Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Продвинутые конечные продукты Glycation Уязвимость к коронарной вазодилатации K +, опосредованной Каналом, у крыс с диабетом

Advanced Glycation End Products Impair Voltage-Gated K+ Channels-Mediated Coronary Vasodilation in Diabetic Rats
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4642979/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: WS WL H. Li. Выполнили эксперименты: WS H. Liu HH. Проанализированы данные: HC. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: H. Liu HH HC. Написал статью: WS WL H. Li.

Ранее сообщалось, что высокая глюкоза ухудшает коронарную вазодилатацию за счет снижения активности канала K + (Kv) с напряжением. Однако основные механизмы остаются неизвестными. Усовершенствованные конечные продукты гликирования (AGE) являются мощными факторами, которые способствуют развитию диабетической васкулопатии. Цель этого исследования состояла в том, чтобы исследовать роль ВОЗРАСТЕЙ при высоком вызванном глюкозе нарушении Kv-опосредованной коронарной вазодилатации.

Для оценки функции и экспрессии Kv-каналов использовались запись защелки и молекулярно-биологические методы. Вазодилатацию изолированных коровых коронарных артерий крыс измеряли с использованием сжатого миографа. Для определения вклада AGEs была проведена обработка изолированных клеток коронарной сосудистой гладкой мускулатуры (VSMC) и индуцированных стрептозотоцином диабетических крыс с аминогуанидином, химическим ингибитором образования AGE.

Инкубация VSMC с высокой глюкозой уменьшала плотность тока Kv на 60,4 ± 4,8% и уменьшала экспрессию Kv1.2 и Kv1.5 как на уровне гена, так и на уровне белка, тогда как ингибирование образования AGE или блокирование AGE, взаимодействующих с их рецепторами, предотвращало высокий уровень глюкозо- индуцированное нарушение каналов Kv. Кроме того, диабетические крысы проявили снижение Kv-опосредованной коронарной дилатации (9,3 ± 1,4% против 36,9 ± 1,4%, Р <0,05), что частично было исправлено обработкой аминогуанидином (24,4 ± 2,2% против 9,3 ± 1,4% , P <0,05).

Чрезмерное образование ВЕГ ухудшает Kv-каналы в VSMC, а затем приводит к затуханию Kv-опосредованной коронарной вазодилатации.

Все соответствующие данные приведены в документе.

Сердечно-сосудистые заболевания являются основными причинами заболеваемости и смертности среди пациентов с диабетом. Было охарактеризовано, что в канальных артериях дисфункция сосудов во многом обусловлена ​​потерей модулирующей роли эндотелия [1]. Напротив, сосудистые гладкомышечные клетки (VSMC), как сообщается, играют доминирующую роль в регуляции сосудистого тонуса для микроциркуляции [2,3]. Каналы K + в VSMC берут на себя основную ответственность за поддержание потенциала покоя мембраны и регулирование гладкомышечных тонов [4]. Ранее мы продемонстрировали, что каналы с накачкой K + (Kv) с напряжением, особенно семейство Kv1 «Shaker-type», несут ответственность за коронарную вазодилатацию в небольших коронарных артериях крысы (RSCAs) [5,6]. Каналы Kv участвуют в ряде физиологических процессов, включая цАМФ-зависимую вазодилатацию [5,7]. Изменения в экспрессии или активности каналов Kv часто переводят на различные сосудистые заболевания, включая атеросклероз [8], системную и легочную гипертензию [9,10] и особенно диабетическую васкулопатию [11]. При этих заболеваниях Kv-нарушения, связанные с деполяризующими сдвигами в VSMC, часто приводят к гиперчувствительности к сосудосуживающим веществам и повышенному уровню сосудистого тонуса. Несмотря на важность каналов Kv при модулировании сосудистого тонуса, механизмы, участвующие в нарушенной Kv-опосредованной коронарной микроциркуляции при диабете, остаются слабо определенными [5].

Продвинутые конечные продукты гликирования (AGE) представляют собой группу сшитых производных, которые необратимо образуются в сыворотке или тканях через неферментативные химические реакции из-за гипергликемии и окислительного стресса [12]. Существует накопление доказательств причинной роли ВОЗ в развитии диабетической васкулопатии [13,14,15,16]. ВОЗРАСТЫ воздействуют главным образом путем взаимодействия с конкретными рецепторами клеточной поверхности, называемыми рецепторами продвинутых продуктов гликирования (RAGE) [17]. Остеогенез / RAGE увеличивает воспаление и окислительный стресс во многих типах клеток, включая VSMC, что приводит к повреждению сосудов [18]. Ранее было показано, что замедление образования AGE с аминогуанидином (AG), наиболее широко изучаемым ингибитором образования AGEs, предотвращает повреждение диабетического сосуда [19,20]. Однако в коронарных VSMC были проведены ограниченные исследования взаимосвязи между ВОЗРАСТАМИ и измененной функцией канала Kv.

Цель нашего исследования состоит в том, чтобы исследовать, влияют ли ВОЗ на активность и экспрессию каналов Kv в VSMC, а также для дальнейшего изучения роли ВОЗРАСТЕЙ в КВ-опосредованной коронарной дисфункции у диабетических животных.

Первичные крысиные коронарные VSMC выделяли в соответствии с опубликованными методами [21] и инкубировали в модифицированной Дульбекко среде Eagle (DMEM, Gibco, США), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, США), 100 ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицин и 200 ммоль / л L-глутамина в течение 48 ч при 37 ° С. Клетки предварительно обрабатывали AG (10 ммоль / л) или анти-RAGE IgG (100 мкг / мл), нейтрализующим RAGE антителом или носителем в течение 30 мин перед инкубацией с 5,6 ммоль / л (нормальная глюкоза) или 23 ммоль / л (высокая глюкоза) D-глюкоза. Чтобы исследовать прямое действие AGE, VSMC предварительно обрабатывали анти-RAGE IgG (100 мкг / мл) или носителем в течение 30 минут перед стимуляцией 100 мкг / мл AGE-BSA в течение 48 часов. Дозозависимый эффект и осмотическое влияние высокой глюкозы на коронарные VSMC были ранее оценены [5,6,22,23], а концентрация глюкозы 23 ммоль / л была зафиксирована для следующих экспериментов. Концентрации AGE-BSA и AG были основаны на предыдущих опубликованных исследованиях [24,25].

Шестинедельные самцы крыс Sprague-Dawley (Vital River, Beijing, China) весом от 180 до 200 граммов были размещены, как описано ранее [23]. Крысы были случайным образом разделены на две части в начале исследования. Контролировали с регулярной чау (13 ккал% жира) в течение 4 недель и вводили только один цитратный буфер. Другие крысы получали диету с высоким содержанием жиров (58 ккал.% Жиров сахарозой, исследовательские диеты) в течение 4 недель, а затем одну внутрибрюшинную инъекцию стрептозоцина (25 мг / кг, свежеприготовленную в 100 ммоль / л цитратном буфере, рН 4,5) после ночь быстро. Крыс с уровнем глюкозы в крови> 16,7 ммоль / л считали диабетом [26,27]. Диабетических крыс обрабатывали 1-3 Е / сут инсулина для предотвращения кетоацидоза. Крысы были разделены на четыре группы: контроль (n = 8), диабет (DM, n = 8), контроль + AG (n = 8) или диабет + AG (DM + AG, n = 8). Группы AG получали 100 мг / кг / день AG, растворенные в питьевой воде в течение 10 недель. Протоколы животных были основаны на руководящих принципах Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в столичном медицинском университете.

Крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (60 мг / кг). RSCAs (внутренний диаметр 150-200 мкм) были вырезаны из левого желудочка и разрезаны на 2 мм длинные кольца. Эндотелий был осушен сухим воздухом. Эффективность эндотелиальной денудации была проверена, как сообщалось ранее [5]. Артериальные кольца были навинчены на две проволоки из нержавеющей стали (диаметром 40 мкм) и смонтированы в камерах с 5-миллилитровыми многогранными миографическими системами (модель 610M, датская технология Myo, Aarhus, Дания), заполненные раствором соли, как описано ранее [5] , Физиологический солевой раствор непрерывно барботировали 95% О2 и 5% СО2 и нагревали до 37 ° С. Сигналы напряжения были прикреплены к блоку записи PowerLab и сохранены в программном обеспечении Chart 7 для Windows (AD Instruments Ltd, Орхус, Дания). После установки сосуды уравновешивали в течение 1 часа до нормализации. Пассивное натяжение — внутренняя окружность определялась растяжением до трансмурального давления 60 мм рт.ст., как сообщалось ранее [6]. Сосуды предварительно доставляли аналогам тромбоксана А2 U-46619 (10 нмоль / л). Форсколин, активатор аденилатциклазы, использовали для выявления опосредуемой цАМФ вазодилатации [5,28]. Дилатации форсколину (10-10-10-6 моль / л) сравнивали в артериальных кольцах до и после применения 4-аминопиридина (4-АР), селективного блокатора каналов Kv. 4-АР (3 ммоль / л) добавляли к камерам и инкубировали в течение 20 мин до регистрации кривых доза-реакция.

Стандартные импульсные протоколы использовались для оценки целых и напряженных К + токов, как описано ранее [5]. Коротко говоря, токи K + генерировались серией деполяризующих импульсов 400 мс от -60 мВ до +60 мВ с шагом 10 мВ. Токи KCa были сведены к минимуму с использованием регистрирующих растворов с низкой концентрацией Ca2 + (10 нмоль / л) и добавления 100 ммоль / л ибериотоксина в растворе ванны. Устойчивость к уплотнению составляла от 2 до 10 ГΩ. Кв-ток определяли путем вычитания внешних токов, регистрируемых в присутствии 3 ммоль / л 4-АР из внешних токов, зарегистрированных в растворе без ванны. Ток плотности каналов Kv рассчитывали для нормализации для области клеточной мембраны. Уровни гиперполяризации 10 мВ усредняли для измерения емкостей емкостей и значений компенсации утечки. Мембранные токи регистрировались с помощью усилителя EPC-9 и программного обеспечения Pulse (Heka Elektronik, Германия). Импульсы генерировались цифро-аналоговым преобразователем, управляемым программным обеспечением Pulse.

Образцы сыворотки и культуральные среды собирали, и уровни AGEs анализировали с использованием набора AGEs ELISA (MyBioSource, США) в соответствии с инструкцией производителя.

Вестерн-блоттинг в VSMC и коронарных тканях проводили, как сообщалось ранее [29]. Использовали следующие антитела: анти-Kv1.2, анти-Kv1.5, анти-RAGE и анти-β-актин (все от Abcam, U.K.).

Выделение РНК и генерация кДНК проводили, как описано ранее [23]. Экспрессия гена Kv1.2 и Kv1.5 оценивалась с помощью количественной RT-PCR. Используемые праймеры были следующими: Kv1.2 sense 5′-CATTTTGTACTACTACCAGTC-3 ‘, антисмысловой 5′-GGAGTGTCTGGACAACTTGA-3′; Kv1.5 sense 5’-TGAGCAGGAGGGGAATCAGA-3 ‘, антисмысловой 5′-ACACCCTTACCAAGCGGATG-3′; β-актин 5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3 ‘, антисмысловой 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’. Значения ΔΔCT были рассчитаны, как описано ранее [23]. Экспрессия гена была нормализована β-актином и сообщалась как отношение по сравнению с уровнем экспрессии в необработанной контрольной группе, которой давалось произвольное значение 1.

AGE-BSA для инкубации VSMC была приобретена у Merck Millipore. Установлено, что уровни эндотоксинов составляют менее 0,8 ЕР / мг белка с анализом Limulus amebocyte (набор E-Toxate, Sigma, США). Анти-RAGE IgG был от R & D системы (Миннеаполис, США). Все остальные химикаты были приобретены у Sigma (Сент-Луис, США).

Представленные значения были выражены как среднее ± SD. Сравнение между различными группами проводили односторонним ANOVA с последующим тестом Бонферрони. Значение рассматривалось как P <0,05.

VSMC инкубировали с AG, после чего проводили обработку с высоким содержанием глюкозы в течение 48 часов. Как показано на фиг. 1А, AGE увеличивали примерно до двух раз путем обработки высокой глюкозой. Напротив, AG затупила производство AGE. На фиг.1В и 1С показаны образцы цепей целых ячеек К +, генерируемых с помощью инкрементных деполяризационных шагов 10 мВ от -60 до +60 мВ в VSMC из RSCAs. Соотношения по току и напряжения, усредненные по шести клеткам, подтвердили, что высокая плотность глюкозы уменьшает плотность тока Kv на 60,4 ± 4,8%, тогда как AG предотвращает высокое индуцированное глюкозой снижение активности Kv на 56,9 ± 7,8% (рис. 1B и 1C). Лечение AG не оказывало явного влияния на активность Kv в нормальных клетках, инсулированных глюкозой.

A: Перепроизводство AGE в высокой глюкозе затуплено обработкой аминогуанидином (AG). B: отношения I-V плотности тока Kv в VSMC. n = 6 для независимых ячеек в каждой группе. C: Образцы следов целых клеточных K + токов, записанных до и после инкубации с 3 ммоль / л 4-аминопиридина (4-AP). Токи K + генерировались с помощью инкрементных деполяризационных шагов 10 мВ от -60 до +60 мВ. D: Экспрессия рецептора передовых продуктов гликирования (RAGE) определялась вестерн-блоттингом. Предварительная обработка анти-RAGE уменьшала доступный RAGE для AGE для связывания. * P <0,05 против нормальной глюкозы (NG). # P <0,05 по сравнению с высокой глюкозой (HG).

Учитывая роль RAGE в каскадах внутриклеточной сигнализации, индуцированных AGE, была также исследована роль RAGE в дисфункции Kv. VSMC предварительно обрабатывали анти-RAGE IgG до лечения с высокой глюкозой. Экспрессия RAGE была увеличена путем лечения высокой глюкозой по сравнению с нормальной глюкозной группой, тогда как анти-RAGE IgG заметно уменьшал доступный RAGE для AGE для связывания (рис. 1D). Результаты патч-зажима показали, что анти-RAGE инвертировал высокое индуцированное глюкозой подавление плотности тока Kv на 69,3 ± 9,5% (рис. 1B и 1C). Эти данные свидетельствуют о том, что высокая плотность тока Kv-плотности в VSMCs в основном опосредуется через AGE.

Далее было исследовано изменение экспрессии Kv канала с высокой глюкозой. VSMC инкубировали с AG с последующей обработкой высоким уровнем глюкозы, а экспрессия Kv1.2 и Kv1.5 оценивали с помощью RT-PCR и анализа вестерн-блоттинга. Как показано на рис. 2, высокая глюкоза значительно уменьшала экспрессию Kv1.2 и Kv1.5 на уровне гена и белка по сравнению с нормальной группой глюкозы. Лечение с помощью AG предотвращало высокое вызванное глюкозой нарушение экспрессии Kv1.2. Кроме того, анти-RAGE меняет изменение Kv1.2, наблюдаемое в высокой глюкозе, приближаясь к уровню, наблюдаемому при контроле. Экспрессия Kv1.5 также была увеличена в группах AG и анти-RAGE на уровне гена и белка по сравнению с высокой группой глюкозы, что указывает на то, что AGE необходимы для высокой глюкозы, вызванной нарушением экспрессии Kv1.2 и Kv1.5 ,

VSMC инкубировали с аминогуанидином (AG) или антирецептором продвинутых продуктов гликирования (RAGE) в течение 30 мин с последующей обработкой высоким уровнем глюкозы и экспрессией Kv1.2 и Kv1.5 на уровне гена и белка оценивали с помощью количественного реального — время-ПЦР (А и В) и анализ вестерн-блоттинга (С). * P <0,05 против нормальной глюкозы (NG). # P <0,05 по сравнению с высокой глюкозой (HG).

Чтобы дополнительно установить роль ВОЗ в условиях повышенной глюкозы-индуцированной Kv-нарушения, было исследовано прямое влияние AGE на Kv-каналы. VSMC предварительно обрабатывали анти-RAGE или носителем перед обработкой AGE-BSA. AGE-BSA инкубировали с VSMC в течение 48 часов с последующим патч-зажимом, RT-PCR и вестерн-блот-анализом. Лечение с помощью AGE было связано с 34% -ным уменьшением плотности тока Kv по сравнению с контролем (фиг. 3A и 3B). Экспрессия Kv1.5 на уровне гена и белка была значительно снижена (рис. 3C и 3D). Kv1.2 также уменьшился после лечения ВЕА по сравнению с контролем, хотя и с менее значительным изменением, чем Kv1.5. Предварительная обработка анти-RAGE блокировала эти модификации, вызванные AGE, что указывает на то, что AGE, независимо от концентрации глюкозы, могут нарушать ток и экспрессию Kv посредством взаимодействия с RAGE.

A: Образцы следов целых клеток K + токов, зарегистрированных до и после инкубации с 3 ммоль / л 4-аминопиридина (4-AP). Токи K + генерировались с помощью инкрементных деполяризационных шагов 10 мВ от -60 до +60 мВ. B: отношения I-V плотности тока Kv в клетках гладкой мускулатуры сосудов. n = 6 для независимых ячеек в каждой группе. C и D: после лечения только AGE или AGE плюс анти-RAGE экспрессия Kv1.2 и Kv1.5 на уровне гена и белка оценивалась с помощью количественного анализа в реальном времени (PC) (C) и вестерн-блот-анализа (D) , * P <0,05 против контроля.

Определялось индуцированное диабетом нарушение Kv-опосредованной вазодилатации в RSCA. Были подтверждены диабетические крысы и выделены коронарные артерии. Зафиксирование патч-зажима и молекулярно-биологические методы показали снижение плотности тока Kv и снижение экспрессии как Kv1.2, так и Kv1.5 у диабетических крыс (P <0,05 против контрольной группы, фиг. 4A, 4B и 4C), что согласуется с результатами in vitro. RSCAs были установлены в артериографе. Чтобы исключить потенциальную роль для эндотелиального поражения, коронарная дилатация сравнивалась в отсутствие эндотелия. На фиг.4D показано, что форсколин вызывал вазодилатацию RSCA дозозависимым образом. Максимальные дилатации до форсколина в RSCA диабетических крыс были снижены (54,6 ± 1,6 против 91,1 ± 2,1%, n = 8 для независимых артериальных колец в каждой группе, P <0,05 против контроля). Эти результаты свидетельствуют о том, что диабет нарушает вазодилатацию, опосредуемую цАМФ. Ослабленная цАМФ-опосредованная дилатация в DM может быть объяснена сосудистыми изменениями, независимыми от эндотелия.

Контрольные и диабетические крысы обрабатывали аминогуанидином (AG) или носителем в течение 10 недель. Маленькие коронарные артерии крыс (RSCAs) были выделены из разных групп крыс. A: плотность тока Kv в клетках гладких мышц сосудов, выделенных из разных групп крыс. n = 6 для независимых ячеек в каждой группе. B и C: экспрессию Kv1.2 и Kv1.5 на уровне гена и белка оценивали с помощью количественного анализа в реальном времени (PC) (B) и вестерн-блот-анализа (C). D: Доза-зависимая дилатация форсколина в RSCA была измерена с использованием миографа под давлением. E: После инкубации RSCA с 3 ммоль / л Kv-ингибитора 4-аминопиридина (4-AP) в течение 20 мин дилатации до форсколина во всех группах крыс были значительно снижены. Kv-опосредованная вазодилатация определялась как разница между дилатациями, измеренными до и после инкубации с 4-AP. n = 8 для независимых артериальных колец в каждой группе. * P <0,05 против контроля. # P <0,05 против диабетической группы (DM).

Далее было исследовано требование для Kv при сосудистой дисфункции, вызванной диабетом. Максимальные дилатации до форсколина были снижены на 3 ммоль / л 4-АР, что указывает на то, что цАМФ-опосредованная дилатация в этих сосудах преимущественно регулируется каналами Kv. 4-AP блокирует вазодилатацию как в контрольной группе, так и в группе DM. Кроме того, 4-AP-чувствительный компонент индуцированной форсколином дилатации в группе DM был снижен (9,3 ± 1,4% против 36,9 ± 1,4%, P <0,05 против контроля, рис. 4E), что указывает на то, что Kv-опосредованная коронарная дилатация нарушается у крыс с диабетом.

Для оценки влияния AGE in vivo диабетические крысы были рандомизированы для лечения AG или носителем. Через 10 недель были собраны коронарные артерии. Как видно из таблицы 1, лечение АГ не влияло на вес, кровяное давление и уровень глюкозы. Тем не менее, AG уменьшило сывороточные AGE. Как функция, так и экспрессия Kv были увеличены с помощью AG-терапии по сравнению с группой DM (фиг. 4A, 4B и 4C). При недиабетическом контроле, хотя лечение АГ понижало уровень AGE, оно не увеличивало экспрессию Kv.

Значения представлены как среднее ± SD. n = 8 для каждой группы. BP, артериальное давление. AGE, продвинутые конечные продукты гликирования. AG, аминогуанидин.

* P <0,05 против контроля.

#
P <0,05 против диабетической группы (DM).

Выделенная Forskolin релаксация была значительно изменена в RSCA у пациентов с диабетом, обработанной AG, по сравнению с крысами, обработанными с помощью диабета, которые оценивались с помощью миографа. Улучшены максимальные дилатации форсколину в RSCA пациентов с диабетом, обработанных AG (74,3 ± 1,6 против 54,6 ± 1,6%, n = 8 для независимых артериальных колец в каждой группе, P <0,05 против DM, рис. 4D). Кроме того, лечение АГ частично изменило снижение Kv-опосредованной коронарной вазодилатации (24,4 ± 2,2 против 9,3 ± 1,4%, n = 8 для независимых артериальных колец в каждой группе, P <0,05 против DM, рис. 4E). Данные, показанные выше, свидетельствуют о том, что ВОЗРАСТЫ являются регуляторами восходящего потока для нарушения Kv, которые опосредуют индуцированное диабетом сокращение коронарной дилатации.

Целью этого исследования было определить механизм коронарной дисфункции в ответ на диабет и, в частности, роль ВОЗРАСТ. Высокий уровень глюкозы уменьшал приблизительно половину плотности тока Kv в VSMC, тогда как уменьшение было почти предотвращено AG, химическим ингибитором образования AGE. Кроме того, AG предотвращало высокое вызванное глюкозой нарушение экспрессии Kv. Наконец, in vivo данные из коронарных микрососудов диабетической крысы также поддерживают роль ВОЗ в КВ-опосредованной коронарной дисфункции. Эти исследования убедительно свидетельствуют о том, что по меньшей мере часть коронарной дисфункции при диабете опосредуется через нарушение каналов Kv, и чрезмерное образование AGE берет на себя основную ответственность в этом процессе.

Настоящее исследование показывает, что ВОЗРАС ослабляет цАМФ-опосредованную релаксацию в коронарных микрососудах крысы, а механизм связан с нарушением каналов Kv в VSMC. Ранее было показано, что каналы Kv нарушаются в различных патологических состояниях, таких как гипертония [10] и гиперхолестеринемия [30]. Некоторые из эффектов, наблюдаемых у крыс DM, могут быть вызваны другими факторами, такими как повышенное кровяное давление. Тем не менее, воздействие VSMC на AGE-BSA in vitro могло непосредственно оценить влияние AGE на Kv-каналы без смешения влияний in vivo. Исследования патч-зажима показали, что AGE уменьшают чувствительный к 4-AP компонент тока K +, предполагая, что каналы Kv восприимчивы к ингибированию AGE. Кроме того, наши данные показали, что AGEs подавляют экспрессию Kv1.2 и Kv1.5 на уровне гена и белка. В нашем предыдущем исследовании было показано, что кратковременное воздействие RSCA на высокую глюкозу в течение 24 ч улучшает нитрование каналов Kv без изменения экспрессии Kv1.2 и Kv1.5 [6]. Различие между этими двумя результатами может быть приписано различным методам и времени воздействия. Инкубация RSCAs in vitro может не обеспечивать такой же степени стимуляции к каналам Kv, как при прямой инкубации VSMC. Наши результаты согласуются с моделью, в которой AGEs подавляют экспрессию каналов KCa2.3 и KCa3.1 в эндотелиальных клетках пупочной вены человека и повреждают KCa2.3 и KCa3.1-опосредованную релаксацию в небольших брыжеечных артериях [31]. Поскольку каналы Kv имеют критическое значение в сосудистой функции [8,9], они представляют собой потенциальные терапевтические мишени для восстановления нормальных уровней сосудистой реактивности.

Сообщается, что перепроизводство ВПГ способствует эндотелиальной дисфункции при диабете типа 2. Предыдущее исследование Гао и коллег показало, что нарушение коронарного вазодилататорного ответа на ацетилхолин было восстановлено путем блокады AGE / RAGE [13]. Возбужденная АГЭ инактивация оксида азота и нарушение эндотелийзависимой вазодилатации наблюдались также в аортах крыс [1] и артериях с артериальной гипертензией [14]. Здесь мы также изучили механизм опосредованной AGE сосудистой дисфункции, сосредоточив внимание на потенциальной роли эндотелийнезависимой вазодилатации. Механическая сила, ведущая к вазоконстрикции, проявляется гладкомышечными клетками, которые, как сообщается, играют доминирующую роль в регуляции индуцированной давлением вазодилатации [32]. Ранее мы сравнивали коронарную дилатацию с форсколином в присутствии и отсутствии эндотелия. Эндотелиальная денудация не уменьшала расширение до форсколина. Кроме того, уменьшение индуцированной форсколином дилатации в высокой глюкозе было сходным в неповрежденных и оголенных сосудах [5]. Результаты, представленные здесь, еще больше укрепляют эту связь и предполагают, что перепроизводство ВОЗРАСТЕЙ в среде с высоким содержанием глюкозы приводит к ухудшению Kv-каналов, регулирующих эндотелий-независимую вазодилатацию.

Ось AGE / RAGE играет важную роль в сосудистой дисфункции при диабете [33,34]. В нашем исследовании экспрессию RAGE повышали при высокой обработке глюкозой, что согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими, что экспрессию RAGE можно инициировать несколькими молекулярными лигандами, включая AGE, которые одновременно присутствуют при инкубации с высокой глюкозой [22,35]. Поскольку образование AGE является неферментативной реакцией, как Kv1.2, так и Kv1.5 при высокой концентрации глюкозы могут быть глицированы с образованием AGE, и их гликирование, несомненно, ухудшит Kv-каналы. Однако, как сообщается, AGE выполняют свою работу как прямым, так и косвенным образом [12]. В первом случае AGE оказывают неблагоприятное воздействие посредством сшивания важных белков. С другой стороны, AGE связываются с RAGE, тем самым вызывая окислительный стресс [18,36,37,38,39], что приводит к нарушению канала Kv и повреждению сосудов [6,40,41,42]. Поэтому мы использовали anti-RAGE для блокировки AGE, привязанных к RAGE. Как показано на фиг.1 и фиг.2, предварительная обработка анти-RAGE почти ингибировала индуцированное глюкозой нарушение Kv-каналов без изменения уровня AGE. Итак, мы заключаем, что ухудшение Kv1.2 и 1.5 происходит после связывания AGE и RAGE. В отличие от того, что белки Kv1.2 и Kv1.5 сами глицируют высокой глюкозой. Это открытие подчеркивает, что нарушение КВ, вызванное ВОЗ, главным образом опосредуется с помощью активации RAGE. Таким образом, ингибирование образования AGE или блокирующих AGE, взаимодействующих с RAGE, может быть потенциальной терапевтической мишенью для Kv-опосредованной коронарной дисфункции у пациентов с диабетом.

Взаимодействие AGE / RAGE может активировать разнообразный набор внутриклеточных сигнальных путей, включая p21ras, MAPK и NF-κB, которые стимулируют окислительный стресс [18,36,37,38,39]. Было описано увеличение окислительного стресса для подавления каналов Kv как на уровне белка, так и на мРНК [40,41,42]. Было показано, что взаимодействие AGE / RAGE снижает регуляцию PPARγ, члена надсемейства рецепторов ядерных гормонов, который был предложен регулятором транскрипционной регуляции экспрессии Kv-канала в артериолах сетчатки [43,44]. Выражение и функция каналов Kv различаются между различными сосудистыми тканями [45]. Ранее сообщалось, что пероксинитрит, образованный взаимодействием супероксида и оксида азота, нарушает функцию канала Kv путем нитрования белка канала Kv в коронарных артериолах [6]. Поэтому мы предполагаем, что окислительный стресс AGEs / RAGE может играть роль в ослабленных каналах Kv в клетках гладкой мускулатуры коронарных сосудов. Тем не менее, необходимо провести дополнительные исследования, чтобы продвинуть понимание механизмов, участвующих в экспрессии канала Kv / RAGE-downregulated.

Следует признать несколько ограничений этого исследования. Во-первых, также было показано, что другие семейства каналов Kv выражены в VSMC и также могут быть затронуты в этой диабетической модели. Здесь мы остановимся только на типичных типах каналов, которые, как сообщается, участвуют в вазодилатации в наших предыдущих исследованиях [5, 6]. В будущих исследованиях будут рассмотрены изменения других каналов VSMC Kv при сосудистой дисфункции, вызванной диабетом. Во-вторых, актуальность наших результатов ограничена спецификой ингибиторов. Хотя AG является наиболее широко изученным ингибитором образования AGE, и были проведены строгие контрольные эксперименты, генетические подходы все равно потребуются для подтверждения влияния оси AGE / RAGE на Kv-нарушения.

ВОЗРАСТЫ ослабляют Kv-опосредованную коронарную вазодилатацию у крыс с диабетом. Наше исследование впервые демонстрирует, что повышенные уровни глюкозы, вызванные избытком AGE, нарушают каналы Kv в VSMC и поддерживают роль каналов Kv в регуляции сосудистой функции у диабетических крыс. Эти результаты могут дать новое представление о механизмах диабетической коронарной дисфункции и иметь клинические последствия для лечения сосудистых осложнений у пациентов с диабетом.

Авторы благодарят Хуа Вэй (Школа основных медицинских наук, Столичный медицинский университет) за техническую поддержку.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *