Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Нарушение иммунной системы, Компромиссный иммунный ответ и повышенная смертность у диабетических мышей типа 2, инфицированных вирусом Западного Нила

Impaired Virus Clearance, Compromised Immune Response and Increased Mortality in Type 2 Diabetic Mice Infected with West Nile Virus
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3432127/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует. Соавтором PVN является член редакционной коллегии PLoS ONE. Это не изменяет приверженность авторов ко всем политикам PLoS ONE по обмену данными и материалами.

Задуманные и разработанные эксперименты: MK VRN PVN SV. Выполнял эксперименты: MK KR BO MN. Проанализированы данные: MK VRN PVN SV. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: MK VRN. Написал документ: MK VRN.

Клиникоэпидемиологические данные свидетельствуют о том, что диабет типа 2 связан с повышенным риском вирусного энцефалита Западного Нила (WNVE). Однако никакие экспериментальные исследования не выяснили роль диабета в нейропатогенезе WNV. Здесь мы использовали модель мыши db / db для понимания иммунопатогенеза WNV у диабетиков. Девятинедельным старым мышам C57BL / 6 WT и db / db инокулировали WNV и смертность, вирусную нагрузку на периферию и мозг, а также анализы противовирусной защиты. Мыши db / db были очень восприимчивы к болезни WNV, проявляли повышенный тканевый тропизм и смертность, чем мыши дикого типа, и не смогли очистить инфекцию. Повышенная и устойчивая репликация WNV наблюдалась в сыворотке, периферических тканях и мозге мышей db / db, а усиленная репликация вируса на периферии коррелировала с усиленной нейроинвазией и репликацией WNV в головном мозге. Инфекция WNV у мышей db / db была связана с усиленным воспалительным ответом и скомпрометированным антивирусным иммунным ответом, характеризующимся задержкой индукции IFN-α, и значительно сниженной концентрацией WNV-специфических IgM и IgG-антител. Скомпрометированный иммунный ответ у мышей db / db коррелировал с повышенной виремией. Эти данные свидетельствуют о том, что отсроченный иммунный ответ в сочетании с неспособностью очистить вирус приводит к увеличению смертности у мышей db / db. В заключение, это исследование дает уникальное механическое понимание иммунопатогенеза WNVE, наблюдаемого у диабетиков, и может быть использовано для разработки терапевтических средств для управления WNVE среди пациентов с диабетом.

Известно, что люди с диабетом типа 2 имеют более высокую заболеваемость бактериальными и грибковыми инфекциями [1] — [3]. Недавние исследования среди диабетических людей и моделей на животных продемонстрировали, что дисфункциональные врожденные и адаптивные иммунные ответы у диабетиков способствуют повышенной восприимчивости к патогенам, таким как Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Porphyromonas gingivalis и Trypanosoma cruzi
[4] — [6]. Эти иммунологические изменения включают измененные уровни специфических цитокинов и хемокинов, а также изменения количества и состояния активации различных популяций лейкоцитов [3], [7] — [9]. Диабет также ингибирует важные аспекты функции лейкоцитов, такие как хемотаксис и фагоцитоз, окислительный взрыв и внутриклеточное убийство [1], [3]. Дефекты при адаптивном иммунитете у диабетиков включают снижение пролиферации лимфоцитов и реакции гиперчувствительности замедленного типа (ответы типа Th1) [3], [7].

Вирус западного Нила (WNV), нейротропный флавивирус, стал важной причиной вирусного энцефалита в Соединенных Штатах. Инфекция WNV у людей обычно протекает бессимптомно или самоограничивается с легкой лихорадочной болезнью, но может прогрессировать до менингита, энцефалита, паралича и смерти [10]. WNV-ассоциированный энцефалит (WNVE) встречается чаще у людей с нарушенной иммунной системой, старшего возраста и с такими основными состояниями, как гипертония и диабет 2 типа [10], [11]. Наличие диабета является важным фактором риска развития тяжелой болезни WNV или смерти, а не лихорадки Западного Нила (WNF) [11] — [13]. Пациенты с диабетом в четыре раза чаще развивают WNVE, чем WNF, что значительно больше, чем другие основные состояния, такие как старость, мужской пол и гипертония [14], [15]. Кроме того, Abroug et al. Сообщили, что у пациентов с ВПЧ-инфекцией более высокая доля пациентов с гипергликемией при поступлении в больницу [16], а у лиц с диабетом наиболее вероятно наличие постоянных симптомов после заражения WNV [17]. Кроме того, диабет также связан с развитием и выраженностью хориоретинита у пациентов с инфекцией WNV [18], [19]. Эти клиникоэпидемиологические данные свидетельствуют о том, что диабет типа 2 связан с повышенным риском WNVE. Однако экспериментальные исследования не проводились, чтобы расшифровать роль диабета в тяжести заболевания WNV.

WNVE характеризуется нарушением гематоэнцефалического барьера (ВВВ), нейровоспалением, активацией микроглии и потерей нейронов [20], [21]. Для ограничения инфекции WNV требуется интактный врожденный и адаптивный иммунный ответ. Производство противовирусного типа I (IFN-α и β) имеет важное значение для подавления вирусных титров в мозге и периферических органах [22]. Индукция WNV-специфических иммуноглобулинов (IgM и IgG) необходима для подавления виремии и распространения вируса [23], [24]. Т-клеточный иммунитет необходим для контроля инфекции WNV в центральной нервной системе (ЦНС). Отсутствие функциональных CD8 + или CD4 + T-клеток приводит к неспособности очистить WNV от инфицированных нейронов в ЦНС [25], [26]. WNV также вызывает резкое увеличение количества провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) и интерлейкин (IL) -1β и -6 [20], [21], [27] и хемокины, такие как MCP- 1 и IP-10, которые регулируют трафик лейкоцитов в мозг и гибель нейронов после инфицирования [27] — [29].

В настоящем исследовании мы инокулировали дикого типа (WT) и диабетических (db / db) мышей с WNV и оценивали ход последующей инфекции, а также результирующий антивирусный иммунный ответ хозяина на инфекцию в поисках развития диабетического мышиную модель для тестирования терапевтических возможностей для управления WNVE у диабетиков.

db / db, для определения зависимости между сахарным диабетом и тяжелой болезнью WNV использовалась хорошо определенная модель мышиного типа 2 с мутациями в гене рецептора лептина [30]. Мыши db / db являются наиболее часто используемой моделью для изучения влияния диабета на различные вирусные, бактериальные и паразитарные заболевания [4] — [6]. Как и ожидалось, мыши db / db имели значительно большую массу тела по сравнению с контролем WT, 41,4 ± 5,3 против 24,3 ± 2,4 г, p <0,0001 (фиг.1A). db / db были непереносимостью глюкозы, как измерено с помощью теста на внутрибрюшинную толерантность к глюкозе (IGTT), и уровни глюкозы в крови были значительно выше (p <0,0001 для всех временных точек), чем у мышей WT (фиг.1B).

(A) Вес тела в граммах девятинедельных мышей WT и db / db. (B) Уровни глюкозы в крови у мышей WT и db / db во время IGTT. Приведенные данные представляют собой среднюю концентрацию (мг / дл) ± SEM уровней глюкозы в крови и представляют собой два независимых эксперимента. * Р <0,0001.

Чтобы исследовать влияние диабета на патогенез WNV, мы оценили заболеваемость и смертность мышей WT и db / db после инфицирования PBS (mock) или 10 PFU WNV. POS-инфицированные мыши оставались здоровыми на протяжении всего периода наблюдения в 21 день, тогда как мыши db / db были более восприимчивы к WNV-заболеванию и имели значительно более высокую смертность по сравнению с мышами WT, 92% против 37%, p <0,0001 (фиг.2A ). На 21-й день после заражения все выжившие животные были подтверждены как положительные для антител к WNV IgG. Как показано на фиг.2В, обе мыши db / db и WT продемонстрировали клинические признаки инфекции, характеризующейся раздраженной шерстью и горбатой позой, однако неврологические симптомы, такие как парез, паралич задней конечности, толчки и атаксическая походка были более серьезными в db / db мышей и наблюдали у всех инфицированных мышей db / db по сравнению с приблизительно 50% мышей WT.

(A) Мышам WT и db / db в возрасте девяти недель вводили подкожно 10 PFU WNV. Все мыши наблюдались в течение 21 дня. Данные объединяются из двух независимых исследований (n = 38 на группу). Разница в выживаемости между мышами WT и db / db была статистически значимой. Все выжившие животные были положительными для антител против WNV IgG. (B) Животных наблюдали за клиническими оценками два раза в день. Обозначение для клинических баллов выглядит следующим образом: 1, оборванный мех / сгорбленная спина; 2, парезы / трудности ходьбы; 3, паралич; 4, умерщвление / эвтаназия; и 5, мертвых. Полосы ошибок представляют собой SEM. (C) Кинетику и уровни WNV определяли в сыворотке мышей WT и db / db после инфекции WNV в указанные моменты времени с помощью анализа бляшек. Данные выражаются в виде PFU / мл сыворотки. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь, и изображены данные из двух независимых экспериментов. Точки данных ниже горизонтальной пунктирной линии являются отрицательными. * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,0001.

Кинетика репликации WNV в сыворотке мышей WT и db / db, измеренная методом бляшки, демонстрировала более высокую и более длительную виремию у мышей db / db. Титр вируса был сходным у мышей WT и db / db на 2-й день после заражения (2 × 103 PFU / мл), однако на 4-й день после заражения титр вируса у мышей db / db был на два журнала выше, чем у мышей WT, 2 × 105 против 1,5 × 103 PFU / мл, p <0,001 (фиг.2C). На 6-й день после заражения уровни WNV снижались у мышей WT, однако он оставался значительно высоким у мышей db / db (1,1 × 103 PFU / мл, p <0,001), что указывало на устойчивую репликацию или задержку в разминировании WNV с периферии. Вирус очищали с периферии всех мышей db / db на 8-й день после заражения.

Чтобы понять, как диабет усиливал восприимчивость мышей к заболеванию WNV, мы сравнивали вирусную нагрузку WNV в периферических тканях и мозге мышей WT и db / db на 2, 4, 6 и 8 днях после инфицирования (рис.3A-E).

Девятинедельные самки мышей WT и db / db инокулировали подкожно 10 PFU WNV, а периферические ткани и мозг собирали в дни 2, 4, 6 и 8 после инфицирования. Вирусные нагрузки в периферических органах и головном мозге измеряли, как указано на рисунке, с помощью анализа бляшек с использованием клеток Vero и сообщают как PFU на грамм ткани. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь, и изображены данные из двух независимых экспериментов. Точки данных ниже горизонтальной пунктирной линии являются отрицательными. Твердая горизонтальная линия означает медианную из семи мышей на группу. * Р <0,05.

В соответствии с более ранними исследованиями [22], [23] WNV был обнаружен в селезенке 1 из 7 мышей WT на 2-й день после заражения (фиг.3А). Напротив, у 67% (4 из 7) мышей db / db были измеримые титры вируса (6 × 102 PFU / г) на второй день после заражения. К 4-му дню, который соответствует пику инфекции WNV в селезенке, наблюдался значительно более высокий титр вируса у мышей db / db по сравнению с мышами WT; 4 × 104 против 8 × 102 PFU / г, p <0,05. В то время как WNV очищали от селезенки 4 из 7 мышей WT на 6-й день после заражения, у мышей db / db был обнаружен повышенный титр вируса 8 × 103 PFU / г. Вирус очищали от всех мышей WT на 8-й день после заражения, однако у 2 из 7 дБ / дБ мышей было обнаружено 8 × 102 PFU / г вируса.

Почка мышей WT относительно устойчива к инфекции WNV, и высокий уровень вируса обычно не обнаруживается [22], [23]. Как и ожидалось, низкие уровни вируса были обнаружены в почках у немногих мышей WT на 4-й день (2 из 7) и 6 (3 из 7) после инфицирования (рис.3B). Тем не менее, значительно большая репликация WNV была обнаружена в почках мышей db / db на 4-й день (2 × 102 PFU / г) и на 6-й день (4 × 104 PFU / г, p <0,05). Однако, в отличие от селезенки, не было стадии очистки, так как высокий уровень вируса сохранялся в почках мышей db / db на 8-й день после заражения; 2 × 104 PFU / г, p <0,05.

WNV не обнаруживался в сердцах мышей WT и db / db на 2-й и 4-й день после инфицирования, за исключением одной мыши WT, которая была положительной на 4-й день (фиг.3C). у мышей db / db развилась сердечная инфекция, начиная с 6-го дня после заражения 85% мышей db / db с высокой виремией (8 × 103 PFU / г, p <0,05), которые сохранялись до 8 дня (6 × 103 PFU / г, p <0,05) после заражения. Для сравнения, низкий уровень вируса был обнаружен только у 42% и 28% мышей WT на 6-й и 8-й день после инфицирования соответственно.

Кинетика репликации вируса, наблюдаемая в легких, была похожа на сердце. Облегчение WNV в легких было либо ниже предела обнаружения, либо очень низкое у всех мышей на 2 и 4 днях после инфицирования (рис. 3D). В то время как WNV был обнаружен только у 28% и 42% мышей WT на 6-й и 6-й день соответственно, 85% мышей db / db имели высокую виремию на 6-й день (2 × 103 PFU / г) и 8-й день (8 × 102 PFU / g) (p <0,05 для обоих временных точек) после заражения.

В соответствии с предыдущими исследованиями [31], ни один вирус не был обнаружен в печени мышей WT в любой момент времени после заражения (рис.3Е). В отличие от других периферических органов, вирус не был обнаружен в печени мышей db / db в любой момент времени, за исключением трех мышей db / db на 4 и 6 днях после заражения, что указывает на неспособность вируса эффективно реплицироваться в печени ,

Вирус не был обнаружен в головном мозге мышей WT и db / db на 2-й и 4-й день после заражения (рис.3F), что согласуется с предыдущими исследованиями [22], [23]. На 6-й день после заражения вирус был обнаружен в мозге 85% (6 из 7) мышей db / db по сравнению с 42% (3 из 7) мышей WT. Мыши db / db (7 из 7, 100%) продолжали демонстрировать значительно повышенную вирусную нагрузку по сравнению с мышами WT (5 из 7, 71%) на 8 день после заражения, 8,4 × 104 против 6 × 103 PFU / г, p <0,05, с повышенной заболеваемостью и смертностью.

Инфекционный вирус анализировали в белом (висцеральном и кожном жире) и коричневых жировых тканях, чтобы определить, поддерживает ли жир репликацию WNV. Вирус не обнаруживался во всех мышах WT и db / db на 2 и 4 днях после заражения (рис.4). В то время как WNV был обнаружен только у 25% мышей WT на 6-й день после инфицирования, 90% мышей db / db проявляли высокие титры вируса в жировых тканях (p <0,05). На 8-й день после заражения 60% мышей db / db были положительными для WNV, но вирус не обнаруживался у всех мышей WT (p <0,05). В целом уровни WNV были выше в белой жировой ткани, чем коричневая жировая ткань.

Вирусные нагрузки определяли в (А) висцеральном (В) кожном и (С) коричневом жире у мышей WT и db / db на 2, 4, 6 и 8 день после заражения с помощью анализа бляшек с использованием клеток Vero и сообщают как PFU на грамм ткани. Каждая точка данных представляет собой отдельную мышь, и изображены данные из двух независимых экспериментов. Точки данных ниже горизонтальной пунктирной линии являются отрицательными. Твердая горизонтальная линия означает медианную из семи мышей на группу. * Р <0,05.

Гуморальный иммунитет является важным компонентом иммунного ответа на инфекцию WNV [23], [24]. Поскольку мы наблюдали высокую виремию и смертность у мышей db / db, мы полагали, что это может быть связано с депрессией WNV-специфических антител. Поэтому мы рассмотрели профиль WNV-специфического IgM и IgG антител в сыворотке мышей WT и db / db с использованием MIA. В соответствии с предыдущими исследованиями [29] у мышей WT WNV-специфические IgM-антитела были впервые обнаружены на 4-й день после инфицирования и постепенно увеличивались на 6-й и 8-й день после инфицирования (рис.5А). Напротив, развитие WNV-специфического IgM задерживали у мышей db / db и демонстрировали значительно более низкие титры на 4, 6 и 8 день после инфицирования (p <0,05 для 4-го дня и p <0,001 для дней 6 и 8). Подобно IgM-антителам, общие уровни WNV-специфических IgG-антител также были значительно снижены у мышей db / db по сравнению с мышами WT на 6-й и 8-й день после инфицирования (фиг.5B, p <0,05).

Сыворотку собирали из мышей WT и db / db в указанные моменты времени, а WNV-специфичные (A) IgM и (B) IgG-ответы измеряли MIA с использованием антигена WNV E, как описано в материалах и методах. Значения представляют собой среднюю флуоресцентную интенсивность (MFI) отдельных инфицированных мышей минус среднее стандартное отклонение MFI + 3 соответствующей макетной группы (n = 8). Данные изображены как разбросанные точки, представляющие отдельных мышей с медианой, представленной как горизонтальная линия, и представляют собой два независимых эксперимента (n = 7-18). * p <0,05, ** p <0,001.

Несколько исследований свидетельствуют о роли IFN типа 1 в ограничении репликации WNV [22]. Поскольку мы наблюдали высокую репликацию вируса на периферии и головном мозге и низкие уровни специфичных для WNV антител, мы предположили, что нарушением реакции интерферона у мышей db / db может быть механизм этого явления. Поэтому мы измерили уровни IFN-α в сыворотке и мозге мышей WT и db / db. IFN-α был впервые обнаружен у мышей WT на 2-й день после заражения, достиг максимума на 4-й день, а затем уменьшился на 6-й день после заражения (фиг.6A). Напротив, мыши db / db не вызывали ответ IFN на 2-й день после инфицирования, а на 4-й день уровни были значительно ниже по сравнению с мышами WT (p <0,05). Высокие уровни IFN-α не были обнаружены у мышей db / db до 6-го дня после заражения. Затем мы исследовали уровни IFN-α в головном мозге на 6 и 8 день после заражения. В мозге мыши WT развивали обнаруживаемый интерфероновый ответ на 6-й день после инфицирования, тогда как в этот момент времени у мышей db / db не было обнаружено никакого IFN-α (рис. 6B, p <0,05). Однако уровни IFN-α были одинаковыми в мозге мышей WT и db / db на 8-й день после инфицирования.

(A) Сыворотку собирали у мышей WT и db / db в указанные дни после инфицирования. Получение IFN-α измеряли с использованием набора ИФА IFN-α ELISA. (B) Мозги собирали у WNV-инфицированных мышей WT и db / db на 6-й и 8-й день после инфицирования и гомогенизировали, как описано в материалах и методах. Представленные данные представляют собой два независимых эксперимента. Твердая горизонтальная линия означает медианную из семи мышей на группу. * Р <0,05.

Диабет типа 2 связан с усиленным воспалительным ответом на инфекции [8], [9]. Поэтому мы измеряли уровни множественных цитокинов и хемокинов в сыворотке мышей WT и db / db после инфекции WNV. Как и ожидалось, воспалительный ответ был более выражен у мышей db / db, чем у мышей WT. Уровни IL-1β резко возрастали у мышей db / db на 4-й день после инфицирования (фиг.7A, p <0,05) и были необнаружимыми на 6-й и 8-й дни. Уровни IL-6 были значительно отрегулированы у мышей db / db на 6 и 8 дни после заражения (фиг.7В, р <0,05). Аналогично, уровни TNF-α в сыворотке мышей db / db были значительно выше, чем у мышей WT на 6-й день после заражения (рис.7C, p <0,05). Аналогичная картина наблюдалась и для экспрессии хемокинов. Уровни IP-10 и MCP-1 были значительно увеличены у мышей db / db на 6-й день после заражения (рис.7D и 7E, p <0,05). В то время как уровни KC были значительно выше у мышей db / db на 4-4 день после инфицирования (рис. 7F, p <0,05 для дней 4 и 6 и p <0,001 на 8 день), уровни RANTES и MIP- 1α (фиг.7G и 7H, p <0,05) были значительно увеличены на 8-й день после инфицирования по сравнению с мышами WT.

Сыворотку собирали у мышей WT и db / db в указанные дни после заражения. Уровни хемокинов и цитокинов, как отмечено на рисунке, измеряли с использованием мультиплексного анализа Luminex и выражали как среднюю концентрацию (pg / mL) ± SEM, представляющую два независимых эксперимента (n = 7 на группу). * p <0,05, ** p <0,001.

Диабет типа 2 связан с нарушением иммунного ответа и повышенной восприимчивостью к различным патогенам [3], [7]. Однако исследования, изучающие влияние диабета на иммунный ответ на вирусные инфекции, ограничены. Насколько нам известно, это первый отчет, характеризующий влияние диабета на инфекцию WNV и связанные с ней иммунные ответы в модели мыши. В этом исследовании мы демонстрируем, что мыши, инфицированные WNV db / db, демонстрируют высокие титры вирусов, увеличивают тканевый тропизм и высокие показатели смертности по сравнению с мышами WT. Эти наблюдения были связаны со значительной задержкой в ​​индукции антивирусных иммунных реакций и увеличением провоспалительных реакций у мышей db / db.

У мышей db / db снижение выживаемости сопровождалось увеличением и устойчивой репликацией WNV в сыворотке, периферических тканях и головном мозге. По сравнению с мышами WT мыши db / db проявляли повышенный уровень титров вируса в сыворотке, которые сохранялись до 6-го дня после заражения и коррелировали с увеличением тканевого тропизма (рис. 2C). Хотя селезенка была единственным периферическим органом со значительной WNV-инфекцией у мышей WT, мыши db / db демонстрировали значительную репликацию вируса в других периферических тканях, таких как почки, сердце и легкие (рис.3). Подобно периферии, наблюдалась усиленная репликация вируса в мозге мышей db / db, что приводило к увеличению смертности. Однако вирус не обнаруживался в мозге выживших мышей WT и db / db путем анализа налета на 21 день после заражения.

Несколько исследований обеспечивают связь между диабетом и повышенной серьезностью заболевания, связанным с несколькими бактериальными и паразитарными патогенами. Инфекция мышей db / db с помощью Staphylococcus aureus приводила к длительной инфекции с сильным воспалительным ответом [5]. Аналогичным образом, заражение Listeria monocytogenes и Trypanosoma cruzi приводило к увеличению смертности и подавлению клиренса патогенов у мышей db / db [4], [6]. Однако исследования вирусных инфекций в экспериментальных диабетических моделях ограничены, за исключением коксасикивируса, в котором мыши db / db проявляют большую восприимчивость к инфекции [32]. Наши результаты свидетельствуют о том, что в дополнение к множественным бактериальным и паразитарным патогенам WNV-инфекция также усиливает тяжести заболевания среди диабетиков.

Мало внимания уделяется роли жировой ткани при инфекционных заболеваниях. Жировая ткань играет важную роль в воспалении и, как известно, является критическим игроком в патогенезе нескольких инфекционных заболеваний [33]. Адипоцит может быть прямой мишенью для ряда патогенов и их продуктов. Несколько вирусов, таких как цитомегаловирус, аденовирусы-2 и -36 и вирус саркомы Rous, способны инфицировать адипоциты in vitro и индуцировать воспалительный ответ [34]. Подтипы аденовирусов могут постоянно инфицировать адипоциты и вызывать ожирение [35]. Кроме того, жировая ткань также служит в качестве резервуара для рецидивирующего заболевания, вызванного инфекциями с Rickettesiae prowazekii и Trypanosoma cruzi
[36], [37]. Опубликованные данные свидетельствуют о том, что WNV не только вызывает острое заболевание, но также может сохраняться в долгосрочной перспективе у людей [38] и животных моделей [39]. Устойчивость WNV наблюдалась в различных органах, таких как кожа, почки, мозг и лимфоидные ткани [39]. В этом случае мы демонстрируем высокие уровни WNV в жировой ткани мышей db / db (фиг.4), предполагая, что жировые ткани также могут служить основным сайтом для репликации и стойкости WNV у диабетиков. Более того, производство воспалительных цитокинов из WNV-инфицированной жировой ткани может играть важную роль в механизмах защиты хозяина во время инфекции WNV.

Прочная индукция противовирусных иммунных реакций имеет решающее значение для контроля инфекции WNV [40]. IFN-α быстро продуцируется после инфекции WNV и имеет решающее значение для борьбы с репликацией вируса и ограничения тканевого тропизма [22]. Мы наблюдали устойчивое увеличение уровней IFN-α в сыворотке и головном мозге мышей WT, которые коррелировали с вирусом. Для сравнения, была значительная задержка в индукции ответа IFN-α в сыворотке и мозге мышей db / db (фиг.6). Уровни IFN-α не были обнаружены в сыворотке мышей db / db до 6-го дня после заражения. Важно отметить, что титры вируса были выше в сыворотке мышей db / db до 6-го дня после заражения, предполагая, что ответ IFN типа 1 дефектен у мышей db / db и может быть ответственным за задержку вируса в мышах db / db , Подобно реакции IFN-α, в предыдущих исследованиях были связаны сниженные WNV-специфические ответы на антитела в раннем возрасте во время инфекции с более высокой виремией, раннее распространение в ЦНС и повышенная смертность [23], [24]. Аналогично, мы наблюдали значительно замедленное производство WNV-специфических IgM и IgG-антител у мышей db / db по сравнению с мышами WT (фиг.5). Это может быть связано с задержкой продуцирования IFN-α, поскольку сообщалось, что IFN типа I усиливает гуморальные иммунные ответы путем стимуляции дендритных клеток [41], а также непосредственно влияет на В-клетки [42], [43]. Purtha et al. также продемонстрировал, что ранняя активация В-клеток после инфекции WNV требует α / β-интерферона [42]. Хотя нарушения иммунного ответа, такие как активация лейкоцитов, и производство цитокинов и хемокинов, были охарактеризованы в моделях диабета [3], [7], [8], влияние диабета на ответ типа IFN типа 1 до сих пор не сообщалось. Это первый отчет, демонстрирующий влияние диабета на подавление ключевых противовирусных ответных реакций, таких как те, которые вызваны антителами IFN-α и IgM и IgG. Однако Smith et al. ранее сообщали об ослабленном ответе ИФН 1-го типа в связанной с диетой модели ожирения при инфицировании вирусом гриппа [44]. Этот вывод также имеет значительные последствия для стратегий вакцинации для WNV во все более диабетической популяции.

В нескольких исследованиях показано, что вызванные WNV провоспалительные реакции модулируют проницаемость BBB, способствуют проникновению лейкоцитов в ЦНС, активируют глиальные клетки и опосредуют гибель нейронов после инфекции WNV [20], [21], [27] — [29]. В этом исследовании мы демонстрируем значительно повышенные уровни мощных цитокинов и хемокинов в сыворотке мышей db / db после инфекции WNV. Уровни IL-1β были высокими на 4-й день после инфицирования у мышей db / db, что также является пиком виремии. IL-1β участвует в индуцированной WNV миграции клеток Лангерганса с кожи на дренирующие лимфатические узлы в модели мышей [45], а также играет важную роль в патогенезе диабета 2 типа и связанных с ним осложнениях [9], [46 ]. IL-1β является основным регулятором и модулирует секрецию других цитокинов, таких как IL-6 и TNF-α [46]. Было продемонстрировано, что опосредуемое IL-1β воспаление увеличивается у мышей db / db из-за связанной с диабетом потери антирегуляции IL-1β [47]. Аналогично в нашем исследовании индукция IL-1β предшествовала восстановле- нию других воспалительных цитокинов, таких как IL-6 и TNF-, и хемокины, такие как IP-10 (CXCL10), KC (CXCL1), MCP-1 (CCL2 ), RANTES (CCL5) и MIP-1α (CCL3) в сыворотке мышей db / db на 6-й и 8-й день после инфицирования (фиг.7), что также коррелировало с появлением WNV в различных периферических тканях и входе вируса в головном мозге мышей db / db (фиг.3). Подобно профилю сыворотки провоспалительных цитокинов и хемокинов, неопубликованные данные нашей лаборатории демонстрируют повышенный уровень этих цитокинов и хемокинов в головном мозге мышей db / db на 6-й и 8-й день после заражения (Kumar et al., Неопубликованные данные ), предполагая усиленный воспалительный ответ как на периферии, так и в мозге мышей db / db после инфекции WNV. Эти данные согласуются с предыдущими наблюдениями о том, что мыши db / db демонстрируют больший воспалительный ответ на различные патогены, такие как Staphylococcus aureus, Porphyromonas gingivalis и Trypanosoma cruzi, в которых усиленный воспалительный ответ коррелирует с повышенной тяжести заболевания [5], [8] , [48]. Повышенное воспаление, наблюдаемое у мышей, инфицированных WNV db / db, также может приводить к множественным эффектам, включая усиление проникновения вируса и лейкоцитов в мозг, увеличение нейроинфлама и гибель нейронов, тем самым способствуя увеличению смертности.

В заключение, мыши db / db были очень восприимчивы к WNV-заболеванию, и в сыворотке, периферических тканях и головном мозге наблюдалось подавление зазора вируса. Врожденные и гуморальные иммунные ответы необходимы для устойчивости к инфекции WNV, а нарушенный антивирусный иммунный ответ у мышей db / db может быть вовлечен в ослабление устойчивости против WNV. Эти данные дают прямые экспериментальные данные о диабете типа 2 как фактор риска тяжелого WNVE. Дальнейшие исследования необходимы для выяснения основополагающих механизмов для разработки вспомогательной терапии для диабетиков с симптомами WNVE.

Это исследование было специально одобрено Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Гавайских островов (IACUC) (протокол № 10-948) и проведено в строгом соответствии с руководящими принципами, установленными Национальными институтами здравоохранения и Университетом Гавайских островов IACUC. Все эксперименты на животных проводились в консультации с персоналом по ветеринарной и животноводческой работе в Гавайском университете в лаборатории 3-го уровня по биобезопасности животных, а мышей, которые проявляли тяжелые заболевания, были подвергнуты эвтаназии, чтобы ограничить страдания.

Самцы девятинедельных мышей C57BL / 6J-Leprdb / Leprdb (db / db) и мышей C57BL / 6J (WT) были приобретены в Лаборатории Джексона и были акклиматизированы в течение 2-4 дней в лаборатории уровня биобезопасности животных 3 до начало исследования. Животных содержали по четыре на клетку и разрешали есть и пить ad libitum. Животный набор поддерживали при температуре 72 ° F, 45% влажности и 12/12 световых / темных циклах. Были установлены постельные принадлежности для опилок вместе с бумажным полотенцем, и клетки менялись еженедельно. Обученный и сертифицированный персонал проводил все эксперименты на животных.

Для исследований выживаемости мышей инокулировали по пути лапы с 10 единицами формирования бляшек (PFU) WNV (NY99) или PBS (макет), а симптомы болезни и смертность наблюдались в течение 21 дня, как описано ранее [49]. Клинические симптомы наблюдались два раза в день, как описано ранее [50]. Эти симптомы включали взъерошенный мех, горбатую позу, затрудненную ходьбу, паралич задней конечности, толчки и атаксическую походку. Чтобы ограничить страждущих животных, проявляющих серьезные симптомы, такие как тремор и атаксическая походка, были немедленно подвергнуты эвтаназии с использованием CO2. В дни 2, 4 и 6 после инфицирования из хвостовой вены собирали 100 мкл крови и сыворотку отделяли и замораживали для анализа титра WNV с помощью анализа бляшек с использованием клеток Vero, как описано ранее [51].

В отдельном наборе экспериментов мышей WT и db / db инокулировали PBS или 10 PFU WNV, а в дни 2, 4, 6 и 8 после заражения мышей анестезировали с использованием изофлурана и перфузировали с PBS. Селезенку, почки, печень, сердце, легкие, висцеральный жир, кожный жир, коричневый жир и мозг собирали и замораживали в 2-метилбутане (Sigma) в вышеупомянутых временных точках. Ткани взвешивали и гомогенизировали в пулевом блендере (Next Advance), используя стеклянные или цикониевые шарики согласно инструкциям производителя, и анализ бляшек проводили, как описано ранее [50].

Мышей голодали в течение 4 ч, а IGTT проводили, как описано ранее [52]. По окончании базовой линии (0 мин) отбирали пробу крови, вводили 2 мг / г массы тела D-глюкозы и измеряли концентрацию глюкозы в двойных образцах в 30, 60, 90 и 120 мин с использованием глюкометров One Touch Basic и One Прикоснитесь к тест-полоскам глюкозы [52].

Уровни WNV-специфических IgM и IgG-антител измеряли в сыворотке с использованием микросферного иммуноанализа (MIA) для белка WNV-оболочки E, как описано ранее [39]. Вкратце, образцы сыворотки (разведение 1:20) инкубировали с микросферами, связанными с рекомбинантным антигеном WNV E в течение 30 минут с последующим вторичным козьим антимышиным IgG или IgM, конъюгированным с красно-фикоэритрином в течение 45 мин. Интенсивность флуоресценции микросфер анализировали с помощью прибора Luminex 100.

Уровни IFN-α измеряли в гомогенатах сыворотки и головного мозга с помощью ELISA, используя ELISA-набор для мыши-интерферона-альфа-группы VeriKineTM (источник интерферона PBL), как описано ранее [27].

Уровни цитокинов и хемокинов измеряли в сыворотке с помощью анализа Luminex с использованием MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine / Chemokine kit (Millipore).

Для анализа данных о выживаемости использовали тест на ранжирование (Mantel-Cox) и тест Gehan-Breslow-Wilcoxon. Тест Mann-Whitney и непарный t-тест учащегося с использованием GraphPad Prism 5.0 были использованы для расчета значений p разницы между титрами вируса и иммунными ответами соответственно. Различия p <0,05 считались значимыми.

Мы благодарим г-жу Джанет Микс за помощь в создании биоразведки JABSOM. Эта работа является частью докторской диссертации МК, которая будет представлена ​​в Гавайский университет.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *