных AGEs конкретно способствует развитию T1D и аутоиммунитету и зависит ли это от прямых или косвенных путей. В совокупности наши исследования идентифицируют ВОЗ в качестве изменяемого фактора риска и терапевтической цели для профилактики Т1D.

Эта статья содержит дополнительные данные в Интернете по адресу http://diabetes.diabetesjournals.org/lookup/suppl/doi:10.2337/db10-1033/-/DC1.

M.T.C. и F.Y.T.Y. в равной степени способствовали этому исследованию.

Эта работа была поддержана Молодежным научно-исследовательским фондом диабета «Инновационный грант» 5-2010-163. M.T.C. проводит Австралийское общество диабетической ранней карьеры. M.T.C., S.A., L.C.H. и J.M.F. являются получателями стипендий от Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии.

Не сообщалось о потенциальных конфликтах интересов, имеющих отношение к этой статье.

M.T.C. проводили ВЭЖХ и диетические исследования, а также анализировали и помогали в подготовке и составлении рукописи. F.Y.T.Y. завершили изолированные островки и исследования NODLt мыши и ответы на дозу в клетках MIN6N8. D.C.K.T. завершили исследования тканевой культуры, в том числе с использованием аденовирусов. S.A. участвовал в тестировании толерантности к глюкозе у всех грызунов и его интерпретации и анализах. A.G. и V.T.-B. завершила всю RT-ПЦР и иммуногистохимию и помогала в исследованиях крыс с использованием AGE. D.E.W. оказал помощь в исследованиях in vitro и составлении рукописи. Джим. обеспечивали ячейки MIN6N8 и помогали в их настройке и интерпретации данных из их исследований. T.W.K. дал экспертное заключение по данным NODLt и исследованиям и завершил анализ проточной цитометрии. Среднеквадратичный способствовали обсуждению, рассмотрели и отредактировали рукопись. D.M.K. с помощью экспериментов с потоком кальция. B.G.D. и B.A.K. провели эксперименты по поглощению глюкозы. S.F. отвечал за подбор, сбор образцов и исследование диабетических индивидуумов типа 1 в рамках исследования семьи в семье в Мельбурне. P.-H.G. помогали в подготовке рукописи и интерпретации данных. L.C.H. отвечал за подбор, сбор образцов и исследование диабетических индивидуумов типа 1 в рамках исследования семьи в семье в Мельбурне и помогал в статистике, составлении рукописей и интерпретации исследований. М.К. с помощью статистики, составления рукописей и интерпретации исследований. J.M.F. задумывали исследования, интерпретировали и завершали результаты, а также помогали в подготовке рукописи.

Авторы выражают благодарность сотрудникам Института сердца и диабета Института Бейкера, Гевину Лангмаиду, Сандре Милявеку и Кайли Гилберт за их экспертную заботу о животных на протяжении всего исследования и Марианн Арнштейн за ее технические знания. Авторы также благодарят Ами Блэр, медицинский факультет Университета Мельбурна, Австралия, для оказания помощи крысам и мышам IVGTT / IPGTT. Газохроматографию-масс-спектрометрию для CML любезно проводил профессор Сюзанн Торп, Университет Южной Каролины.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *